Nanotechnológia Nukleinsavak Készítette - Fehérvári Gábor
Bevezető A nukleinsavak az élő anyag alapvetően fontos komponensei. Meghatározó szerepet töltenek be az átöröklésben, a fehérjék szintézisében és a biológiai evolúcióban. Nukleinsavakat először F. Miescher (1869) vont ki fehérvérsejtekből, és hering spermából. A nukleinsavak tanulmányozásában és szerkezetük megismerésében elsők között vett részt a kolozsvári Plósz Pál, egyetemi tanár. F. Casspersen és J. Brachet ismerték fel, hogy a sejtmagban dezoxiribonukleinsav (DNS), míg a citoplazmában ribonukleinsav (RNS) található. A nukleinsavaknak a genetikai információk tárolásában való szerepükről ekőször I. Avery, Mac Leod és McMarthy (1944) mutattak rá. Az örökletes tulajdonságok érvényesülését a DNS és az RNS a fehérjeszintézis irányításával biztosítja. A nukleinsavak izolálásától kezdve az 1950-es évekig megfelelő analitikai módszerek hiányában csak igen kezdetleges elképzelések voltak ezen óriásmolekulák szerkezetét illetőleg. Az alapvető komponenseket, a dezoxi-ribonukleiotidokat és a ribo-nukleotidokat már ismerték, de a nukleotid-szekvencia tanulmányozása és a nukleinsavak térszerkezetének megállapítása, csak a kromatográfia, az elektroforézis, a radioaktív izotópos nyomjelzők és a röntgen-diffrakciós analízis segítségével vált lehetségessé. Az első eredményeket I. Chargaff és társai közölték. A nukleinsavak hidrolízises bontása után nukleotidok szabadulnak fel. A nukleotidok számos biológiai folyamat nélkülözhetetlen résztvevői: sejtek energiatárolásában, nukleinsavak alapegységei, szállítómolekulák. E folyamat savas vagy lúgos közegben, magasabb hőmérsékleten (80-90 Celsius-fok) megy végbe. A nukleotidok tovább bonthatók nitrogéntartalmú szerves bázisokra, öt szénatomos cukor molekulákra (ribóz, dezoxiribóz) és foszforsavra. A pentóz ötödik szénatomjához észterkötés kialakulásával kapcsolódik a foszfátcsoport, egy molekula víz kilépése közben, az elsőhöz pedig a szerves bázis egyik nitrogénatomja. Ez az adenozin-monofoszfát. Az autotróf élőlények a felépítésükhöz szükséges energiát mindenekelőtt a Nap fényenergiájából nyerik és azt alakítják kémiai energiává. A heterotrof élőlények ezt a kémiai energiát veszik fel táplálék formájában. Tehát lényegében minden élőlény kémiai energiát használ fel életjelenségeinek fenntartásához. Az élőlények a kémiai energiát nagy energiájú kötéseket tartalmazó molekulákban tárolják. Ilyen molekula az adenozin-trifoszfát (ATP), melynek 1 móljának hidrolízise során kb. 25 kj energia szabadul fel, ekkor adenozin-difoszfát keletkezik. A foszfátcsoport mozgékonysága és a molekula nagy energiaraktározó képessége az alapja az ATP központi jelentőségének a sejtek energiaforgalmában. Energiatermelő folyamatokban ADP ---> ATP, energiaigényes folyamatokban ATP ---> ADP.
A DNS molekula, szerkezete, főbb jellemzői A nukleinsavak akár több ezer nukleotid egységekből kondenzációval felépülő polinukleotidok. A szomszédos nukleotid egységek a pentózmolekulák 5. illetve 3. szénatomja közötti foszfátcsoporton keresztül kapcsolódnak össze. A felépítő pentóztól és a nitrogéntartalmú szerves bázisoktól függően két nagy csoportjuk van: DNS és RNS. A nukleinsavak molekuláiban az egyes nukleotidokat csak a N-tartalmú szerves bázisok különböztetik meg egymástól. Ezért a nukleinsavak szerkezetének elsődleges meghatározója a bázissorrend.az RNS és a DNS hidrolízisével nyerhető heterociklikus vegyületek a következők: RNS adenin (A) guanin (G) citozin (C) uracil (U) DNS adenin (A) guanin (G) citozin (C) timin (T) A különbség tehát annyi, hogy a három azonos vegyület mellett az RNS-ben uracil, a DNS-ben timin található. A DNS-molekulát alkotó nukleotidok felépítésében négyféle bázis található: adenin, timin, guanin, citozin. Egy DNS-molekula két egymással szemben levő és ellentétes irányba futó polinukleotid-láncból épül fel, ezeket H-kötések kapcsolják össze (A-T 2, G-C 3 H-kötés). A hidrogénhidak kialakulását a bázisok szerkezete határozza meg. Minden bázispárban egymással szemben egy nagyobb méretű purinbázis és egy kisebb méretű pirimidinbázis helyezkedik el. Ennek következménye, hogy a két lánc párhuzamos egymással, az egyik lánc bázissorrendje egyértelműen meghatározza a másikét. A polinukleotidszál hossztengelye körül spirális formában feltekeredik - kettős hélixszerkezet. A spirál átmérője 2 nm, egy teljes csavarulat hossza 3,4 nm. A DNS szerkezetét James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins fedezte fel.
A DNS-molekulában nem csak a bázisok között lép fel kémiai kölcsönhatás, hanem a felcsavarodó lánc egyes rétegei között is, így megkülönböztethetjük a kisárkot és a nagyárkot, amelyek felváltva követik egymást. A DNS a tulajdonságok nemzedékről nemzedékre való átadásáért felelős. Ezeknek kialakítását a fehérjék aminosavsorrendjének információja határozza meg, amit a DNS tartalmaz.
A RNS molekula, szerkezete, RNS-típusok és funkcióik Mindegyik RNS-molekula csak egyetlen polinukleotid-szálból épül fel (kivétel a vírusoknál található kétszálú). A felépítő pentóz a ribóz. Az RNS-molekulák nukleotidjai négyféle szerves bázist tartalmaznak: adenin, guanin, citozin, uracil. Az RNS-nek csak a vírusoknál van örökítő szerepe. Az RNS-molekulák biológiai működésük szerint csoportosíthatók. Legnagyobb mennyiségben (80%) a sejtben lejátszódó fehérjeszintézis helyein található riboszómák építőanyagai, a riboszómális vagy rrns-ek. Kisebb részük (15-20%) a megfelelő aminosavakat szállítja a fehérjeszintézis helyére, ezek a szállító- (transzfer) vagy trns molekulák. Kis százalékuk a fehérjeszintézisre vonatkozó információkat fordítja le a DNS-molekulákról, vagyis megszabja az aminosavsorrendet, ezek a hírvivő- (messenger) vagy mrns-molekulák. Ez a sejtmagban keletkezik, DNS mintaszál alapján, a sejtmaghártya pórusain keresztül kijut a citoplazmába és riboszómák kötődnek hozzá. Térszerkezetük igen változatos lehet: egy aminosavat szállító trns-molekula önmagával is képezhet bázispárokat. Genetikai kód A fehérjét kódoló génekben a bázisok sorrendje hordozza azt az információt, amely meghatározza a fehérje aminosav sorrendjét a fehérjeszintézis során. A fehérjeszintézis első lépéseként a DNS molekula megfelelő szakaszáról RNS másolat készül. A transzkripció meghatározott helyen kezdődik és egészen egy "stop" jelig halad. A genetikai információ lefordítása aminosavsorrenddé az érési folyamaton átment, tehát intronjaitól megszabadított mrns molekuláról történik a riboszómák felületén. Az írott nyelvvel összehasonlítva azt mondhatjuk, hogy az információ legkisebb eleme, a betű, a DNS egy-egy bázisának felel meg (A,C,T,G), a legkisebb értelmes egység, a szó, pedig három bázisból áll. A három, egymásután következő bázist együttesen kodonnak nevezik, egy kodon a fehérjét kódoló génben egy aminosavat kódol. A kodonok és aminosavak közötti megfeleltetés szabályait együttesen genetikai kódnak nevezzük. A genetikai kód univerzális, azaz szinte minden eukariota nukleáris gén és szinte minden prokariota gén azonos szabályok szerint hordozza az információt. Mivel összesen négyféle nukleotid van és egy kodon három nukleotidből áll, a
lehetséges kombinációk száma 4 3 = 64. Ez jóval több, mint az elsődleges aminosavak száma, egy aminosavat így több kodon is kódolhat. A lehetséges 64 tripletből összesen 61 triplet kódol aminosavat, ezeket értelmes kodonnak (sense codon) is nevezik, a maradék három nem értelmezhető és a transzlációs folyamat végét jelzik (nonsense vagy stop codon). A fehérjeszintézis kezdetét az AUG kodon jelzi, ami a metionin aminosavat határozza meg. A legtöbb eukarióta fehérje metioninnal kezdődik, amelyet a szintézis végeztével egy mechanizmus eltávolít. Az azonos aminosavat meghatározó kodonok (synonymous codons), többsége csak a triplet harmadik bázisában különböznek egymástól. Régebben génnek a DNS molekulának azt a szakaszát nevezték, amely egy fehérje aminosavsorrendjét kódolta. Az eredeti gén definíciót azért is módosítani kellett, mert az újabb kutatások alapján kiderült, hogy a DNS láncnak csak egy kis része kódol fehérjéket, más szakaszok egyéb funkciókat, pl. szabályozást láthatnak el. Ezeken kívül sok olyan DNS szakasz van, aminek a funkcióját, ha van egyáltalán, nem ismerjük. Mindezek következtében a régi egyszerű meghatározás "egy gén - egy fehérje" ma már nem elfogadható. Jelenleg háromféle gént különböztetünk meg: (1) proteint kódoló gének, amelyek átíródnak RNS molekulába és ezután fehérjébe, (2) RNS-t meghatározó gének, amelyek csak RNS-be íródnak át és (3) szabályozó gének. Az RNS saját molekulájának az önszerkesztését katalizálhatja. Ennek során a DNSbeli gén bázissorrendje alapján létrejövő (átíródó) előhírvivő RNS-ből (premrns-ből) aminosavakat kódoló szakaszokat (exonokat) elválasztó nem kódoló szakasz (intron) hasad ki, így az exonok egymáshoz csatlakozhatnak. A gének belső eltérései az intronok számában és hosszában vannak, az exonok hossza független a gének méretétől. Érdekes módon a nagy génekben kevesebb exon és sok igen nagy intron található.
A DNS megkettőződésének folyamata A DNS-molekula az élőlények öröklődő tulajdonságainak információhordozója. Az információ nemzedékről nemzedékre történő átadása feltételezi, hogy a DNS-molekuláról pontos másolat készül. Ez biztosítja ugyanis a biológiai információ lényegében változatlan megőrzését az utódnemzedékben. A DNS-molekula másolata a DNS-megkettőződés során jön létre. Sok enzim vesz részt ebben a folyamatban. 1, Fellazító enzimek a szuperhélixet széttekerik a H-kötések mentén. 2, A DNS két szálát szétcsavaró fehérjék távolítják el egymástól, a szabad DNS szálak mintaszálként szolgálnak. 3, A DNS-szintézis nem folyamatos, szakaszos, a teljes utódlánc rövid fragmentumok összekapcsolásával jön létre. 4, A replikáció RNS-szintézissel kezdődik, mert a DNS-polimeráz nem képes csupasz templátláncon megindítani a szintézist. 5, Az RNS-polimerázok felismerik a DNS-en a replikáció kezdőpontjait és ribonukleozidtrifoszfátokból a templátlánccal komplementer rövid indító RNS-t (RNS-primer) szintetizálnak. 6, A DNS-polimeráz az indító RNS-hez köti az első dezoxiribonukleotidot foszfátészterkötéssel, majd a szintézist addig folytatja, amíg a következő indítópontig nem ér, így jönnek létre az Okazaki-fragmentumok. 7, Az új nukleotidláncok szintézise 5'-től 3' irányba történik (antiparallelitás törvénye). 8, A feleslegessé vált indító RNS-eket ribonukleáz enzim távolítja el, az így keletkezett részeket a DNS-polimeráz tölti ki. 9, Az Okazaki-fragmentumokat a DNS-ligáz köti össze foszfátészterkötés
10, Az utódmolekulák szétválnak és DNS-giráz segítségével szuperspiralizált formába kerülnek. A folyamat végén a két újonnan keletkezett DNS-molekula egyik nukleotidszála az eredeti DNS-molekulából való, míg az újonnan képződött ennek kiegészítő másolata - a két DNS-molekula teljesen megegyezik. A szintézis a prokarióta baktériumoknál általában egy ponton, az eukarióta sejtekben akár 5-6000 ponton is megindulhat, így mindössze pár percet vesz igénybe. A DNS-molekula nagyon törékeny, mégis több milliószor is megkettőződhet hiba nélkül, mivel különböző javító mechanizmusok (enzimek) gondoskodnak a DNS információtartalmának megőrzéséről. A leggyakoribb hiba a timindimerek kialakulása. A javító enzim a hibás részletet kihasítja, majd ezt a részt a megfelelő építőegységekből újra szintetizálja. DNS olvadás A DNS hasítására képes restrikciós enzimek használatával feldarabolják az élőlényekből kivont DNS-t néhány száz bázispár hosszú darabokra. Ha ezt az oldatot felmelegítik, akkor egy hőmérséklet fölött (80-90 Celsius-fok) a kettős DNS-szálat összetartó hidrogénkötések felbomlanak és egyszálú DNS keletkezik. Minél több a DNS-ben a G-C bázispár annál magasabb hőmérsékleten (H-híd kötések miatt) következik be a DNS szálak szétválása.
DNS szekvenálás Az emberi DNS közel 2 000 000 000 nukleotid hosszúságú. Ezeknek a sorrendjének a meghatározása többféleképpen történhet: