A BIOTECHNOLÓGIAI MÛSZAKI HÁTTERE A fermentálás fejlesztése a nagyipari termelés irányába Tárgyszavak: fermentáció; vegyipar; méretnövelés; termékkinyerés; biomassza; fejlesztés. A fenntartható fejlődés és lehetőleg megújuló erőforrások használata jegyében a fermentálással előállítható termékek listájára a hagyományos kistételű, nagy értékű készítmények mellé felkerültek a tömegesen, jelenleg szintetikus úton gyártott alapvegyszerek is. A tradicionális vegyi nagyipar technológiáival azonban ez az irányzat csak a maximális hatékonyság, ugyanakkor minimális költség és hulladékképződés feltételeivel versenyezhet. Ezeket a célokat pedig csak a fermentálásnak és az utólagos termékszeparálásnak mint egyetlen integrált folyamatnak a megtervezésével lehet elérni. A ma szokásos, sokszor összehangolatlan gyártástervezésnek az az eredménye, hogy az összköltségnek aránytalanul nagy részét emészti fel a termék tisztítása és izolálása. Megtakarítás méretnöveléssel A biológiai folyamatok termékeinek elkülönítése nemcsak a termék sejten belüli vagy kívüli elhelyezkedésétől, molekulaméretétől, oldékonyságától és töltésétől, hanem a folyamat méretétől és a termék értékétől is függ. Pl. a kromatográfia mint kiválasztás jó eredménnyel használható hormonokra, antitestekre vagy enzimekre, de alapvegyszerekre túl drága és méretnövelésre sem alkalmas. A végtermék kinyerésének mai költségaránya igen széles határok közt: az extracelluláris enzimek 5 10%-ától a biológiailag lebontható műanyagként használt poli(3-hidroxi-alkanoát)ok bakteriális termelésének 90%-áig terjed (1. táblázat). Ez a nagy költség a csekély termékkoncentrációnak, a fermentlé számos komponensének (különösen a roncsolt sejtekből kiszabaduló intracelluláris anyagoknak), valamint az egymást követő nagy veszteséggel járó tisztítási lépéseknek
tulajdonítható. A kinyerés költsége nagymértékben változik a termék kívánt tisztasági fokától függően is, amely terápiás és diagnosztikai fehérjék esetében 99,999%-os. 1. táblázat Fermentálási folyamatok végtermékeinek kinyerési és tisztítási költsége az előállítás összköltségének %-ában Kiindulási anyag Termék A kinyerés költségének százaléka a termelési költségből Élesztősejt-biomassza Alapvegyszerek Extracelluláris enzimek Antibiotikumok Intracelluláris enzimek/fehérjék egysejtfehérje, élesztőkivonat tejsav, citromsav, maleinsav amilázok, proteázok penicillin humán inzulin, interferon 5 10 50 10 20 50 90 Az elérhető mérettakarékossággal összefüggésben a termék eladási ára fordítva arányos a fermentlében a folyamat végén beálló koncentrációjával, amely 9 10 nagyságrenddel változhat (1. ábra). 10 3 nagytételű vegyszerek/biomassza a kiindulási anyag koncentrációja, g/l 10-1 10-7 antibiotikumok nagytételű enzimek kutatási/diagnosztikai enzimek gyógyászati enzimek 10-2 10-1 10 7 10 9 eladási ár, USD/kg 1. ábra Gazdaságosság méretnöveléssel: összefüggés az elérhető termékkoncentráció és az eladási ár között
Nagyméretű erjesztőtechnológiák fejlesztése A nagyipari méretben alkalmazható fermentálás kifejlesztésének lépései: 1. az erjesztő organizmus kiválasztása, tekintettel a melléktermékek képződésére, szubsztrátumainak sokféleségére, az organizmus robusztusságára (változástűrésére), életképességére (a sejt visszaforgathatóságára), fiziológiai jellemzőire (maximális szaporodási sebesség, levegőztetési igények stb.) és genetikai hozzáférhetőségére; 2. anyagcsere- és sejtmódosítás: a szervezet meglevő tulajdonságainak megjavítására, új funkciók bevitelére, pl. a termékkinyerés növelésére, a szubsztrátum- és termékskála bővítésére, valamint a nem szokásos körülmények közötti fermentálás céljából; 3. a fermentálási folyamat fejlesztése: a tenyésztés és a tápközeg optimálása (komplex helyett minimál táptalaj használatával), a termék kinyerését és tisztítását befolyásoló tenyésztési paraméterek optimálása (minimális melléktermék-képződés és vegyszerbevitel, valamint nagy sejtsűrűségű tenyészthetőség érdekében), a sejtretenció és visszaforgatás fokozására; 4. utóműveletek bevitele a fermentálás folyamatába pl. extraktív fermentálás, elektrodialízis vagy in-line membrános szétválasztó technikák segítségével. A fermentálásba való integrálás lehetőségei A beépítést több oldalról lehet megközelíteni: 1. A tápoldat egyszerűsítése azon alapszik, hogy elvben nincs szükség egyetlen olyan adalékra sem, amely nem jelenik meg a végtermékben. Pl. gazdag és olcsó nitrogénforrásként az erjesztéshez gyakori élesztőkivonat és a kukorica nedves őrlési szennyvizének használata. Ehelyett sókból és vitaminokból, bár jelentős fejlesztő munkával, érdemes táptalajt összeállítani, mivel így némileg csökkent hozam árán lényegesen kevesebb az elválasztási utómunka. 2. Olykor a termékforma megváltoztatása is megkönnyítheti az elkülönítést, pl. a szerves savak sokkal egyszerűbben nyerhetők ki, mint a sók. Ha a fermentálás és a szeparálás a szokásos módon külön zajlik, ak-
kor az utóbbinál savanyítani, majd semlegesíteni kell, ami nagy menynyiségű (és hulladékként kezelendő) só képződésével jár. Mindez elkerülhető a tápoldat ph-jának beállításával, eleve olyan alacsonyra, hogy a terméknek túlnyomórészt szabad savformája keletkezzék A savas közegű gyengébb fermentációs teljesítményt kiegyenlíti az elmaradt vegyszer- és sólerakási költség. 3. A tápoldat komponenseinek ismételt felhasználása jelentős haszonnal jár, jóllehet a sejtek visszanyerése tisztán és a stressztől megkímélt, változatlan életképességükben nem egyszerű műszaki feladat, de ha ez nem sikerül is, a visszatáplált biomassza az aktív sejtek táplálékforrása lehet, és a sejtkoncentráció növelése a gazdasági eredményt is javítja. 4. A termék többnyire gátló hatással van a fermentációs reakciókra, tehát eltávolítása a folyamat közben szintén fokozza a biomassza hozamát. Ehhez mellékáramban kell kivezetni, majd visszajuttatni folyamatosan a fermentlevet. Kialakítható kétfázisú fermentálás is a termék kivonásával a biomasszát tartalmazó vizes fázisból és betáplálásával a szerves fázisba, ahonnan on-line kinyerhető. 5. A fermentációs táptalajnak mintegy 90%-a víz. A nehezen kezelhető nagy víztérfogatot jótékonyan csökkenti az ún. nagy sejtsűrűségű technológia (high-cell-density = HCD fermentation). Ehhez géntechnikai módosítással létre kell hozni nagy termékkoncentrációt tűrő élesztőtörzset és el kell távolítani a bioreaktorból az egyéb gátló komponenseket. A fermentálás lépéseit összevonó technológiák példái tejsavgyártás A tejsav a vegyi nagyipar terméke, gyógyszer-, élelmiszer- és polimeralapanyag, amelyet általában növényi dextrózból bakteriális, gombás vagy élesztőgombás erjesztéssel állítanak elő. A tejsavalapú polimerek (polylactic acid-based, PLA-polymer) gyártása ökológiailag fenntartható folyamat, amely a petrolkémiai alapú műanyagok gyártásához szükséges kőolajnak ugyanazon mennyiségéből fűtőanyagként használva 20 50%-kal több PLA-t termel, emellett a PLA-bázisú műanyagban levő növényi szénhidrátból származó szén fotoszintézis útján jött létre szén-dioxidból, ami csökkenti a nettó CO 2 -kibocsátást. Szakemberek a PLA majdani milliárd dolláros gyártásában és forgalmában bíznak, de olcsó és tiszta tejsav ilyen tömegtermeléséhez még néhány problémát meg kell oldani. Először is egyszerű zavaró hatásokra nem kényes és nagy hozamú, lehetőleg melléktermék képződése nélküli eljárást kellene kifejleszteni, mivel az alapanyagként használt cukor a tejsavtermelés költségének több mint 50%-át igényli.
A legtöbb fermentálás végterméke nátrium- vagy kalcium-laktát (NaLa, CaLa), mivel a folyamat ph-ját a sav disszociációs állandójánál ( 3,8) magasabb (lúgosabb) értéken kell tartani. A nem disszociált tejsav az ezt követő savanyítás hatására képződik. Ehhez kénsavat, savas ioncserélő gyantát vagy CO 2 trietil-amin-kezelést használnak, elkerülendő nagy mennyiségű szulfát leválását. A tejsavat töményíteni lehet etanolos észterezéssel és ezt követő desztillálással, majd hidrolízissel, közvetlen lepárlással vagy folyadék/folyadék-extrahálással. Egyes baktériumok mint biokatalizátorok segítségével közvetlenül, nagy hozammal lehet tejsavat előállítani (ugyanis a cukor C-atomjainak több mint 90%-a tejsav-c-vé alakul át); a térfogatra számított hozam pedig 0,1 10 g/l h. A biokatalizátorból csupán 5 g/literre van szükség. A termentációs tejsavtermelés integráló fejlesztésének lehetőségei, ill. már elért eredményei: só melléktermékek képződésének megakadályozása a sók regenerálásával és alacsony ph-jú tejsavtechnológiák kidolgozásával, definiált összetételű fermentációs tápoldatok és különféle kiinduló szubsztrátumok használatával. Nagy sejtsűrűségű (HCD) sütőélesztő előállítása A HCD-fermentálás jellemző, száraz anyagra számított sejtkoncentrációja 100 g/l (szemben az általános 5 20 g/literrel). Az alapanyagra számított fehérjemennyiség és a fajlagos termelékenység két-három nagyságrenddel a vegyipari szintéziseké alatt marad. A HCD-fermentálást sütőélesztő és rekombináns humán szérumalbumin (rhsa) gyártására fejlesztették ki, közönséges élesztő (Saccharomyces cerevisiae) segítségével. Ebben az eljárásban a fermentációs közeg térfogatának több mint 25%-át foglalja el a sejtbiomassza, ami fehérje termelésekor azért okoz nehézséget, mert hajlamos azt vízzel együtt adszorptive megkötni. Ennek elkerülésére a fejlesztők megpróbálják a közeget optimálni a C-forrás megválasztásával, pontosan összeállított táptalajjal, habzásgátlással. Tekintettel a termelt biomassza nagy mennyiségére, ügyelni kell az oxigénbevitelre és a hőátvitelre (a hűtéshez). A mindenből a kellő mennyiséget és nem többet tartalmazó HCD-közegben feltétlenül kerülni kell a tápanyagfölösleget
mérgezés és ozmózisos jelenségek kiküszöbölésére, költségcsökkentés, extracelluláris fehérjék könnyebb eltávolítása és kevesebb szennyvíz képződése céljából. A világ sütőélesztő-termelése évi 2500 E t és ennek minden tonnájához 15 m 3 ivóvízminőségű vízre van szükség. Gazdasági és ökológiai szempontból egyaránt fontos, sőt kiemelten sürgős volna tehát olyan fermentálás kidolgozása, amellyel utólagos gondozás nélkül élelmiszer-tisztaságú sütőélesztőt lehetne végtermékként nyerni. Rekombináns humán albumin előállítása Az emberi vesében bőségesen (40 g/l) található rha-t több g-os adagokban használják sokk és égés kezelésére, valamint vérveszteség pótlására. Az évi 400 000 kg-os fogyasztás, az 5 g/literes termékkoncentráció és a 80% utókezeléses kinyerés alapján világviszonylatban évente mintegy ezer 100 m 3 -es HCD-fermentálással lehet számolni. A feladat itt expressziós rendszerek kifejlesztése a fehérje HCD-feltételű termeléséhez, a tisztítási követelmények minimalizálásával. A fermentálás fejlesztésének nehézségei kritikai megjegyzések Az élesztő-biomassza HCD-termelése aerob körülményeket igényel. Ezért tekintettel az oxigén gyenge vízoldhatóságára és a nagyméretű fermentorokban az oxigéntranszfer és a hűtőkapacitás korlátozottságára az aerob körülmények fenntartása érdekében szabályozni kell a biomassza szaporodásának ütemét a szénhidrát szubsztrátum adagolásával. A kis szaporodási sebesség mellett azonban az élesztő, egyszerűen energiaforrásként használva, elégeti szén-dioxiddá a cukor nagy részét, ami általános megfigyelés fehérje- és biomasszatermelő organizmusoknál. A sütőélesztő esetében a csekély növekedési ütem gyenge kelesztőképességgel jár együtt, a fejlesztésnek tehát e képesség javítására kell irányulnia alacsony növekedési ráta mellett. A fehérjetermelés meghatározó mutatója a szakirodalomban ritkán közölt fajlagos termelési ütem, amely 0,5 és 2,5 mg/g h között változik (0,1 h -1 növekedési ütemnél) és a teljes sejttermelésnek általában kevesebb, mint 10%- át képezi. Fontos volna tisztázni az összefüggést a tenyészet növekedési üteme és a fajlagos fehérjetermelési ráta között. Ennek ismeretében tovább lehetne op-
timálni a fehérjeexpressziós rendszert, többek között annak stabilitása (több generáción át), markerválasztás és az expresszió feltételei szempontjából (2. ábra). 150 0,4 szakaszos termelés szakaszos adagolás biomassza-koncentráció, g/l 125 0,3 100 75 0,2 50 0,1 szubsztrátumbetáplálás, l/h szaporodási sebesség, 1/h 25 0 0,0 0 12 24 36 48 idő, h 2. ábra A sütőélesztő-termelés mutatóinak időbeli alakulása (Dr. Boros Tiborné) Hoek, P.; Aristidou, A.: Fermentation goes large-scale. = Chemical Engineering Progress, 99. k. 1. sz. 2003. p. 375 425. Williams, J. A.: Keys to bioreactor selection. = Chemical Engineering Progress, 98. k. 3. sz. 2002. p. 34 41. EGYÉB IRODALOM Patwardhan, A. W.: Rotating biological contactors; a review. (Forgó biológiai érintkeztető: áttekintés.) = Industrial and Engineering Chemistry Research, 42. k. 10. sz. 2003. máj. 14. p. 2035 2051. Bühler, B.; Bolldhalder, I. stb.: Chemical biotechnology for the specific oxyfunctionalization of hydrocarbons on a technical scale. (Kémiai biotechnológia szénhidrogének ipari méretű oxifunkcionalizálására.) = Biotechnology and Bioengineering, 82. k. 7. sz. 2003. ápr. p. 833 842.