Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Környezettudományi Centrum Anaerob fermentált szennyvíziszap biokémiai jellemzése enzimaktivitás vizsgálatokkal Készítette: Vaszkó Virág Környezettudomány szakos hallgató Témavezetı: Kardos Levente tanársegéd Budapesti Corvinus Egyetem Kertészettudományi Kar Talajtan és Vízgazdálkodás Tanszék Belsı konzulens: Dr. Barkács Katalin adjunktus Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Analitikai Kémiai Tanszék 2009. június 19.
Problémafelvetés, célkitőzés Fosszilis energiahordozók (kıszén, kıolaj, földgáz) használata ma még meghatározók az energiaellátásban Hatásaik veszélyesek a földi környezetre: CO 2 üvegházhatás globális éghajlatváltozás SO 2 savas esık kıolaj szállításkor olajszennyezés Környezetkímélı megoldás megújuló energiaforrások (vízenergia, napenergia, ár-apály, geotermikus energia, biogáz, biomassza, szélenergia) használata A biogáz energiatartalma nagy, így az energiaválságban kitőnıen alkalmazható elektromos és hıenergiaként Anaerob rothasztás folyamatának vizsgálata enzimaktivitás mérésekkel 2009.06.19. 2
A biogáz és képzıdése Szerves anyagok baktériumok által történı anaerob rothasztása során keletkezik. Összetétele: metán (~70 %), szén-dioxid (~30 %), kénhidrogén (H 2 S), ammónia (NH 3 ) és egyéb gázok Biogáz elıállítható: kommunális hulladékból, szennyvíziszapból, mezıgazdasági termékekbıl (növényi, állati), élelmiszeripari melléktermékekbıl. A biogáz felhasználása: meleg víz, generátor elektromos energia, hıforrás (közvetlen elégetés gázkazánokban), motorüzemanyag (CO 2 eltávolítása után). Szennyvíziszap anaerob fermentációjából nagy mennyiségő biogáz nyerhetı szennyvíztelepek helybeni és lakossági energiaellátás 2009.06.19. 3
A lebontást meghatározó legfontosabb tényezık Szubsztrát összetétel Szubsztrát terhelés Hımérséklet (mezofil: ~ 35ºC, termofil: ~ 55ºC) Oltóanyagban lévı mikroorganizmusok faja, száma Toxikus anyagok Üzemeltetési körülmények (tartózkodási idı, keveredés, tartály kialakítás) 2009.06.19. 4
Az anaerob lebontás 3 lépcsıre bontható: 1. lépcsı: a hidrolízis a savtermelı baktériumok extracelluláris enzimjei végzik (vízoldható vegyületek keletkeznek) 2. lépcsı: acidogenezis folyamata - a hidrolízis végtermékei ecetsavvá és nagyobb molekulatömegő zsírsavakká alakulnak (ecetsav (CH 3 COOH), propionsav (C 2 H 5 COOH), tejsav (C 3 H 6 O 3 ), vajsav (C 3 H 7 COOH), CO 2, H 2, stb. képzıdik acetogenezis folyamata - az elızı lépések intermedierjei (propionsav, vajsav stb.) ecetsavvá alakulnak 3. lépcsı: metánképzıdés folyamata - elızı folyamatok köztitermékeibıl, metanogén baktériumok által metán (CH 4 ) és szén-dioxid (CO 2 ) Az iszaprothasztás gyakorlatában kevert reaktorokat alkalmaznak 2009.06.19. 5
Az anaerob lebontás vázlata szénhidrátok Nyers iszap proteinek zsírok monoszacharidok peptidek,aminosavak glicerin, zsírsavak propionsav, vajsav, alkoholok, stb. Baktériumszintézis Baktériumszintézis H 2, CO 2, ecetsav H 2, CO 2, ecetsav NH 4+, H 2 S, stb. Biogáz ~70% CH 4, ~30% CO 2 Baktériumszintézis 2009.06.19. 6
Szennyvíztelepi vizsgálatok A folyamatokat ellenırzı paraméterekkel és enzimaktivitás vizsgálatokkal lehet nyomon követni: Klasszikus ellenırzı paraméterek: száraz- és szerves anyag (MSZ 318/3-79), ph (MSZ 318/4-79), illósav (Standard Methods 16th Edition,1985.), lúgosság (Standard Methods 16th Edition,1985.), gázösszetétel (MSZ 5313 57). Enzimaktivitás mérések: dehidrogenáz (MSZ-08-1721/3-86), proteáz (Thiel, P.G. és Hattingh W.H.J, 1967.), lipáz (Vorderwülbecke, T. et al., 1992.), celluláz (Hofmann, 1955.). 2009.06.19. 7
Üzemi anaerob fermentorok (FCSM Zrt. Délpesti Szennyvíztisztító Telep) 2009.06.19. 8
A szennyvíztelepen alkalmazott enzimaktivitás vizsgálatok Dehidrogenáz enzimaktivitás meghatározása A dehidrogenáz aktivitás összaktivitás jellemzı paraméter, a hidrogén átvitelét katalizálja a redukált hidrogén donorról az oxidált hidrogén akceptor szubsztrátra. Mesterséges hidrogén akceptor: 2,3,5-trifenil-tetrazóliumklorid (TTC) az enzim által katalizált folyamat eredményeképpen vörös színő trifenil-formazánná (TF) redukálódik mennyisége a színreakció után spektrofotometriásan mérhetı. A mérés elve: rothasztott szennyvíziszap + telített NaHCO 3 (puffer) + TTC-oldat (szubsztrát) inkubálás 1 órán keresztül 37 ºC-on a biokémiai folyamat leállítása etanollal szőrés abszorbancia mérése 485 nm-en etanollal szemben. 2009.06.19. 9
Dehidrogenáz enzimaktivitás mérése során alkalmazott változtatások Mérések során változtatott paraméterek: Iszapminta térfogata: 0,5, 1,0, 2,0 ml (szárazanyag-tartalom: ~30-50 g/kg) Inkubálás hımérséklete: szobahımérséklet, 37, 45 és 55 ºC Mérési eredmények: Iszaptérfogat: 1,0 ml Ideális inkubálási hımérséklet: 37 ºC az inkubálás hımérséklete függ az anaerob rothasztás körülményeitıl (mezofil vagy termofil) Kevésbé volt érzékeny a mérési körülmények változtatására. 2009.06.19. 10
A Formazán-koncentráció változása mg For rmazán/g sz.a.i iszap*h 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 Hımérséklet 2009.06.19. 11
A szennyvíztelepen alkalmazott enzimaktivitás vizsgálatok Proteáz enzimaktivitás meghatározása A proteázok a fehérjékben található peptidkötések hidrolízise révén bontják le a fehérjéket kisebb peptidekre, majd aminosavakra. A mérés elve: rothasztott szennyvíziszap + kazein-oldat (szubsztrát) minták: 1/3 rész iszapminta + 1/3 rész szubsztrát + 1/3 rész desztillált víz inkubálás 1 órán kersztül szobahımérsékleten reakció leállítása triklórecetsavval szőrés lúgosítás szőrés hígított Folin-reagens hozzáadása után abszorbancia mérése 660 nm-en a vak mintával szemben (kék színő oldat) 2009.06.19. 12
Proteáz enzimaktivitás mérése során alkalmazott változtatások Mérések során változtatott paraméterek: Iszapminta térfogata: elıször 1,0, 2,0 és 4,0 ml, késıbb 0,5, 1,0 és 2,0 ml, végül csak 1,0 és 2,0 ml Inkubálás hımérséklete: szobahımérsékletrıl 37 ºC-ra Inkubálás leállítása triklórecetsavval: 10 %-os helyett 15 és 20 %-os alkalmazása Töményebb NaOH-oldat: 0,5 M helyett 1,0, 1,5 és 2,0 M- os oldatok Szőrés: vákuumszőrés (pórusátmérı: 0,45 µm) Folin-reagens hozzáadásával kialakuló kék szín idıfüggése 2009.06.19. 13
Mérési eredmények Mintatérfogatok: 1,0 és 2,0 ml megbízhatóbb adatok Ideális inkubálási hımérséklet: 37 ºC nagyobb biológiai aktivitás, azaz nagyobb enzimaktivitás értékek A reakció leállításához 15 %-os triklórecetsav-oldat Lúgosításhoz 1,0 M-os NaOH-oldat Folin-reagens hozzáadása után 15 perc várakozás a kialakuló kék szín stabilizálódásához 2009.06.19. 14
Folin-reagens idıbeli stabilitásának kialakulása Minta Abszorbancia 0 5 perc 10 perc 15perc 25perc 30perc 35perc vak1 0,621 0,641 0,648 0,643 0,641 0,639 0,642 vak2 0,686 0,724 0,740 0,728 0,728 0,727 0,725 1 0,793 0,796 0,802 0,798 0,790 0,785 0,783 2 0,712 0,711 0,714 0,706 0,700 0,695 0,693 3 0,770 0,774 0,774 0,771 0,771 0,763 0,759 2009.06.19. 15
Összefoglalás Dehidrogenáz: viszonylag homogén eredmények Proteáz: különbözı mintákban eltérı eredmények, a reakciók érzékenyen reagáltak a változtatott paraméterekre további elemzések szükségesek Laboratóriumban és üzemi gyakorlatban egyaránt fontos a mérési módszerek további fejlesztése, egyszerősítése, tökéletesítése (dehidrogenáz, proteáz, celluláz, lipáz) 2009.06.19. 16
Köszönöm a figyelmet! 2009.06.19. 17