Tienamicin-analóg 2-izoxacefémvázas vegyületek sztereoszelektív szintézise

Ph.D. Értekezés Tienamicin-analóg 2-izoxacefémvázas vegyületek sztereoszelektív szintézise Készítette: Sánta Zsuzsanna Témavezető: Dr. yitrai József egyetemi tanár Készült a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Szerves Kémia Tanszékén 2006

Köszönetnyilvánítás Köszönöm témavezetőmnek, Dr. yitrai Józsefnek lelkiismeretes témavezetését, mindenre kiterjedő figyelmét, támogatását. álás köszönettel tartozom laboránsunknak, Gerberi Juliannának (Julcsinak), aki a munkámhoz szükséges technikai feltételeket fáradhatatlanul megteremtette és anyai gondoskodásával mindenben segítségemre volt. Köszönöm Dr. uszthy Péter és Dr. ovák Lajos tanszékvezetőknek, hogy a tanszéken töltött éveim alatt mindvégig támogattak. Szeretettel gondolok Dr. agy Józsefre, akinek sok, rendkívül érdekes szakmai- és magánbeszélgetést köszönhetek. Köszönöm a BME Szerves Kémia Tanszék minden dolgozójának, különösen a Műteremben és annak közelében dolgozóknak, hogy tanszéki éveimet végig meleg, baráti közegben tölthettem el és azt, hogy tanácsaikra és segítségükre mindig számíthattam. Köszönöm Ófalvi Katalinnak az I felvételek elkészítését, Dr. Kolonits Pálnak, Dr. Szöllőssy Áronnak, valamint Kiss Erzsébetnek az M felvételek elkészítését és az azok kiértékeléséhez nyújtott segítséget; hálás vagyok Peltz Csabának (EGIS), Dr. áda Viktornak (ichter), Dr. Parlagh Gyulának és Makó Attilának az MS mérések elkészítéséért, Medzihradszky Schweiger edvignek (ELTE) a mikroanalitikai mérésekért és Dr. Párkányi Lászlónak (KKKI) a röntgenkrisztallográfiai vizsgálatokért. Köszönöm Dr. Klaus Thirring (ovartis/abriva Therapeutics/Vienna) és Jean-Marc Paris (Laboratoire Biochimie École ationale Superieure de Chimie de Paris) készséges segítségét abban, hogy az előállított molekulákat antibakteriális és β-laktamázgátló hatásra tesztelték. Kutatásomhoz anyagi támogatást kaptam, ezért köszönettel tartozom az TKA-nak (T 14200, T 37875), a Varga József Alapítványnak, a ichter Gedeon Zrt.-nek, a Magyar Mérnökakadémia ubik Alapítványnak és a Vegyészmérnöki Kar Doktori Tanácsának, amelyek ösztöndíjjal segítették munkámat, valamint vegyszer- és eszközbeszerzéseimet, konferencia-részvételemet támogatták. 2

TATALMJEGYZÉK övidítések jegyzéke...5 1. Bevezetés...6 2. Célkitűzés...13 3. Irodalmi áttekintés...14 3.1. A β-laktámváz felépítési lehetőségei...14 3.2. Módszerek 2-izoxacefémváz előállítására...14 3.2.1. DYLE-féle első szintézis...14 3.2.2. Diazoészter-beékelődéses eljárás...16 3.2.3. Dioxoészteres eljárás...17 3.2.4. Alkilezésen alapuló eljárás...18 3.3. 3-(1-idroxietil)-4-(hidroximetil)azetidin-2-on monociklusos β-laktám intermedierek szintézisekvivalenseinek előállítása...18 3.3.1. Szubsztituálatlan β-laktámból kiindulva...19 3.3.2. 3-idroxivajsav-észterből...19 3.3.3. Diketén és imin addíciójával...20 3.3.4. β-enaminoketoészterből...20 3.3.5. Treoninból...21 3.3.5.1. Epoxidon keresztül...21 3.3.5.2. Sheehan-Bose szintézis alapján...22 3.3.5.3. Közvetlen előzmények...24 4. Elméleti rész...26 4.1. etroszintézis...26 4.2. Monociklusos β-laktám intermedierek előállítása...28 4.3. Transz-2-izoxacefémvázas molekulák előállítása...36 4.4. Cisz-2-izoxacefémvázas molekulák előállítása...39 4.5. Biológiai vizsgálatok...49 4.6. Benzil-(2,3-dioxobutirát) szerkezete...50 5. Kísérleti rész...54 3

5.1. A 4.2. fejezethez tartozó kísérletek...54 5.2. A 4.3. fejezethez tartozó kísérletek...58 5.3. A 4.4. fejezethez tartozó kísérletek...59 5.4. A 4.6. fejezethez tartozó kísérleti adatok...61 6. Összefoglalás...63 Vonatkozó publikációk...65 Irodalomjegyzék...66 4

övidítések jegyzéke Ala all Bn CA DBU DCC DEAD DIBAL DMB EtAc MPT LA LDA Ms BA PMS PTC PTSA TF alanin allil benzil cérium-ammónium-nitrát 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-én diciklohexilkarbodiimid dietil-azodikarboxilát diizobutil-alumínium-hidrid 2,4-dimetoxibenzil etil-acetát hexametil-foszforsav-triamid lítium-alumínium-hidrid lítium-diizopropilamid mezil (3-nitrobenzil)-alkohol para-metoxifenil foszformolibdénsav fázistranszfer-katalízis para-toluolszulfonsav tetrahidrofurán 5

1. Bevezetés A baktériumok okozta betegségek elleni küzdelem egészen a XX. század első harmadáig reménytelennek tűnt; TBC, szifilisz, műtétek utáni fertőzések következtében rengeteg ember vesztette életét. Az első világháború alatt igazán égetővé vált az a probléma, hogy nem állt az orvosok rendelkezésére hatékony antibakteriális szer. Az akkoriban használt antiszeptikumok a szöveti sejtekre éppen annyira toxikusak voltak, mint a baktériumsejtekre. Szerencsés véletlennek köszönhető, hogy 1929-ben, az ekkoriban éppen antiszeptikumok vizsgálatával foglalkozó FLEMIG Staphylococcus tenyészetei Penicillium notatum gombafertőzés hatására elpusztultak. FLEMIG feltételezte, hogy a gomba egyik anyagcsereterméke okozta a baktériumok pusztulását. Az általa penicillinnek nevezett anyagról kimutatta, hogy nem toxikus, és sok Gram-pozitív baktérium ellen hatásos. A felfedezés keltette kezdeti lelkesedés azonban gyorsan alábbhagyott, mivel az anyag elég bomlékonynak bizonyult, előállítása és tisztítása nehézségekbe ütközött. Amikor a 30-as években megjelentek a szulfonamidok szisztémás hatású kemoterapeutikumok, a penicillin lényegében feledésbe merült. 1938-ban FLEY és CAI vezetésével szisztematikus kutatás kezdődött a természetes antibakteriális anyagok kémiai és biológiai természetének felderítésére. A penicillinnel kapcsolatos kutatásokat meggyorsította az a felismerés, hogy nem csak lokális, hanem szisztémás alkalmazása is lehetséges rendkívül kicsi toxicitása miatt, valamint, hogy a Staphylococcus-ok okozta, szulfonamidokkal nem kezelhető esetekben is hatásos. 1 A kutatások később párhuzamosan folytak Angliában és az Egyesült Államokban, teljes titoktartás mellett. A vizsgálatok során kiderült, hogy a két kutatócsoport által vizsgált anyag ugyan hasonló, de nem ugyanaz. A molekula szerkezetét illetően heves tudományos viták alakultak ki, az akkoriban forradalmian újnak számító β-laktámvázas szerkezetet végül minden kétséget kizáróan röntgenkrisztallográfiai mérésekkel sikerült bizonyítani (CWFT-DGKI). A penicillinek az alábbi általános szerkezettel jellemezhetőek (1), az eltérő penicillineket betűkkel különböztették meg: 2 6

C 6 1 5 4 S 1 2 3 C = C 6 5 C 2 (G) C 3 C 2 C=CC 2 (F) atásuk a baktériumok peptidoglikán sejtfalának felépítésének gátlásán alapszik. Feltehetőleg a sejtfal peptidláncainak D-Ala-D-Ala részleteivel mutatott szerkezeti hasonlóság a hatás alapja, a molekulát szubsztrátjának ismeri fel a sejtfal szintézisében résztvevő transzpeptidáz enzim. Szelektív toxicitásuk annak köszönhető, hogy a magasabbrendű állatok szervezetében (így az emberekében) nincs a baktériumok sejtfalához hasonló struktúra. Egyes személyeknél azonban allergiás válaszreakciót válthatnak ki. A penicillinek izolálásáért, és terápiás alkalmazásának kidolgozásáért FLEY, CAI és FLEMIG 1945-ben orvosi obel-díjat kapott. Fermentációs ipari előállításukat a háború alatt fejlesztették ki és kezdték el. A 6-aminopenicillánsav (6-APS, 2) izolálása (1959), 3 majd ennek a penicillin hidrolízisével történő előállítása lehetővé tette félszintetikus származékok szintézisét és alkalmazását a 60-as évektől kezdve. A 6-APS acilezésével kevésbé savérzékeny és jobb terápiás hatást mutató származékokat állítottak elő (így elérhető a hatásspektrum kiszélesítése a Gram-negatív baktériumokra is), melyek a természetes penicillineket háttérbe szorították. Ilyen félszintetikus származék többek között az ampicillin (3), az amoxicillin (4). 4 2 2 S C 2 C 3 S C 2 C 4 S C

Már az 1940-es években, a penicillin kutatása közben észlelték egyes baktériumtörzsek rezisztenciáját, ill. hogy szelekciós nyomás hatására az eredetileg szenzitív törzsek rezisztenssé váltak. Szemléletes példája a jelenségnek a Staphylococcus aureus: 1941-ben a törzsek 1%-a, 1946-ban 14%-a, 1947-ben 38%-a volt rezisztens penicillinre, a 80-as évekre azonban a rezisztens törzsek aránya meghaladta a 80%-ot. A rezisztenssé válás több okra vezethető vissza. Egyrészt a sejtfal megváltozhat úgy, hogy a molekula bejutása a sejtbe megnehezül. Ez a mechanizmus főleg a Gram-negatív baktériumokra jellemző. Másrészt a sejtfalszintézisben résztvevő, a penicillin által gátolt ún. PBP (penicillin binding protein = penicillinkötő fehérje) változhat meg úgy, hogy csökken az antibiotikum affinitása az enzimhez. Gyakorlati szempontból azonban a legfontosabb eset az, amikor a rezisztencia egy hidroláz enzim (β-laktamáz) jelenlétével függ össze, amely a β-laktám kötést bontja, ezáltal inaktiválja a molekulát, mielőtt az a hatás helyére érkezhetne. A β-laktamáz enzimek genetikai kódját a baktériumokban gyakran plazmidok hordozzák, melyek rendkívül mobilis genetikai elemek lévén a rezisztenciának egyik törzsről a másikra való gyors terjedését okozhatják. A rezisztencia különösen klinikai törzsek esetében okoz gondot, melyek az egy-egy kórházban általánosan alkalmazott antibiotikumoknak akár mindegyikére rezisztensek lehetnek. Legyengült, csökkent védekezőképességű betegek kórházi felülfertőződésének kezelése olykor nagy nehézségeket okozhat. 5 Az antibiotikumok kutatása során újabb és újabb, a penicillintől eltérő szerkezetű β-laktámvázas vegyületet izoláltak. Így fedezték fel a cefalosporinokat * (5), a karbapenémeket (6a), a monociklusos β-laktámokat (nokardicinek, 7a), és a szintén monociklusos monobaktámokat (7b). Az utóbbiak képviselőit a korábbi β-laktám antibiotikumokkal szemben nem gombák, hanem baktériumok anyagcseretermékeként izolálták. 6 * A magyar elnevezést illetően nincs közmegegyezés a tekintetben, hogy a cefa- avagy a kefa- kiejtésmód a követendő. A dolgozatban a cefa- megnevezést használom, ld. Bakos Ferenc: Idegen szavak kéziszótára, Terra Budapest, 1977, 117. 8

C 7 6 5 S 1 4 2 C 3 ' 5 6a,b a: = b: = C= C S ' C C ' '' 7a C 7b S 3 Ma a félszintetikus cefalosporinszármazékok részesedése a β-laktám antibiotikumok piacából nagyobb, mint a penicillinszármazékoké. Ennek oka a kevésbé feszült gyűrűrendszer miatti nagyobb β-laktamázstabilitás. A karbapenémek közül kiemelkedően jó hatású a tienamicin (6a), amely a leggyakoribb β-laktamáz enzimekkel szemben ellenálló, Gram-pozitív és -negatív baktériumok ellen egyaránt hatásos, de csak szűk p-tartományban stabilis. 7 Szerkezetének érdekessége, hogy 6-os helyzetben a szokásos amid oldallánc helyett 1-hidroxietil oldalláncot tartalmaz transz helyzetben, mely feltehetőleg nagyban hozzájárul a β-laktamázstabilitáshoz. 8 Azonban izoláltak már olyan törzseket is, melyek a karbapenémeket is hidrolizálják, cinkközpontú metallo-enzimjeik segítségével. 8a -formimidoil származéka (6b) imipenem néven került forgalomba, azonban ez a májban található dihidroxi-peptidáz-i (DP-I) enzim hatására lebomlik. A Tienam nevű kombinációs készítmény 1:1 arányban tartalmaz tienamicint és DP-I inhibitor cilastatint (8). C 2 S 8 C 9

DP-I stabilis tienamicin-analogonok kutatása, fejlesztése ma is nagy intenzitással folyik a világ gyógyszergyáraiban. β-laktamázstabilis molekulák kutatásával párhuzamosan a β-laktamáz enzimek inhibitorainak keresése is folyamatos. A β-laktamázgátlás mechanizmusa a legtöbb esetben öngyilkos típusú, azaz a molekula szubsztrátja az enzimnek, de a β-laktám (amid) kötés hidrolízise után az enzimhez irreverzibilisen kötve marad. Ilyen β-laktamázgátló vegyületek például a természetes eredetű klavulánsav (9), 9 valamint a félszintetikus penicillánsav-szulfon (sulbactam, 10) 10 és analogonjai. A klavulánsavat β-laktamázérzékeny molekulákkal együtt, kombinációban adják, ld. Augmentin (amoxicillin + klavulánsav). A sulbactam kedvezőtlen farmakológiai tulajdonságai miatt közvetlenül nem, csak származékai formájában alkalmazható, például ampicillinnel képzett észtereként (sultamicillin, 11). Megjegyzendő, hogy terjedőben vannak az említett β-laktamázgátlókra is rezisztens törzsek. S 9 C 10 C C S S 2 11 CC 2 C A természetes antibiotikumok megismerése után a β-laktámgyűrűvel kondenzált gyűrű vázmódosításával új származékokat állítottak elő és vizsgáltak. Érdeklődésre tarthatnak számot a penémek, valamint a karba-, oxa-, aza-, 2-izo-, 2-izoxacefém-származékok. A penémvázas vegyületek, melyeket 1975-ben szintetizáltak először a Woodward Kutató Intézetben (Basel), 11 a penicillinek és cefalosporinok hibridjeinek tekinthetők. Ígéretesek a 10

6-os helyzetben a tienamicinhez hasonlóan transz-állásban 1-hidroxietil oldalláncot tartalmazó származékok, pl.: ritipenem (12). A cefalosporinok vázanalogonjai közül eddig az oxacefémvázas vegyületek bizonyultak a leghatásosabbaknak, például a moxalactam (13) jó antibakteriális tulajdonságú és β-laktamázstabil molekula. 12 S C Me C S C 2 13 C Az első 2-izoxacefémvázas (14a, = alkil; = metil, C 2 X) molekulákat a 70-es évek végén állították elő, és köztük több vegyületet jó antibakteriális hatásúnak találtak. 12 A Budapesti Műszaki Egyetem Szerves Kémia Tanszékén is foglalkoztak 2-izoxa- és 2-izocefémvázas β-laktámok szintézisével. A kutatócsoport által előállított vegyületek között mind gyenge antibakteriális (14, = acilamino), mind gyengén β-laktamázgátló (14b) hatásút is találtak. 13 ' 7 6 1 2 'C 7 6 1 2 14 3 4 C 14a 3 4 C C (+/-)-14b A β-laktám vegyületek ma az antibiotikumpiac kb. 50%-ából részesednek. A β-laktámok családján kívül számos fontos, antibakteriális hatású vegyületcsoportot fedeztek fel (tetraciklinek, makrolidok, aminoglikozidok, szintetikus kinolinszármazékok, stb.), ennek ellenére a baktériumok rendkívüli alkalmazkodóképessége miatt az antibiotikumkutatás nem tekinthető befejezettnek, újabb és újabb vegyületek kifejlesztése indokolt. övidített név, helyesen 1-detia-2-oxacefém, az egyszerűség kedvéért a továbbiakban a 2-izoxacefém változatot használom. 11

A molekulacsalád új terápiás lehetőségeit is kutatják, így például egyes β-laktám antibiotikumokról állatkísérletekben kimutatták, hogy növelik a GLT1 (glutamát transzporter) aktivitását, ezáltal olyan, az idegrendszer degradációjával járó, halálos betegségek esetén lehetnek hasznosak, mint pl. az amyotrophic lateral sclerosis. 14 Ezen kívül koleszterinfelvétel-gátló, 15 trombingátló, 16 ill. humán leukocita elasztáz-gátló 17 hatású β-laktámvázas vegyületek fejlesztése is folyik. 12

2. Célkitűzés Célul tűztük ki 7-es helyzetben 1-hidroxietil-, 3-as helyzetben metiloldalláncot tartalmazó sztereoegységes 2-izoxacefémvázas molekulák előállítását (14c). Ennek megvalósítására olyan szintézisút kidolgozását terveztük, melynek segítségével királis prekurzorok felhasználásával, sztereoszelektív lépések alkalmazásával előállíthatók a megfelelő királis monociklusos kulcsintermedierek, majd ezekből a megfelelő 2-izoxacefémvázas vegyületek. Az előállított molekulák kiralitáscentrumainak abszolút konfigurációjára egyértelmű bizonyítékot kívántunk adni. 7 6 1 2 14c 4 3 C Mint a bevezetőben láthattuk, az 1-hidroxietil oldallánc a karbapenémek és a penémek esetén hatáshordozónak bizonyult, valamint a klavulánsav esetében is hatásnövekedést eredményezett. 18 Az általunk előállítani kívánt vegyület egyaránt tartalmazza ezt a szerkezeti elemet, valamint a 2-izoxacefémvázat, ezért antibakteriális és/vagy β-laktamázgátló hatás fellépését remélhettük. Az előállított molekulákat 2 laboratórium tesztelte antibakteriális és β-laktamázgátló hatás szempontjából. 13

3. Irodalmi áttekintés 3.1. A β-laktámváz felépítési lehetőségei A β-laktámváz leggyakrabban alkalmazott általános felépítési lehetőségei az alábbiak szerint csoportosíthatóak: 19 A) Gyűrűzárás: 2 1. -C2 (amid) kötés kialakítása 2. C3-C4 között 4 3 2 3. -C4 között (4. C2-C3 között) B) [2+2] cikloaddíció: 1. C3-C2 + C4-2. -C2 + C3-C4 C) 1,3-bifunkciós vegyületekből 3+1 stratégiával D) Egyéb módszerek: gyűrűszűkülés, gyűrűbővülés, oxidáció 1 A 1 B 3.2. Módszerek 2-izoxacefémváz előállítására A 2-izoxacefémváz eddig ismert szintéziseiben mindig a β-laktámgyűrű kialakítása után végzik a dihidrooxazingyűrű zárását. Amennyiben 3-as helyzetben alkilszubsztituens található, a gyűrűzárás általában enol-észter (β-oxoészter) szerkezetű intermedieren keresztül történik. 3.2.1. DYLE-féle első szintézis A 70-es évek végén DYLE és kutatócsoportja szintetizált elsőként 2-izoxacefémvázas vegyületeket. Az általuk előállított és vizsgált vegyületek mindegyike 7-es helyzetben acilamino oldalláncot tartalmazott cisz-helyzetben. Eljárásukban Schiff-bázist (16) és Ebben a fejezetben a témához kapcsolódó általános irodalmi előzmények szerepelnek. A munkámhoz közvetlenül kapcsolódó előzményeket az adott helyen tárgyalom. 14

azidoacetil-kloridból (15) in situ keletkező ketént reagáltattak [2+2] cikloaddícióval (B/1 módszer), majd a kapott cisz-azetidinon (17) oldalláncának ozonolízisével aldehidet (18), ennek ab 4 -es redukciójával alkoholt (19) nyertek. A hidroxilcsoport mezilezésével, az -védőcsoport eltávolításával a gyűrűzárásra alkalmas enol-észtert (21) kapták. Ezt bázissal ciklizálva, majd az amid oldalláncot kialakítva, a benzil védőcsoportot hidrogenolízissel eltávolítva 22 2-izoxacefémvázas vegyületekhez jutottak: 20 3 Ph 3 C=CPh + CCl CBn BnC BnC 15 16 (+/-)-17 (+/-)-18 X = C (+/-)-19 X = C 2 3 C 2 Ms 'C (+/-)-20 X = C 2 Ms BnC C, ' = alkil (+/-)-21 (+/-)-22 3 X Ebben az esetben a β-oxoészter szerkezeti részletet már a szintézisút kiindulási vegyülete tartalmazza. A módszer hátránya, hogy a 3-as helyzetű szubsztituens variálása újabb és újabb Schiff-bázis szintetizálását igényli. A metodika racém cisz-vegyületekhez vezet, az ábrán a relatív konfiguráció látható. A szintézisút kis változtatással enantioszelektívvé tehető. 21 Az enantioszelektivitás a D-treoninból képezett Schiff-bázisban (23) meglévő aszimmetriacentrumok hatásának következménye. Az enol-észter szerkezet (30) kialakítását 29-ből Jones-reagenssel végezték. Enantioszelektivitás elérhető azidoecetsav helyett királis, aktivált ecetsavszármazék alkalmazásával is. 22 15

Ph 3 + CCl CBn SiMe 2 tbu 3 C=CPh SiMe 2 tbu CBn 3 X SiMe 2 tbu CBn 15 23 24 25 X = C 26 X = C 2 27 X = C 2 Ms 3 C 2 Ms 3 C 2 Ms C BnC BnC 29 30 31 C 3.2.2. Diazoészter-beékelődéses eljárás Törekvések történtek olyan szintézisutak kidolgozására, melyek a gyűrűzárás kulcsvegyületének számító enol-észtert a korábban felépített β-laktám nitrogénjén utólag alakítják ki. Az egyik eljárás diazo-vegyületből ródium-acetát katalizátor [h 2 (Ac) 4 ] jelenlétében in situ képződő karbén -kötésbe való intermolekuláris beékelődésén alapul. Alkalmas diazovegyület (33) megfelelően szubsztituált acetecetészterből tozil-aziddal állítható elő. 23 A módszer egy lépésben sok esetben jó termeléssel szolgáltatja a kulcsvegyület enol-észtert ( = acilamino, = alkil). 13b,24 A reakció azonban erősen szubsztituensfüggő mind a reagens, mind a reaktáns oldaláról. 25 ' C 2 Ms + 32 33 + tbu ' C 2 Ms h 2 (Ac) 4 Et 3 tbuc 34 ' 35 CtBu 16

A módszert alkalmazták a klavulánsav előállítására, 26 ill. a Merck cég kutatói a tienamicin szintézisének megvalósításakor, 27 intramolekuláris változatban. 3.2.3. Dioxoészteres eljárás A BME Szerves Kémia Tanszékén kifejlesztett eljárásban -en szubsztituálatlan β-laktámok 2,3-dioxovajsav-észterekre (37) történő addíciójával állították elő 38-at, melynek hidroxilcsoportját tionil-kloriddal (SCl 2 ) klórra cserélve (39), majd cink ecetsavas redukciót alkalmazva kapták az enol-észter szerkezetű intermediert (40). Ennek ciklizálásával nyerték a 2-izoxacefémvázas vegyületet (41). 13 Könnyű eltávolíthatósága miatt az ' = benzilszármazék bizonyult a legjobbnak. C 2 Ms + 36 37 ' C 2 Ms 'C 38 SCl 2 =, ipr C 2 Ms Cl 'C C 2 Ms Zn/Ac Et 3 'C C' 39 40 41 Annak ellenére, hogy ez utóbbi módszer több lépésen keresztül szolgáltatja a kívánt végterméket, a dioxoészteres és a diazoészter-beékelődéses módszer összehasonlításakor a dioxoészteres metodika 7-es helyzetben alkilszubsztituens esetén minden esetben jobb termeléssel szolgáltatta a kívánt 2-izoxacefémet, míg 7-es helyzetben nitrogéntartalmú szubsztituenst tartalmazó molekulák esetén a diazoészter-beékelődéses módszer bizonyult megfelelőbbnek. 28 17

3.2.4. Alkilezésen alapuló eljárás A β-oxoészter-rész bevitele a molekulába elvileg alkilezéssel is történhet. Ezt nehezíti, hogy a 2-es helyzetben halogénatomot tartalmazó acetecetészter gyorsan átrendeződik ω-halogén származékká. Korábbi kísérletek ezzel a módszerrel nem voltak eredményesek. 29 Két lépésben azonban megvalósították a β-oxoészter kialakítását (ennek tautomer formája az enol-észter) alkilezéssel. A β-laktám gyűrű nitrogénjét brómecetsav-allil-észterrel alkilezték fázistranszfer-katalízis segítségével, majd a kapott vegyületet (43) lítiumhexametildiszilazid [Li(SiMe 3 ) 2 ] jelenlétében savkloriddal acilezték és kapták a megfelelő β-oxoésztert (44). Ez utóbbi, védőcsoport-eltávolítás után, ciklizálható (46). 30 C 2 SiMe 2 tbu BrC 2 Call PTC 42 = tritil C 2 X Call 43 X = SiMe 2 tbu 'CCl Li(SiMe 3 ) 2 C 2 X ' allc 44 X = SiMe 2 tbu 45 X = Mitsunobu ''C ' ' Call C 46 47 ', " = alkil 3.3. 3-(1-idroxietil)-4-(hidroximetil)azetidin-2-on monociklusos β-laktám intermedierek szintézisekvivalenseinek előállítása A 3-(1-hidroxietil)-4-(hidroximetil)azetidin-2-on-származékok (48) kulcsintermediernek számítanak, amennyiben a 2-izoxacefémvázhoz vezető szintézis során a β-oxoészterrész 18

kiépítése a β-laktámgyűrű kialakítása után történik. A P ill. P csoportok védőcsoport funkciót töltenek be, míg L jó kilépő csoport kell, hogy legyen. P' C 2 L 48 P 3.3.1. Szubsztituálatlan β-laktámból kiindulva acém 49-ből acetaldehiddel LDA jelenlétében képezett anionon keresztül 50a,b racém transz-diasztereomerpár állítható elő. 27,31 Az oldalláncot oxidálva (51), majd sztereoszelektíven redukálva valamelyik disztereomer racemáthoz juthatunk (50a vagy b). LDA, C 3 C ' ' ' ' (+/-)-49 (+/-)-50a,b (+/-)-51 (+/-)-50a vagy b 3.3.2. 3-idroxivajsav-észterből ptikailag aktív 3-hidroxivajsav-észterek egyszerűen nyerhetők acetecetészterből enzimes/mikrobiológiai redukció segítségével, ezért enantioszelektív szintéziseknek könnyen elérhető kiindulási anyagai. GEG és munkatársai (S)-3-hidroxivajsav-észterből (52) valósították meg 55 szintézisét, az 52-ből bázis jelenlétében képződő dianion iminre történő addíciójával (B/1. módszer, ld. 3.1.). A királis kiindulási anyag a kialakuló β-laktám 3-as szenén gyakorlatilag 100%-os sztereoszelektivitást okozott, a reakcióban 54a,b cisz és transz vegyületek kb. 1:1 arányban keletkeztek. asonló reakciót nem sikerült megvalósítani akkor, amikor a kiindulási Schiff-bázis feniletenilcsoport helyett észter funkciót tartalmazott. 32 19

Ph Ph CEt + LDA, MPT 52 53 54a,b 55 3.3.3. Diketén és imin addíciójával Diketén (56) és 57 imin imidazol jelenlétében lejátszódó [2+2] cikloaddíciójával (B/1. módszer) racém 58-et állították elő, melynek ab 4 -del végzett redukciója a 59a,b diasztereomer (racemát) párt 4:1 arányban eredményezte. A diasztereoszelektivitás oka az, hogy 58 oxocsoportja diasztereotóp felületekkel rendelkezik. 33 + CMe imidazol CMe ab 4 i-pr CiPr 56 57 (+/-)-58 (+/-)-59a,b 3.3.4. β-enaminoketoészterből Acetecetészter és etil-cianoformiát cink katalizálta reakciójában β-enaminoketoészter kapható (60), melyet védés után redukálva racém 61-hez juthatunk. A molekula az aminocsoport és az oxigén között kialakuló hidrogénkötés miatt teljesen merev, katalitikus hidrogénezése sztérikus hatások miatt főtermékként 62-t adja. Ez -trimetilszililezés után terc-butil-magnézium-klorid jelenlétében ciklizálható (63) (A/1 módszer, ld. 3.1.). 20

Zn(acac) 2 Z + C-CEt MeC CEt MeC CEt Me 60 61 CEt 1. Me 3 SiCl 2. t-bumgcl MeC CEt (+/-)-62 (+/-)-63 2 3.3.5. Treoninból 3.3.5.1. Epoxidon keresztül Japán szerzők L-treoninból (64) kiindulva epoxidképzésen keresztül alakították ki a 48-nak megfelelő β-laktám vegyületet. A kiindulási vegyületet a 2 -tel és KBr-dal reagáltatva az aminocsoportot brómra cserélték (65). A reakció szomszédcsoporthatás miatt feltételezhetően retencióval játszódik le, melyet néhány aminosav esetén bizonyítottak. 34 Diciklohexilkarbodiimid (DCC) jelenlétében 65-öt nitrogénen védett glicin-észterrel kondenzáltatták (66). Ezt lítium-hexametildiszilaziddal reagáltatva az epoxidgyűrű kialakulása során a 2-es szénatomon inverió játszódik le (67), további Li(Si(C 3 ) 3 ) 2 adagolásra megtörténik a β-laktámgyűrű zárása (68) (A/2. módszer, ld 3.1.). Ez a reakció szobahőmérsékleten végezve sztereoszelektíven transz terméket eredményez. A gyűrűzárás során újabb inverzió történik, tehát 68 3-as szénatomjának konfigurációja S lesz, és így a tienamicinnek megfelelő sztereokémiával rendelkező monociklusos β-laktám keletkezik. A kapott 4-oxoazetidin-2-karboxilát védése (69) után ab 4 -es redukcióval (70), majd a - védőcsoport eltávolításával 3-(1-hidroxietil)-4-hidroximetilazetidin-2-on-származékot (71) nyertek. A redukció terc-butil észterező csoport esetén gyenge termeléssel, míg metilészter esetén kitűnő termeléssel ment végbe. 35 21

C DCC CC 2 C' C' Li(SiMe 3 ) 2 Li(SiMe 3 ) 2 X Br 64 X = 2 65 X = Br 66 '= t-bu, Me 67 X C' 68 X = 69 X = SiMe 2 tbu ab 4 SiMe 2 tbu C 2 SiMe 2 tbu 70 71 C 2 3.3.5.2. Sheehan-Bose szintézis alapján 48-nak megfelelő szerkezetű molekulák előállíthatók Sheehan-Bose szintézisen 36 alapuló eljárással is. Ennek lényege, hogy α-halogén karbonsav-kloridból (72) és aminomalonátból (73) savamidot (74) állítunk elő, majd bázis jelenlétében (kihasználva, hogy a malonészterrész savas -t tartalmaz) zárjuk a β-laktámgyűrűt (75). A malonészterrészt parciálisan hidrolizálva (76), valamint dekarboxilezve 4-oxoazetidin-2-karboxilátokhoz (77) jutunk. Ezek redukálásával nyerhetők a megfelelő 4-(hidroximetil)azetidin-2-on (78) származékok (ez a lépés már nem része az eredeti szintézisnek). X 'C + CCl 72 73 C' C' '' X C' C' '' 74 75 C' C' C' '' C 2 C '' '' 76 77 78 '' 22

Ennek a szintézisnek megfelelő eljárással előállítottak D-allo-treoninból (79) az α- és 3-as pozícióban a tienamicinnek megfelelő konfigurációval rendelkező 3-(1-hidroxietil)-4- oxoazetidin-2-karboxilátokat, melyek alkalmasak lehetnek 48-nak megfelelő szerkezetű molekulák szintetizálására. 37 A kiindulási D-allo-treonin aminocsoportját brómra cserélték (80, ld. 21-22. oldal 64 65 átalakítás), majd a hidroxilcsoportot acetilezték (81) és tionilkloriddal savkloridot képeztek (82). A kapott vegyületet nitrogénen védett aminomalonészterrel (83) reagáltatták (84), és DBU-val ciklizálták (85). Feltételezték, hogy a gyűrűzárás során a brómatomhoz kapcsolódó szénatomon inverzió játszódik le, a reakció tiszta S 2-es mechanizmusa miatt. A kapott molekulát egy ekvivalens a-dal kezelve a transz-észtert szelektíven hidrolizálni tudták, így fél-észter fél-karbonsavhoz jutottak (86). Ez utóbbit dekarboxilezve transz- és cisz-észterek 4:1 arányú keverékét kapták (87a,b), melyek kromatográfiásan elválaszthatók. A keverék további hidrolízise során eltávozik az acetilcsoport, ill. a másik etilcsoport (88a,b), tömény sósavas kezelés hatására a cisz konfigurációjú molekula biciklusos laktont (89) képez. X C 79 =, X = 2 80 =, X = Br 81 = Ac, X = Br Ac Br 82 CCl DMB Et 3 83 CEt CEt Ac Br 84 CEt CEt DMB DBU Ac 85 CEt CEt DMB C 1 ekv. 1 a Ac CEt C DMB C' DMB 86 87a,b = Ac, ' = Et 88a,b = ' = cc. Cl 88a DMB DMB 89 23

86 szerkezetének bizonyításához a karbonsavfunkciót terc-butil-észterré alakították (90), mely lúgosan nem hidrolizálható. Az újabb hidrolízis után kapott γ-hidroxikarbonsav (91) ecetsav-anhidriddel reagáltatva biciklusos laktont képez (92). Mivel ez csak a 3-as és 4-es helyzetű szubsztituensek cisz-állása esetén valósulhat meg, ezért 86-ban a karbonsavfunkció transz-állású kellett, hogy legyen. Ac CEt C DMB Ac 86 90 CEt CtBu DMB 0,1 a C CtBu Ac 2 DMB 91 92 CtBu DMB Az eddig összefoglalt irodalmi előzmények mindegyikében az előállított molekulák kiralitáscentrumainak abszolút konfigurációit irodalmi analógiák (pl. aminocsoport bróm reakció sztereokémiája), ill. a gyűrűs vegyületek M felvételeiben tapasztalt - csatolási állandók alapján határozták meg. 3.3.5.3. Közvetlen előzmények ÉMET ILDIKÓ diplomamunkája keretében L-treoninból kiindulva szintetizált sztereokémiailag egységes 2-izoxacefémvázas vegyületet (100). A kulcsintermedier 3-(1- acetoxietil)-4-hidroximetilazetidin-2-on (96) előállítására egy, a Sheehan-Bose szintézisen alapuló eljárást alkalmazott. 95a és b diasztereomer észterpár ab 4 -es redukciója során kizárólag a transz-észter redukálódik (96), a keletkező transz-alkoholt a reagálatlan cisz-észtertől kromatográfiával választotta el. Az izoxacefémváz kialakítását a diazoészteres metodikával végezte. A reakciósor eredményeképp rossz termeléssel kapta 100-at. A termékek abszolút konfigurációjára egy közbenső termék (95b) apró kristályain elvégzett por-röntgendiffrakciós vizsgálat alapján meghatározott szerkezetéből lehetett következtetni, mert az utána végrehajtott reakciók nem érintették az aszimmetriacentrumokat. Azonban a r mérés bizonytalansága túl nagy volt. 38 24

X C 65 X = 2 66 X = Br i Ac 93 Br CMe CMe ii Ac CMe CMe 94 iii Ac Ac Ac CMe C 2 iv + 95a,b 96 95b CMe Ac 96 C 2 v Ac Ac C 2 Ms C 2 Ms vi + tbu + 97 98 tbuc 99 vii Ac 100 C eagensek: i: a) a 2, KBr, 2 S 4, 0 C b) AcCl, piridin, C 2 Cl 2, 0 C; c) TF/víz; d) SCl 2, C 2 Cl 2, reflux; e) dimetil-[-(4-metoxifenil)aminomalonát], benzol, reflux; ii: DBU, benzol; iii: a) 1 ekv 1 a, piridin, 0 C; b) α-pikolin, reflux; iv: ab 4, t- Bu; v: a) MsCl, piridin, 0 C; b) CA, acetonitril/víz, -10-0 C; vi: h 2 (Ac) 4 ; benzol, reflux; vii: a) Et 3, CCl 3, reflux; b) AlCl 3, anizol 25

4. Elméleti rész 4.1. etroszintézis Enantiomeregységes Ia, Ib, IIa, IIb (ill. ezek enantiomerjeinek) 2-izoxacefémvázas molekulák előállítását az alábbi retroszintetikus út alapján terveztük megvalósítani (ábrát ld. a következő oldalon) L- ill. D-treonin kiindulási anyagból: II célvegyületet visszavezethető α-epimerjére, I-re, mely III enol-észterből bázis jelenlétében ciklizálva kapható. III-ból retroszintetikus úton IV azetidinonhoz jutunk, míg a IV-el ekvivalens alkohol a megfelelő észterből (V) redukcióval állítható elő. V visszavezethető VI-ra, mely az aktív hidrogént tartalmazó VII-ből a β-laktámgyűrű zárásának eredményeképp kapható (A/2 módszer, ld. 3.1.). VII pedig L-treoninból, mint optikailag aktív, királis prekurzorból kapható, így 2 kiralitáscentrum konfigurációja adott. Amennyiben II-t (ill. enantiomerjét) hasonló elv alapján, de I-et kihagyva kívánnánk előállítani, akkor a megfelelő királis kiindulási anyag L/D-allo-treonin lenne, melyek azonban nagyságrenddel drágábbak, mint C3-epimerjeik. A treonin V út lényegében megfelel a Sheehan-Bose szintézisnek. 36 Közben feltételeztük, hogy az oldallánc 1-hidroxietil-csoportjának konfigurációja csak az epimerizációs lépésben változik (I II); az azetidinné történő ciklizálás S 2-es mechanizmussal, inverzió lejátszódása közben történik (VII VI), valamint, hogy a treoninból VII előállítható a 2-es szénatom konfigurációjának változása nélkül. Az ábrán feltüntetett Ia, Ib, IIa, IIb célvegyületek enantiomerjeinek (a további négy izomer) alapanyaga a D-treonin. 26

27 C S S S C S Q Y X Q X C C S C Q Y X Q X C S Q X C C 2 C S L-treonin transz cisz X ZC Y X ZC Y S IIa Ia IIb Ib IIIa IIIb IVa IVb Vb Va VI Q Br X C C S VII

4.2. Monociklusos β-laktám intermedierek előállítása A 48 (ld. 19. old.) általános képlettel jelölt (a retroszintézisben IVa,b, 27. old.) monociklusos β-laktám intermedierek előállításánál nagyban támaszkodtam a 3.3.5. fejezetben említett munkákra, elsősorban ÉMET ILDIKÓ diplomamunkájára (ld. 25. old.). L- és D-treoninból az általa kidolgozott eljárással állítottam elő 95a,b diasztereomer észterpárt ill. ezek enantiomerjeit. [I]** Az eljárás következő lépése, a ab 4 -del végzett diasztereoszelektív redukció során csak a transz-észter redukálódik, a cisz-észter feltételezhetően sztérikus okok miatt nem reagál. A reagálatlan cisz-észter a transzalkoholtól kromatográfiásan elválasztható. Azonban a reakció egyszerűbbé tehető, ha a diaszeteromereket még előtte részben elválasztjuk, mely a terc-butil-alkoholbeli jelentős oldhatóság-különbségük alapján egyszerű eldörzsöléssel könnyen megoldható. Ennek a módszernek előnye, hogy a transz-észtert tartalmazó anyalúg a redukcióban közvetlenül felhasználható, hiszen ennek oldószere szintén terc-butil-alkohol (ld. 5.1. 1.). A reakciósorban ez az első pont, amikor a termék kromatográfiás tisztításra kerül, a korábbi lépésekben keletkező anyagokat tisztítás nélkül használtam fel. éhány, a reakciósorban keletkező mellékterméket is izoláltam és azonosítottam (101, 102). 101 valószínűleg az α- pikolinban magas hőmérsékleten végzett dekarboxilezés közben lejátszódó ecetsav elimináció majd redukció eredménye. 102 intermolekuláris átacetilezés révén keletkezhet. Az ábrákon csak az egyik enantiomert ábrázoltam (az L-treoninból, mint kiindulási anyagból előállítottakat). Amennyiben szükséges, a D-treoninból előállított molekulákat azonos számmal, felső indexben vesszővel jelöltem. ** A saját publikációkra való hivatkozásokat római számmal jelöltem, a hivatkozások a Vonatkozó publikációk c. részben találhatók meg. 28

C 2 65 Ac CC 3 CC 3 94 (Σ = 41 %) Ac 1. a/piridin 2. 2-pikolin, 140 C 95a CC 3 + Ac CC 3 95b (Σ =24 %) ab 4 /t-bu C 2 Ac C 2 Ac Ac C 2 101 102 96 (Σ = 5 %) 96 transz-alkoholt mezilezve (103), ill. a -védőcsoportot eltávolítva az izoxacefémváz kialakítására alkalmas kulcsvegyületet (97) kapjuk. 96 mezilezését az általánosan használt piridint, mint oldószert alkalmazó módszer helyett TF-ben trietil-amin jelenlétében végeztem (ld. 5.1. 2.), így a reakcióelegy feldolgozása lényegesen egyszerűbb, a termék tisztább. A para-metoxifenil csoport CA-tal távolítható el. 32 Ac C 2 Ac C 2 Ms Ac C 2 Ms 96 MsCl, Et 3, TF 103 CA 97 (Σ = 75 %) 95b szerkezetének bizonyításához röntgendiffrakciós módszert is alkalmazni kívántunk, azonban ennek tűs kristályszerkezete miatt megfelelő méretű egykristályt nem lehetett készíteni. Korábban készült pordiffrakciós felvétel, 38a azonban ennek bizonytalansága túl nagy volt. A molekulába bróm bevitelét terveztük, ez ugyanis az abszolút konfiguráció közvetlen meghatározását lehetővé teszi. Ennek legkényelmesebb módjának az aromás gyűrű brómozása tűnt, mely jégecetben végezve 39 a várakozásoknak megfelelően 104 29

monobrómozott származékot eredményezte, 105 dibrómszármazék (ld. [I] és 5.1. 3.) mellett, mely a vizes anyalúgból izolálható és feltehetőleg a feldolgozás során szenved hidrolízist. PÁKÁYI LÁSZLÓ (KKKI) 104 diklórmetán/hexán oldószerből végzett kristályosítással kapott egykristályaiból sikeres röntgendiffrakciós felvételeket készített. A mérések egyértelműen igazolták a feltételezett konfigurációkat. [I] Ac CMe Ac CMe Ac CMe Br 2 jégecet Br + C Br Br 95b Me 104 (71 %) Me 105 Me 104 TEP diagramja A cisz-analogonok előállításához 95b redukcióját is meg kellett oldani. A transz-alkohol előállításában jól bevált ab 4 még metanolos forralás esetén sem reagál 95b-vel. A 30

redukálószer aktiválása LiCl-dal sem hozott eredményt. Így más, a β-laktámgyűrűt érintetlenül hagyó módszert kerestem. Észterek redukciója aldehiddé DIBAL-del megvalósítható. 40 Ugyan a molekula két észterfunkciót tartalmaz, és a redukció során az acetilcsoport minden bizonnyal távozik (acetaldehiddé redukálódva), de terveim szerint a kialakuló 2-karbaldehid aldehidfunkciója a hidroxilcsoport védése után könnyebben redukálható, mint az eredeti karboxilát: P P Ac C C C 2 CC 3 DIBAL 95b A -78 C-on elvégzett reakciókban rossz termeléssel két terméket, egy biciklusos laktont (106) és egy félacetált (107) kaptam, melyek az M spektrumok alapján sztereoegységesek. 107 ab 4 -del reagáltatva szobahőmérsékleten a 108 diolt eredményezi. Ac 95b CMe DIBAL -78 C 106 (3 %) + 107 (20 %) ab 4 C 2 108 (97 %) 107 biciklusos laktolban új sztereocentrum (C-4) is létrejön. A vegyület 1 M spektrumában megfigyelhető, hogy az 1-es és 2-es protonok között van, míg a 4-es és 5-ös 31

protonok között nincs csatolás. Ez arra utal, hogy a 2-es és 4-es protonok térállása ellentétes, és a 4-es és 5-ös hidrogének diéderes szöge megközelítőleg 90, amint az az alábbi ábrákon látható. Spartan 04 V1.0.1 programmal végzett molekulageometriaoptimalizálás 4-5 diéderes szögére 91,8 -ot szolgáltat. 2 1 4 5 107 A molekulát p-brómbenzoil-kloriddal reagáltatva sikerült acetál-észterré (109) alakítani, melynek röntgendiffrakciós vizsgálata bizonyította, hogy a 2-es szénatom konfigurációja nem változott, és a 2-es és 4-es hidrogének valóban transz-állásúak. [II] p-brc 6 5 CCl 107 109 (65 %) Br A vegyület számozása a biciklusos vegyületek nevezéktanát követi. 32

109 TEP diagramja A DIBAL-del végzett redukció gyenge termelése miatt más módszert kerestem. Irodalomból ismert, hogy karbonsavak redukciója megoldható az ún. vegyesanhidrides módszerrel, melynek során a karbonsavból klórhangyasav-észterrel kialakított anhidrid ab 4 -del redukálható. 41 95b-t karbonsavvá (110) alakítottam 1 Cl-val forralva. Az így keletkező hidroxi-karbonsavat klórhangyasav-etil-észterrel reagáltatva, majd -20 C-on redukálva a már ismert 107-hez jutunk (ld. [II] és 5.1. 4.), valamint 107 etoxikarbonilezett származéka is izolálható. A ab 4 -es redukció két lépésben való végrehajtását (-20 C-on 107-ig, majd szobahőmérsékleten 108-ig) 107 könnyebb tisztíthatósága indokolta. Ac 95b CC 3 1 Cl C 1. ClCEt 2. ab 4, -20 C 110 (77 %) 107 (70 %) 33

108 diol előállítására a legkényelmesebbnek azonban az a módszer bizonyult, amikor 110- ből acetil-kloriddal 106 laktont képeztem, majd azt redukáltam ab 4 -del. [ÍÍÍ] C AcCl ab 4 C 2 110 106 (95 %) 108 (84 %) 108 diolt mezilezni szerettem volna, hogy a para-metoxifenil csoport eltávolítása után 97- tel analóg szerkezetű az izoxacefémváz kialakítására alkalmas cisz konfigurációjú vegyülethez jussak. 108 mezilezése piridinben, 0 C-on meglepetésre két vegyület kb. 1:1 arányú keverékét eredményezte. A két termék a várt dimezil származéknak (111), ill. egy biciklusos tetrahidrofurán származéknak (112) bizonyult. A mezil-kloridot feleslegben alkalmazva a termékarány nem változott. A reakciót elvégeztem TF-ben úgy, hogy trietilamin bázist a mezil-klorid után adagoltam, így lényegében kizárólag a várt 111 dimezilátot kaptam, mely a védőcsoport eltávolítása (CA) után a 2-izoxacefémváz kialakítására alkalmas. C 2 Ms C 2 Ms + 111 (32 %) MsCl/piridin 112 (43 %) 108 MsCl, Et 3, TF Ms C 2 Ms 111 (85 %) 34

A két termék keletkezése úgy magyarázható, hogy a primer hidroxilcsoport gyorsabban reagál a mezil-kloriddal, mint a szekunder, és bázis jelenlétében intramolekuláris nukleofil szubsztitúció (112 keletkezése közben) tud lejátszódni. Azonban ha a bázis koncentrációja a reakciósebességet limitáló faktor (ld. trietil-amin adagolás), és mezil-klorid felesleg van jelen, akkor a szekunder hidroxilcsoport mezileződése lesz a kedvezményezett folyamat. Feltételezésemet igazolni kívántam 112 pontos konfigurációjának meghatározásával. Arra, hogy a biciklusos vegyület 2-es C atomjának konfigurációja nem változott, indirekt bizonyíték a vegyület 1 -M spektruma, melyben 4-es hidrogének közül egyiknek van csatolása, míg a másiknak nincs az 5-ös hidrogénnel, és a 2-es hidrogén csatol az 1-essel, hasonlóképp, mint a már bizonyított szerkezetű 107-ben. Tehát a 2-es C konfigurációja 112-ben és 107-ben minden bizonnyal meg kell, hogy egyezzék. Érvelésünk alátámasztásaképp 112 aromás gyűrűben brómozott származékát röntgendiffrakciós vizsgálatnak kívántuk alávetni. A már korábban alkalmazott módszerrel előállítottam 113 monobrómozott vegyületet kevés 114 dibrómszármazék keletkezése mellett. Sajnálatos módon azonban a 113 etanolból végzett kristályosítással kapott egykristályai a vizsgálat közben a röntgensugárzás hatására elbomlottak, diffrakciós képük analízisre alkalmatlannak bizonyult. [III] Br 2, jégecet + Br Br 112 Br 113 (62 %) Me 114 (20 %) Me 111-t a szokásos eljárással (CA-tal) de(para-metoxifenil)ezve 115 molekulához jutunk, mely 97-hez hasonlóan alkalmas lehet 2-izoxacefémvázú vegyületek kialakítására. 35

Ms C 2 Ms CA Ms C 2 Ms 111 PMP 115 (66 %) 4.3. Transz-2-izoxacefémvázas molekulák előállítása Az enol-észter szerkezeti részlet kialakítására elsőként a diazoészter-beékelődéses metodikát alkalmaztam. A korábban használt terc-butil-észter helyett [2-(trimetilszilil)etil]- acetoacetátból képezett diazovegyülettel (116) reagáltattam 97-et h 2 (Ac) 4 jelenlétében benzolban (ld. 5.2. 1.), mivel a terc-butil-csoport eltávolításánál alkalmazottakhoz képest a trimetilszililetilcsoport eltávolítása feltehetőleg kíméletesebben valósítható meg tetrabutilammónium-fluoriddal. Sajnos ebben a reakcióban nem sikerült beékelődött vegyület (117) képződését kimutatni. Ac C 2 Ms + + C 2 C 2 SiMe 3 Ac C 2 Ms Me 3 SiC 2 C 2 C 97 116 117 A dioxoészteres metodika szerint eljárva 97-et és enantiomerjét azonban sikeresen alakítottam 119 (ill. 119 ) 2-izoxacefémvázas molekulává, melyből katalitikus hidrogénezéssel 120 acetoxi-karbonsav kapható. [II] [II]-vel jelölt cikkben a D-treoninból előállított 119 hidrogénezésénél sajnos hibás termelésadat található, helyesen: 97%. 36

Ac C 2 Ms + 97 37 Bn 1. Et 3 2. SCl 2 /pir 3. Zn/Ac Ac C 2 Ms BnC 118 Et 3 Ac 2, Pd/C Ac Ac CBn 119 (Σ = 53 %) C 120 (92 %) 119' CBn Az acetil védőcsoport eltávolítását célszerű a hidrogénezés előtt elvégezni, 119 metanolban, katalitikus mennyiségű ame jelenlétében végzett alkoholízise jó termeléssel szolgáltatja 121-et, melynek hidrogénezése a rendkívül higroszkópos, védőcsoportok nélküli 122 (ld. 4.1. Ia; 27. old.) 2-izoxacefémvázas hidroxi-karbonsavat eredményezi. [III] Ac ame/me 2, Pd/C CBn CBn C 119 121 (95 %) 122 (80 %) 122' C A D-treoninból előállítható 122 α-epimerje a tienamicinéval megegyező konfigurációjú vegyületnek. Ahhoz, hogy ilyen konfigurációjú vegyületet előállítsunk, az α-szénen inverziót kell előidézni. Ez S 2 típusú reakcióban valósítható meg, melyhez azonban ebben a pozícióban egy jobb kilépő csoportra van szükség. Ezért 121 szabad hidroxilcsoportját mezileztem (123) (ld. 5.2. 2.), melyet megpróbáltam közvetlenül vízzel egy lépésben hidroxilcsoportra cserélni (124). Ugyan a víz meglehetősen rossz nukleofil, mégis találhatók az irodalomban utalások a reakció megvalósítására. 42 Azonban ez esetemben 37

nem vezetett eredményre, így a mezilcsoportot aac-tal újra acetoxira (125) próbáltam cserélni. Ms MsCl CBn CBn 121 123 (56%) 2 aac 124 Ac CBn 125 CBn Mivel ez sem sikerült, ezért 121 vegyületen Mitsunobu reakciót hajtottam végre ecetsavval. Érdekes módon az általánosan használt reakciókörülmények 43 (kis feleslegben vett DEAD, sav és PPh 3 ) csak nagyon rossz termeléssel szolgáltatták a kívánt terméket, azonban a reaktánsokat jóval nagyobb feleslegben véve (ecetsav 10 -es, PPh 3 4 -es, DEAD 4 -es) 44 sikerült a reakciót megvalósítani. Az α-szén konfigurációjának változására közvetett bizonyíték, hogy 125 és 119 vegyületek tulajdonságai eltérnek (M, forgatás, ill. hogy 125 119-el szemben szobahőmérsékleten szilárd). Az abszolút konfiguráció meghatározására olyan származékokat is kívántam készíteni, melyek brómot tartalmaznak, így előállítottam 125 p-brómbenzoiloxi- (126) és brómacetiloxi- (127) analogonjait is, ezek azonban olajoknak bizonyultak. CBn C, PPh 3, DEAD/DIAD C CBn 121 125 = C 3 (70 %) 126 = p-brfenil (40 %) 127 = BrC 2 (30%) 38

125-ből 128 védőcsoportok nélküli célmolekulát azonos lépésekkel kaptam, mint 119-ből 122-et, azaz az acetil csoportot ame/me-lal (124), a benzil csoportot kat. hidrogenolízissel távolítottam el (128, ld. 4.1. IIa; 27. old.). [III] Ac ame/me 2, Pd/C CBn CBn C 125 124 (80-90 %) 128 (88 %) 122, 122, ill. 128 és 128 előállításával az összes transz-7-(1-hidroxietil)-3-metil-2-izoxacefém-4-karbonsav előállítását megoldottam. 4.4. Cisz-2-izoxacefémvázas molekulák előállítása Mivel a transz vegyületek esetén a dioxoészteres metodika segítségével egyszerűen kaptam a kívánt vegyületeket, ezért a cisz vegyületek esetén is ezt alkalmaztam. 115-öt a már említett módon reagáltattam 37-tel, majd az Cl csere és redukció után Et 3 jelenlétében megvalósítottam a gyűrűzárást. Sajnos azonban a reakció a várt 129 mellett 130 telítetlen vegyületet is eredményezte. [III] Ms C 2 Ms + 115 37 CBn Ms + CBn CBn 129 (15 %) 130 (10 %) A fenti tapasztalat arra ösztönzött, hogy a két hidroxilcsoport megkülönböztetésére keressek eljárást, vagyis olyan P és L csoportokat próbáljak bevinni a molekulába, melyek egyrészt védőcsoport funkciót (P), másrészt távozó csoport funkciót (L) töltenek be (ld. 48, 18-19. old.). 39

P L 108 cisz-"48" Primer és szekunder hidroxilcsoportok megkülönböztetésére gyakran alkalmazzák a szénhidrátkémiában a tritilezés/acetilezés/detritilezés lépésekből álló módszert. A tritilcsoport a nagy térkitöltése miatt a primer hidroxilcsoportra lép be, így a szabad hidroxilcsoporto(ka)t acetilezve, majd a tritilcsoportot eltávolítva a szekunder hidroxilcsoporto(ko)n védett, szabad primer hidroxilcsoportot tartalmazó vegyülethez juthatunk. 108 dihidroxi vegyületet ezért az irodalomból jól ismert módszerrel tritileztem, majd acetileztem így 131 molekulához jutottam, melynek szerkezetét 2D M módszerek (SQC, MBC) segítségével határoztam meg (ld. 5.3. 1.). A tritilcsoport eltávolítását az általánosan ismert módszerekkel próbáltam megoldani. Katalitikus hidrogenolízissel alkalmazásával nem történt reakció, míg sósav/dioxán rendszerben is csak több napos kevertetés után tapasztalható átalakulás, ekkor azonban 108 kapható vissza. 90%-os vizes ecetsavban végzett forralás hatására 132 diacetil és 133 primer hidroxilcsoporton acetilezett monoacetil termék izolálható. 108 Ac C 2 C 2 Tr 1. TrCl/piridin 90% Ac 2. AcCl/Et 3 131 (70 %) Ac C 2 Ac + 132 (45 %) C 2 Ac 133 (50 %) Ezeket a termékeket 108 korábban elvégzett direkt acetilezésének termékeivel való azonosságuk alapján identifikáltam. Azt, hogy 133 a primer hidroxilcsoporton tartalmazza az acetilcsoportot, jól mutatja az α- 1 M-ben tapasztalt jellegzetes eltolódása, mely acetoxi helyettesítő esetén mindig kb. 5,5 ppm, míg esetén 4 ppm körüli. Tritilcsoport 40

eltávolítását leírták FeCl 3 *3 2 /C 2 Cl 2 reagenssel, amely módszer használatával a szerzők el tudták kerülni az acetilcsoport vándorlását, 45 ami feltehetőleg esetemben lejátszódik. A módszer szerint eljárva a kiindulási anyag elfogyása után ismét csak 133-at tudtam izolálni (ld. [III] és 5.3. 2.). A tritilezéssel kapcsolatos sikertelen kísérletek miatt más módszert kerestem. Szintén a szénhidrátkémiában használatos eljárás térben közeli hidroxilcsoportok védésére a benzilidéncsoport acetálként való bevitele a molekulába. Az így keletkező két oxigént tartalmazó gyűrű regioszelektíven redukálva felnyitható: 46 Bn Általánosan használt reagens erre a célra az alán (LA/AlCl 3 ) és a DIBAL, melyekkel végrehajtott redukcióban a reagens a kevésbé zsúfolt (primer) oxigén felől támadva primer hidroxilcsoportot és szekunder benziloxicsoportot eredményez. Mivel a módszert egy β-laktámfunkciót is tartalmazó vegyületen kívántam alkalmazni, az alán, mint reagens, szóba sem jöhetett, azonban a DIBAL alkalmazása ígéretesnek tűnt, hiszen ezt a reagenst már korábban alkalmaztam anélkül, hogy a β-laktámgyűrű reagált volna. A szerves kémiai adatbázisokban nem találtam rá utalást, hogy a módszert próbálták-e már ilyen típusú molekulán. Amennyiben sikerül a reakciót megvalósítani, a molekulában a szekunder helyén benzil-éter védőcsoport és egy primer hidroxilcsoport alakul ki, mely ideális a további reakciókhoz. 108-at benzaldehiddel PTSA jelenlétében reagáltatva 134 vegyület állítható elő diasztereoszelektíven, ennek pontos térszerkezetét 2D-ESY M spektrum alapján határoztuk meg. A 4- térállását a jelentkező pozitív keresztcsúcsok 2-val, 1--val és 7--val bizonyítják (más keresztcsúcsok nem figyelhetők meg). 41

A DIBAL-del végzett redukció meglepetésre nem a várt benziloxiszármazékot (135) eredményezte, hanem a β-laktámgyűrű redukcióját γ-aminoalkohollá (136), miközben a dioxepángyűrű érintetlen maradt. Emellett kis mennyiségben feltehetőleg (MS alapján) 137 azetidin is keletkezett (M = 325, ld. 5.3. 3.), de ezt nem sikerült megfelelő tisztaságban izolálni (rendkívül gyorsan oxidálódik), valamint a termékek MS vizsgálata során olyan komponens is látható volt, mely klórtartalomra utaló jellegzetes izotóparányt mutatott (M Cl-35 = 361; a klór az oldószerként használt C 2 Cl 2 -ból valamilyen gyökös folyamat eredményeképp léphet a molekulába). Érdekes jelenség, hogy míg 95b DIBAL-del végzett redukciója a stabil 5+4-es gyűrűrendszerű 106-ot és 107-et eredményezi (ld. 31. old.), addig 134 4+7 gyűrűrendszere hasonló körülmények között készségesen reagál és a β-laktámgyűrű felnyílását eredményezi. A Beilstein adatbázist böngészve nem találtam olyan hivatkozást, melyben β-laktám vegyület redukcióját aminoalkohollá DIBAL-del végezték volna, ennek a reakciónak a tipikus reagense ugyanis a LA ill. a diborán. Feltehetőleg a 4+7-es gyűrűanelláció miatti megnövekedett gyűrűfeszültség okozza a β- laktámgyűrű nagyobb reakciókészségét. Bn 108 C 2 PhC PTSA 4 2 1 7 6 DIBAL 134 (70 %) 135 +? 136 (64 %) 137 42

Ismert, hogy ha benzilidén helyett p-metoxibenzilidén-csoportot használunk, akkor az a redukciós gyűrűnyitásra érzékenyebb, így felnyitása esetleg a β-laktámgyűrű redukciójával konkurrálni tudna, azonban a keletkező p-metoxibenzil-éter oxidatív hatásra elbomlik, ezért a védőcsoport mellett nem használható védőcsoportként. 47 Leírták benzilidén-acetál védőcsoportot tartalmazó vegyületek regioszelektív redukcióját acb 3 /Cl reagenssel is, mely esetén a reakciót pont fordított regioszelektivitásúnak találták, azaz primer benziloxi- és szekunder szabad hidroxilcsoport keletkezését tapasztalták. 48 Ezek alapján az alábbi szintézistervet készítettem: Ac Ac Bn Bn acb 3 /Cl AcCl kat. 2 134 A redukciót elvégezve három terméket kaptam, melyek közül kettő a két regioizomernek (135, 138) bizonyult. Meglepetésre főtermékként a szabad primer hidroxilcsoportot tartalmazó molekula keletkezett (135), mely ellentétes az irodalomban eddig tapasztaltakkal, igaz, 1,4-diolokból kialakított 7 tagú gyűrű esetén a módszert még nem vizsgálták. A reakcióban sajnos jelentős mennyiségben 108 kiindulási diolt is visszakaptam. acb 3 /Cl 134 Bn Bn + + 135 (42 %) 138 (20 %) 108 (9 %) 43

135-öt mezileztem Et 3 bázis jelenlétében a korábban már alkalmazott módszer szerint. A reakciót különböző sarzsok esetén megvalósítva azt tapasztaltam, hogy amennyiben a kiindulási 135 szervetlen (feltehetőleg a acb 3 reagensből származó, I-ben óriási jellegzetes C jelet tartalmazó) szennyezőktől nem mentes, a reakció kizárólag a korábban már előállított 112 biciklusos vegyületet eredményezi, melynek azonosítása az M, I spektrumok, valamint olvadáspont azonosság alapján történt. 135 tisztítása igen bonyolultnak bizonyult, ugyanis a már említett szennyezőket sem savas, sem bázisos kirázással nem sikerült eltávolítani, és kromatografálás során is részben együtt jönnek. Így csak oszlopkromatográfia és prep. VK módszer együttes használatával tudtam tiszta 135- öt előállítani. Ennek mezilezése valóban a várt 139 vegyületet eredményezi. Érdemes megemlíteni, hogy ennek CDCl 3 -ban készült M mintája 1 napos állás után teljes egészében 112-vé alakul. Ez arra utal, hogy a benzilcsoport igen labilis, könnyen kilép kation formájában, és a szabad nukleofil támadást indíthat a térközelben lévő meziloxicsoport ellen, így eredményezve 112 keletkezését (hasonlóan 108 mezilezésénél látottakhoz). [IV] 135 MsCl/Et 3 Bn Ms vagy 139 (81 %) 112 Mivel a 134 135 átalakításkor az elérhető termelés nem volt túl jó, és a termékek tisztítása is meglehetősen bonyolult, többszöri kromatografálást igénylő volt, ezért inkább egy új szintézisstratégiát készítettem. A stratégia lényege, hogy olyan, ún. ortogonális védőcsoportokat alkalmazunk, melyek egymástól függetlenül távolíthatók el. Ezért a monociklusos 95b-nek olyan analogonját (144b) állítottam elő, mely metil-észter helyett benzil-észtert tartalmaz. A szintézis logikáján nem változtattam, így ezt is enantiomeregységes L- ill. D-treonin kiindulási anyagból a már ismert 3-acetoxi-2-brómvajsav-kloridokon keresztül valósítottam meg: 44

CBn CBn Ac CBn CBn i ii iii iv Br Br CBn CBn CBn 140 (Σ = 46 %) CBn Me 141 Me Ac CBn CBn 142 (iii + iv: 70 %) v Ac Ac Ac CBn C CBn vi CBn + 143 144a 144b (Σ = 24 %) viii vii Ac C 2 Ac C 96 (Σ = 14 %) 145 (90-95 %) eagensek: i: Br 2, CCl 4 ; ii: p-anizidin, éter; iii: (2*,3S*)-3-acetoxi-2-brómvajsav-klorid, toluol, 80 C; iv: DBU, toluol; v: 1 a, piridin, 0 C; vi: 2-pikolin, 140 C; vii: 2 /Pd/C, DMF; viii: ab 4, terc-butil-alkohol A treoninból előállított 3-acetoxi-2-brómvajsav-kloridot dibenzil-malonátból előállított dibenzil--(4-metoxifenil)aminomalonáttal (140) kapcsoltam, így jutottam 141-hez. 140 előállítását a rendkívül nyálkahártya-ingerlő tulajdonságú dibenzil-brómmalonáton keresztül végeztem. 144a,b-hez vezető lépéseket analóg módon végeztem, mint 95a,b esetén. 144a és b elegyéből a keletkező 144b jelentős része EtAc-os eldörzsöléssel izolálható, az anyalúg maradék 144b tartalma az elegyet terc-butil-alkoholban felvéve 45

kiszűrhető. 144a ab 4 -es redukciója a már korábban előállított 96-ot adja, míg 144b hidrogénezésével 145-höz juthatunk. 145-öt a 110 redukálására alkalmazott vegyesanhidrides módszerrel redukáltam, a reakcióban főtermékként 146-ot kaptam, de mellette kb. 10%-ban ennek transzacetileződés eredményeképp keletkező regioizomerje, 133 is keletkezik, melyek elválasztását nem sikerült megoldani, szerkezetüket M spektrumok alapján azonosítottam. A két fő termék mellett izoláltam egy továbbredukálódott, 3-as helyzetben etilcsoportot tartalmazó molekulát is (147). A reakcióban keletkező két regioizomer alkohol aránya hosszabb reakcióidő és nagyobb feleslegű redukálószer (egyben bázis) jelenlétében 133 felé tolódik. A reakció két lépése (ClCEt-es anhidridképzés és ab 4 -es redukció) között az elegyből mintát véve meglepetésre nem a várt szénsav-észterrel képzett vegyes anhidridet, hanem az anyag szimmetrikus anhidridjét (148 a D-treoninból indított sorban) tudtam izolálni. Ac Ac C C 2 C 2 Ac 1. ClCEt 2. ab 4, -20 C + + 145 146 Σ = 97 % 133 147 C 2 Ac Ac Ac 148' Karbonsavak redukcióját leírták I 2 jelenlétében végzett ab 4 -es redukcióval is. 49 145 esetén azonban nem sikerült a reakciót megvalósítanom (ld. 5.3. 4.). Ugyan 146 és 133 keverékét nem sikerült elválasztom, de azt mezilezve éteres eldörzsölés után a kívánt 149 tisztán izolálható. A vegyület -védőcsoportja a már említett CA-os módszerrel eltávolítható (ld. először 29. old.), így 150 a 2-izoxacefémváz kialakítására alkalmas vegyülethez jutunk. 46

Ac Ac Ac C 2 C 2 Ac C 2 Ms + MsCl, Et 3, TF CA C 2 Ms 146 133 149 (85 %) 150 (70-80 %) 150-et a dioxoészteres metodikát követve sikerrel alakítottam 151 2-izoxacefémvázas molekulává. Az acetil védőcsoport eltávolítását ismét katalitikus mennyiségű ame jelenlétében metanolban kívántam elvégezni hasonlóan a transz sorban alkalmazott reakcióhoz, a reakciót szobahőmérsékleten végezve azonban zömmel 130 telítetlen vegyülethez jutottam. Ugyanerre az eredményre jutottam, amennyiben metanolban ammonolízist próbáltam alkalmazni (ld. 5.3. 5.). Fenilmetántiollal kat. mennyiségű a bázis jelenlétében forralva semmilyen reakció nem ment végbe, míg katalitikus mennyiségű PTSA jelenlétében végzett alkoholízis hatására rendkívül sok azonosíthatatlan termék keletkezett. A legjobb eredményt a ame/me-os módszer 0 C-on végzett kivitelezésével értem el (alacsonyabb hőmérsékleten egyáltalán nem tapasztaltam konverziót). Így 40%-os termeléssel jutottam 152 dezacetilezett vegyülethez, a reakcióban 130 telítetlen vegyület kis mennyiségben keletkező geometriai izomerjét (153) is izoláltam és azonosítottam. 130 és 153 telítetlen vegyületekben a kettős kötés térállására a β-metilcsoport ill. a telítetlenség hídfőatomján lévő 1 -M spektrumban megfigyelhető eltérő eltolódásából következtettem, ezt ugyanis a karbonilcsoport mágneses anizotrópiája okozza. 47

Ac C 2 Ms 150 C 154' 154 (70 %) 2 Pd/C Ac ame/me + + 0 C CBn CBn CBn 151 (40-50 %) 152 (40 %) 130 (24 %) C CBn 153 (4 %) Annak oka, hogy a 6,7-es szubsztituenseket cisz helyzetben tartalmazó vegyületek esetén az oldalláncban történő elimináció a kedvezményezett folyamat, feltehetőleg az eltérő térszerkezetben keresendő. A cisz-vegyületek esetében ugyanis a -7 sztérikusan jobban hozzáférhető helyen van, mint a transz-vegyületeknél, míg ellenben az α-acetoxicsoport a transz-vegyületek esetében van sztérikusan kevésbé zsúfolt helyen. (ld. köv. oldali ábra. A két konfiguráció reaktivitásbeli óriási különbségét már a monociklusos β-laktám észterek 95b és 144b ab 4 -es redukciójánál is tapasztaltuk, ahol a cisz-vegyületek sztérikus zsúfoltsága azt eredményezte, hogy a redukció egyáltalán nem ment végbe, ld. 28. old). 48

119 és 151 molekulamodellje (Spartan) 152 szobahőmérsékletű hidrogénezése 154 védőcsoport nélküli 2-izoxacefém-4- karbonsavat adja (ábrát ld. 48. oldalon; retroszintézisben Ib, ld. 27. old.). Megpróbálkoztam 130 hidrogénezésével is, azonban az izolált anyag azonosíthatatlan keveréknek bizonyult. [III] 154 α-epimerjének előállítását végül a 151 dezacetilezésének váratlanul rossz termelése miatt végül nem sikerült megoldanom. 4.5. Biológiai vizsgálatok Az előállított 2-izoxacefémvázas molekulák közül a 120, 122, 128 és 154-es számúakat és enantiomerjeiket antibakteriális és β-laktamázgátló hatás tesztelésére Bécsbe a ovartis/abriva Therapeutics-hoz és Párizsba a Laboratoire Biochimie École ationale Superieure de Chimie de Paris ba küldtük. A molekulákat a következő törzseken tesztelték: Staphylococcus aureus (100 mg/l koncentrációban, ampicillin kontroll), Enterococcus faecalis, Enterobacter cloacea, Serratia marcescens, Escherichia coli, Proteus vulgaris, az utóbbiak esetén 25,6 mg/l koncentrációt alkalmaztak eomycin kontroll mellett. Az eredményeket 37 C-on történő inkubálás után, 1, 2, 8 és 16 óra 49