Tavaszi-nyári reprodukciós folyamatok nyomon követése és takarmány-kiegészítő hatásának vizsgálata juhnál Novotniné Dankó Gabriella - Gyimóthy Gergely - Oláh János - Kulcsár Margit - Magyar Károly - Vass Nóra - Posta János- Balogh Péter - Jávor András e-mail: novotnine@agr.unideb.hu Összefoglalás A szerzők szapora merinó juhfajta petefészek működését vizsgálták hormonanalitikai módszerekkel tavaszi-nyári, tehát a klasszikus tenyésszezonon kívüli hónapokban. Progeszteron + PMSG tartalmú ciklusindukciós kezelés után laparoszkópos mesterséges termékenyítést végeztek. Vérplazma-progeszteron vizsgálattal és UH-os vemhességvizsgálattal követték nyomon az állatok petefészek működését, termékenyülését, vemhességének lefolyását április-augusztus hónapokban. Mikroelem és vitamin tartalmú Ovitrace plus for sheep takarmány-kiegészítő hatását is vizsgálták a termékenyülésre. Eredményeik szerint az áprilisi - májusi időszakban a szapora merinó anyák negyede ciklikus petefészek-működésű, de az acikliás egyedek jól reagálnak ciklusindukciós kezelésre. A vemhesülési és ellés % a szezonon kívüli időszakban megfelelő (68, illetve 49 %), a vemhesség lefolyását azonban sok külső tényező, főképpen takarmányozási és időjárási hatások befolyásolhatják. Vizsgálataik alapján az Ovitrace takarmány kiegészítő alkalmas lehet a magzatelhullásokból származó bárányveszteség csökkentésére. Summary Examination of ovarian function, the conception and the embryo loss of ewes in out-of season reproductive period The authors examined the ovarian function of Prolific Merino sheep breed by hormoneanalytical methods in spring and early summer. Blood plasma progesterone level was measured for fallowing up the ovarian function; examine the reaction of ewes for cyclus induction methods, rate of conception and the process of pregnancy, respectively. Laparoscopic artificial insemination and ultra-sound pregnancy control were applied. According to results the cyclus induction was very effective for Prolific Merino in out-of season reproductive period. The Ovitrace for sheep supplementary can be serviceable to reduce embryo loss.
Irodalmi áttekintés A mérsékelt égöv alatt élő parlagi juhfajták ivari viselkedése, a szezonalitás részben a hőmérséklethez való alkalmazkodás eredménye, az év folyamán szexuálisan aktív ösztrusz időszak (tenyésszezon vagy ciklusos állapot) és inaktív ún. anösztrusz időszakok (acikliás petefészek-működésű állapot) váltják egymást (12). A jerkék petefészek működésének ciklusát a hypothalamusban (HTh), a hypophysisben, a tüszőben, a sárgatestben és a méhben termelődő hormonok, és ezek egymás közötti kapcsolata szabályozza pozitív és negatív feedback láncolatokon keresztül (1,2). Az ivari működés szezonális jellegének élettani alapja a juhfajban az ösztrogén (E2) idukált pozitív visszacsatolás, azaz a hypothalamus surge centerének a szintjén érvényesülő E2-indukált pozitív feed-back válaszkészség (3). Kiskérődzők esetében az ivari működés szonális jellege és annak mértéke genetikailag meghatározott tulajdonság, amelyet külső tényezők szinkronizálnak (4). A legfontosabb környezeti tényező a fény, mely a fotoperiodikus szabályozórendszeren keresztül hat. Ez magában foglalja a szemet, a hypothalamus suprachiasmaticus magjait (SCN) és a tobozmirigyet, mely a melatonin hormont termeli (8). A hormonszint-emelkedés időtartama kritikus tényező a melatonin-hatás reprodukciós érvényesülésében, mely szabályozza GnRH, valamint ennek következtében az LH lökésszerű felszabadulását is (4,10). Az LH koncentráció meghatározott értéke szükséges majd a sárgatest progeszteron (P4) szekréciójának beindulásához is. A plazma progeszteron koncentrációja az egyéb állatfajokhoz hasonlóan juhon is az élettani állapotnak megfelelően jellegzetesen változik (7). Két-három nappal az ovuláció után a progeszteron szint emelkedése figyelhető meg a perifériás vérben, ilyenkor kezdi el aktív tevékenységét a sárgatest (corpus luteum, CL). A progeszteron koncentráció maximális szintjét a ciklus 10-12. napján éri el, amely fennmarad a luteolízisig, tehát a ciklus 14-15. napjáig. A mérsékelt égövi parlagi juh fajtáknál még erőteljes hatású az ivari működés szezonális élettani mechanizmusa - ősszel a nappalok rövidülésének hatására (szeptember-október) ivarzanak és tavasszal ellenek, az év többi részére mély anösztrusz jellemző- azonban a domesztikált és különböző tenyész célokra szelektált fajták megfelelő körülmények között már egész éven át képesek lehetnek az ivarzásra és fogamzásra (6). Az ivari tevékenység élénkebb, vagy mérsékeltebb megnyilvánulását a hőmérséklet és a légnyomás is befolyásolja. Hőmérséklet tekintetében a juh elsősorban a melegre érzékeny, ami gátolja az ivarzást, rontja az embrió megtapadásának esélyét, gyengíti a született bárányok életképességét (11).
Saját vizsgálat A kutatómunka keretén belül 47 szapora merinó anya petefészek működését, termékenyülési eredményeit, vemhességének lefolyását monitoroztuk április-augusztus hónapokban, a klasszikus tenyésszezonon kívüli időszakban. Célunk volt annak vizsgálata, hogy a szaporodásbiológiai szempontból legkritikusabbnak tekinthető tavasz végi - kora nyári időszakban milyen a ciklikus petefészek-működésű egyedek aránya és hogy a szapora merinó egyedek miként reagálnak a ciklus-szinronizációs/indukciós kezelésre. A termékenyítést júliusban végeztük. Termékenyítés után progeszteron-szintmérésekkel és ultrahangos vemhességvizsgálattal követtük nyomon, hogy vemhesült-e az állat, illetve történt-e magzatelhalás ebben a szezonon kívüli, nyári időszakban. Mikroelem és vitamint-tartalmú Ovitrace plus for sheep (a kísérlethez felajánlotta: Hajdú- Vet Kft, Debrecen) takarmány kiegészítő hatását is vizsgáltuk a termékenyülésre. Anyag és módszer Kísérletsorozatunkat a Debreceni Egyetem Agrár- és Gazdálkodástudományok Centruma (DE AGTC) kísérleti juhtelepén végeztük az évnek szaporodásbiológiai szempontból kritikus időszakában, vegyes életkorú és kondíciójú szapora merinó anyajuhokon 2009 évben. A kísérletbe vont szapora merinó anyák tél végén (február 07. és március 01. között) ellettek, vegyes életkorúak (2-8 év), súlyúak (39±6,3 kg) és kondíció pontszámúak (2,2± 0,8) voltak. Az anyákat illetve jerkéket a tél folyamán lucernaszéna és búzaszalma ad libitum etetése mellett karámozták, április elejétől pedig legeltették. Mivel a termékenyítést a mérsékelt égövi fajták szaporodásbiológiailag kedvezőtlen, fiziológiásan anösztruszos időszakában terveztük, ezért a szezonon kívüli petefészek működést is vizsgáltuk április-június hónapban. A petefészek működésére, a sárgatest jelenlétére utaló vérplazma progeszteron (P4) szintet határoztuk meg egyedenként. A kísérleti anyáknál június közepén ivarzásszinkronizációt (illetve ivarzás indukciót) végeztünk, 40 mg fluorogeszton acetát tartalmú Chrono-gest hüvelyszivacs (Intervet, Boxmeer, Hollandia) és 500 NE PMSG (pregnant mare serum gonadotrophin) tartalmú Folligon injekció i.m. (Intervet, Boxmeer, Hollandia) alkalmazásával. Termékenyítésük laparoszkópos mesterséges termékenyítéssel történt július elején. Ultrahangos vemhesség vizsgálatot augusztusban, a termékenyítés után 38-39. napon és az 52.-53.napon végeztünk. A kísérlet a 1-es táblázatban feltüntetett időrend szerint zajlott.
A vérmintákat a torkolati véna (vena jugularis) punkciójával, trikálium EDTA vakuténeres csövekbe gyűjtöttük, 1 órán belül centrifugáltuk (5100 G-n 8 percig). A plazmából 1-1,5 ml-t Eppendorf-csőbe pipettáztunk és a plazmamintákat feldolgozásig -20 C o -on tároltuk. A vérplazma progeszteron tartalmának meghatározását MEIA (Mikropartikuláris Enzim Immuno Assay) módszerrel végeztük az Abbott Axsym készülékén juh fajra történő validálás után. A konroll minták (saját alacsony, közép és magas és gyári kontroll) intra- és interesszé CV% értékei végig 10% alatt voltak A szapora merinó anyáktól a tavaszi ellés utáni 60-76. napon kezdtük el a mintavételeket. Az ivarzásindukcióig (tamponálásig) levett 8 minta progeszteron-szint alakulásából megállapítottuk, hogy a tél végi ellés után ciklusba lendült-e és ha igen, mikor. Ciklikusnak ítéltük a petefészek működését, ha a tamponálás előtti nyolc vérplazma-mintából legalább az egyikben CL jelenlétére utaló, emelkedett ( 3,18 nmol/l) progeszteron szintet találtunk. Tamponkivétel után 60 órával történt a laparoszkópos termékenyítés, utána 3 nappal, majd 7 héten át hetente újabb vérmintákat vettünk. Ezekből az eredményekből arról kaptunk információt, hogy a gesztagén+pmsg kezelés hatására ciklusba lendültek-e az előzőleg acikliás állatok, valamint a progeszteron szint tartós (16. napot követően is magas) emelkedése termékenyülésre utalt, a későbbi csökkenés pedig esetleges magzatelhalásra. Az Ovitrace plus for sheep (Hajdú- Vet Kft, Debrecen) kelát formájú vitamin és ásványianyag tartalmú takarmány-kiegészítőt kísérleti céllal adtuk 24 anyának (per os. 1x 10 ml) termékenyítés előtt 6 héttel, a másik 23 állat pedig kontrolként szerepel. Eredmények Szezonon kívül ciklikus és acikliás egyedek aránya és a vemhesülési mutatók A vizsgált évben a hormonkezelés (tamponálás) előtti, április közepe és június közepe között vett vérminták progeszteron szintje alapján a 47 szapora merinó anyából 35 egyed (75%) acikliás volt, nem mutatott ciklikus petefészek működést. A vizsgált állomány 25 %-a, 12 állat endokrinológiailag ciklusban lévőnek bizonyult. A gesztagén kezelés utáni progeszteron vizsgálatok eredménye alapján az anyák 91%-a ciklikus petefészek-működést mutatott, csupán 4 állat nem lendült ciklusba az alkalmazott gesztagén+pmsg kezelés ellenére sem (1. ábra). A 47 állatot két csoportban (két napon) termékenyítettük, a gesztagén forrás eltávolítása+pmsg kezelés július 7-én és 8-án este történt, 60 óra múlva, július 9-én és 10.-én reggel laparoszkópos mesterséges termékenyítést végeztük.
A július 13-i, 20-i és 27-i hormonanalitikai vizsgálatok alapján 32 állatnál mértünk emelkedett progeszteron szintet ( 3,18 mmol/l), ennek alapján a vemhesülési arány 68%-os volt tekinthető. A többi 15 állatból 4 acikliás maradt, 11-nél emelkedett progeszteron szintet regisztráltunk az első két mérésnél, majd a termékenyítés utáni 17. napon lecsökkent. Ez azt jelenti, hogy ciklusba lendült az állat, de nem termékenyült. Késői embrionális vagy magzatelhalás összesen 28 %, 32 vemhesült állatból 9 anyánál következett be, zömében a termékenyítést követő 24. napon belül. A 47 termékenyített állatból 23 ellett meg, december elején, ami 49%-os ellési arány. Az előzetesen ciklikus egyedek vemhesülési és ellési aránya jobb volt (83 és 58 %), magzatvesztése kevesebb, mint az acikliásoké (63 és 46%). A szezonon kívül ciklikus petefészek működésű egyedek és az acikliások vemhesülési mutatói eltértek, de a Fisher-féle ekzakt próba nem mutatott ki különbséget (p = 0,171) (2. táblázat). A hormonanalitikai vizsgálatokból megállapítható, hogy az április-májusi időszakban a szapora merinó anyák negyede ciklikus petefészek működést mutat. Az alkalmazott ciklusindukcióra (gesztagén+pmsg kezelésre) az acikliás egyedek is jól reagálnak, a vizsgált egyedek 91%-ánál következett be tüszőrepedés a ciklusindukciós kezelés után. Eredményeink szerint a tavaszi, tenyész-szezonon kívüli ciklusindukció a szapora merinó fajtánál igen hatékony, a vemhesülési eredményeket azonban sok külső tényező, főképpen takarmányozási és időjárási hatások befolyásolhatják. Az ultrahangos vemhességvizsgálat eredménye Ultrahangos vemhességvizsgálatot augusztus 17.-én, a mesterséges termékenyítés utáni 38.- 39. napon végeztünk először. Ekkor 11 pozitív ( vemhes ) eredményt regisztráltunk, 14 állatnál nem volt egyértelműen megállapítható a vemhesség, 22 állatnál negatív ( nem vemhes ) eredményt kaptunk. A második UH vizsgálatnál augusztus 31.-én, a termékenyítés utáni 52.-53. napon az előzőleg 11 vemhes -ből 9-et újra vemhesnek találtunk, 2-nél már negatív volt az eredmény. Ebből az egyiknél a progeszteron szintben is látszott egy jelentős visszaesés az aug.17 és 24. közötti mért P4 értékekben, a másiknál az UH vizsgálat előtt jóval korábban, július 27-én már alacsony P4 szint volt mérhető. A második UH vizsgálatnál összesen 24 állat volt pozitív ( vemhes ), ebből 23 megellett. Egyet, bár mindkét UH vizsgálaton vemhesnek ítéltünk nem ellett meg és a progeszteron szintje is mindvégig alacsony volt. Az életkor hatása a termékenyülésre
A vizsgálatba vont szapora merinó egyedek vegyes életkorúak voltak, kettőtől nyolc évesig. A 2-es ábrán láthatóan azonban minden korosztályból legalább 40-50%-a leellett az egyedeknek, a legfiatalabbak nem ellettek le (2. ábra). A hőmérséklet hatása a termékenyülésre és a magzatelhalásra A vemhesülési arány a kísérleti állatcsoportnál a szezonon kívüli nyári időszakban igen jó volt, 68% a progeszteron analízis eredményei szerint. Ez köszönhető a vemhesítés napján relatív alacsony hőmérsékletnek 17 C o, illetve az érvényesülő lehűlésnek, hidegfronti hatásnak (3. ábra). A nagyarányú (28 %-os) magzatvesztés okai között szerepelhetett a következő napok erős felmelegedési ciklusa, amikor a napi középhőmérséklet a hónap elejeit meghaladva 26 C o -ot is elérte, illetve erős ingadozásokat mutatott. Az OVITRACE takarmány kiegészítő hatása Azon csoportnál, mely OVITRACE for sheep takarmány kiegészítőt kapott közel azonos volt a termékenyülési arány, mint a kontrol csoportban (67, illetve 69%), viszont a kontrol csoport vemhesült egyedeinél nagyobb mértékben tapasztaltunk magzatvesztést, mint a kezelt csoportnál (38, illetve 19%), de a Fisher-féle ekzakt próba szignifikancia szintje p=0,217 volt. (3. táblázat) az induló állományra vetítve a kísérleti csoportból 54 %, míg a kontrollból 43 % ellett meg. Következtetések Vizsgálataink eredményei szerint az áprilisi - májusi időszakban a szapora merinó anyák negyede ciklikus petefészek-működésű, de az acikliás egyedek jól reagálnak az általánosan használt, gesztagén + PMSG alkalmazásával végzett ciklusindukcióra. A vemhesség lefolyását azonban sok külső tényező, főképpen takarmányozási és időjárási hatások befolyásolhatják. Fontos az állatok valós igényeit kielégítő energiaellátás biztosítása, ami további kutatások tárgyát képezheti, az energetikai státusz megítéléséhez például értékes információkat szolgáltathat egyes metabolikus hormonok (inzulinszerű növekedési faktor-1: IGF-1, inzulin, leptin) meghatározása. A szezonon kívül ciklikus és acikliás egyedek aránya és a vemhesülési mutatók a szapora merinó fajta esetében az előzetesen ciklikus egyedek vemhesülési és ellési aránya jobb volt (83 és 58 %), magzatvesztése kevesebb, mint az acikliásoké. Az Ovitrace plus for sheep szájon át adható kelát formájú nyomelem és multivitamin tartalmú takarmány kiegészítő juhok számára. A kelát forma biztosítja az állati szervezet számára az egészség
fenntartásához és a megfelelő termékenyüléshez szükséges nyomelemek maximális hozzáférhetőségét. Az Ovitrace takarmány kiegészítővel feltehetően csökkenthető a magzatelhullásokból származó bárányveszteség, bár ebben a kísérletben a statisztikai teszt nem tudott kimutatni jelentős különbséget (valószínűleg a kis állatlétszám miatt) de a százalékok alapján további vizsgálatok javasolhatók, mivel az eltérések megfigyelhetők voltak. Köszönetnyilvánítás A szerzők mély tisztelettel adóznak Huszenicza Gyula Professzor Úr munkássága előtt. Tanár Úr még ezen kísérletsorozat előkészítésében is részt vett, ameddig ereje engedte gondoskodással segítette munkánkat. A szerzők közül külön köszönik Novotniné Dankó Gabriella, Gyimóthy Gergely és Oláh János Tanár Úrnak PhD dolgozatuk elkészítésében való segítségét, témavezetését. Emlékét kegyelettel megőrizzük. Továbbá köszönjük dr. Faigl Vera állatorvosnak (SZIE ÁOTK tudományos segédmunkatárs) étékes szakmai tanácsait, amivel segítette a cikk elkészülését. Irodalomjegyzék 1. ADAMS, G.P.: Comparative patterns of follicle development and selection in ruminants. J. Reprod. Fert., 1999. Suppl. 54. 17-32. 2. DRIANCOURT M.A.: Regulation of ovarian follicular dynamics in farm animals. Implications for manipulation of reproduction. Theriogenology 2001. Vol.55 No.6 pp:1211-1239 3. FAIGL V., MARTON A., KERESZTES M., NOVOTNINÉ DANKÓ G., CSATÁRI G., ANTAL J., NAGY S., ÁRNYASI M., KULCSÁR M., CSEH S., HUSZENICZA GY.: Az anyajuhok szaporodási teljesítményének növelésével összefüggő egyes újabb élettani kérdések és ezek technológiai vonatkozásai. Irodalmi áttekintés. Magy.Áo.Lapja 2005. 127.évf. 10. sz.. pp: 586-593 4. FAIGL V., KERESZTES M., MÁRTON A. SCHNEIDER Z., KORVIN L., NAGY S., NOVOTNINÉ DANKÓ G., ÁRNYASI M., KULCSÁR M., JÁVOR A., CSEH S., HUSZENICZA GY.: Melatonin-, ill. fénykiegészítés alapú ciklusindukciós technikák kiskérődzőkben. Élettani vonatkozásaik és gyakorlati alkalmazás. Irodalmi áttekintés. Magy.Áo.Lapja 2007. 129. évf. 4.sz. pp: 219-230 5. HARASZTI J. : A háziállatok szülészete és szaporodásbiológiája. Mezőgazdasági kiadó. Budapest 1987. ISBN: 963-232-453-6
6. HUSZENICZA GY., FAIGL V., KERESZTES M., BALOGH O., KULCSÁR M., CSEH S., SOLTI L.: A fenntartható fejlődés szaporodásbiológiai alapjai kérődzőkben. Animal welfare, etológia és tartástechnológia. 2008. 4. Különszám, 9-18. 7. KULCSÁR, M.- PETHES GY.-NAGY E.: Az un."javuló tápláltsági állapot" (flushing) hatása a plazma progeszteron koncentrációjára a ciklus és a korai vemhesség idején juhokban. Magy. Áo.Lapja 1982. 37. évf. 5. sz. pp.:323-326 8. LINCOLN, G.A.-LINCOLN, C.E.- MCNEILLY, A.S.: Seasonal cycles in the blood plasma concentration of FSH, inhibin and testosteron, and testicular size on rams of wild, feral and domesticated breeds of sheep J. Repr. Fert. 1990. Vol. 88, issue 2. pp:623-633 9. LINCOLN, G.A.: Photoperiod- melatonin relay in deer. Act.Vet.Hun. 1998. 46 (3) pp.: 341-357 10. MALPAUX, B.- THIERY, JC.-CHEMINEAU, P. :From the eye to the pitutary: Pathways controlling seasonal Reproduction. Reprod. Dom.Anim. 2000. Supplem.6. 3 rd Conference of the ESDAR 11. MUCSI I. (szerk): Juhtenyésztés és tartás. Mezőgazdasági kiadó, Budapest. 1997. ISBN: 963-9121-24-X 12. SCARAMUZZI R.J.- ADAMS N.R.- et.al : A model for follicle selection and the determination of ovulation rate in the ewe. Reprod.Fertil.Dev. 1993. Vol.5 Nr.5. pp.:459-478
1. táblázat: A kísérlet időrendje Table 1: Timing of the experiment Időpont Szapora merinó Dátum /gyakoriság/ vérvétel sorszáma Ellés utáni 1. Ápr. 28. 60-76. nap 2.-7. minta Május 5. - Június 18.-ig /7-10 naponta/ Tamponálás 8. Június 24-25 Tampon kivétel 9. Július 7-8 Mesterséges termékenyítés (MT) 10. Július 9-10 11.-18. Július 13. Aug.31.-ig /hetente/ UH-os vemhességvizsgálat Aug.17. és Aug.31. (MT után 38.-39. napon és 52.-53. napon) 2. táblázat: Szezonon kívül ciklikus és acikliás egyedek aránya és vemhesülésük Table 2: Number of cyclic and acyclic ewes in out of season period and their conception ÖSSZES ANYA n=47 (100%) CIKLIKUS n=12 (25%) ACIKLIÁS n=35 (75%) db % db % db % Vemhesült 32 68 10 83 22 63 Leellett 23 49 7 58 16 46 Magzatelhalás 9 28 3 30 6 27
3. táblázat: Az OVITRACE-szel kezelt és nem kezelt állatok vemhesülési, magzatelhalási adatai Table 3: The conception rate and the miscarriage of the control and experimental group treated with OVITRACE OVITRACE KÍSÉRLETI n=24 KONTROL n=23 db % db % Vemhesült (P4 alapján) 16 67 16 69 magzatelhalás 3 19 6 38 ellett (a vemhesültből) 13 81 10 62 ellett (az összesből) 13 54 10 43 1. ábra: A vizsgált állomány petefészek működése gesztagén kezelés előtt és után (%) Diagram 1: The ovarian activity of the experimental Prolific merino flock before and after gestagen treatment (n=47) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 gesztagén kezelés előtt gesztagén kezelés után ciklikus acikliás
2. ábra: A vizsgált szapora merinó anyák korfája és a leellett anyák száma (db) Diagram 2: The age and the lambing of Prolific Merino ewes Korfa és leellett anyák száma 8 8 5 7 0 2 anya kora (év) 6 5 4 2 4 5 2 5 4 nem ellett leellett 3 3 5 2 2 0 2 4 6 8 10 12 14 anyák száma (db) 3. ábra: 2009 évi júliusi napi középhőmérsékleti diagram Diagram 3: Mean temperature in July 2009 (Forrás: www.met.hu)