MEMBRÁNSZERKEZET, MEMBRÁNPOTENCIÁL, AKCIÓS POTENCIÁL Biofizika szeminárium 2012. 09. 24.
MEMBRÁNSZERKEZET Biológiai membránok (citoplazma, sejten belüli membránféleségek) közös jellemzője: Nem kovalens kötésekkel összetartott lipidekből és fehérjékből állnak. Fő komponens: foszfolipid, amfipatikus molekulák Foszfolipid: diglicerid + foszfát csoport + szerves molekula Foszfatidil-kolin
Membrán-modellek Lipid-oldékony anyagok gyorsan bejutnak a sejtbe. Amerikai fizikai kémikus 1932 Nobel díj Zsírok egyrétegű elrendeződése a víz felszínén. Benzin-lipid keverék, a benzin elpárolgása után molekuláris lipid film keletkezik Benzin-oldékony lipidek két rétegből álló filmet alkotnak víz felszínén. 1925 Kettős lipidréteg A fehérjék integráns részei a sejt membránnak. A lipid bilayert kívül-belül proteinek rétege fedi. Részben magyarázza a proteinek, cukrok, ionok és más hidrofil anyagok gyors átjutását. Elektronmikroszkóp felfedezése. A sejtek plazmamembránnal burkoltak. Unit-membrane modell. 1972 Folyékony mozaik modell Proteinek mozaikos elrendeződése a membránban. Egyes proteinek átérik a membránt, transzmembrán proteinek. Dr. habil. Kőhidai László
KETTŐS LIPIDRÉTEG A membrán kétszer annyi lipidet tartalmaz, mint amennyi indokolt lenne. Gorter, E. and F. Grendel. 1925. On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes of the blood. 439-443. The Journal of Experimental Medicine. 41:439-443.
FLUID MOZAIK MEMBRÁN MODELL Singer Nicolson 1972 vvt. membrán
SEJTMEMBRÁN SZERKEZETE
MEMBRÁNFEHÉRJÉK Meghatározzák a membránok funkcióit. Csoportosítás: Szerep: Integrális membránfehérjék (transzmembrán) hidrofób maghoz kapcsolódnak, vagy átívelik a membránt. Perifériális membránfehérjék nem közvetlenül, hanem az integrális fehérjéken keresztül kapcsolódnak a membránhoz. Glikoproteinek ezek az oligoszacharidok az extracelluláris oldalon kapcsolódnak a membránfehérjékhez. Glikozil foszfatidil inozitol (GPI) kovalensen kötődnek a membránlipidekhez. Ioncsatornák Receptorok Jelátvitel
NYUGALMI MEMBRÁNPOTENCIÁL
A NYUGALMI MEMBRÁNPOTENCIÁL Tintahal óriás axon Preparált izomsejtek Mikroelektródddal történő vizsgálat. (KCl oldattal töltött azonos mobilitás. Nincs zavaró diffúziós pot.) Az élő sejt belseje és külső felszíne között mérhető potenciálkülönbség. V Extracelluláris + (0 mv) Intracelluláris ( -70 mv)
Membrán-potenciál 0V U nyugalmi : -30mV _ -100 mv Mikroelektróda A sejtmembrán két oldala között kialakuló elektromos potenciálkülönbség (V). Intracelluláris tér Extracelluláris tér
AZ INTRA- ÉS EXTRA-CELLULÁRI TÉR FŐ ÖSSZETEVŐI Víz Ionok Kationok (K +, Na +, Ca 2+ ) Anionok (Cl -, H 2 PO 4 és HPO 4 2 ionok) Fehérjék Főleg intracellulárisan Többnyire negatívak (ph! izoelektromos pont)
A TÖLTÖTT RÉSZECSKÉK MOZGÁSÁT BEFOLYÁSOLÓ ERŐK Kémiai potenciál: (Willard Gibbs - 1876) A kémiai potenciálja egy termodinamikai rendszernek azzal az energiamennyiséggel egyenlő, amennyivel a rendszer teljes energiája megnőne, ha növelnénk a rendszerben lévő alkotóelemek számát. Koncentráció grádiens diffúzió: részecskék mozgása a nagyobb koncentrációjú helyről a kisebb koncentrációjú hely felé diffúziós potenciál. Elektromos potenciál: Az elektromos térben lévő töltött részecskére vonatkozó energiamennyiség. Az elektromos tér erőt fejt ki a töltött részecskére (ionok, fehérjék) elektromos áram: töltött részecskék mozgása. Elektrokémiai potenciál
A nyugalmi membrán-potenciál eredete Bernstein kálium hipotézise Nernst-féle egyensúlyi potenciál (elektromos potenciál - kémiai potenciál) Donnan egyensúly: a membrán egyes ionos összetevők számára átjárhatatlan (pl. intracelluláris fehérjék). Goldman egyenlet: az egyensúlyi potenciálok és a membránpermeabilitások súlyozott értékeit valamint az abszolút ionkoncentrációk értékeit egyaránt figyelembe kell venni.
Nernst - egyenlet Kémiai potenciál W chem NRT ln X X 1 2 N = a koncentrációgrádiens kialakításában résztvevő mólok száma R = egyetemes gázállandó T = abszolút hőmérséklet X 1 / X 2 = koncentráció grádiens Elektromos potenciál W elektr NzFE N = az elektromos potenciálkülönbség kialakításában résztvevő töltött részecskék móljainak száma z = valencia (vegyérték) F = Faraday szám E= elektromos térerő (V)
Egyensúlyi feltétel NzFE NRT ln X X 1 2 zfe RT ln X X 1 2 E RT zf ln X X 1 2
EGYENSÚLYI POTENCIÁL Nernst-egyenlet: Mekkora elektromos potenciál (E) képes egyensúlyban tartani a kialakult koncentráció grádienst (X 1 /X 2 ). A befelé és kifelé történő ionáramok dinamikus egyensúlyban vannak. E RT zf ln X X 1 2
IONKONCENTRÁCIÓK BÉKA IZOMSEJT ESETÉN Na + : 120 mm K + : 2.5 mm Cl - : 120 mm Na + : 20 mm K + : 139 mm Cl - : 3.8 mm [K + ] E mv = -58/1 log (139/2.5) = - 101.2 mv [Na + ] E mv = -58/1 log (20/120) = + 45.1 mv [Cl - ] E mv = -58/1 log (3.8/120) = + 86.9 mv = 30.8 mv Nyugalmi potenciál (mért) E mv =-92mV
A Nernst-egyenlet önmagában nem alkalmas a membránpotenciál meghatározására. Más értékeket kapunk, ha külön-külön számoljuk a potenciál értékeket és mást, ha mérjük a nyugalmi potenciált. Nem zárt rendszer Az ionok viselkedése nem független egymástól.
Egyensúlyi potenciál [K + ] E mv = -58/1 log (139/2.5) = - 101.2 mv K + =2.5 mm K + =139 mm - + - 101.2 mv E mv = - 101.2 mv E mv > - 101.2 mv E mv < - 101.2 mv töltések nettó mozgás zéró (egyensúly) K + áramlik ki K + áramlik be Egy ionra nézve az a feszültség érték, mely egyensúlyt tart a koncentráció különbséggel.
Egy átlagos nyugvó állati sejtben: - kifelé K + áramot befolyásolja: nagy koncentrációkülönbség nagy K + permeabilitás negatív membránpotenciál - befelé Na + áramot befolyásolja: nagy koncentrációkülönbség kis Na + permeabilitás negatív membránpotenciál Így a két áram egyenlő stabil nyugalmi V m
SZIVÁRGÁS a membrán-potenciál egyetlen ionra nézve sem egyenlő az adott ion egyensúlyi potenciáljának az értékével EmV_K + = -101.2 mv EmV_Na + = +45.1 mv EmV_Cl - = +86.9 mv E mv = - 92mV az ionok megpróbálnak átjutni a membránon ok + próbál kijutni ona + próbál bent maradni ocl - próbál bent maradni Szivárgás
IONCSATORNÁK Nyugalmi v. független ioncsatornák Működésüket nem befolyásolja a membránpotenciál értéke (pl. nyugalmi K + csatornák; K + -Na + szivárgó csatornák) Függő ioncsatornák Kinyílnak speciális ligandok vagy membránpotenciál változás esetén (pl. feszültségfüggő K + és Na + csatornák)
SZIVÁRGÓ IONCSATORNÁK 100x jobban átjárhatóak a kálium számára mint a nátriumra. Az ionok lassú és állandó mozgása jön létre. Kompenzálásra szorul. K + Na + K + Na + Nátrium-kálium (K + -Na + ) szivárgó csatorna
NA-K ATPÁZ A nyugalmi membránpotenciál kialakulásának főszereplői a K + és Na + ionok (eltérő eloszlás és membránpermeabilitás). A Na-K ATPáz képes ellensúlyozni a Na + és K + passzív áramlását, aktív munka kifejtése árán hozzájárul a membránpotenciál kialakulásához. 3 Na + kifelé és 2 K + befelé történő mozgatását végzi. Működéséhez ATP szükséges.
AKCIÓS POTENCIÁL
Ingerlékeny sejtek membránján: ideg-,izomsejtek, egyes receptorok vagy szekréciós sejtek Sejttípusra jellemző, állandó alak és időbeli lefutás Küszöb feletti inger
Akciós potenciál: a nyugalmi membránpotenciál időleges megváltozása ~ - 70mV-ról + 40 mv-ra, melyet a nyugalmi potenciál visszatérése követ Ionok membránon keresztüli mozgásának eredménye Stimulus a membrán potenciál megváltozása (küszöbpotenciál) akciós potenciál Kialakulása a minden vagy semmi törvényét követi Ingerküszöb (küszöb-potenciál) alatti ingerlés esetén nincs AP. Ingerküszöb (küszöb-potenciál) feletti inger mindig egyforma és teljes depolarizációt okoz. Az akciós potenciálnak különböző fázisai különíthetőek el.
Nyugalmi fázis (potenciál)
1. Emelkedő fázis Depolarizációs küszöb feletti inger hatására a feszültségfüggő Na + csatornák megnyílnak.
3. Csúcs fázis Na + beáramlás lelassul EmV_Na + = +45.1 mv (Nernst egyenlettel számolható egyensúlyi potenciál) Na + csatornák egy részének inaktiválódása K + csatornák nyitása megindul 2 3
4. Csökkenő fázis Feszültségfüggő K + csatornák teljesen megnyílnak Nagyfokú K + kiáramlás a sejtből Na + csatornák teljes bezáródása (inaktiválódás) refrakter periódus 2 3 4
5. Utódpotenciál Na + csatornák teljes bezáródása (inaktiválódás) refrakter periódus A K + ionok beáramlása lassul EmV_K + = -101.2 mv (Nernst egyenlettel számolható egyensúlyi potenciál) A K + csatornák teljes bezáródása A nagyszámú és lassan inaktiválódó K + csatorna hiperpolarizációt eredményez
Az intracelluláris ionkoncentráció változás nagysága az AP során kicsi (0.0001% - 1% a vastag illetve vékony axonokban). Na + /K + ATPáz visszaállítja a nyugalmi potenciál eredeti értékét, de nem azonnal. Na + /K + ATPáz bénítását követően tintahal óriás axonjában még további 100,000 impulzus kiváltása után is csak 10%-al nő meg az intracelluláris Na+ koncentráció.
Refrakter periódus Abszolút RF Az abszolút refrakter fázis alatt a Na+csatornák inaktivált állapotban vannak. Új akciós potenciál kialakulása teljesen gátolt. Relatív RF A relatív refrakter fázis alatt a Na+csatornák egy része már megnyitható (aktiválható) állapotban van. Az ingerküszöbnél nagyobb depolarizáció elindíthatja az AP létrejöttét.
Membrán-potenciál K + és Cl - ionok áramlása plató-fázis Egyensúly a Ca 2+ felszabadulás és a kifelé történő K + áramlás között ~+35mV Gyors depolarizáció gyors Na + beáramlás K + kiáramlás ~-90mV 0 ms 350 ms Idő (ms) Nyugalmi membrán potenciál Nyugalmi membrán potenciál
PATCH-CLAMP MEMBRÁNFOLT FESZÜLTSÉGRÖGZÍTÉS Mikroelektrofiziológiai technika Mikroelektróda: 0,5-1 μm átmérőjű, megfelelő összetételű elektrolitoldatot tartalmaz. Nagy ellenállású kapcsolat jön létre Így csak a mikroelektród alatt lévő területen elhelyezkedő ioncsatornák áramát tudjuk mérni. Egyedi csatornák vizsgálatára alkalmas. Ionáram jellemzői: Adott csatornára (fajtára) mindig ugyanakkora áram jellemző. Azonos intenzitású Lehet következtetni, hogy hány csatornát mérünk egyszerre.