A növényvédelemben alkalmazható gyógynövény illóolajok főkomponenseinek ciklodextrin komplexei

Tudományos Diákköri Dolgozat OLÁH ESZTER A növényvédelemben alkalmazható gyógynövény illóolajok főkomponenseinek ciklodextrin komplexei Témavezetők: Dr. Orgoványi Judit és Dr. Fenyvesi Éva Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 27 1

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE CD = ciklodextrin α-cd = α-ciklodextrin β-cd / BCD = β-ciklodextrin γ-cd = γ-ciklodextrin RAMEB = véletlenszerűen (random) metilezett-β-ciklodextrin DIMEB = heptakisz-2,6-di-o-metil-β-ciklodextrin MA-RAMEB = monoamino- véletlenszerűen (random) metilezett-β-ciklodextrin MA-BCD = monoamino-β-ciklodextrin HPBCD = 2-hidroxi-propil-β-ciklodextrin SU-RAMEB = szukcinil- véletlenszerűen (random) metilezett-β-ciklodextrin SU-BCD = szukcinil-β-ciklodextrin TG = termogravimetria (Thermogravimetry) DTG = derivált termogravimetria (Differential Thermal Gravimetry) DTA = differenciális termikus analízis (Differential Thermal Analysis) XRPD = röntgen pordiffrakció (X-Ray Powder Diffraction) GC = gázkromatográfia (Gas Chromatography) HPLC = nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (High Performance Liquid Chromatography) 2

1. BEVEZETÉS A növényvédelemben ma a legelterjedtebb és leghatásosabb módszer a vegyszeres kezelés, amely ugyan a növény károsítóit nagymértékben elpusztítja vagy elriasztja, viszont a környezetünket is jelentősen megterheli. Emiatt munkám során arra törekedtem, hogy minél inkább környezetbarát, egészségre kevésbé ártalmas növényvédő szer formulációkat állítsak elő, és ezzel megvalósítsam a növényvédelem szelíd formáját. Egyik ilyen lehetőség a növényekből kivonható illóolajok, illetve illóolaj komponensek alkalmazása, melyek rovarriasztó, gombaölő és antibakteriális hatása már régóta ismeretes. Illékonyságuk, levegőre és hőre való érzékenységük miatt azonban a növényvédelemben való használhatóságuk korlátozott. A ciklodextrin-vendégmolekula zárványkomplexek képzésével szeretném elérni, hogy a rovarriasztó hatású gyógy- vagy gyomnövények illékony, instabil illóolajai elegendően stabil formába kerüljenek, hogy ezzel használhatóságukat a mindennapi életben lehetővé tegyem. Munkám során célul tűztem ki, hogy a kiválasztott illóolajok (levendulaolaj, citromfűolaj, kakukkfűolaj és borsmentaolaj) főbb komponensei (linalool, citrál, borneol, timol, mentol) és a különböző ciklodextrin származékok kölcsönhatását felmérjem. Ennek legegyszerűbb módja a hatóanyagok különböző ciklodextrinek (BCD, RAMEB, MA-RAMEB, SU-RAMEB, HPBCD) vizes oldatában való oldhatóság-változásának követése. Az oldhatósági izotermák alapján a hatóanyagokhoz leginkább illő ciklodextrin származékok kiválaszthatók, ezekkel zárványkomplexek elkészítését tervezem különböző komplexképzési technikákkal (szuszpenziós-, gyúrásos technikával, illetve közös oldatból). Célom volt továbbá, hogy az elkészített szilárd komplexeket minősítsem hatóanyag-tartalmuk, víztartalmuk, termikus stabilitásuk, vízoldhatóságuk alapján, annak érdekében, hogy kiválaszthassam a növényvédelemben leginkább alkalmazható formulációt. 3

2. IRODALMI RÉSZ 2.1. Növényvédelem szelíd növényvédelem A növényvédő szer kémia tudományos, fejlesztési és gyártási hátterének fejlődése a század közepétől ugrásszerűen növekedő peszticid felhasználást tett lehetővé. Alkalmazásuk révén biztonságosabb élelmiszertermelés, növekvő hozamok, a károsítók biológiájának figyelembevételével gyors, hatásos, hosszú időre garantált védekezés vált lehetővé. A növényvédő szerek és alkalmazásaik fejlesztése a mai napig folyik, jelenleg a világon összesen kb. 7 növényvédő szer hatóanyag van forgalomban [1]. A növényvédő szer (peszticid) fogalom összetett, ide sorolunk minden olyan anyagot, mely alkalmas a mezőgazdasági haszonnövények, termékek, termények károsodásának gátlására. Ilyen károsodást a legkülönbözőbb élőlények idézhetnek elő. A peszticidek csoportosítása azon alapszik, hogy milyen kórokozóra hatnak, így az 1. táblázatban látható típusokat különböztethetjük meg. [2] 1. táblázat A növényvédőszerek típusai Növényvédőszer viricid baktericid fungicid zoocid akaricid rodenticid inszekticid herbicid Hatása víruspusztító baktériumölő gombaölő állati kártevőt irtó atkaölő rágcsálóirtó rovarölő gyomirtó A növényvédő szer hatóanyagokat ritkán használják tiszta formában, általában különböző segédanyagokkal együtt alkalmazzák a készítményeket. A növényvédő szer kereskedelmi néven kerül forgalomba, s ez egyben utal a peszticid megjelenési állapotára, formulációjára is. A név utáni L jelölés mindig a folyékony, a D poralakú, a G granulátum formát, az EC emulzióképző jelenlétét jelöli. [2] 4

A növényvédő szerek igen hatékony és széles körben, nagy- és kisüzemi kultúrákban egyaránt használatos anyagok. Így már kis koncentrációban is kifejthetik káros hatásukat, s jelenlétükre mind a felszíni, mind a felszín alatti vizekben számítani lehet. A toxikusság mértékének megítéléséhez figyelembe kell vegyük a forgalmazással együtt kötelezően előírt információkat, a munkaegészségügyi-, élelmiszer-egészségügyi várakozási időt, az 5% pusztulást előidéző dózist (LD 5 ), a környezetvédelmi besorolást és a megengedhető szermaradék mennyiségét. Az évenként megjelenő Növényvédő szerek, műtrágyák c. kiadvány a hazánkban forgalmazott valamennyi peszticidre tartalmazza ezeket az adatokat. A növényvédő szerek vízminőségi megítélésénél a toxikusság mellett nagyon fontos azoknak a természetes lebomlással szembeni ellenálló képessége. Ez a bomlásnak ellenálló képesség (rezisztencia) azt jelenti, hogy az anyagok környezetidegenek, s a természetes környezetben hosszú ideig megmaradnak (perzisztencia). Ugyanis, minél hosszabb ideig áll ellent a természetes lebontási folyamatnak, annál valószínűbb, hogy bekerül a biológiai rendszerekbe, s így káros hatását az emberre is kifejtheti. A növényvédő szerek perzisztenciájának megítélésénél ezért fontos szempont a vegyületek lebomlásának és az arra ható faktoroknak az ismerete. A toxikusság és perzisztencia egy-egy növényvédő szer esetén egymástól eltérő is lehet. Általános igény ugyanis, hogy a vegyületek rövid életűek legyenek, vagyis a természetben gyorsan lebomoljanak, ugyanakkor rövid idő alatt kell kifejteni a növényvédő hatást, tehát végső soron a nagyobb toxikusságot. [2] Természetesen a modern mezőgazdasági termelésben a növényvédelem szükségessége nem kérdőjelezhető meg. Azonban a gyakorlatnak mindinkább a szelíd növényvédelem felé kell eltolódnia. Az alternatív védekezési eljárások között szerepel például a csalánlé amely a levéltetvek és atkák távoltartására kiválóan alkalmas, az édeskömény, amelyből kivont illóolaj gombaölő és rovarriasztó hatású. A zsurló levét szintén gombabetegségek ellen használhatjuk. De mind közül a legismertebb a molyriasztó hatású levendula. [3] A Varroa destructor atka ma világszerte a legnagyobb gazdasági kárt okozó méhkártevő. Ellene a vegyszeres kezelés helyett alternatív védekezési eljárásokat is kidolgoztak. Irtására a méztől nem idegen természetes aroma-anyagokat, illóolajokat, illetve szerves savakat alkalmaztak. A párolgó növényi olajok közül a legjobb atkaölő hatásúnak a timol, a mentol és az eucaliptol mutatkozott. [4] 5

2.2. Illóolajok Az illóolaj a természetben különböző növényekben előforduló, azok illóolaj járataiban megtalálható, illetve a növények különböző részeiből (virág, levél, gyökér) kivonható, már kis mennyiségben is kellemes, jellegzetes illatú, könnyen illó folyadékok gyűjtőneve. Már a Biblia, illetve az ókori indiai, egyiptomi feljegyzések is említenek különböző illatos olajokat, kenőcsöket. Az arabok az illóolajok lepárlásával is foglalkoztak. Európában a 11 13. században a patikaszerek között szerepeltek lepárlási termékként. A 18. században több mint 1-féle illóolajat használtak Európában. A 19. században gyarapodtak az illóolajok szerkezeti összetételére vonatkozó ismeretek. A 2. században az egyes illathordozó anyagok elkülönítésére törekedtek, később több alkotójuk szintetikus előállítását is megoldották. Mintegy 5 komponensük ismert, egy-egy illóolajban 5-féle is előfordulhat. [5] Az illóolajok tiszta állapotban színtelenek, vízben alig, vízmentes alkoholban, benzolban, kloroformban jól oldódnak. Papírra cseppentve szobahőmérsékleten is elpárolognak, nem hagynak olajos foltot. Nagy részük baktériumölő hatású, a bőrt irritálja. Kémiailag nem egységesek, különböző szerkezetű és összetételű vegyületek részben szilárd, részben folyékony összetevőinek egymásban való oldatából állnak. Az élelmiszeriparban mint íz- és aromakomponensek jelentősek. Fontos felhasználási területük a gyógyszer- és a kozmetikai (ill. illatszer-) ipar: főként komponensként, illatok kialakításában, szagok elfedésére, kozmetikumok illatosítására használja. [5] A növényekből vízgőz-desztillációval, extrakcióval, sajtolással, préseléssel vonhatók ki, tisztításuk frakcionált desztillációval történhet. Egy adott növényi fajon belül az illóolajok különböző komponensei állandó összetételűek. Az éghajlati viszonyok bár befolyásolhatják őket, azonban mégsem térnek el nagymértékben az átlagértéktől. Az egymástól rendszertanilag távol álló növényekben is előfordulhatnak ugyanazon illóolaj alkotórészek. Az illóolajok fő komponensei adják általában a növény jellegzetes tulajdonságát. Munkám során kiválasztott 4 féle illóolaj jellemzői a 2. táblázatban találhatók: a növények magyar és latin neveit, az illóolaj latin nevét és főbb komponenseit [6] foglaltam össze, közülük kék színnel emeltem ki az általam részletesen vizsgált főkomponenseket. 2. táblázat A gyógynövények jellemzése Növény magyar neve Növény latin neve Illóolaj latin neve Főbb hatóanyagok borsmenta Mentha piperita Ae. Menthae piperitae mentol, menton citromfű Melissa officinalis Ae. Melissae citrál, citronellal kakukkfű Thymus vulgaris Ae. Thymi timol, karvakrol, borneol levendula Lavandula angustifolia Ae. Lavandulae linalool, borneol 6

Az illóolajok és főkomponenseik hidrofób, szobahőmérsékleten illékony anyagok, amelyek fényre, levegőre, nedvességre is érzékenyek (oxidálódhatnak, polimerizálódhatnak, elgyantásodhatnak). Felhasználásuk növényvédőszerként ezen tulajdonságaik miatt nehézkes, ezért ciklodextrinekkel való komplexálásuk nagymértékben elősegíti a kényelmes alkalmazhatóságot és a tárolhatóságot. 2.2.1. A felhasznált aromaanyagok jellemzése [6] Borneol (2-endo-bornanol) C 1 H 18 O Hexagonális kristályok alkotják, szúrós, kissé kámforszagú anyag, melynek olvadáspontja 28 C és forráspontja 212 C (szublimál). Vízben oldhatatlan, szerves oldószerekben jól oldódik. A jobbra forgató borneol OH 1. ábra Borneol levendulaolajban, valamint rozmaringolajban fordul elő. A balra forgató alakot fenyőtűolajban, a valeriánaolajban, citronellaolajban, korianderolajban és tujaolajban mutatták ki. Kínában a Blumea balsamifera fészkes virágzatú növény desztillációjával nyerik. A racém borneolt kámfor redukciójával állítják elő. Balzsamozásra, füstölőszerként és észterek szintézisére használják. A növényvédelemben antibakteriális, antioxidáns [7], és rovarkártevők elleni hatása miatt alkalmazzák [8]. Citrál (3,7-dimetil-2,6-oktadienal) C 1 H 16 O A kereskedelmi citrál a két cisz-transz izomer, a geranial CHO (= citrál A) és neral (= citrál B) keveréke; tulajdonságaik csak kis mértékben térnek el. Sárgás, citromillatú olaj, melynek CHO forráspontja 228 C. Fénnyel, levegővel szemben érzékeny, mérsékelten ingerli a bőrt. A citrál számos illóolajban 2. ábra Citrál A és B található, mindenek előtt az andropogonolajban (7-85%) és citromolajban (3,5-5%). Andropogonolajból állítják elő hidrogén-szulfit-vegyületeken keresztül (geranial és neral izomerkeverék keletkezik) vagy geraniol oxidációjával. Előállítható acetilénszármazékokból és izoprénből is. Kiindulási anyagként használják fel az A-vitamin, metil-jonon és jonon szintézisében; likőrökben, illatszerekben és kozmetikai cikkekben alkalmazzák. A növényvédelemben rovarriasztó hatása miatt kártevők elleni védekezésre alkalmas [9]. 7

Linalool (3,7-dimetil-1,6-oktadien-3-ol, linalil-alkohol) C 1 H 18 O Színtelen, gyöngyvirágra emlékeztető illatú folyadék, melynek OH forráspontja 198 C. A geraniol és nerol izomerje. Levegőre, hőre és savakra érzékeny. Számos illóolajban előfordul, így például a bergamottolaj, rózsaolaj, fahéjolaj, kakukkfűolaj, geraniumolaj, 3. ábra Linalool citromolaj tartalmazza. A linaloolt ma leginkább mircénből vagy az A-vitamin-szintézis egyik köztitermékéből állítják elő. Észtereivel együtt az illatszeriparban használják fel. Rovarrisztó és antimikrobiális hatása miatt a növényvédelemben is jól alkalmazható [1,11]. Mentol (3-p-mentanol, mentakámfor, hexahidrotimol) C 1 H 2 O Négy sztereoizomere lehetséges: a (cisz-1,3, transz-1,4) mentol, az izomentol, a neomentol és a neoizomentol. Ezek mind optikailag aktívak. A mentol négy módosulatának olvadáspontja 31, 33, 35, ill. 44 C, OH forráspontjuk pedig 216 C. Vízben kevéssé, alkoholban, éterben, 4. ábra Mentol kloroformban jól oldható. A természetes mentol balra forgató; alkoholos oldatban fertőtlenítő hatású, növeli a vérnyomást, enyhe görcsoldó, fokozza az epekiválasztást. A mentol a borsmentaolaj fő alkotója. Kifagyasztással vagy szintetikusan állítják elő. Felhasználhatjuk likőrként, édesítőszerként, illatszerként. Testápoló szerekben fertőtlenítő- és hűtő hatása miatt, a bőrgyógyászatban bőrirritációk elleni szerként elterjedt. A növényvédelemben rovarriasztóként [12] és gombaellenes szerként [13] használható. Timol (kakukkfűkámfor,2-izopropil-5-metil-fenol, 3-p-cimenol) C 1 H 14 O Színtelen, fűszeres kakukkfűillatú anyag, melynek olvadáspontja 51 C és forráspontja 233 C. Vízben és glicerinben kevéssé, alkoholban, éterben, kloroformban, szén-diszulfidban és nátronlúgban jól oldódik, vízgőzzel OH átdesztillál. A timol izomerjével, a karvakrollal együtt, a különféle kakukkfűfajtákban és más fűszernövényekben (majoránna) elterjedt. Fenol 5. ábra Timol jellege miatt a timol erős fertőtlenítő hatású, e tekintetben meghaladja a fenolét is. Felhasználható szamárköhögés, férgek ellen, gombaölő szerként, kötszerekben, kenőcsökben. A növényvédelemben is alkalmazható szintén erős antibakteriális [14,15], lárvaölő [16] és rovarriasztó hatása [8, 12] miatt. 8

A 3. táblázatban foglalom össze a gyógynövény illóolajok főbb komponenseinek fizikai kémai jellemzőit: összegképletét, moláris tömegét, olvadáspontját, sűrűségét és megjelenési formáját. 3. táblázat A gyógynövény illóolajok főbb komponenseinek jellemzése borneol citrál linalool mentol timol Összegképlet C 1 H 18 O C 1 H 16 O C 1 H 18 O C 1 H 2 O C 1 H 14 O Moláris tömeg / (g/mol) 154,25 152,23 154,24 156,26 15,21 Olvadáspont / ( C) 28 --- --- 41 51,5 Sűrűség / (g cm 3 ) ---,89,87 --- --- Megjelenése fehér kristályok sárga folyadék sárga folyadék fehér kristályok fehér kristályok 2.3. Ciklodextrinek szerkezete és tulajdonságai [17] Ciklodextrinek a keményítő enzimes hidrolízisével állíthatók elő. A keményítő származhat kukoricából és burgonyából is, azonban Magyarországon a jelentős kukoricatermelés miatt inkább az ebből készült keményítő a gazdaságosabb. Az átalakító enzimet (CGT-áz = ciklodextrin-glükozil-transzferáz) a Bacillus macerans nevű mikroorganizmus termeli. A ciklodextrinek gyűrű alakú, nem redukáló oligoszacharidok, amelyeket méreteik alapján α-, β-, γ- ciklodextrineknek neveztek el. Az α- 6, a β- 7, a γ-ciklodextrinek 8 C-1 6. ábra Az α-, β- és γ-ciklodextrin szerkezete konformációjú glükopiranóz egységből állnak. A glükózrészek 1, 4 helyzetben kapcsolódnak, a glükozidos szénatomok α-konfigurációjúak. A hattagúnál kisebb ciklodextrin gyűrű keletkezése sztérikus okok miatt nem lehetséges [18]. A nyolctagúnál nagyobb gyűrűk komplexképző sajátsága jelentéktelen [19]. A szabad primer és szekunder hidroxil-csoportok a csonka kúphoz képest a térben lefelé és felfelé helyezkednek el (hidrofil rész). A gyűrű belsejét hidrogén atomok és glükozidos oxigén-hidak alkotják (hidrofób/lipofil rész). 7. ábra A ciklodextrin gyűrű 3D szerkezete 9

Ez a speciális szerkezet teszi lehetővé, hogy különböző apoláris vendégmolekulákkal zárványkomplex képződés menjen végbe. A 4. táblázatban az alap ciklodextrinek főbb tulajdonságát foglalom össze. [2] 4. táblázat Az α-, β-, γ- ciklodextrin jellemző tulajdonságai α-cd β-cd γ-cd Glükopiranóz egységek száma 6 7 8 M (g/mol) 972 1135 1297 Üregátmérő 4,7 6 Ǻ ~8 Ǻ ~1 Ǻ Vízmolekulák maximális száma az üregben 6 11 17 Víztartalom 1,2% 13,2-14,5% 8,1-17,7% Oldhatóság vízben 25 C-on (g/1 cm 3 ) 14,5 1,85 23,2 A ciklodextrinek fehér, kristályos vegyületek. Jellemző olvadáspontjuk nincs, bomlásuk 25 C körül kezdődik el. Lúgra nem érzékenyek. Sűrűségük 1,42-1,45g/cm 3. Oldhatóságuk vízben eltérő, az alap molekulák közül a β-ciklodextriné a legkisebb. Az üres, vendégmolekulát nem tartalmazó ciklodextrin üregét a méretének megfelelő számú vízmolekula foglalja el. 2.3.1. Ciklodextrin származékok jelentősége Az alap ciklodextrinek vízoldhatóságának növelése céljából sok esetben módosítani kellett a glükopiranóz egységek három (C2-es, C3-as szekunder és C6-os primer) hidroxil oldalcsoportját. Az iparban előállított számos szubsztituált származék között szerepel a metil-, hidroximetil-, acetil-, tio-, tozil- stb. csoportot tartalmazó CD. Gazdasági szempontból viszonylag alacsony áruk miatt a komplexképzéshez gazdamolekulának a β-ciklodextrint és annak származékait használják. [17] 5. táblázat A β-ciklodextrin és származékainak főbb jellemzői RAMEB MA-RAMEB SU-RAMEB HPBCD Glükopiranóz egységek száma 7 7 7 7 Szubsztitúciós fok 11,8 DS ME = 12 DS ME = 12 3 DS A = 1 DS SU = 4 Moláris tömeg / (g/mol) 1311 1297 1292 144 1

A heptakis(2,6-di-o-metil)-β-cd vagy más néven DIMEB kristályos származék, amely a legjobb oldhatóságnövelő tulajdonságú anyag (a vendégmolekula oldhatóságát 1-szeresére növelheti). Izomer tisztasága 95% felett van. Ipari alkalmazásban mégis a kisebb szubsztitúciós fokú véletlenszerűen (random) metilezett β-cd (RAMEB) terjedt el nem sokkal kisebb aktivitása miatt. A 2-hidroxipropil-β-CD (HPBCD) lúgos közegben propilén-oxid és β-cd reagáltatásával állítható elő. Az elmúlt években elsősorban gyógyszerek formulázása terén volt nagy jelentősége. [21] Számos új ciklodextrin származékot királis szelektorként használnak kapilláris elektroforézis mérésekben, például a monoamino-β-cd (MA-BCD) és a szukcinil-β-cd (SU-BCD) származékokat [22, 23, 24]. A monoamino- véletlenszerűen (random) metilezett-βciklodextrin (MA-RAMEB) és a szukcinil- véletlenszerűen (random) metilezett-βciklodextrin (SU-RAMEB) a legújabb generációs ciklodextrinek. 2.4. A zárványkomplexekről általában Kétféle molekulából létrejövő kristályos, addíciós vegyületek, amelyekben az egyik részvevő (gazdavegyület) kristályrácsának üregébe beágyazza a másik résztvevőt (vendégmolekula). A komponenseket főként van der Waals-erők tartják össze. A zárványkomplexek három típusát különböztethetjük meg aszerint, hogy az üreg 3, 2, ill.1 dimenzióban zárt (ketrec-, csatorna-, rétegzárvány), ez látható a 8. ábrán [5,6]. 8. ábra A zárványkomplexek típusai Az első típusba a klarátok, a másodikba a karbamid, tiokarbamid és a ciklodextrinek tartoznak. A harmadik csoportot a cink-hidroxid, montmorillonit, grafit, zeolit alkotják, melyekben a vendégmolekulák a gazdamolekulák rétegei között helyezkednek el. 11

2.4.1. A ciklodextrinek zárványkomplexképzése A komplexképzés víz jelenlétében lejátszódó dinamikus egyensúlyra vezető folyamat. A molekuláris dézsa külső oldala hidrofil, belseje hidrofób. Az üreg hidrofób jellege miatt a benne lévő vízmolekulákat a szintén hidrofób vendégmolekula kiszorítja. A gazdát és a vendégmolekulát csak fizikai erők tartják össze. A komplexbe zárt molekulák mérete egy vagy két benzolgyűrű nagyságú lehet, az ennél nagyobb vendég-molekulák csak oldalláncaik révén kapcsolódhatnak. 9. ábra A ciklodextrin zárványkomplex képzésének sémája Az üregek alakja csak korlátozott mértékben tud alkalmazkodni a vendégmolekulákhoz. Ezáltal a kristályos adduktumok képződésével elválasztás érhető el: azok a molekulák, amelyek alakjuknál és méretüknél fogva nem illenek bele a kristályrács üregébe, azok az oldatban maradnak vissza. [17] A bezárt molekula hidrofób részei lehetőség szerint az üreghez, míg a hidrofil részei a komplex külső peremén lévő csoportokhoz kapcsolódnak. Komplexképződéskor így a gyűrűbe zárt, hidrofób, kémiailag érzékeny anyagok stabilabbá válnak, illékonyságuk csökken, és vízoldhatóságuk megnövekszik. Ezek reverzibilis változások, megfelelő körülmények közt ez a zárványkomplex könnyen disszociál, és a vendégmolekula visszanyeri eredeti fizikai-kémiai sajátságait. [25] 2.4.2. Zárványkomplexek előállítása [2, 26] A zárványkomplexképzésnek számos előállítása lehetséges. A leggyakrabban alkalmazott módszer a közös oldatból kiinduló együttkristályosítási-, a szuszpenziós- és a gyúrásos eljárás. Az együttkristályosítási eljárásnál a β-ciklodextrin vizes etil-alkoholos oldatához csepegtetik az etil-alkoholban oldott aromaanyagot. A csepegtetés alatt a reakcióelegyet szobahőmérsékletű vagy enyhén fűtött vízfürdőn kevertetik. A terméket üvegszűrőn szűrik, és tömegállandóságig szárítják. A szuszpenziós módszerre jellemző, hogy a ciklodextrint előzetesen desztillált vízben szuszpendálják. Ehhez csepegtetik közvetlenül vagy oldott formában a vendégmolekulát. 12

Az elegyet szobahőmérsékleten kevertetik. A kristályos terméket liofilizálással választják el. Mivel a ciklodextrinek kristályos állapotban is tartalmaznak üregükben vízmolekulákat, ezért szilárd állapotban is lehetséges a komplexképzés. A gyúrásos eljárás során achátmozsárba bemérik a ciklodextrint és a sztöchiometriai mennyiségnek megfelelő vendégmolekulát. Az intenzív gyúrás során a ciklodextrinben levő vízmolekulák vendégmolekulákra cserélődnek. 2.4.3. A ciklodextrin komplexek analitikai vizsgálata A vendégmolekula - ciklodextrin komplexképzés során előállított mikrokristályos termék nem biztos, hogy teljes mértékig zárványkomplex. Ezért fontos megvizsgálni, hogy mennyi hatóanyagot zárt komplexbe a ciklodextrin üreg és hogy mekkora a komplexált / nem komplexált hatóanyag aránya. A zárványkomplex létrejöttét a vendégmolekula fizikai kémiai tulajdonságainak lényeges változása mutatja. Ezen változásokat különféle analitikai eszközökkel vizsgálhatjuk: a) Az előzetesen feloldott komplexek hatóanyag-tartalmának meghatározásra UV-VIS spektrofotométert, GC-t, HPLC-t alkalmaznak. UV-VIS spektrofotométer: Egykomponensű hatóanyagot tartalmazó minták esetén jól használható, amennyiben a vendégmolekula abszorpciós elnyelése UV-VIS tartományba esik. A ciklodextrinek nem UV-aktív anyagok, de a hatóanyag UV spektrumát megváltoztathatják. (A változás a csúcsmaximum értékek eltolódásában és a moláris abszorpciós koefficiens megváltoztatásában nyilvánul meg.) [27] HPLC módszer: Több komponensű hatóanyagot tartalmazó komplexek (esetünkben később a gyógynövények illóolajai) is vizsgálhatók. Az egyes komponensek egymás mellett mérhetők, külön-külön meghatározhatók. Az alkalmazás előnye, hogy a 195-22 nm-es tartományban is pontos mérést végezhetünk. [27] b) A szilárd minták víztartalmának meghatározására Karl-Fischer titrálást, szárításos eljárást, vagy termogravimertiás mérést alkalmaznak. 13

Karl-Fischer eljárás: A módszer alapelve, hogy a jód és a kén-dioxid az alábbi reakció szerint reagál nemvizes közegben (a víz csak reakciópartnerként van jelen): CH 3 OH + SO 2 + RN [RNH]SO 3 CH 3 H 2 O + I 2 + [RNH]SO 3 CH 3 + 2 RN [RNH]SO 4 CH 3 + 2 [RNH]I (RN = bázis) Termoanalitikai mérés: Azon komplexeknél alkalmazható, amelyekben a vendégmolekula 25 C alatti (ciklodextrin bomlási hőmérséklete) olvadás- illetve forrásponttal rendelkezik. A változások mértékét a tiszta hatóanyagok és komplexeik termikus viselkedésének összehasonlításával mérhetjük fel. c) A szilárd minták nedvesedésének vizsgálata: Lényeges eltérés mérhető a zárványkomplexek, a tiszta hatóanyagok és a fizikai keverékek nedvesedése között. A komplexképzés javítja a vendégmolekula nedvesedésének mértékét a mechanikai keverékekkel szemben. A nedvesedés mértéke érintési szög alapján és mintával töltött csövek segítségével vagy immerziós hő mérésével határozható meg. [28] d) Egyéb ritkábban alkalmazott mérési eljárások között szerepel a Röntgen pordiffrakció (XRPD), IR- és RAMAN spektroszkópia. Ezek a módszerek a tiszta hatóanyagok, a fizikai keverékek és a komplexek összehasonlító mérésén alapulnak. [27] e) Oldhatósági izoterma meghatározása A rosszul oldódó vendégmolekula vizes szuszpenziójához ciklodextrint adva, a vendégmolekula oldhatósága megnövekszik. Az oldott vendégmolekula koncentrációját ábrázolva a ciklodextrin koncentráció függvényében, az oldódási izotermát kapjuk. A különböző típusokat a 1. ábrán mutatom be. Alapvetően két típust különböztetünk meg, melyek altípusokba sorolhatók. Az A típusú izotermák esetén a vizsgált ciklodextrin koncentráció tartományban a komplex oldhatósági határát még nem értük el, míg a B típus korlátozott oldhatóságú komplexekre jellemző. Az A L altípusú izotermánál az oldhatóság lineárisan nő változatlan sztöchiometria (ciklodextrin : vendégmolekula = 1:1) mellett. Ilyenkor csak oldott komplex képződik. Az A P és A N izoterma szintén monoton növekvő, de az előbbi pozitív, míg az utóbbi negatív irányban tér el a lineáristól. Mindkét esetben változik a komplex sztöchiometriája: A P -nél további 14

vendégmolekulák, A N -nél további gazdamolekulák kapcsolódnak a komplexhez, illetve A N eltérését még a vendégmolekula vagy a komplex hidratációjának változása is okozhatja. A korlátozott oldhatóságú B típusba tartozik a B S és B I izoterma. B S esetén a hatóanyag kezdeti oldhatóságának 1. ábra Az oldhatósági izotermák típusai növekedése eléri a komplex oldhatóságának határát. Ezután a ciklodextrin koncentrációt tovább növelve a vendég oldhatósága nem növekszik, megkezdődik a komplex mikrokristályos állapotban való kicsapódása az oldatból. Ha csak oldhatatlan komplex képződik és a vendégmolekula oldhatósága nem nő, az izoterma B I típusú. [17, 29] Komplexképzési állandó számítása: Ha az oldhatóság-növekedés mérési pontjaira egyenest tudunk illeszteni, akkor az alábbiakban megadott képlet segítségével számíthatjuk a komplexképzési állandó értékeit. ahol K: a komplexképződés egyensúlyi állandója m: az illesztett egyenes meredeksége S : a vendégmolekula oldhatósága vízben. Az A N és A P típusú izotermákból nem ilyen egyszerű a komplexképzési állandó számítása [3, 31], a B típus pedig eleve kizárja az efféle vizsgálatokat. 15

3. KÍSÉRLETI RÉSZ 3.1. Az alkalmazott anyagok A vizsgált hatóanyagok közül a borneol a Fluka AG Chem. Fabrik CH-947 Buchs, a citrál a Sigma-Aldrich Chemie GmbH (EC No. 2263946), a linalool a Sigma-Aldrich Chemie GmbH (EC No. 211344), a mentol 917-1629 és a timol a Fővárosi Tanács Gyógyszertári Központ (821) terméke. Munkám során használt β-ciklodextrin és szubsztituált származékai (RAMEB, MA-RAMEB, SU-RAMEB, HPBCD) (4 és 5. táblázat) a CycloLab Kft termékei. 3.2. Oldatban végzett vizsgálatok módszerei 3.2.1. Koncentráció meghatározás UV fotometriás módszerrel Törzsoldatot készítettem 1 cm 3 -es mérőlombikba kb. 1 mg hatóanyagból és 5%-os etanolból. A kalibráció felvételéhez az oldatot különböző mértékben 5%-os etanollal hígítottam meg. Megállapítottam a megfelelő hullámhosszt, amelyen a szűrt mintáinkat mértem. Az abszorbancia maximumokból és a hígítások mértékéből számítottam a vendégmolekula mg/ cm 3 -ben mért koncentrációját. 6. táblázat A borneol, citrál és timol kalibráló egyenesének paraméterei Vegyület λ / nm Kalibráló egyenes egyenlete R 2 borneol 287 A =,46(c / mg*cm -3 ),99996 citrál 242 A = 95,68(c / mg*cm -3 ),99982 timol 276 A = 12,99(c / mg*cm -3 ),99982 A 6. táblázatban foglaltam össze a mérések hullámhosszát, a kalibráló egyenes egyenletét és az illesztett egyenes regressziós koefficiens értékét. 16

3.2.2. Koncentráció meghatározás gázkromatográfiás analízissel A linalool és mentol BCD és RAMEB szilárd komlpexeit dimetil-formamidban oldottam és a gázkromatográfiás elemzéshez megfelelő hígításban alkalmaztam. Az alábbiakban a gázkromatográfiás körülményeket jellemzem: Gázkromatográf: Shimadzu GC-17A, AOC-5 automata injektorral, Lángionizációs detektorral (FID) Gázok: Vivőgáz: hélium (99,999 %) Segédgázok: nitrogén (99,999%), szintetikus levegő (99,999%) és hidrogén (Whatman hidrogén generátorból) Oszlop: ZBWax Plus (3 m x,25 mm x,5 μm) Hőfok program: A kolonnát 8 C-on tartjuk 1 percig, majd 22 C-ra fűtjük 15 C/min-es felfűtési sebességgel, a szennyezések eltávolítása céljából ezen a hőmérsékleten tartjuk 1 percig. Injektor hőmérséklete: 2 C Detektor hőmérséklete: 22 C Split arány: 2:1 Injektált térfogat: 2 μl A kalibráló egyenesek egyenletei összefoglalva a 7. táblázatban láthatók. 7. táblázat A linalool és mentol kalibráló egyenesének paraméterei Vegyület Kalibráló egyenes egyenlete R 2 linalool T csúcs = 6,62 1-4(c/μg*cm -3 ),999244 mentol T csúcs = 6,4 1-4 (c/μg*cm -3 ),994322 3.2.3. Oldhatósági izotermák felvétele Az oldhatósági izotermák kevertetési idejét optimalizáltam a dinamikus egyensúly kialakulásának függvényében. Jól lezárható üvegcsékbe 2 cm 3 desztillált vizet, 5%-os oldatnak megfelelő ciklodextrin mennyiségeket, és feleslegben 1 mg vendégmolekulát mértem be. A mérések során a borneolnál HPBCD, a citrálnál és linaloolnál RAMEB, a mentolnál és a timolnál MA- RAMEB ciklodextrin származékokat használtam. A mintákat szobahőmérsékleten (T = 26 C) 17

1, 2, 3, 4 és 5 óra hosszat kevertettem mágneses keverővel, majd kiülepedésüket centrifugával (5 ford./min., 2 perc) segítettem elő. A vendégmolekula koncentrációját UV fotometriával és gázkromatográfiás analízissel határoztam meg. A minták további oldhatósági izotermapontjainak felvételéhez, 1, 3, 5%-os RAMEB, MA-RAMEB, SU- RAMEB, HPBCD ill. a BCD estén,,5; 1; 1,5%-os oldatnak megfelelő ciklodextrin mennyiségeket, és feleslegben 1 mg vendégmolekulát (borneol, citrál, linalool, mentol, timol) mértem be. 3 órás kevertetési idők 11. ábra Minták kevertetés közben mellett a fentiekben leírt eljárást alkalmaztam. 3.3. Komplexképzés a.) Komplexképzés közös oldatból Az 1:1 mólaránynak megfelelő mennyiségű RAMEB-et 1 cm 3 -es gömblombikokba bemértem, és 25 cm 3 desztillált vizet hozzáadva mágneses keverővel kevertetve feloldottam. A linalool és a citrál folyadék, ezeket közvetlenül hozzámértem. A borneol, timol, mentol szilárd porok, amelyeket külön max. 2 cm 3 96%-os etanolban oldottam fel, és mostam be a gömblombikokba. (A 2 cm 3 etanol mennyiséget a liofilizálás szabta meg.) A 4 órás szobahőmérsékleten való kevertetés után az anyagokat fagyasztva szárítottam. A bemért anyagok: 4 mmol RAMEB = 5,2 g, borneol,61 g, citrál,68 cm 3, linalool,71 cm 3, mentol,62 g, timol,6 g b.) Szuszpenziós komplexképzés 15 cm 3 es főzőpoharakba bemértem 6,2 g BCD-t, és 25 cm 3 desztillált vizet adtam hozzá. Mágneses keverővel előzetesen feloldottam a ciklodextrineket, majd a folyékony hatóanyagokat közvetlenül mértem hozzá. A por alakúakat külön oldottam fel,8 cm 3 etanolban. Az oldatokat addig kevertettem szobahőmérsékleten mágneses keverővel, amíg 18

kissé be nem sűrűsödtek, majd üvegszűrőn szűrtem át az egyes komplexeket. Szűrés után az anyagokat óraüvegre téve levegőn szárítottam meg. A bemért anyagok: 5 mmol BCD = 6,2 g, borneol,77 g, citrál,85 cm 3, linalool,88 cm 3, mentol,78 g, timol,75 g c.) Komplexképzés gyúrásos technikával Az 1:1 mólaránynak megfelelő mennyiségű ciklodextrinek és aromaanyagok mozsárban fél órát tartó dörzsölésével a vízmolekulák egy része kicserélődött az aroma anyagra. A bemért anyag: 5 mmol BCD = 6,2 g, borneol,77 g 3.3.1. Víztartalommérés Karl-Fischer módszerrel Az általam előállított különféle ciklodextrin komplexek víztartalmát Orion, AF8 típusú Karl- Fischer titrátorral határoztam meg. A titráláshoz,1% víztartalmú metanol oldószert és piridinmentes, egykomponensű HYDRANAL 3485 Composite 5 mérőoldatot használtam. A titrálóedénybe beleöntöttem a metanolt és összeállítottam a készüléket. Folyamatos mágneses kevertetés közben a metanol oldószerben jelenlévő kis víztartalmat megtitráltam. Mivel a mérőoldat faktora nem állandó, ezért ezt naponta minden mérés előtt ellenőrizni kellett. A kalibráció során az oldathoz 3 25 µl desztillált vizet mértem Hamilton fecskendővel, és a rendszert újra megtitráltam. Ezután adagoltam az oldószerhez a különféle ismeretlen víztartalmú ciklodextrin-komplexek várható kb. 1%-os víztartalmának megfelelő 1 mg-os mennyiségeit. A mintát a lehető leggyorsabban mértem hozzá, hogy az oldatot minél jobban óvjuk a levegő nedvességtartalmától. A reakció végpontját biamperometriás ( dead-stop ) végpontjelzéssel határoztam meg. 19

3.3.2.Hatóanyag-tartalom meghatározás A zárványkomplexek hatóanyagtartalmát az alábbi módon határoztam meg: a) 1 cm 3 -es mérőlombikokba bemértem analitikai mérlegen a ciklodextrin komplexeket (borneol / RAMEB 3 mg, timol / RAMEB 3 mg, timol / BCD 15 mg, citrál / RAMEB 25 mg, citrál / BCD 25 mg), és 5%-os etanollal a mérőlombikokat jelre töltöttem. Három párhuzamos mérést végeztem. Ezen oldatok hatóanyag-tartalmát fotométeres UV aktivitásméréssel határoztam meg. b) A nem UV aktív anyagok (mentol, linalool) hatóanyag-tartalmát gázkromatográfiás analízissel határoztam meg. A mintákat dimetil-formamiddal hígítottam. 3.3.3. Termoanalízis A termogravimetriás méréseket MOM Derivatograph-PC számítógép vezérelt, WINDER kiértékelő szoftverrel ellátott készülékkel végeztem. A minták (BCD, RAMEB, az általam előállított komplexek és a tiszta hatóanyagok) 7-2 mg-jait Al 2 O 3 nyitott tégelybe mértem be, referenciaanyagként kiizzított Al 2 O 3 port alkalmaztam. A mérést szobahőmérséklettől 25 C-ig, 5 C/perc felfűtési sebességgel végeztem, 5 m 3 /h sebességgel áramló N 2 atmoszférában. 3.3.4. Oldhatósági vizsgálatok A 6 db BCD komplex 1 mg-nyi, és 5 db RAMEB komplex 5 mg-nyi mennyiségeit főzőpoharakba ill. kis kémcsövekbe mértem be. Egyre növekvő vízmennyiség adagolásával meghatároztam az egyes komplexek oldhatóságát szobahőmérsékleten (T = 26 C). Az oldódást ultrahangfürdővel segítettem elő. 2