ZÁRVÁNYKOMPLEXEK VIZSGÁLATA Környezettechnológia gyakorlat III. éves környezettudós és IV. éves környezettan tanárszakos hallgatók számára ELTE Kémiai Intézet, Szerves Kémia Tanszék
Bevezetés A zárványkomplexek A zárványkomplexek kétféle molekulából álló addíciós vegyületek, amelyekben a komponenseket csak fizikai erők tartják össze. Az egyik komponens a gazdamolekula a szerkezet hordozója, kristályrácsainak üregeibe zárja be a másik komponenst, a vendégmolekulát. Ipari méretekben fontos a zárványkomplex képzés keverékek szétválasztásában, ui. azok a vendégmolekulák, amelyek alakjuknál és méretüknél fogva nem illenek be a kristályrács üregébe, az oldatban maradnak vissza. Így zárványkomplex képzés segítségével keverékek komponensei elkülöníthetők egymástól. Ipari szempontból jelentős továbbá, hogy zárványkomplexek formájában kémiailag érzékeny anyagok stabilizálhatók. Különösen a karbamid zárványvegyületeinek van jelentős szerepe az iparban, pl. n-paraffinok szénhidrogén elegyből történő elkülönítését karbamidos addukt képzéssel végzik. Zárványkomplexek előállítási módjainak szemléltetésére a gyakorlat során egy világviszonylatban is új ipari alapanyagot használunk. Ez a vegyület a ciklodextrin, amelyet hazánkban kukoricakeményítőből enzimek segítségével állítanak elő. A ciklodextrinek ciklikus, nem redukáló oligoszaharidok, amelyek 6, 7 vagy 8 glükopiranóz egységből állnak, ezeket α-, β-, és γ-ciklodextrinnek nevezzük. Közülük a legfontosabb és a legnagyobb mennyiségben előállított a β-ciklodextrin, amelynek szerkezete és molekuláris méretei az 1. ábrán látható. 1. ábra: A β-ciklodextrin szerkezete és mérete 2
A gyűrűs szerkezetű ciklodextrinekben a glükopiranóz egységek úgy helyezkednek el, hogy a gyűrű egyik peremén helyezkedik el az összes primer hidroxil-csoport, a másik peremén valamennyi szekunder hidroxil-csoport. A gyűrűk belseje hidrofób, külseje hidrofil, jól nedvesedő. A ciklodextrineket szerkezetük alkalmassá teszi zárványkomplexek képzésére minden olyan vegyülettel, amelyek molekuláris méretei megfelelnek a ciklodextrin üreg méreteinek. A bezárt molekula oly módon helyezkedik el, hogy hidrofób része az apoláris ciklodextrin üreggel, míg hidrofil része a ciklodextrin külső, hidroxil csoportjaival és a szolvenssel létesít kapcsolatot. A komplexbe zárt molekula fizikai, kémiai sajátságai jelentős mértékben megváltozhatnak. Zárványkomplexek alkalmazása Komplexképző sajátságaiknak köszönhetően számos gyakorlati célra alkalmazhatók a ciklodextrinek. Kozmetikai szerekben elsősorban az oldhatóság és nedvesedés fokozása miatt alkalmaznak ciklodextrineket. Illatanyagok megőrzésére parfümökbe, krémekbe keverve fordulnak elő. A ciklodextrineket a gyógyszerekben komplexálásra vagy segédanyagként lehet alkalmazni. Ciklodextrinek segítségével folyékony vegyületek kristályossá alakíthatók, amelyek alkalmasak tabletták előállítására. Kis dózisú hatóanyag tablettáiban a hatóanyag egységességét így könnyen meg lehet valósítani, hiszen a ciklodextrin komplexek könnyen homogenizálható, laza szerkezetű porok. Stabilis vizes oldatok készíthetők olyan hatóanyagokból, amelyek egyébként csak szerves oldószerekben oldhatók. Az oldhatóság növelésén kívül fontos az oldódási sebesség, valamint a biológiai hozzáférhetőség fokozása is. A bomlás, polimerizálódás, átrendeződés és autokatalitikus reakciók sebessége jelentős mértékben csökken mind oldott, mind szilárd állapotban a komplexképzés következtében. Hőre, fényre érzékeny anyagok stabilitása is javul ciklodextrinekkel történő komplexálás következtében. Ciklodextrinek kitűnően alkalmazhatók bizonyos környezetvédelmi problémák megoldására is. Szorbensként használhatók oldószergőzök, üzemanyagok aromás vegyületeinek csökkentésére, valamint szennyvizek tisztítására is. A mezőgazdaságban a növényvédő szerek és a rovarirtók vízoldhatóságát növelhetjük, ha ciklodextrint adagolunk hozzájuk. Számos szerző számol be arról, hogy növényvédő szerek ciklodextrinnel való komplexképzése előnyös, mert a komplexek hatékonyabbak, mint a hatóanyag molekulák önmagukban, a hatás jobban kontollálható, ezen kívül egyes könnyen bomló növényvédő szerek esetén a komplexképzéssel stabilabb vegyületek nyerhetők. 3
A ciklodextrinek élelmiszeripari felhasználását az teszi lehetővé, hogy egészségre ártalmatlanok. Alkalmazhatók illékony, bomlékony vegyületek stabilizálására (például aromaanyagok esetén), kellemetlen illatok és ízek csökkentésére, vagy édesítőszerként. Aromaanyagok komplexálása A ciklodextrin zárványkomplexek jelentős csoportját képviselik az élelmiszerekben található anyagok komplexei, amelyek többsége ma már a hazai kereskedelmi forgalomban is kapható (pl. fűszeraromák, tea- és kávéaroma zárványkomplexek). A természetes aroma- és illatanyagok többsége sok komponensből áll és e komponensek szobahőmérsékleten is nagy illékonyságot mutatnak. Ezen kívül a növényekből kinyert aroma koncentrátumok oxigénnel szembeni érzékenységük miatt vagy fotokémiai átalakulások következtében mennyiségileg és minőségileg károsodhatnak. Ezeknek a kémiailag kevéssé stabil anyagoknak β-ciklodextrinnel történő komplexálása számottevően fokozza eltarthatóságukat, stabilitásukat, csökkenti illékonyságukat. Zárványkomplexek készítése Az aromaanyagok β-ciklodextrinnel történő komplexálására három komplexképzési eljárás alkalmazható: a.) Közös oldatból kiinduló együttkristályosítási eljárás. Ennél a komlexképzési eljárásnál a β-ciklodextrin 30 %-os vizes etil-alkoholos oldatához csepegtetik az abszolút etil-alkoholban oldott aromaanyagot. A csepegtetés alatt a reakcióelegyet vízfürdőn kevertetik, amelynek hőmérsékletét úgy választják meg, hogy a ciklodextrin feloldódjon, és a hatóanyag olvadáspontját ne érjék el. A reakcióelegy hőmérsékletét ezután szobahőfokra csökkentik, majd a komplex kiválását hűtéssel segítik elő. A kristályos terméket üvegszűrőn szűrik, és tömegállandóságig szárítják. b.) A gazdaságosság növelése céljából előállíthatók a zárvány-komplexek a ciklodextrinek vizes szuszpenziójában is. Ennél az eljárásnál a β-ciklodextrint desztillált vízben szuszpendálják, majd ehhez a vizes szuszpenzióhoz csepegtetik az aroma abszolút etanolos oldatát. A továbbiakban szobahőmérsékleten kevertetik a reakcióelegyet. Az előállított kristályos komplexet üvegszűrőn szűrik, és tömegállandóságig szárítják. c) A β-ciklodextrin átlagosan 12-14 % nedvességtartalma lehetővé teszi a zárványkomplexek előállítását szilárd fázisú komplex-képzéssel. Ennek során a ciklodextrinek apoláris üregébe 4
zárt vízmolekulákat helyettesítik az alkalmas méretű és polaritású molekulák a komplexképzésnél. A komplexek előállítása ez esetben úgy történik, hogy achátmozsárba mérik a β-ciklodextrint és a sztöchiometriailag megfelelő mennyiségű aromaanyagot, majd két órán keresztül intenzíven dörzsölik. Mivel a laktóz nem képez komplexet az aromaanyaggal, összehasonlítás céljából készítendő fizikai keverék előállításánál alapanyagként használható. Zárványkomplexek vizsgálata Zárványkomplex képzés következtében a komplexbe zárt vendég-molekula fizikai, kémiai tulajdonságai jelentős mértékben megváltozhatnak. Mivel ezek a változások reverzibilisek, a komplex disszociációját követően a szabaddá vált vendégmolekula minden jellemzője a komplexálás előttivel azonos lesz. Ez teszi lehetővé, hogy az egyébként kémiailag kevéssé stabilis, illékony aromaanyagokból β-ciklodextrinnel történő komplex-képzés révén hosszú ideig stabilisan eltartható, oxidatív behatásokkal szemben ellenálló termékek keletkezzenek. Az élelmiszeriparban ez ma már elterjedt és széles körben alkalmazott módszer érzékeny anyagok gazdaságos és hatékony stabilizálására. A ciklodextrinekkel történő zárványkomplex képzés során egy vendégmolekulát rendszerint egy vagy két ciklodextrin un. gazdamolekula zár magába. A ciklodextrin zárványkomplexek sajátságainak tanulmányozására különféle fizikai és kémiai módszereket alkalmaznak. A komplexek vizsgálatában az első lépés annak igazolása, hogy a képződött termék nem keverék. A komplexek tanulmányozása során ezért mindig kb. azonos aromatartalmú fizikai keveréket használnak összehasonlítóként. Annak igazolására, hogy valóban komplex keletkezett számos módszer használható, pl. a minták hatóanyagtartalmában bekövetkező változások vizsgálata hőkezelést követően, mosások okozta hatóanyag-vesztés követése, új típusú rácsszerkezet kialakulásának igazolása, megváltozott kromatográfiás sajátságok vizsgálata, nedvesedés és kioldódási sebesség mérése vízben. Komplexek hatóanyag-tartalma Igen fontos továbbá a zárványkomplexek hatóanyag-tartalmának meghatározása. Erre alkalmas a komplexek feltárása és a hatóanyag kinyerése utáni összes aromatartalom mérése UV fotometriás, kolorimetriás, gázkromatográfiás, desztillációs és tömeg szerinti meghatározási módszerekkel. 5
A hatóanyag-tartalmat leggyakrabban UV fotometriával határozzák meg a gyakorlat során is ezt a módszert alkalmazzuk előzetesen elkészített kalibráció alapján. A módszer felhasználható többkomponensű aromák esetén is, ha a rendszer UV-színképét adó komponensek aránya a komplexálódás során nem változik. Aromakomplexek stabilitása Kísérletileg gyorsított tartamstabilitási vizsgálatokkal következtetünk az aromák hosszú idejű eltarthatóságára. Ilyenkor általában összehasonlítjuk az aromakomplexek és a fizikai keverékek hatóanyag-tartalmát 80 C-on meghatározott ideig történő hevítés után. A hosszú időtartamú, szobahőmérsékleten történő tárolás esetén az aromakomplexek összes aromatartalma az esetek jelentős részében esetleg több évig sem változik, amint az 1. táblázat adatai mutatják. 1. táblázat Komplex Aromaanyag-tartalom % minta 1978 1980 1985 1987 1992 timol - CD 10,8 10,2-10,4 10,2 édesköményolaj-cd 10,7 10,8-10,6 9,0 vanillin - CD 6,1 5,8 3,2 2,8 - citromolaj - CD 8,8-7,0 5,5 - kakukkfűolaj - CD 9,9 9,1 9,4 9,7 9,4 Komplexek nedvesedése A hőstabilitási kísérletek mellett a minták nedvesedési vizsgálata is igen jól demonstrálja a komplexek és keverékek eltérő viselkedését. Számos vitamin, peszticid és más biológiailag aktív anyag igen hidrofób, nehezen és lassan oldódik vízben. Ezen anyagok β-ciklodextrinnel képzett komplexei azonban jól nedvesedő, hidrofil termékek. A szabad aroma, a fizikai keverék és a komplexált aroma eltérő viselkedését mutatja a nedvesedési kísérlet során a 2. ábra mentol esetén. 6
2. ábra: A mentol/laktóz keverék és mentol/β-ciklodextrin komplex nedvesedése Gyakorlati munka A gyakorlat célja A laboratóriumi gyakorlat során β-ciklodextrin gazdamolekulával és timol aromaanyag vendégmolekulával képzett zárványkomplexeket és timol/laktóz fizikai keveréket vizsgálnak. Meghatározzák a minták aromatartalmát UV-fotometrálással előzetes kalibráció segítségével. Az aromakomplexek jellemzésére stabilitási vizsgálatokat is végeznek. Összehasonlítják a komplexeket és a keveréket hőstabilitási vizsgálatok és nedvesedési kísérletek segítségével. A gyakorlat menete: 1.) Aromaanyag kalibrációs görbéjének elkészítése A gyakorlat felszerelése mellett található a timol UV-spektruma. A kalibrációt a gyakorlaton használt aromaanyag UV spektrumán megjelölt hullámhosszon kell elvégezni. Az előre elkészített törzsoldatból (10 mg/100 cm 3 ) 3 különböző koncentrációjú oldatot készítünk a következő módon. 2, 5 és 7 cm 3 törzsoldatot kétjelű üvegpipettával kipipettázunk egy-egy 10 cm 3 -es mérőlombikba, majd 50%-os etanollal jelre töltjük. Végül a gyakorlatvezető segítségével megmérjük a minták UV-elnyelését. 7
2.) Aromatartalom meghatározása A zárványkomplexek és a fizikai keverék hatóanyagtartalmát az alábbi módon határozzuk meg: 20-20 mg mintát 10 cm 3 -es mérőlombikba bemérünk analitikai mérlegen. 5-5 cm 3 96%-os etanolt pipettázunk a mérőlombikokba, majd ultrahang fürdőbe tesszük. Ezután desztillált vízzel jelre töltjük a mérőlombikot. A komplexek és a keverék aromatartalmának feltárása után a készített oldatokból 5-szörös hígítást készítünk. Az oldat aromatartalmát a megadott hullámhosszon UV-elnyelés alapján mérjük, majd a kalibráció segítségével számítjuk ki a minta hatóanyagtartalmát. 3.) A komplexek és a keverék hőstabilitásának vizsgálata 20-20 mg mintát üvegcsónakba analitikai mérlegen bemérünk. 40 percig 80 C-os szárítószekrényben tartjuk, majd exszikkátorban hagyjuk lehűlni. Ezt követően a mintákat 10 cm 3 -es mérőlombikba töltjük, és hatóanyagtartalmukat a korábban leírt módon tárjuk fel és határozzuk meg. 4.) A zárványkomplexek és a keverék nedvesedésének meghatározása A minták nedvesedését a 3. ábrán látható, egyszerű berendezés segítségével mérjük. 3. ábra Berendezés a zárványkomplexek nedvesedésének meghatározásához A készülékbe helyezhető mérőcsövek alját vattával zárjuk el. A csöveket a komplexekkel és a keverékkel a vatta szintjétől számított 4 cm magasságig töltjük meg úgy, hogy közben kocogtatással biztosítjuk a csövek minél homogénebb töltését. A nedvesítést szobahőmérsékleten, festett vizes oldattal végezzük. Amikor a csöveket a vizes oldatba 8
merítve az oldat szintje eléri a csövek alján elhelyezkedő vatta-dugó tetejét, a stopperórát beindítjuk. Feljegyezzük a vizes oldat frontjának a csövek mögött elhelyezett milliméterskálán leolvasott helyzetét az egyes oszlopokban 30 másodperc és 1, 2, 3 stb. perc múlva. (A leolvasás ideje maximum 10 perc legyen.). A mért értékeket az idő függvényében grafikusan ábrázoljuk. Feladatok a. Oldatok készítése a timol/β-ciklodextrin komplexek és a timol/laktóz keverék aromatartalmának meghatározásához hőkezelés nélkül. b. Oldatok készítése a timol/β-ciklodextrin komplexek és a timol/laktóz keverék aromatartalmának meghatározásához hőkezelést követően. c. A zárványkomplexek és a keverék nedvesedésének meghatározása. d. A hatóanyag-tartalom meghatározásához elkészített oldatok fotometrálása. e. Timol kalibrációs görbéjének elkészítése. Jegyzőkönyv készítése A leadott jegyzőkönyvnek a következőket kell tartalmaznia: A timol kalibrációs görbéjét (fényelnyelést - koncentráció függvényében ábrázolva). Az aromatartalom meghatározásának rövid, tömör leírását, a mért értékeket, számításokat. Írják le a hőstabilitási vizsgálat menetét, a mért értékeket! A számítás során adják meg, hogy az előállított mintáknak mennyi az aromatartalma (...mg/100 mg minta) és az egyes minták melegítés utáni aromatartalma a kiindulásinak hány százaléka! Indokolják a kapott eredményeket! A nedvesedési vizsgálatok eredményeit jegyezzék fel táblázatban, majd ábrázolják grafikusan a vizes oldat frontjának helyét (mm) az idő függvényében. Magyarázzák a kapott eredményeket! Értékeljék a kapott eredményeket aszerint, hogy az adott aroma esetén melyik eljárást választanák komplexképzés céljára ipari méretben. 9
Ellenőrző kérdések 1. Mit nevezünk zárványkomplexnek? Rajzolja le a szerkezetét! 2. Ipari eljárások során mire használható a zárványkomplex képzés? 3. Mik a ciklodextrinek? 4. Rajzolja le a β-ciklodextrin szerkezetét! 5. Mire használhatók a ciklodextrinek a kozmetikai iparban, gyógyszeriparban, élelmiszeriparban, környezetvédelemben, mezőgazdaságban? Írjon egy-egy példát is mindegyikre! 6. Milyen módszerekkel állíthatók elő ciklodextrinek zárványkomplexei? 7. Mi a lényege az együttkristályosítás módszerével végzett zárványkomplex képzésnek? 8. Mi a lényege a szuszpenziós módszerrel végzett zárványkomplex képzésnek? 9. Mi a lényege a szilárd fázisú zárványkomplex képzésnek? 10. Milyen módszerekkel igazolható, hogy CD-komplex keletkezett vagy keverék? 11. Hogyan viselkednek az aromaanyagok komplexei és keverékei nedvesedési kísérletek során? Mivel magyarázható az eltérő viselkedés? 12. Mi az oka, hogy a hidrofób aromaanyagok CD-vel történő komplexálást követően jobban nedvesednek? 13. Hogyan határozható meg a komplexek hatóanyagtartalma? 14. Hőkezelést követően milyen hatóanyag-tartalom változást feltételez a komplexek és milyet a keverék esetén? Miért? 15. Hogyan állítjuk elő a CD-aroma komplexet együttkristályosítás módszerével? 16. Hogyan változik az aroma-komplex minták hatóanyag-tartalma szobahőfokon, hosszú ideig történő tárolás során? 17. Milyen nedvesedőképességet mutat a gyakorlat leírásában szereplő mentol komplexe, keveréke és az aroma maga? 18. Az alábbi mérési eredményekből számolja ki a kalibrációs görbe egyenletét!... 19. Az alábbi mérési eredményekből számolja ki a komplex hatóanyagtartalmát!... 20. Az alábbi mérési eredményekből számolja ki hogy a hőkezelésnek alávetett minták hatóanyag-tartalma hány %-a a hőkezelés előtti hatóanyag-tartalomnak!... 10