Transzgénikus nyárfák (3S-gshI-ggs és 3S-rbcS-gshI-6lgl) alkalmazása a fitoremediációban Gyulai Gábor, Bittsánszky András, Malone P. Renee 3, Gullner Gábor, Kőmíves Tamás SZIE MKK GBI Gödöllő; MTA ATK NÖVI Budapest, 3 DIT Dublin e-mail: gyulai.gabor@mkk.szie.hu; bittsanszky.andras@agrar.mta.hu; renee.malone@dit.ie; gullner.gabor@agrar.mta.hu; komives.tamas@agrar.mta.hu. Összefoglalás A transzgénikus növénynemesítésnek kiemelt szerepe van a fák mindkét nagy csoportjában, a tűlevelű nyitvatermőkben és a zárvatermő lombos fákban (ez utóbbin belül az erdei és gyümölcsfákban). Az erdei nyitva- és zárvatermő fákban elsősorban a fa mennyiségi és minőségi javítására, a gyors növekedésre és ellenállóságra való nemesítés a cél. A gyümölcsfák esetében az (a)biotikus stresszt tűrő képesség és a termés mennyiségének, minőségének és beltartalmi értékeinek a növelése, valamint az évekkel előrehozott virágzás indukciója a fő cél. A fák hosszú életideje megnehezíti ezeknek a céloknak az elérését, de a gyors növekedésű fákban (pl. a nyárfák) sok előrehaladás történt. Írásunk bevezető részében áttekintjük a fás növények nemesítésének evolúciós lehetőségeit, főbb csoportjait és tulajdonságait, majd összefoglaljuk a legfontosabb transzgénikus nyárfa kísérleteket, és beszámolunk a 3S-gshI transzgénikus szürke nyárban (Populus x canescens) elért eredményeinkről.. Bevezetés A virágos növények evolúciójában nem az egyszerűbb lágyszárú, egy/kétéves növények jelentek meg először, hanem a hosszú életidejű, évelő, bonyolultabb fás növények: a fák. Ezért nem a lágyszárú, hanem a fás életforma az ősibb ( fejletlenebb ), de sikeresebb, az életidő (ld. több ezer évig élő fenyők) és a nagyság (ld. mamutfenyő) értelmében. Mind a három leg -növény nyitvatermő fa É-amerikai géncentrummal: a Föld legnagyobb tömegű növénye az óriás mamutfenyő (Sequoiadendron giganteum), a legmagasabb növénye a tengerparti mamutfenyő (Sequoia sempervirens) és a legtovább élő növénye a szálkásfenyő (Pinus longaeva) (a legöregebb élő példánya ma 479 éves) (. ábra). A nyitvatermőknek (pl. fenyők) minden faja fa (nincs lágyszárú, egynyári nyitvatermő ). A fás növényeken belül a nyitvatermő tűlevelű fák (nem minden nyitvatermőnek tű alakú a levele) ősibbek a zárvatermő lombos fáknál. A nyitvatermők fák fajszámban (Gingko faj, Gnetumok 66 faj, Szágópálmák faj, Fenyők - Coniferales 6 faj; összesen cca. 7 faj) elmaradnak a.-es fajszámú zárvatermőktől. Fajdiverzitásban a nyitvatermők talán nem használták ki a megjelenésük óta eltelt 3 millió évet, szemben a zárvatermők millió éves fejlődésével. Igaz, a legkorábban megjelent podokarpuszok 69 faja és az millió évvel később ( millió évvel ezelőtt) megjelent fenyők (Pinaceae) 9 faja igen diverz fajkialakulást jelez.
(A) (B) (C). ábra A három ősi mamutfenyő törzse, levélzete és toboza. (A) az óriás mamutfenyő (Sequoiadendron giganteum) egy példánya, és 4 éves telepítése a gödöllői Arborétumban (fotó: Krassay L. ); (B) az elágazásra hajlamos tengerparti mamutfenyő (Sequoia sempervirens); és (C) az ősi kínai mamutfenyő (Metasequoia glyptrostroboides) (fotó: Gyulai Zs. G., Freiburg, ). Genetikai értelemben a nyitvatermők további két leg -tulajdonságban is közel állnak az elsőséghez. A Pinusok hatalmas genomméretét ( x 9 DNS bp) csak néhány liliom múlja felül (4 x 9 DNS bp), összehasonlítva a búza (6 x 9 DNS bp; n=6x=4), az ember (3,6 x 9 DNS bp; n=x=46) és a nyárfa igen kis (,x9 bp; n=4x=3) genomméretével (. ábra). 9 A genomok mérete (x DNS bp) és kromoszómaszámuk (n) 9 x bp 46 4 4 3 4 6 4 4 zs (6 x) ro pa ár ád rn cu ko be r 3, em ric a k,7 ku ko ar s as zm yp o ch riz d. di um pe ro O, 4 3,6 Br a (P op fa tiu ul us ) ) us (P in ny ár ők m Fe ny,4,3 uh,, ci ro ol, bú za (6 x) b za 4 n = 4 4 3 3. ábra A genom mérete és kromoszómaszáma. Nyitvatermő (Pinus) és zárvatermő (Populus) fák összehasonlítása a zárvatermő egy- és kétszikűekkel, valamint az emberi genommal. Sejtszervek (kloroplasztisz és mitokondrium) A teljes kloroplasztisz genom (cpdns) méretében is az egyik nyitvatermő cikászpálma (Cycas taitungensis) felülmúlja (63.43 bp; #NC96) a zárvatermő fákat (3. ábra). Igaz, a Cathaya argyrophylla fenyő (csak 9-
ben írták le) kloroplasztisza az egyik legkisebb méretű (7. bp; #NC49), amelyet már csak az élősködő növények (pl. aranka) génvesztett kloroplasztisz méretei múlnak alul (Cuscuta obtusiflora) (.6 bp; NC49). 4,9 4 9, 6, 4 7,7 6 6,47 9,7 6 9,9 9,, 4 3 4,49 6 33,3 9 3 4, 3 6,4 6 3 4,4 9 3 4 6 7 9 3 4 6 7 9 3 3 3 33 7,, 6 7 3,3 4 7, 6, 7 4,47 6 7,7 9 7,3 3 4 9, 6 3,4 4 6, 6 6 6,9 9,9 3 6,7 9 63,4 3 cp D N S (b p ) 6,6 6 4 3,7 7 4,3 4 7 3. ábra A kloroplasztisz genom (cpdns) méretei. A nyitvatermő (Pinus) és zárvatermő (Populus) fák összehasonlítása a zárvatermő egyés kétszikűekkel. () Cycas taitungensis NC96. () Amborella trichopoda NC6. (3) Platanus occidentalis NC_33. (4) Vitis vinifera NC797. () Nuphar advena NC7. (6) Nymphaea alba NC6. (7) Liriodendron tulipifera NC36. () Morus indica NC39. (9) Prunus persica NC4697. () Populus trichocarpa NC943. () Populus alba NC3. () Arabidopsis thaliana NC93. (3) Euglena gracilis NC63. (4) Zea mays NC666. () Hordeum vulgare NC9. (6) Triticum aestivum NC76. (7) Oryza sativa Japonica NC3. () Oryza sativa Indica NC. (9) Equisetum arvense NC46. () Marchantia polymorpha NC39. () Lathyrus sativus NC463. () Welwitschia mirabilis. NC64. (3) Cedrus deodara NC47. (4) Pinus longaeva NC7. () Durinskia baltica NC47. (6) Pinus monophylla NC. (7) Gnetum parvifolium NC94. () Ephedra equisetina NC94. (9) Cathaya argyrophylla NC49 (9). (3) Cuscuta obtusiflora NC49. (3) Euglena longa NC6. (3) Epifagus virginiana NC6. Cucumis melo: 6.7 bp cpdna (NC93). A cpdns méretében a Floydiella terrestris zöldmoszat hatalmas kloroplasztisz-dns-e a máig legnagyobb szekvenált cpdns-minta (.6 bp; #GU966.). A mitokondrium genom méretére néhány adat: az apró genomú emberi (Homo s.) mtdns 6.69 bp hosszú (#NC9), összehasonlítva a növényi mtdns méreteivel: pl. a lúdfű (Arabidopsis th.; 366.94 bp; #NC4), szágópálma (Cycas taitungensis, 44.94 bp; #NC33), szőlő (Vitis v., 773.79 bp; NC9) és a sárgadinnye (Cucumis melo) eddig legnagyobb, óriásméretű mtdns-ével (.9. bp). A fák evolúciója Az első és legősibb zárvatermő lombos fa (Amborella trichopoda) közel 4 millió ével ezelőtt jelent meg és ma is él az Új Kaledóniai szigeteken. Alacsony kétlaki kisméretű fa, amely egyivarú virágainak felépítésében már zárvatermő, de a fatörzs szerkezetében még nyitvatermő, mert fatestében csak vízszállító fasejtek (tracheidák) vannak, mint minden nyitvatermő (fenyőféle) fában. A kétlakiság is ősi bélyegnek tekinthető, mert a nyitvatermők között az ősi Ginkgo és a Cikászok is kétlakiak. A Gnetumok és a fenyők már egylakiak (igaz a legősibb nyitvatermő, a fenyők közé tartozó Podokarpuszok egylakiak). A nyitvatermőkben nem alakult még ki kétivarú virág. Az evolúcióban fejlettebb zárvatermő lombos fa törzsében, az egymás fölötti fasejtek (tracheida) egybenyílásából kialakultak a facsövek (tracheák) (3-4 millió évvel ezelőtt) és jelen vannak minden zárvatermő lombos fában. Ha figyelembe vesszük a három fenti nyitvatermő leg -fafajt, a fatestnek ez a fejlődése nem lett sikeresebb (viszont ez tehette lehetővé a gyümölcsfák gyümölcsének megjelenését a tobozok helyett). A lombosfák evolúciós kirajzása az alig száz ősi kétszikű ANITA faj (basal dicots) megjelenésével kezdődött: ezek a fás Amborella (Új Kaledónia, faj) mellett a lágyszárú Nymphaea (tündérózsa, vizitök, stb; Euramerika; faj); a 3
fás, örökzöld Illicium (pl. csillagánizs; Ázsia, Amerika; 4 fafaj), a fás Trimenia (Ausztrália, faj) és a szintén fás, kúszó lián Austrobaileya (Ausztrália, faj) fajai. Az ősi kétszikűeket követték a valódi kétszikűek (eudicots), közöttük a legtöbb fafajt () magába foglaló pillangós családot (Fabaceae), és a Rosaceae család legjelentősebb gyümölcsfáit (alma, körte, barack, szilva stb.). A pillangósok családja (Fabaceae) azért is nevezetes, mert az Astragalus (Csüdfüvek) nemzetsége a legnagyobb fajszámú (. faj) növénynemzetség. Csak két növényrendben (Gunnerales, Geraniales) nem alakult (még) ki fa. Vízfelvétel, gyors növekedés, aquaporin gének A növények gyors növekedése, ezzel fitoremediációs kapacitása, attól függ, hogy milyen intenzíven és hatékonyan tudják felvenni a vizet és a benne oldott tápelemeket. A vízfelvétel genetikai szabályozása elsősorban az aquaporin (aqp) gének által kódolt AQUAPORIN (AQP) sejthártyafehérjék aktivitásának a függvénye (Agre P, kémiai Nobel díj, 3). Az AQP fehérjék a MIP (major intrinsic protein) csoportba tartoznak, és aminosav-összetételükre az igen magas alanin-, glicin- és treonintartalom jellemző (4. ábra). aa (%) 4 4 3 3 76 6 NIP-.Arabidopsis t. BOR.Arabidopsis t. K+ ion channel A.t. Myosin (Homo s.) Dragline silk (Nephila sp) 4 3 3 4 9 7 7 4 6 4 3 4 3 6 6 4 3 3 3 Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val 6 4. ábra Két aquaporin fehérje (NIP-, BOR) aminosav-összetétele (aa %) összehasonlítva a növényi Kálium-ion csatorna, az emberi miozin, és a pókfonál (dragline silk) aa-összetételével. A MIP aquaporinok (6-3 kd) működése megegyezik az állatokban, ahol 3 típusuk van, és a növényekben, ahol csoport ismert: PIP, TIP, NIP, SIP és XIP (PIP - plasma membrane intrinsic proteins, TIP - tonoplast intrinsic proteins, NIP - NOD6-like intrinsic proteins of symbiosome membranes, a SIP - small basic intrinsic proteins, és a be nem sorolt XIP intrinsic proteinek). Az aminosav-szekvenciákból szerkesztett filogenetikai hasonlósági dendrogram három fő csoportba osztja az AQP fehérjéket, köztük az igen intenzív vízfelvevő tökféléket és a leggyorsabban növekvő nyárfákat (Populus) és a nyitvatermőket (Pinus, Picea) (. ábra). A fák hosszú élete és nagy tömege is a vízfelvétel függvénye. Növekedési erélyben is úgy tűnik, hogy a nyitvatermők a leghatékonyabbak. A gödöllői Arborétum kísérleti telepén látható olyan 4 éves mamutfenyőtelepítés, amely kétszer akkora fatömeget hozott, mint a -éves telepítésű feketefenyő (. ábra), és többszörösét, mint a lombos fák. A lágyszárú zárvatermők között a Cucurbitaceae fajai (pl. tök, uborka, dinnye) a legintenzívebb növekedésűek (ld. a világ legnagyobb termését adó takarmánytököt). 4
AQLP.AAL94.Pinus taeda NIP6-.XP_3649.Medicago truncatula NOD.6.XP_34649.Glycine max NOD, AQP AQP.ADN34.Cucumis melo 6 AQP.ABN96.Cucumis sativus AQP NIP-.NP_9366.Arabidopsis_thaliana NIP-3.XP_367.Brachypodium distachyon AQP.NP_4637.Oryza sativa Japonica Pinus 4 4 39 NOD-6.CAD67694.Cucurbita pepo Si-TRP.BAK97.Cucurbita moschata NOD-.ADK69.Fragaria chiloensis NOD-6.CAB46.Pisum sativum NIP-.XP_39376.Medicago truncatula NIP-.ABS7446.Vigna unguiculata NIP-.DAA3374.Gossypium hirsutum Si-TRP, NOD, AQP 7 NIP3-.NP_7447.Arabidopsis thaliana NIP-.XP_377.Brachypodium distachyon NIP4-.NP_99.Arabidopsis thaliana NIP.XP_39.Populus trichocarpa Picea - Populus 6 4 3 NIP-.NP_7.Zea mays AQP.ABK73.Picea sitchensis NIP.XP_34.Populus trichocarpa NIP-.XP_36343.Vitis vinifera AQP.ABN97.Cucurbita ficifolia NIP-.ADE349.Gossypium hirsutum NIP-3.ADE3493.Gossypium hirsutum AQP.XP_3737.Populus trichocarpa NIP-6.XP_67.Ricinus communis BAJ963.AQP.Hordeum vulgare NIP-6.ABY9374.Lotus japonicus Populus AQP.XP_9733.Selaginella moellendorffii....6.4... ábra Az aquaporin fehérjék (AQP, NIP, NOD and Si-TRP) filogenetikai kapcsolatai. A nyitvatermő (Pinus, Picea) és zárvatermő (lágyszárú és fás) fajok, valamint a külső csoport Selaginella csipkeharaszt kiemelésével. A fehérjeszekvenciák (NCBI) letöltése, blast-elemzése és illesztése után a dendrogram szerkesztése Mega4 (Tamura et al. 4) programmal történt a génbanki (NCBI) számok, a relatív genetikai távolság (mérce) és a bootstrap (x) értékek feltüntetésével. 3. Fitoremediáció A fitoremediáció ma már egy technológia, amelyben növényekkel történik a talajszennyeződések eltávolítása: a szennyezett talaj megtisztítása, remediálása. Összehasonlítva a fizikai (pl. talajelhordás), kémiai (pl. Na EDTA kelát-kezelés) és biológiai (pl. baktériumok alkalmazása) remediációs módszerekkel, a növények használata költséghatékony és kevésbé káros a környezetre. A mérgezés felszámolása történhet lebontással, talajból történő kivonással (fitoextrakció), vagy a szennyezőanyagok megkötésével, immobilizációjával. A fitoextrakció során, a növények tápanyagfelvevő mechanizmusát használjuk fel a szennyezőanyagok talajszint feletti szövetekben történő akkumulációjához. Néhány évi növekedés után a föld fölötti biomasszát begyűjtve a szennyezés eltávolítható a területről. A növényanyag elégetéséből (bioenergia) visszamaradt hamuban tovább koncentrálódnak a szennyezőanyagok, amelyeket újrahasznosíthatunk, vagy lezárt hulladéktárolókba helyezhetünk. Fitoextrakcióra azok a növények alkalmasak, amelyek képesek a szennyezőanyagok gyors felvételére, és a föld fölötti szöveteikben történő akkumulációjára/tűrésére/lebontására, amelyre a Populus fajok kiemelten alkalmasak. Ültetésük egyszerű, jól gyökeresednek, vegetatív úton könnyen szaporíthatók, növekedésük gyors (4- méter/év). A Populus fajokra, a fás növények közül a legjobban tanulmányozott fajokra, számos módszert dolgoztak ki erdészeti, vegetatív szaporítási, szövettenyésztési, géntranszformációs nemesítési és betakarítási eljárásokra. A nyárfajoknak magas a transpirációs rátájuk, hosszú gyökérzetük révén elérik a talaj mélyebb vízrétegeit, könnyen
adszorbeálják, lebontják és/vagy detoxifikálják a szennyezőanyagokat, miközben gátolják a talajeróziót is. Fajai világszerte elterjedtek főként az ártéri területeken, így nagy valószínűséggel található a potenciális fitoremediációs területekre megfelelő Populus faj. A nyár nem része az emberi tápláléknak, habár számos állatfaj hasznosítja táplálékként (pl. rovarok) és lakhelyként (pl. madarak). Mindezek alapján a Populus fajok ideális jelöltek a fitoremediációra történő nemesítésre (. táblázat). A legtöbb nyárfával végzett fitoremediációs feladatot az Egyesült Államokban dolgozták ki, ahol már több erre szakosodott gazdasági társulás alakult. Ezek között is a legfontosabbak a glutation (GSH) alapú fitoremediációra génnemesített 3S-gshI transzgénikus nyárfák. A GSH (glutation) és szerepe a stressz elleni védekezésben Rey-Pailhade -ban izolált élesztőből egy olyan vegyületet, amely elemi kénnel reagálva spontán reakcióban hidrogén-szulfidot termelt. A vegyületet két görög szó felhasználásával filotionnak ("kenet szerető") nevezte el (Meister, l9). 9-ben Hopkins vizsgálta újra ezt a vegyületet, és először (tévesen) glutamátból és ciszteinből álló dipeptidként jellemezte. A két aminosav kapcsolódására utalva Hopkins nevezte el a vegyületet glutationnak (GSH) (glutaminsav+filotion+pepton). amely elnevezés egyben az eredeti filotion névhez és az egyszerű peptideket jelző pepton végződéshez is kapcsolódott. Hopkins később megismételte vizsgálatait, és 99-ben helyesen ismerte fel a GSH tripeptid voltát. A redukált GSH ( -L-glutamil-L-ciszteinil-glicin) oxidált formája a GSSG, melyben két GSH molekula kén-hídon keresztül kapcsolódik össze. A GSSG visszaalakulását GSH-vá a glutation reduktáz enzim (GR) katalizálja és a reakcióhoz a fotoszintetikus elektrontranszport-láncban termelődött NADPH-t használja fel. A GSH a növényi antioxidáns rendszer fontos eleme. Szintézisének két utolsó lépésében két ATP-t igénylő lépés van. Az elsőben a γ-glutamil-cisztein (γ-ec) jön létre a glutaminsav és a cisztein között, amelyben nem a szokásos peptidkötés alakul, ki hanem egy speciális peptidkötés, amelyben a glutaminsav nem az α-, hanem a γ- karboxilcsoportjával kapcsolódik a ciszteinhez, aminek következtében a glutationt a proteolitikus enzimek nehezen tudják lebontani. 6. ábra A glutation bioszintézisének két utolsó enzimatikus lépése és a reakciókat katalizáló enzimek. A második lépésben a glicin kapcsolódik a C-terminális helyzetű ciszteinhez, így alakítva ki a glutation tripeptidet. Az első lépést a γ-glutamilcisztein szintáz enzim (γ-ecs) (kódoló génje a gsh), a másodikat a glutation szintáz enzim (GS) (kódoló génje a gsh) katalizálja. A reakció végbemegy a citoszolban és a kloroplasztban is (6. ábra). 6
A GSH a stressz elleni védelemben több ponton is hat, melyek közül a reaktív oxigéngyökök elleni védelem (különösen a membránlipidek és -proteinek védelme), a H O elleni védelem (az aszkorbinsav regenerációján keresztül), és a fitoremediációs kapacitást biztosító nehézfémkötő fehérjék (HMBP heavy metal binding proteins) (pl. fitokelatinok) prekurzoraként a teljes növényi nehézfémtűrésben tölt be központi szerepet. A fitokelatinok kiinduló molekulája a GSH, melyek bioszintézisét a fitokelatin szintáz enzim katalizálja: (γglucys) ngly + (γglucys) ngly (γglucys) n+gly (n =,,3 ). A Cu, Cd, Pb és a Zn különösen jól kötődnek a Cys (cisztein) tiol (SH) csoportjához, oldható fémkelátot hozva létre. A GSH, hasonlóan a többi kéntartalmú peptidhez, a xenobiotikumok (kémiai szennyeződések) nagy csoportjával képes reakcióba lépni (pl. GSH-herbicid komplex), amelyeket az ABC transzporterek (ATP binding casette) szállítanak a vakuólum depóba. A fák biotechnológiai modellnövénye a nyárfa A nyárfa az erdészeti biotechnológiai kutatások modellnövénye. Ezt annak köszönheti, hogy rendelkezik számos olyan, a többi fás növényben együtt nem jelentkező tulajdonsággal, amelyek megkönnyítik a biotechnológiai és molekuláris biológiai kutatásokat. Ezek a következők: Kisméretű a nukleáris genom (. ábra), a haploid genom mérete,4± x 9 bp, hasonló a rizsgenom méretéhez, és csak 4 nagyobb az Arabidopsisénál, de 4 kisebb, mint a fenyő genomja; Ismert a Populus trichocarpa teljes genomszekvenciája (Tuskan et al. 6); Könnyű a vegetatív szaporíthatóság, amellyel a genetikai állomány változatlanul fenntartható; Gyors a növekedése és a termőre fordulása, a kísérletek viszonylag gyorsan (- év) elvégezhetők; Könnyű transzformálhatóság, könnyű transzgénikus fák előállítása. 4. Génbevitel nyárfába A nyár genomszekvencia-adatai szabadon hozzáférhetők (http://www.jgi.doe.gov/poplar/). Mindezen jó tulajdonságok alapján nem meglepő, hogy az első transzgénikus fa szintén a nyár volt, amelyet 97-ben állítottak elő, a bevitt tulajdonság a glifozát-rezisztencia volt (. táblázat). A 3S-gshI-ggs és a 3S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus szürke nyárfák jellemzői A vizsgálatainkhoz a szürkenyárhibrid (Populus tremula Populus alba = Populus canescens) két transzformáns klónját alkalmaztuk (INRA No.77--B4): a ggs és a 6lgl klónokat, összehasonlítva a nem transzformált szürkenyárral (WT). A növények az Escherichia coli baktériumból származó γ-glutamil-cisztein szintáz (γ-ecs) enzimet kódoló gént (gsh) hordozták. A gén eredeti start-kodonját (TTG) PCR technikával ATG szekvenciára módosították. Magát a kódoló szekvenciát (,7 kb) tartalmazó HindIII/SmaI fragmentumot a plbr9 plazmidba klónozták. A promóter a karfiolmozaik-vírus (CaMV) konstitutív 3S promótere volt, dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával (p7) és a CaMV poli-a szekvenciájával. Ezt a CaMV-3S promóter gshi poli-a gén-kazettát a pbin9 bináris vektorba klónozták egy SstI/XbaI inszertben. Az így elkészített vektort építették be az Agrobacterium tumefaciens C (pmp9) törzsébe, és végezték el a szürkenyárhibrid (P. canescens) genetikai transzformációját. Kétféle gshi-génnel transzformált nyárfa klóntípust állítottak elő. A ggs klónban (3S-gshI-ggs) a transzgén fehérjeterméke a citoszolban expresszálódik. A 6lgl klónban (3S-rbcS-gshI-6lgl) a CaMV-3S promóter és a gshi gén közé beépítették a borsó RUBISCO gén kis alegységének tranzit peptidjét (borsó rbcs), aminek következtében a gshi gén terméke beszállítódik a kloroplasztiszba (7. ábra). A transzgénikus klónokban a GSH-tartalom -4-szer nagyobb lett, mint a kontroll klónokban. A szürkenyárklónok (ggs, 6lgl, kontroll) steril hajtásai Németországból (Albert-Ludwigs-Universität, Institut für Forstbotanik und Baumphysiologie, Freiburg, Prof H Rennenberg) érkeztek. 7
. táblázat: A fontosabb genetikailag módosított nyárfák (A) HERBICIDREZISZTENCIA Faj/Hibrid Transzgén* Rezisztencia tulajdonság Irodalom P. alba P. grandidentata aroa Glifozát rezisztencia (Fillatti et al. 97) P. tremula P. alba bar Foszfinotricin rezisztencia (de Block ) P. trichocarpa P. deltoides bar Foszfinotricin rezisztencia (de Block ) P. tremula P. alba bar Foszfinotricin rezisztencia (Devillard ) P. tremula P. alba crs- Klórszulfuron rezistzencia (Brasileiro et al. ) P. tremula P. alba crs- Klórszulfuron rezistzencia (Chupeau et al. 4) P. tremula P. alba bar Foszfinotricin rezisztencia (Chupeau et al. 4) P. alba P. grandidentata aroa Glifozát rezisztencia (Donahue et al. 4) (B) ROVARREZISZTENCA P. alba P. grandidentata cryia(a) Malacosoma disstria (M C Cown et al. ) P. nigra cryia(c) Lymantria dispar (Wang et al. 6) Apochemia cinerarius P. tremula P. tremuloides cryiiia Chrysomela tremulae (Cornu et al. 6) P. tremula P. tremuloides oci Chrysomela tremulae (Leple et al. ) P. alba P. grandidentata pinii Lymantria dispar (Heuchelin et al. 7) P. tremula P. grandidentata pinii Plagiodera versicolora (Klopfenstein et al. 7) [P. alba (P. davidiana + P. simonii)] P. tomentosa cryia(ci Lymantria dispar (Yang et al. 3) Clostera anachoreta [(P. tomentosa P. bolleana) P. tomentosa] CpTI Lymantria dispar Malacosoma disstria Stilpnotia candida (Zhang et al. ) (C) ANYAGCSERE-MÓDOSÍTÁS P. alba StSy resveratrol 3-glükozid (Giorcelli et al. 4) P. tremula P. alba ipt Citokinin-tartalom (Schwartzenberg et al. 4) P. sieboldii P. grandidentata ipt Citokinin-tartalom (Ebinuma et al. 7) P. tremula P. tremuloides GA--oxidáz Hormon anyagcsere (Eriksson et al. ) P. tremula P. tremuloides iaam, iaah Hormon anyagcsere (Tuominen et al. ) P. tremula P. tremuloides iaam Hormon anyagcsere (Tuominen et al. ) P. tremula P. tremuloides rolc Hormon anyagcsere (Nilsson et al. 6) P. tremula P. tremuloides rolc Hormon anyagcsere (Ahuja és Fladung 6) P. tremula rolb+rolc Módosult gyökérzet (Tzfira et al. ) P. tremula P. tremuloides phya Hormon anyagcsere (Olsen et al. 7) P. nigra Homeobox OSH Rendellenes fejlődés (Mohri et al. 9) P. tremula P. alba gor Glutation anyagcsere (Foyer et al. ) P. tremula P. alba gshii Glutation anyagcsere (Foyer et al. ) P. tremula P. alba gshi Glutation anyagcsere (Arisi et al. 7) P. tremula P. alb GS Nitrogén hasznosítás (Gallardo et al. 9) P. tremula P. alba AS comt Lignin anyagcsere (Van Doorsselaere et al. ) P. tremula P. alba AS cad Lignin anyagcsere (Baucher et al. 6) P. tremula P. alba chs chalkon szintáz (Nicolescu et al. 6) P. tremula P. alba FeSOD stressztűrés (Arisi et al. ) P. tomentosa mtld sóstressz (Hu et al. ) (D) VIRÁGZÁSMÓDOSÍTÁS P. tremuloides leafy Korai virágzás (Weigel és Nilsson ) P. tremula P. alba, leafy Korai virágzás (Rottmann et al. ) P. tremula P. tremuloides P. trichocarpa P. deltoides P. tremula P. alba, ptlf Korai virágzás (Rottmann et al. ) P. tremula P. tremuloides P. trichocarpa P. deltoides P. trichocarpa P. deltoides leafy Korai virágzás (Skinner et al. 3) (E) PROMÓTERMÓDOSÍTÁS P. tremula P. alba pcad/gus Xilém specifikus expresszió (Feuillet et al. ) P. tremula P. tremuloides prolc/gus Évszak specifikus expresszió (Nilsson et al. 6) P. tremula P. alba p-sam/gus Szövet specifikus expresszió (Mijnsbrugge et al. 6) P. tremula P. tremuloides p3s/gus Konstitutív expresszió (Nilsson et al. 6) *Jelmagyarázat: aroa: mutáns EPSP szintáz, AS: antiszensz; bar: foszfinotricin acetyl transzferáz; cad: cinnamil alkohol dehidrogenáz; cat: kloramfenikol acetil transzferáz; comt: kávésav O-metil transzferáz; CpTI: tripszin inhibitor; crs-: mutáns acetolaktát szintáz; cryia(c), cryia(a), cryiiia: Bacillus thuringiensis δ-endotoxin gének; FeSOD: vas szuperoxid dizmutáz; GS: glutamin szintáz gshi: γ-glutamilcisztein szintáz gshii: glutation szintáz gor: glutation reduktáz gus: β-glükuronidáz; ipt: izopentenil transzferáz; iaah: indol-3-acetamid hidroláz; iaam: triptofán--mono-oxigenáz; luxf: luciferáz; mtld: mannitol--foszfát dehidrogenáz; oci: rizs cisztein proteináz inhibitor; p: promóter; phya: fitokróm A; pinii: burgonya proteáz inhibitor II; StSy: stilbén szintáz.
7. ábra A 3S-gshI-ggs és a 3S-rbcS-gshI-6lgl transzgén-kazetta felépítése. (A) A citoszolban expresszálódó 3S-gshI-ggs transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció. LB: bal oldali határoló régió; P-p7: karfiolmozaik-vírus 3S promótere dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával; gsh: a γ-ecs enzimet kódoló gén szekvenciája; T-3S: karfiolmozaikvírus poli(a) szekvenciája; T-nos: nopalin szintáz promótere; nptii: neomycin foszfotranszferázt kódoló gén szekvenciája; P- nos nopalin szintáz terminátor szekvenciája; RB: jobb oldali határoló régió. (B) Az rbcs tranzitpeptiddel a kloroplasztiszba szállított 3S-rbcS-gshI-6lgl transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció a γ-ecs kloroplasztiszban való túltermeltetéséhez. rbcs: borsó RUBISCO enzim kis alegységének tranzitpeptidjét kódoló része. A 3S-gshI transzgénikus szürke nyár mikroszaporítása in vitro A növények mikroszaporítása nodális hajtástenyészetben in vitro történt WPM táptalajon (. ábra).. ábra A transzgénikus 3S-gshI transzgénikus szürkenyár (P. x canescens) mikroszaporítása in vitro. () a kiinduló gyökeres hajtástenyészetből vágott, () nodális szárdarabokon megindul, (3) az alvórügyek kihajtása, (4) és teljes kifejlődése, majd () gyökereztetése, a (6) a nagy mennyiségű klón előállításában. 9
A 3S-gshI és a 3S-rbcS-gshI transzgén beépülő kópiaszámának és expressziójának meghatározása (qpcr) A 3S-gshI transzgén beépülési kópiaszámának meghatározása, a konstitutívan expresszálódó actin gén kontrolljában végeztük, tervezett primerekkel (Primer3, NCBI), qpcr elemzésben ( µl) (Corbett Gene 6), DyNAmo HS SybrGreen I qpcr Kit (# F-4L, Finnzymes, Finland Izinta) felhasználásával, a ΔΔCt módszer kiértékelésével (9. ábra). Az RT-qPCR eredmények szerint, a 3S-gshI transzgén a 3S-gshI-ggs klónban magasabb (,6) beépülési kópiaszámot mutatott, mint a 3S-rbcS-gshI-6lgl klónban (,), amelyben azonban a transzgén expressziója 3,- szöröse volt a folyamatos kloroplasztiszba történő géntermék (GSH) szállításának eredményeként (9. ábra). 4 3 - gshi-mrns szint (rel. génexpresszió) 6 4 3, n n n,6n n 3,,,,3 Pop.gsh Ecoli.3S-gshI Pop.gsh Ecoli.3S-rbcS-gshI Pop.gsh - Gén kópiaszám (relatív) - WT TR(ggs) TR(lgl6) 9. ábra A 3S-gshI-ggs és a 3S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus-, valamint a kontrol (WT) szürke nyár (n=4x=3) klónok (P. x canescens) transz/gén beépülésének és saját Pop.gsh génjének kópiaszáma és relatív génexpressziója. A relatív génexpressziót a génekről átírt mrns-ek mennyiségének mérésével határoztuk meg a totál RNS (, g levélszövetből kivonva, és NanoDrop ND- UV-Vis spectrofotométerrel ellenőrizve) mintákból szintetizált cdns-ből. A nyárfa saját gshi génjének (Pop.gsh- mrns), valamint a két transzgén konstrukciónak (3S-gshI-ggs-mRNS és a 3S-rbcS-gshI-6lgl-mRNS) az mrns mennyiségét az a-tubulin (a-tubulin-mrns) és az aktin (actin-mrns) mrns-ének mennyiségéhez (,) viszonyítottuk (Absolutely RNA Miniprep Kit (# 4, Stratagene, USA - Biomedica, Magyarország) követve a protokollt. cdna szintézis: Az mrns-ek reverz transzkripciójához (cdns szintézis) RT-t (reverse transcriptase, Moloney Murine Leukemia Virus: M-MuLV), oligo(dt) (, µg) és 3 -primert alkalmaztunk (# K6; Fermentas Biocenter, Szeged, Hungary). Génexpresszió mérése: Az egyszálas cdna-mintákat (, μl) közvetlenül vittük qrt-pcrbe ( µl) a megtervezett primerekkel (4 nm) ( Primer3 NCBI) DyNAmo HS SybrGreen I qpcr kitben. A qrt-pcr ciklusai: perc elődenaturációt (9 C) követő 3 amplifikációs ciklus (9 C/ sec, 6 C/ sec, 7 C/ sec) 4 C-os véghűtéssel (Rotor Gene 6, Corbett Research, Australia). Az adatok kiértékelése. A kalibrációhoz és a qvantáláshoz -szeres cdns koncentrációsorban történt (x, x, x, 3 x cdna) (. ábra), NTC (non DNA-template control) és ddh O kontrollal. A számítás (Ct, ΔC, ΔΔCt meghatározása) ΔΔCt módszerrel történt: Ct-szint (threshold cycle): A küszöbértékének meghatározása a felszaporodó cdns-fragmentum küszöbérték feletti fluoreszcencia értékéből (dr) történt kézi illesztéssel. A standard görbe, amely a Ct-érték és a felszaporodó cdns-fragmentum fluoreszcenciája közötti korrelációt mutatta magas R -értékű volt (,97). ΔC: ΔCt értéke a Ct Ecol.gshI Ct a-tubulin és a Ct Pop.gsh Ct a-tubulin különbségét mutatja. ΔΔCt values: A ΔΔCt érték Ct kezeletlen átlaga Ct kezelt átlag különbségének a ΔΔCt értéke.
. ábra A gshi transzgén kimutatása RT-qPCR-el a 3S-gshI-ggs (- -) és a 3S-rbcS-gshI-6lgl (- -) transzgénikus szürkenyárklónokban. A PCR ciklusok száma (Cycles) és a DNS-be kötődő SybrGreen festék fluoreszcenciája (dr) közötti korrelációs görbe. A reakció kalibrációja és kvantálása -szeres cdns koncentrációval (x, x, x, 3 mennyiségű cdns; az ábrán Standard,,3,4 ) és NTC (DNS nélküli kontroll; non DNA-template control) alkalmazásával történt. A transzgén működésének reaktivációja DHA-indukált DNS-demetilációval A TGS (transzkripcionális géncsendesítés) leghatékonyabb módja, az adott szervben szükségtelen gének működésének (expressziójának) elhallgattatása (gene silencing). Mindkét TGS, a fehérje szintű (az adott gén környezetében levő hiszton fehérjék de/acetilálása, a HDAC: hiszton deacetiláz katalízisében), és a DNS szintű (a gén citozin bázisainak metilálása met C-vé, a DNMT: DNS-metiltranszferáz katalízisében) indukálható kémiai kezeléssel. Vizsgálatainkban a humán rákterápiában alkalmazott, nem metilálható citozin-analógot a DHAC-t (dihidro-azacitidin) alkalmaztuk. A DHC képes beépülni az éppen osztódó sejt replikálódó DNS-ébe, ezzel az utódsejtekben az adott gén citozinjainak metilálhatatlanságával az adott gén reaktiválódik. Megállapítottuk a két transzgén (a 3S-gshI-ggs és a 3S-rbcS-gshI-6lgl) mellet a nyárfa saját gsh génjének nagyságrendi (x) reaktiválódását a két transzformált nyárfában és nem transzformált (WT) klónban (. ábra). - gsh-mrns szint (relatív gén expresszió) - 6 4 6 4 6 4, Pop.gsh 9, Pop.gsh + DHAC, 3S-gshI- ggs, 3S-gshI- ggs + DHAC 3, Pop.gsh, Pop.gsh + DHAC 3, 3,7 3S-rbcSgshI-6lgl 3S-rbcSgshI-6lgl + DHAC,3 Pop.gsh 3,9 Pop.gsh + DHAC WT TR(ggs) TR(lgl6). ábra A 3S-gshI-ggs és a 3S-rbcS-gshI-6lgl transzgének (E. coli), valamint a nyárfa (Populus x canescens) saját (WT) gsh génjének reaktiválása DHAC (4x -7 M) kezeléssel ( napig kezelt in vitro levélkorong-tenyészetben).
Funkcionális elemzések: a transzgén hatása a nyárfa egyéb génjeinek (gst) működésére Paraquat stressz alatt (4x -7 M, nap, levélkorong-tenyészet) a transzgénikus klónokban megvizsgált saját GST-enzimaktivitás (glutation S-transzferáz) pozitív serkentést (co-expressziót) mutatott a 3S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus klónban. Ez az eredmény igazolja, hogy a kloroplasztiszban, a fotoszintetikus elektrontranszport láncára ható paraquat elleni védekezéshez felhasználódik a kloroplasztiszba szállított transzgén által kódolt GSH is (. ábra). 3S-gshI-ggs - -,% szacharóz fény - -,% szacharóz, fény - -,% szacharóz, fény - -,% szacharóz sötét - -,% szacharóz sötét 3S-rbcS-gshI- Nem-transzgénikus. ábra A 3S-gshI-ggs és a 3S-rbcS-gshI-6lgl transzgén hatása a nyárfa egyéb génaktivitására. A gst által kódolt GST enzim (glutation S-transzferáz) aktivitásának változása eltérő szénellátás (% - -, - % - -, -,% - - szacharóz) és fény (6 h fény/ h sötét fotoperiódus és folyamatos sötét inkubációval - -, - -), valamint paraquat stresszben (4x -9 4x -6 M) (az átlagértékek és a szórás jelölésével; n=3). A vizsgálati eredmények igazolják, hogy a transzgénikus 3S-gshI nyárfaklónok (Populus) közel -szer aktívabban képesek a talajszennyeződések felvételére, ezért alkalmazásukkal tizedére csökkenthető egy szennyezett (ld. napjaink vörösiszap-katasztrófái) terület remediálása. Köszönetnyilvánítás: A vizsgálatokat az OTKA-K7764 és az OTKA-PD769 pályázat támogatta. Ajánlott irodalom Bittsánszky A, G Gyulai, G Gullner, J Kiss, Z Szabó, Gy Kátay, L Heszky, T Kőmíves (9): In vitro breeding of grey poplar (Populus canescens) for phytoremediation purposes. Journal of Chemical Technology & Biotechnology 4: 9 94. Gullner G, G Gyulai, A Bittsánszky, J Kiss, L Heszky, T Kömíves () Enhanced Inducibility of Glutathione S-Transferase Activity by Paraquat in Poplar Leaf Discs in the Presence of Sucrose. Phyton 4: 39 44. Gyulai G, Z Tóth, A Bittsánszky, Z Szabó, G Gullner, J Kiss, T Kőmíves and L Heszky (a) Gene up-regulation by DNA demethylation in 3S-gshItransgenic poplars (Populus x canescens). in: Genetically Modified Plants: New Research Trends. Eds. T Wolf and J Koch, Nova Science Publisher, Inc. USA, Chapter, pp. 73 9. ISBN 97--646-696-3. Kőmíves T, Gullner G () Phytoremediation. In: Plant-Environment Interactions (RE Wilkinson ed.), Marcel Dekker Publ, New York, pp. 437 4. Malone R, Dix PJ () Mutagenesis and triazine herbicide effects in strawberry shoot cultures. J Exp Bot 4: 463 469.