POLISZACHARIDOK (BIOPOLIMEREK) FERMENTÁCIÓJA (PSZ.) inulin (ß(2 1) A növényi poliszacharidokat régen alkalmazzák: keményítő, cellulóz, agar-agar, alginát, pektin.. A mikróbiális poliszacharidokat néhány évtizede, de sok van! Dextrán, xantán, pullulán, szkleroglukán Unikális fiz. tulajdonság: gélképzés és viszkozitás növelés Lokalizáció: - sejtfal komponens - (felületi makromolekulához kapcsolódik) - Extracelluláris komponens: nyálkahártya: zselés kolónia, viszkózus tenyészoldat 1. Exo poliszacharid tulajdonságok, szerkezet: Alkotó komponensek: nagy változatosság karboxilcsop. hidroxilcsop. β-izomer pozícióban C1 aszimmetrikus szénatom hidroxilcsop. α-izomer pozícióban β-d glükóz piranóz forma (6 tagú gyűrű) a = a D-mannóz 2. szénatomján levő hidroxilcsop. helyzete b = a D-galaktóz 4. szénatomján levő hidroxilcsop. helyzete glükurónsav polianionos jelleg: urónsav piroszőlősav kationkötők: Ca, Ba, Na a tisztításnál fontos L-glükóz A hidrofil/anionos jelleg erősödik ketálképzés mannóz -4 CH3 C -6 COOH észterképzés mannóz C 6 O-acetát a lipofil jelleg erősödik ecetsav propionsav glicerinsav borkősav? Ábra: a mikrobiális exopoliszacharidok egyes alkotóelemei
2 Exo poliszacharid szerkezet - Homo poliszacharid - Hetero poliszacharid 3 Homo poliszacharid típus ismert: + pullulán Ábrázolási módok (LINEÁRIS) CURDLÁN (OLDALLÁNC) SZLEROGLIKÁN (ELÁGAZÓ) DEXTRÁN Hetero poliszacharid: különböző cukrokat ismétlődő alegységeket tartalmaz Alegység Pentaszacharid egység az anionos jelleg a hidrofil hatást erősíti Ábra: a xantán szerkezete háromféleképpen ábrázolva
3 Dextrán: Szacharóz Leuconostoc mesenteroides Dextrán sacharáz dextrán +(n-1) Fruktóz Transzglikozilálás! Lineáris rész: α(1-6), elágazás α(1-4): glükóz polimer Irreverzibilis 100 %-os konverzió. Molekulatömeg: 15 000 500 000 Cukorgyárakban: léfertőződés Leván: Szacharóz Leván szacharáz leván +fruktóz+glukóz Aerobacter levanicum Bacillus subtilis Konverzió: 62 % 2 3 fruktozid kötés : fruktóz polimer Poliszacharid tulajdonság: viszkozitás, függ a hőmérséklettől és a nyírástól Olvadáspont Polimer T m (kb.) ºC xantán 120 szukcinoglikán 70 szkleroglikán 150 velán 150 T m felett degradálódás
4 A T m feletti hőmérsékleten viszonylag kicsi a viszkozitás változása Ábra: A hőmérséklet hatása a viszkozitásra Nyírás (nyíróerő): kis nyíróerő: nagy viszkozitás nagy nyíróerő: kis viszkozitás Jó szivattyúzhatóság, porlaszthatóság Szerkezeti viszkozitás: áramlás xantán Gélképzés: általános tulajdonság Alginát: Ca-t igényel (poligerluronat) Funkció: kiszáradás ellen fagocitózis, fágok ellen tartalék tápanyag (xantán nem) immunológiai determináns Polihidroxibutirát (PHB) (3-OH vajsav polimer): észter (lehet 4-OH polimer is) Polihidrroxi-alkanoát (PHA): (5 15 szénatomos sav) Alcaligenes enthrophus ICI 1982 Szabadalom: 11 16 ipari törzs: BIOPOL A sejt 80 %-a PHB: granulumban: tartalék tápanyag Biodegradábilis, biokompatibilis polimer 100 30 000 monomer.
5 2. A poliszacharidok bioszintézise általában: a bioszintézis a citoplazmában történik, ezután (közben) kijut a külső térbe dextrán, leván: extracelluláris szintézis: transzglükozilálás UDP cukor Központi szerep: - cukor interkonverzió (cukor P. is!) Ábra: a cukorfoszfátok és cukor-nukleotid foszfátok interkonverziója GDP - cukor Acetil CoA: ecetsav transzfer Szintézis: xantán - energia a poliszacharid szintézishez Ábra: a xantán bioszintézisének egyszerűsített vázlata
6 Exo poliszacharid képzés genetikája: Xanthomonas campestris: xantán (mutációval) Xantán cluster nagy operon: 16 Kb DNS szekvencia: 12 gén hasítás BAM H1 restrikciós enzimmel 1 Az egyes gének biokémiai funkciói: I-V: transzferáz, I-V. Acy: acetiláz, I-II Ket: ketáz, Pol: polimeráz, Exp: export 2 Xantán gének, gumb-m 3 BAM H1 restrikciós térkép, amely megadja a 16 Kb-os xantán cluster fragmenseinek hozzávetőleges méretét (Kb) 3. POLISZACHARID FERMENTÁCIÓ (általános elvek) Tápközeg: normál. szénforrás: szacharóz (dextrán, leván), glükóz (többi poliszacharid) Fermentor: 50 200 m 3, különleges keverővel Törzs, inokulum : N 2 gáz ( -80 C), liofilezett törzstenyészet Papírcsík inokulum : 1 évig stabil 4 C - on
7 Fermentáció: ph: 6 7,5 (xantán opt. ph: 7; ph: 5 alatt a folyamat lelassul!) Hőmérséklet: a C maximumig emelik: viszkozitás csökken, OTR: nő OTR: lásd alábbi ábra 3% xantán viszkozitása: 10 000 cp felett! Elmenő levegő: szűrés. Növénypatogén! Oxigen transfer rate OTR Xantán: legfontosabb: 10 000 t/év. 408 M USD/év Xanthomonas campestris: növény patogén: káposzta, gyümölcsfák Minden kimenő anyagot sterilezni! Könnyen befertőződik: xantán burok miatt t g =nagy, lassan növekszik Glükóz + NH 3 : N-forrás szabja meg a végső %-ot (N-limit) (glutarátot helyettesítheti) Nagy a viszkozitás: I típusú fermentáció: Ábra: Xantán gumi batch fermentációja X. campestris-szel 4 5 % glükóz 25 30 g xantán/l; konverzió: 70 % -os. ph szabályozás: 7 ± 0,3. (Savképződés: termékképz. lassul, leáll.) Anyagátadás: holt terek ne legyenek Nagy keverő (kavaró) átmérő.
8 Buborék: nagy gyorsan felszáll és kis relatív felület: OTR kicsi kis - stabil diszperzió (áll a buborék) egyensúlyi gázösszetétellel: OTR kicsi Szukcinoglikán: III. típusú fermentáció, N-limit. Ábra: Szukcinoglikán batch fermentációja Pseudomonas fajjal Dextrán: 10 20 % szacharóz + 2% CSL. Sejtnövekedés termékképződés gyenge. BIOGAL Enzimes technológia: nem gazdaságos Dextránképzéshez nem kell levegőztetés, csak kevés (2 nap) O 2 limit 0,5 g baktérium 80 g dextránt termel Tejsavképződés: ph szabályozás Kicsapás: metil-alkohol. Szűrés. Pirogénmentes vízben oldás. metil-alkoholos kicsapás Vérplazma: a) HCl. 100 C lebontás (viszkozitás csökkenés.) Frakcionált kicsapás kis molekulatömeg vérplazma, nagy molekulatömeg: visszavezetés HCl hidrolízis b) Enzimes hidrolízis: Dextranóz. P. funiculosum 4. DOWN STREAM műveletek a.) Ultraszűrés (+porlasztva szárítás) 5 10 szeres koncentrálás (xantán). - dezinficiálni az oldatot (biol. Lebontás) hátrány! - Kis molekulatömegű komponensek (tápoldatból) eltávoznak előny. - Olcsóbb, nincs oldószervisszanyerés b.) Szerves oldószeres kicsapás: Metanol, Etanol, aceton, propan -2-ol Xantán: oldószer mennyisége csökkenthető (4x-re): Ca, K adagolásával. (Melegítés: 100 130 C, 1 15 ) Szárításnál vigyázni: robbanásveszély. Szárazon tárolandó: biológiai lebontás. Élelmiszer célra (FDA): 10 000 sejt/g max!
9 Propilén-oxidos dezinficiálás + C : megöli a sejteket. Kicsapás: Metanol; ph=5,6; 25% MeOH: viszkozitás csökkenés: centrifugálással: a sejt és a lebegő részek eltávolíthatók + 2 % KCr + 70 % MeOH: szűrés 5. ALKALMAZÁS - Por (élelmiszer célra: dezinficiálás) - Oldat 8 % ( + dezinficiáló anyag eltartás) Xantán: 60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, salátadresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelő 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textil 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett) (Ca alginát sejt enzim immobilizálás: enyhe körülmények!) Dextrán: Vérplazma pótló: 6 %-os oldat, 50 100 000 Molekulatömeg Sephadex: gélkromatográfia Vizes kétfázisú rendszer elválasztás: kis felületi feszültség Liganddal: Enzimek PEG-Dextrán: növelni a megoszlást PEG-hez kapcsolt 6. CIKLODEXTRINEK (CD) (Schardinger dextrinek) (Szejtli J.) α - amilázzal hidrolizált (burgonya) keményítő ciklodextrin-glikoziltranszferáz (CGT-áz) (lineáris és) gyűrűs dextrinek CD izolálás CGT-áz: 1. Bac. macerans 2. Alkalofil Bakt. 38-2 3. Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. CGT-áz gyártás: mikroba tenyésztés, CGT-áz izolálás CD gyártás: 1. Előhidrolízis: α amilázzal 5 % keményítő 10DE értékig 2. Konverzió: CGT-ázzal 34 C-on. 58 % konverzió 3. α-, β-, γ- CD arány szabályozása (6,7,8 glükóz) Ábra: a ciklodextrinek szerkezete n = glükopiranóz egységek száma. n = 0: α-cd, 1: β-cd, 2: γ-cd
10 a.) Mikrobától is függ: 1,3 kezdetben elsősorban α-t 2. Kezdetben elsősorban β-t. b.) Toluol adagolás: β-val zárványkomplex (α β), a végén: 90 % β CD, 1 % αcd. c.) 1-dekanol adagolás: 36 % αcd és 3,7 % β CD d.) Enzim mennyiség 15 E CGT-áz/g keményítő : 24 % CD 90 E CGT-áz/g keményítő : 56 % CD β CD termelés: 33 %-os Keményítő. ph=7,2 (HCl), Ca(OH) 2 + B. subtilis α-amiláz 80 C, 10 hidrolízis. E. inaktiválása: 120 C, 30 Konverzió: 50 C CGT-áz, 5 % toluol + keverés 105 h! Komplex szűrés, vákuum bepárlás (toluol elmegy), szűrés, krist. α CD termelés: jól oldódik, kristályosítani nehéz. Komplexáló vegyület: decanol Konverzió. Oldékonyság 140 mg/ml. Nincs β és γ Kitermelés: 50 %. Dekanol vízgőzzel eltávolítható γ CD termelés: β CD gyártás mellékterméke. 750 g keményítőből 14 g γ CD nyerhető ioncserélő oszlopon. Komplexáló szerrel: metil-etilketon-α-naftol keveréknél Konverzió CGT-ázzal. Oldhatatlan komplex. Metanolban oldódik. Ioncsere, aktívszenes tisztítás. Kitermelés: 20 % Elágazó CD: az 1,6 kötés beépülésekor 1,2,3 glükóz lehet a gyűrűn CD származékok: OH-hoz köthető. Legnagyobb mennyiség: metil, hidroxipropil CD. (Fig.4) Ilyenkor az oldhatóság, a komplexképző tulajdonság, és a vendégmolekula reaktivitása is módosul A CD gazda molekula adduktot, inklúziós komplexet képez a vendégmolekulával (Fig.3.) α, β, γ és származékok: gazdamolekula választék: különböző vendéget köt. Így növelni lehet az oldhatóságot: terfenadin (antiallergikum): 60 mg/6 l víz 60 mg komplex/1 ml víz. A reaktivitás is változik: ált. csökken (Fig.6.) + Gyógyszerek Ábra: Az inklúziós komplexek képződésének vázlata. A kis körök jelölik a vízmolekulákat, amelyeket mind a hidrofób p-xilol molekula (potenciális vendég molekula), mind a ciklodextrin hidrofób ürege taszítja. Az inklúzió hajtóereje főként az apoláros-poláros kölcsönhatások (pl.: az apoláros CD-üreg és a víz, vagy az apoláros vendégmolekula és a víz között) apoláros-apoláros kölcsönhatásokra (vendégmolekula CD-üreg) való kicserélődése jelenti.
11 Alkalmazás 1. Gyógyszer: oldhatóság nő, felszívódás Biohozzáférhetőség nő Gyors oszcilláció Injekciók: vízben nem oldható vegyületek üreg méret: 1 mol: 1 g: Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetőleges üregméretei Stabilizál: nem párolog el, oxidálás ellen, hőstabilitás nő Irritáló hatás csökken (indometacin) Prostaglandin E 2 - β-cd: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E 1 - α-cd: injekció (érszűkület) Benexate- β-cd: gyomorfekély Fokhagymaolaj β-cd: koleszterin csökkentés Prognózis: néhány 100 t/év felhasználás 2. Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület stabilizál. Oxidálás ellen véd. Hagyma β-cd: Élelmiszeraromák (Magyarországon 1983 óta) Alacsony koleszterint tartalmazó vaj előállítása (Belgium): olvadt vaj + β-cd, 1 lépésben a koleszterin 90 %-a eltávolítható
12 Kellemetlen íz, illat eltávolítás: kávé, tea, keserű íz. Kávé oldószermentes koffeinmentesítése Kozmetikumok: hosszú ideig megtartják az illatot 3. Biotechnológia: Mikrobiológiai konverzió Hidrokortizon β-cd prednisolon (Udvardyné 1983) aciláz Lanatozid C dimetil CD digoxin Hozam:20 % 50-60 % Β-glükozidáz Ábra: a lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinné. D = digitoxóz, G = D-glükopiranóz, Ac = acetil csoport Bordatella pertussis: zsírsav inhibeálja a növekedédt. + β-cd zsírsav komplex: jó szaporodás Mycobacterium leprae: nem szaporodott fermenterben, mivel az esszenciális palmitin és sztearinsavat nem tudta a vizes fázisból felvenni + dimetil β-cd: növekedés A dimetil β-cd zsírsav komplex helyettesíti a szérumot állat szövettenyészetekben: interferon, MCAB termelés Szennyvíz detoxifikálás. Klórozott aromás vegyületeknél: β-cd szennyvíz kis konc. nagy konc. nagy konc. eleveniszap nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus megy toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus leáll nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus megy Ábra: a mérgező vegyületek tolerálható szintjét növeli a CD hozzáadása a mérgező szennyvízhez
13 Biospecifikus elválasztás: amilázok megkötése Mátrix CD D E CD D CD D S E- komplex CYCLODEXTRIN GLIKOZILTRANSFERÁZ (Bac. Circulans) EC. 2.4.1.19. Klebsiella pneumoniae: E. klónozás B. subtilis-be α- amilázzal hidrolizált keményítő 10 DE-ig E Lineáris és gyűrűs dextrinek CD izolálás β-cd előállítás 1.) 33 %-os keményítő: ph: 7,2, Ca ++, α- amiláz, 80 C, 1 h: hidrolízis 2.) 100 C, 30, E, inaktiválás 3.) 50 C, 100 h, 5 % toluol, E 2, konverzió 4.) Bepárlás: toluol elmegy Kristályosítás: Hozam: 90 % β-cd α-cd előállítás Konverzió: dekanol. Csak α-cd képződik Hozam: 50 % Dekanol vízgőzzel eltávolítható
14 Ciclodextrin (CD): α(6c), β(7c), γ(8c). Származékok Ábra: A kristályos heptakisz(2,6-di-o-metil)-β-ciklodextrin (DIMEB) és a véletlenszerűen hidroxipropilált β-ciklodextrin szerkezete. Az iparilag előállított nem kristályosítható, véletlenszerűen metilezett β-ciklodextrin (RAMEB) ugyancsak kb. 14 metoxi csoportot tartalmaz, de véletlenszerű eloszlással.
15 Oldott enzim, vizes fázis: α, β és γ keverék képződik ph: 6, T= 55 C Hozam: α=23 %, β=11 % A ciklodextrin inhibitálja az enzimet. α megkötés: sztearinsav ligandon kitozán hordozón. Szelektivitás: 100 %. β megkötés: ciklohexán propánamid és n-kapronsavval. Toluol. α β (90 %) Az adszorbciós kolonnába vezetés előtt hűtés 30 C-ra és 3 5 NaCl adagolás: megakadályozza az E. adszorpcióját a kolonnán MARCIAN Co. Japan termelés A CD gazdamolekula vendégmolekeula. Addukt inklúziós komplex Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetőleges üregméretei
16 Ábra: Az inklúziós komplexek képződésének vázlata. A kis körök jelölik a vízmolekulákat, amelyeket mind a hidrofób p-xilol molekula (potenciális vendég molekula), mind a ciklodextrin hidrofób ürege taszítja. Az inklúzió hajtóereje főként az apoláros-poláros kölcsönhatások (pl.: az apoláros CD-üreg és a víz, vagy az apoláros vendégmolekula és a víz között) apoláros-apoláros kölcsönhatásokra (vendégmolekula CD-üreg) való kicserélődése jelenti. Ábra: A megfelelő vendégmolekulákkal alkotott duplex CD szerkezetekkel létrejöhetnek akár K dis 10 6-10 9 dm 3 /mol inklúziós komplexek is
17 Ábra: A gazda-vendég kölcsönhatás vázlatosan. Az inkúziós komplex egy igen mozgékony tároló, amely az egyébként lassan oldódó szabad vendégmolekulát konstans koncentrációban tartalmazza.
18 Ösztradiol Progesztreron ampicillin prosztaglandin F Ábra: hatóanyag-ciklodextrin komplexek