5. Mikrobiális poliszacharidok

Átírás

1 Reológiai tulajdonságok 5. Mikrobiális poliszacharidok Viszkozitás: függ a hőmérséklettől és a nyírástól Olvadáspont : egy jellemző hőmérséklet (T m ) felett hirtelen csökkenés szerkezeti viszkozitás Nyírás: pszeudoplasztikus jelleg: kis nyíróerő nagy viszkozitás; nagy nyíróerő kis viszkozitás 4 Poliszacharidok Reológiai tulajdonságok Az ipari léptékben termelt/használt poliszacharidok túlnyomó része növényi eredetű: keményítő, cellulóz, pektin, agar-agar, inulin, guar gum De egyes speciális célokra terjednek a mikrobiális poliszacharidok is: gélképzés viszkozitás növelés (pszeudoplasztikus, tixotróp, viszkoelasztikus oldatok) 2 5 Poliszacharidok Reológiai alapok Ipari léptékben termelt extracelluláris mikrobiális poliszacharidok: xantán, dextrán, leván, pullulán, szkleroglükán, kurdlán, (ciklodextrinek) viszkozitás = nyírófeszültség nyírósebesség τ µ = γɺ Sőt újabban már az alginátot és a heparint is inkább mikrobiológiai úton termelik. 3 6 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 1

2 Reológiai alaptípusok Exopoliszacharidok szerkezete Homopolimerek: egyféle monomerből épülnek fel dextrán (glükóz) leván (fruktóz) kurdlán (glükóz) pullulán (glükóz) alginátok (guluronsav, mannuronsav) szkleroglükán (glükóz) Heteropolimerek: ismétlődő egységei többféle molekulából tevődnek össze xantán (glükóz, mannóz, glükuronsav, ecetsav, piruvát) 7 10 Pszeudoplasztikus folyadék Homopoliszacharidok kis nyíróerő nagy viszkozitás; nagy nyíróerő kis viszkozitás 8 11 Poliszacharidok Homopoliszacharidok A poliszacharidok biológiai funkciója: Védelem kiszáradás ellen Védelem fagocitózis, fágok ellen Tartalék tápanyag (xantán nem) Immunológiai determináns Lokalizáció: extracelluláris (oldat, nyálka) sejtfalhoz kötve sejtmembránhoz kötve Pullulán: glükóz monomerek statisztikusan (1-4) és (1-6) kötésekkel összekötve 9 12 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 2

3 Heteropoliszacharid: xantán Poliszacharidok fermentációja Közös jellemzők: Tápközeg: normál, C-forrás: glükóz, speciálisan szacharóz (dextrán, leván) bőséges C-ellátás kell (C/N arány > 10) ph=6-7,5 (baktériumok) Levegőztetés: igen intenzív, mert a viszkózus közegben nehéz megfelelő anyagátadást elérni különleges keverők Downstream műveletek: szerves oldószeres kicsapás: metanol, etanol, aceton, propan- 2-ol, n-propanol (porlasztva) szárítás Poliszacharidok bioszintézise Dextrán Szerkezete: elágazó láncú glükóz polimer, mint az amilopektin, de: a kötések túlnyomó része (1-6), mellette kevés (1-4), (1-2) és (1-3) A lánc elején egyetlen fruktóz van. Templát: UDP, GDP A xantán bioszintézise Dextrán előállítása 12 lépés 12 gén egy operonban = xantán cluster 1. az öt szénhidrát a sejten belül épül össze (lipid karrieren) 2. ezeket az alegységeket egy enzim exportálja 3. a sejten kívül történik a polimerizáció és a származékképzés (+acetát, +piruvát) Bioszintézise: Egylépéses biokonverzió: transzglikozilálás (ld. BIM) Irreverzibilis reakció: ~100% konverzió Lehetne az enzimet tiszta formában kinyerni (extracelluláris), de a fermentlében végrehajtani gazdaságosabb. Cukorgyárakban: léfertőződés - dugulások BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 3

4 Dextrán fermentációja Xantán BIOGAL technológia: Szerkezete még egyszer: L. mesenteroides tejsavbaktérium, anaerob előbb a sejtszaporítás, aztán a termékképzés tápoldat: 10-20% szacharóz + 2% CSL + foszfát levegőztetés nem kell, csak keverés ph szabályozás: 5,0 5,2 a képződő tejsavat közömbösíteni kell 0,5 g/l baktérium ~80 g/l dextránt (átlagos móltömeg: ~ ) termel, + esetleg a fruktóz is hasznosítható Kinyerés: kicsapás alkoholokkal, szűrés Móltömeg: 2-15 millió 2-3 lánc spirált alkothat Dextrán felhasználása Xantán termelés Vérplazma pótlásra: csak a Daltonos frakció felel meg (6%-os oldat), ezért hidrolízissel aprítani kell: - sósavas hidrolízis 100 C-on, vagy - enzimes hidrolízis: dextranáz (P. funiculosum) azután: frakcionált kicsapás alkoholokkal: a kis molekulatömegű (40-60 kda) frakció vérplazma pótló nagy molekulatömegű frakció vissza a hidrolízisbe Sephadex gélek (gélkromatográfia): térhálósított dextrán Bioszintézise: már volt Gyártás: ~ t/év (erősen ingadozik) Törzs: Xanthomonas campestris növénypatogén (káposzta, gyümölcsfák) a technológiából nem kerülhet ki élő sejt (kimenő levegő szűrése, lé utópasztőrözése) A xantán burok miatt rossz az anyagátadás a környezettel lassan növekszik, más törzsek könnyen túlnövik Törzsfenntartás, inokulum készítés: Papírcsík inokulum technika Leván Xantán fermentáció Fruktóz polimer (2-3 fruktozid kötés) Bioszintézis: analóg a dextránnal: transzglikozilálás Sokféle törzs termeli Konverzió: ~62% Felhasználás: élelmiszeripar gyógyszeripar kozmetikai és festékipar (gumiarábikum helyett) C-forrás: glükóz (4-5 %), N-forrás: komplex, szerves anyagok (0,05-0,1%) Hőmérséklet: C ph: 7 ± 0,3, a képződő savakat közömbösíteni kell, ph = 5 körül a termelés már lelassul. Fermentációs idő: óra Konverzió: %, azaz g/l A (látszólagos) viszkozitás cp (= millipa.s) -ig emelkedhet BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 4

5 Xantán fermentáció levegőztetése Xantán felhasználása Levegőztetés: a viszkózus lé miatt rossz a tömegátadás, speciális, nagy átmérőjű keverők, ne legyenek holt terek. A buborékok nehezen szállnak fel. 60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, saláta-dresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelő 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textilipar 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett), fúróöblítő folyadék Xantán felhasználása Fúróöblítő folyadék: olajfúrásnál a fúrófej körül erős nyírás érvényesül kicsi a viszkozitás, jó a hűtés. A felszálló áramlásban kicsi a nyírás nagy a viszkozitás, lassítja a kőtörmelék ülepedését A xantán feldolgozása Hőkezelés: 90 C-on pasztőrözés, a mikrobák elölése Kicsapás: valamelyik alkohollal (metanol izopropanol) Elválasztás: ülepítő centrifugával Szárítás: max. 50 C-on, tálcás vagy vákuum szárító Őrlés Egyéb mikrobiális poliszacharidok Pullulán törzs: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba a-1,4- és a-1,6 glükán szerkezet Változó molekulatömeg Vízoldható, vizes oldata igen viszkózus Jó adhéziós tulajdonság Nem toxikus Fermentáció: 4 % cukor, 5 nap, ~70 % hozam Felhasználás: filmek, fóliák készítése BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 5

6 Egyéb mikrobiális poliszacharidok Szkleroglükán Törzs: (Sclerotium rolfsii, S. glucanicum) β-glükán: nagyrészt β1-3 és kevés β 1-6 kötés Vízoldható Pszeudoplasztikus tulajdonság Felhasználás: kőolajfúrási iszapok stabilizálására festékek, tinták készítésére növényi magbevonat ragasztójaként HIALURONSAV Diszacharid egységekből (1-3 glükuronsav glükózamin) álló polimer. Polfoka változó, több milliós móltömegig. Az élőlényekben sok helyen fordul elő, legnagyobb koncentrációban a kakastaréjban. Gyógyszerként: Zn-hialuronát Curiosin Egyéb mikrobiális poliszacharidok Alginát, alginsav Mannuronsav β(1-4) polimer, α-guluronsavval, homopolimer blokkok váltják egymást anionos jellegű (vö. pektin) Barnamoszatok sejtfalában fordul elő (Laminaria fajok), innen nyerték ki, ma fermentálják is (Ps. aeruginosa, Azotobacter vinelandii). HIALURONSAV 2. Szerepe többféle: Kenőanyag izületi felszíneken Sejtek mechanikai védelme Sebgyógyulás folyamata Magzati fejlődés, differenciálódás Alkalmazásai: Égések, forrázások, sebgyógyulás Izületi súrlódások kezelése injekcióval Plasztikai sebészet: feltöltés, implantátum Kozmetikumok Alginát Viszkózus, gumiszerű anyag, vízben nem oldódik, de sok vizet köt meg. Kationkötő, kationcserélő, Ca 2+ ionokkal gélt képez (sejtek bezárása) Felhasználása: a gyógyszeriparban széles körben alkalmazzák égési sérülések esetén elősegíti a sérült rész gyógyulását fémmérgezés esetén fémek megkötésére használják élelmiszerekben sűrítőanyagként, stabilizálószerként, zselésítő anyagként, valamint emulgeálószerként használják E400 néven. HIALURONSAV GYÁRTÁSA Kétféle eljárást használnak: - szervextrakció - fermentáció A fermentációs gyártás valamivel olcsóbb, de az injekciós minőséget nehezen éri el (endotoxinok, mikrobák) 1. A szervek aprítása 2. Fehérjebontás alkálikus proteázzal (ph= 8) 3. Főzés híg savas oldatban 4. Szűrés 5. Kicsapás benzalkónium-kloriddal, szűrés 6. Visszaoldás NaCl oldatban 7. A maradék benzalkónium-klorid butanolos extrakciója 8. Kicsapás, mosás etanollal BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 6

7 HEPARIN Majdnem minden szervben előfordul szervextrakció. Többféleképpen szulfonált mukopoliszacharid, Ca-só formájában hozzák forgalomba. A ciklodextrinek méretei Antikoaguláns = véralvadásgátló Egyéb mikrobiális poliszacharidok Ciklodextrinek előállítása Foszfomannán (Hansenula, Pichia, Pachyselon nemzetség egyes fajai) Mikrobiológiai lebontással szemben ellenálló Jó viszkozitásnövelő Stabilizáló Diszpergáló hatású Kitozán (Mucor rouxii, Absidia coerulea) Nitrogéntartalmú poliszacharid Felhasználás: flokkuláló szerként, papíripari ragasztóként, kelátképzőként Egylépéses biokonverzió: ciklodextrin-glikozil-transzferázzal (CGTáz) Több törzs is termeli: 1. Bacillus macerans 2. Alkalofil bakt Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. 4. Bacillus circulans Izolált, oldott enzimet használnak Ciklodextrinek (CD, Schardinger dextrinek) Ciklodextrinek előállítása BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 7

8 Ciklodextrinek előállítása Mindig többféle CD keveréke keletkezik + lineáris melléktermékek. Irányított gyártások: α-cd előállítás Termék-inhibíció: a keletkező CD gátolja az enzimet. α-, β -, γ - CD arány szabályozása: Mikrobától is függ: 1.,3. kezdetben α -t termel 2. kezdetben β -t termel Toluol adagolás: β-val zárványkomplex, eltolja az egyensúlyt (α β), végén ~90% β -CD Dekanol adagolás: α irányába tolja el, 36% α-cd, mellette csak 3.7% β -CD Komplexáló vegyület: dekanol (vízgőzzel eltávolítható) Csak α-cd képződik: jól oldódik (140 mg/ml), nehéz kristályosítani Hozam: ~50% Mercian eljárás (J) Bacillus circulans enzim, vizes oldatban: ph=6, T=55 C, 8,3 % elfolyósított keményítő Nem használnak zárvány molekulát. α, βés γ keverék képződik, hozam: α - 22,3%, β - 10,8%, γ - 5,1% Elválasztás szelektív adszorpcióval (folyamatos recirkuláció, hűtés 30 C-ra, majd vissza 55 C-ra) α megkötés: kitozán hordozón sztearinsav ligand szelektivitás: ~100%. β megkötés: ciklohexán propánamid n-kapronsav ligandon Irányított gyártások: β-cd előállítás Hidrolízis: 33%-os keményítő, folyósítás α-amilázzal, 80 C-on, 1h, ph=7.2, Ca 2+ kell Enzim inaktiválás: C-on 30 percig Biokonverzió: CGT-áz enzim, 50 C, h, keverés Komplexáló vegyület: toluol A komplex szűrése, vákuum bepárlás/stripelés (toluol elávolítása), kristályosítás Hozam: ~90% Mercian eljárás (J) γ-cd előállítás A β-cd gyártás mellékterméke Konverzió CGT-ázzal Komplexáló szer: metil-etilketon - α-naftol keverék Vízben oldhatatlan komplex, mely metanolban feloldódik Ioncsere, aktív szenes tisztítás Hozam: ~20% BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 8

9 A ciklodextrinek alkalmazásai: molekuláris csomagolás Ösztradiol Progeszteron Az inklúziós komplexek képződésének vázlata Az apoláris molekulák beilleszkedése az apoláris gyűrűbe energiacsökkenéssel jár. Ampicillin Prosztaglandin F Ciklodextrinek alkalmazása Ciklodextrinek alkalmazása Gyógyszerek formulázása: Oldhatóság nő (felszívódás): vízben nem oldható vegyületek is adhatók injekciókban A hozzáférhetőség nő Stabilizál: kevésbé párolog, véd az oxidálás ellen, a hőstabilitás nő Irritáló hatás csökken (indometacin) Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület, stabilizál, oxidálás ellen véd hagyma - β-cd: élelmiszeraromák Alacsony koleszterin tartalmú vaj előállítása: olvadt vaj + β-cd = bezárja a koleszterint Kellemetlen íz, illat eltávolítása: kávé, tea keserű íze; Kávé oldószermentes koffein-mentesítése Kozmetikumok: az illat hosszabb ideig megmarad Ciklodextrinek alkalmazása Ciklodextrinek alkalmazása Példák: Prostaglandin E2- β-cd: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E1- α-cd: injekció (érszűkület) Benexate- β-cd: gyomorfekély ( kiékelő molekula: Arg) Fokhagymaolaj β-cd: koleszterin csökkentés Szteroidok Biotechnológia: Mikrobiológiai konverziók szteránvázas vegyületek Lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinná dimetil-β-cd zsírsav komplex Szennyvíz detoxifikálás Biospecifikus elválasztás BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 9

10 Mikrobiológiai konverziók 55 Toxikus anyagok megkötése Szennyvíztisztításban, talajmeliorációban. 56 Biospecifikus elválasztás A keményítő szerkezetanalógja, lásd a BIM gyakorlatot. 57 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 10