Reológiai tulajdonságok 5. Mikrobiális poliszacharidok Viszkozitás: függ a hőmérséklettől és a nyírástól Olvadáspont : egy jellemző hőmérséklet (T m ) felett hirtelen csökkenés szerkezeti viszkozitás Nyírás: pszeudoplasztikus jelleg: kis nyíróerő nagy viszkozitás; nagy nyíróerő kis viszkozitás 4 Poliszacharidok Reológiai tulajdonságok Az ipari léptékben termelt/használt poliszacharidok túlnyomó része növényi eredetű: keményítő, cellulóz, pektin, agar-agar, inulin, guar gum De egyes speciális célokra terjednek a mikrobiális poliszacharidok is: gélképzés viszkozitás növelés (pszeudoplasztikus, tixotróp, viszkoelasztikus oldatok) 2 5 Poliszacharidok Reológiai alapok Ipari léptékben termelt extracelluláris mikrobiális poliszacharidok: xantán, dextrán, leván, pullulán, szkleroglükán, kurdlán, (ciklodextrinek) viszkozitás = nyírófeszültség nyírósebesség τ µ = γɺ Sőt újabban már az alginátot és a heparint is inkább mikrobiológiai úton termelik. 3 6 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 1
Reológiai alaptípusok Exopoliszacharidok szerkezete Homopolimerek: egyféle monomerből épülnek fel dextrán (glükóz) leván (fruktóz) kurdlán (glükóz) pullulán (glükóz) alginátok (guluronsav, mannuronsav) szkleroglükán (glükóz) Heteropolimerek: ismétlődő egységei többféle molekulából tevődnek össze xantán (glükóz, mannóz, glükuronsav, ecetsav, piruvát) 7 10 Pszeudoplasztikus folyadék Homopoliszacharidok kis nyíróerő nagy viszkozitás; nagy nyíróerő kis viszkozitás 8 11 Poliszacharidok Homopoliszacharidok A poliszacharidok biológiai funkciója: Védelem kiszáradás ellen Védelem fagocitózis, fágok ellen Tartalék tápanyag (xantán nem) Immunológiai determináns Lokalizáció: extracelluláris (oldat, nyálka) sejtfalhoz kötve sejtmembránhoz kötve Pullulán: glükóz monomerek statisztikusan (1-4) és (1-6) kötésekkel összekötve 9 12 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 2
Heteropoliszacharid: xantán Poliszacharidok fermentációja Közös jellemzők: Tápközeg: normál, C-forrás: glükóz, speciálisan szacharóz (dextrán, leván) bőséges C-ellátás kell (C/N arány > 10) ph=6-7,5 (baktériumok) Levegőztetés: igen intenzív, mert a viszkózus közegben nehéz megfelelő anyagátadást elérni különleges keverők Downstream műveletek: szerves oldószeres kicsapás: metanol, etanol, aceton, propan- 2-ol, n-propanol (porlasztva) szárítás 13 16 Poliszacharidok bioszintézise Dextrán Szerkezete: elágazó láncú glükóz polimer, mint az amilopektin, de: a kötések túlnyomó része (1-6), mellette kevés (1-4), (1-2) és (1-3) A lánc elején egyetlen fruktóz van. Templát: UDP, GDP 14 17 A xantán bioszintézise Dextrán előállítása 12 lépés 12 gén egy operonban = xantán cluster 1. az öt szénhidrát a sejten belül épül össze (lipid karrieren) 2. ezeket az alegységeket egy enzim exportálja 3. a sejten kívül történik a polimerizáció és a származékképzés (+acetát, +piruvát) Bioszintézise: Egylépéses biokonverzió: transzglikozilálás (ld. BIM) Irreverzibilis reakció: ~100% konverzió Lehetne az enzimet tiszta formában kinyerni (extracelluláris), de a fermentlében végrehajtani gazdaságosabb. Cukorgyárakban: léfertőződés - dugulások 15 18 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 3
Dextrán fermentációja Xantán BIOGAL technológia: Szerkezete még egyszer: L. mesenteroides tejsavbaktérium, anaerob előbb a sejtszaporítás, aztán a termékképzés tápoldat: 10-20% szacharóz + 2% CSL + foszfát levegőztetés nem kell, csak keverés ph szabályozás: 5,0 5,2 a képződő tejsavat közömbösíteni kell 0,5 g/l baktérium ~80 g/l dextránt (átlagos móltömeg: ~500.000) termel, + esetleg a fruktóz is hasznosítható Kinyerés: kicsapás alkoholokkal, szűrés Móltömeg: 2-15 millió 2-3 lánc spirált alkothat 19 22 Dextrán felhasználása Xantán termelés Vérplazma pótlásra: csak a 40-60.000 Daltonos frakció felel meg (6%-os oldat), ezért hidrolízissel aprítani kell: - sósavas hidrolízis 100 C-on, vagy - enzimes hidrolízis: dextranáz (P. funiculosum) azután: frakcionált kicsapás alkoholokkal: a kis molekulatömegű (40-60 kda) frakció vérplazma pótló nagy molekulatömegű frakció vissza a hidrolízisbe Sephadex gélek (gélkromatográfia): térhálósított dextrán Bioszintézise: már volt Gyártás: ~30.000 t/év (erősen ingadozik) Törzs: Xanthomonas campestris növénypatogén (káposzta, gyümölcsfák) a technológiából nem kerülhet ki élő sejt (kimenő levegő szűrése, lé utópasztőrözése) A xantán burok miatt rossz az anyagátadás a környezettel lassan növekszik, más törzsek könnyen túlnövik Törzsfenntartás, inokulum készítés: Papírcsík inokulum technika 20 23 Leván Xantán fermentáció Fruktóz polimer (2-3 fruktozid kötés) Bioszintézis: analóg a dextránnal: transzglikozilálás Sokféle törzs termeli Konverzió: ~62% Felhasználás: élelmiszeripar gyógyszeripar kozmetikai és festékipar (gumiarábikum helyett) C-forrás: glükóz (4-5 %), N-forrás: komplex, szerves anyagok (0,05-0,1%) Hőmérséklet: 28-31 C ph: 7 ± 0,3, a képződő savakat közömbösíteni kell, ph = 5 körül a termelés már lelassul. Fermentációs idő: 40-48 óra Konverzió: 68-70 %, azaz 25-30 g/l A (látszólagos) viszkozitás 10-30.000 cp (= millipa.s) -ig emelkedhet 21 24 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 4
Xantán fermentáció levegőztetése Xantán felhasználása Levegőztetés: a viszkózus lé miatt rossz a tömegátadás, speciális, nagy átmérőjű keverők, ne legyenek holt terek. A buborékok nehezen szállnak fel. 60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, saláta-dresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelő 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textilipar 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett), fúróöblítő folyadék 25 28 Xantán felhasználása Fúróöblítő folyadék: olajfúrásnál a fúrófej körül erős nyírás érvényesül kicsi a viszkozitás, jó a hűtés. A felszálló áramlásban kicsi a nyírás nagy a viszkozitás, lassítja a kőtörmelék ülepedését. 26 29 A xantán feldolgozása Hőkezelés: 90 C-on pasztőrözés, a mikrobák elölése Kicsapás: valamelyik alkohollal (metanol izopropanol) Elválasztás: ülepítő centrifugával Szárítás: max. 50 C-on, tálcás vagy vákuum szárító Őrlés Egyéb mikrobiális poliszacharidok Pullulán törzs: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba a-1,4- és a-1,6 glükán szerkezet Változó molekulatömeg Vízoldható, vizes oldata igen viszkózus Jó adhéziós tulajdonság Nem toxikus Fermentáció: 4 % cukor, 5 nap, ~70 % hozam Felhasználás: filmek, fóliák készítése 27 30 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 5
Egyéb mikrobiális poliszacharidok Szkleroglükán Törzs: (Sclerotium rolfsii, S. glucanicum) β-glükán: nagyrészt β1-3 és kevés β 1-6 kötés Vízoldható Pszeudoplasztikus tulajdonság Felhasználás: kőolajfúrási iszapok stabilizálására festékek, tinták készítésére növényi magbevonat ragasztójaként HIALURONSAV Diszacharid egységekből (1-3 glükuronsav + 1-4 glükózamin) álló polimer. Polfoka változó, több milliós móltömegig. Az élőlényekben sok helyen fordul elő, legnagyobb koncentrációban a kakastaréjban. Gyógyszerként: Zn-hialuronát Curiosin 31 34 Egyéb mikrobiális poliszacharidok Alginát, alginsav Mannuronsav β(1-4) polimer, α-guluronsavval, homopolimer blokkok váltják egymást anionos jellegű (vö. pektin) Barnamoszatok sejtfalában fordul elő (Laminaria fajok), innen nyerték ki, ma fermentálják is (Ps. aeruginosa, Azotobacter vinelandii). HIALURONSAV 2. Szerepe többféle: Kenőanyag izületi felszíneken Sejtek mechanikai védelme Sebgyógyulás folyamata Magzati fejlődés, differenciálódás Alkalmazásai: Égések, forrázások, sebgyógyulás Izületi súrlódások kezelése injekcióval Plasztikai sebészet: feltöltés, implantátum Kozmetikumok 32 35 Alginát Viszkózus, gumiszerű anyag, vízben nem oldódik, de sok vizet köt meg. Kationkötő, kationcserélő, Ca 2+ ionokkal gélt képez (sejtek bezárása) Felhasználása: a gyógyszeriparban széles körben alkalmazzák égési sérülések esetén elősegíti a sérült rész gyógyulását fémmérgezés esetén fémek megkötésére használják élelmiszerekben sűrítőanyagként, stabilizálószerként, zselésítő anyagként, valamint emulgeálószerként használják E400 néven. HIALURONSAV GYÁRTÁSA Kétféle eljárást használnak: - szervextrakció - fermentáció A fermentációs gyártás valamivel olcsóbb, de az injekciós minőséget nehezen éri el (endotoxinok, mikrobák) 1. A szervek aprítása 2. Fehérjebontás alkálikus proteázzal (ph= 8) 3. Főzés híg savas oldatban 4. Szűrés 5. Kicsapás benzalkónium-kloriddal, szűrés 6. Visszaoldás NaCl oldatban 7. A maradék benzalkónium-klorid butanolos extrakciója 8. Kicsapás, mosás etanollal. 33 36 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 6
HEPARIN Majdnem minden szervben előfordul szervextrakció. Többféleképpen szulfonált mukopoliszacharid, Ca-só formájában hozzák forgalomba. A ciklodextrinek méretei Antikoaguláns = véralvadásgátló 37 40 Egyéb mikrobiális poliszacharidok Ciklodextrinek előállítása Foszfomannán (Hansenula, Pichia, Pachyselon nemzetség egyes fajai) Mikrobiológiai lebontással szemben ellenálló Jó viszkozitásnövelő Stabilizáló Diszpergáló hatású Kitozán (Mucor rouxii, Absidia coerulea) Nitrogéntartalmú poliszacharid Felhasználás: flokkuláló szerként, papíripari ragasztóként, kelátképzőként Egylépéses biokonverzió: ciklodextrin-glikozil-transzferázzal (CGTáz) Több törzs is termeli: 1. Bacillus macerans 2. Alkalofil bakt. 38-2 3. Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. 4. Bacillus circulans Izolált, oldott enzimet használnak. 38 41 Ciklodextrinek (CD, Schardinger dextrinek) Ciklodextrinek előállítása 39 42 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 7
Ciklodextrinek előállítása Mindig többféle CD keveréke keletkezik + lineáris melléktermékek. Irányított gyártások: α-cd előállítás Termék-inhibíció: a keletkező CD gátolja az enzimet. α-, β -, γ - CD arány szabályozása: Mikrobától is függ: 1.,3. kezdetben α -t termel 2. kezdetben β -t termel Toluol adagolás: β-val zárványkomplex, eltolja az egyensúlyt (α β), végén ~90% β -CD Dekanol adagolás: α irányába tolja el, 36% α-cd, mellette csak 3.7% β -CD Komplexáló vegyület: dekanol (vízgőzzel eltávolítható) Csak α-cd képződik: jól oldódik (140 mg/ml), nehéz kristályosítani Hozam: ~50% 43 46 Mercian eljárás (J) Bacillus circulans enzim, vizes oldatban: ph=6, T=55 C, 8,3 % elfolyósított keményítő Nem használnak zárvány molekulát. α, βés γ keverék képződik, hozam: α - 22,3%, β - 10,8%, γ - 5,1% Elválasztás szelektív adszorpcióval (folyamatos recirkuláció, hűtés 30 C-ra, majd vissza 55 C-ra) α megkötés: kitozán hordozón sztearinsav ligand szelektivitás: ~100%. β megkötés: ciklohexán propánamid n-kapronsav ligandon Irányított gyártások: β-cd előállítás Hidrolízis: 33%-os keményítő, folyósítás α-amilázzal, 80 C-on, 1h, ph=7.2, Ca 2+ kell Enzim inaktiválás: 100-120 C-on 30 percig Biokonverzió: CGT-áz enzim, 50 C, 100-105 h, keverés Komplexáló vegyület: toluol A komplex szűrése, vákuum bepárlás/stripelés (toluol elávolítása), kristályosítás Hozam: ~90% 44 47 Mercian eljárás (J) γ-cd előállítás A β-cd gyártás mellékterméke Konverzió CGT-ázzal Komplexáló szer: metil-etilketon - α-naftol keverék Vízben oldhatatlan komplex, mely metanolban feloldódik Ioncsere, aktív szenes tisztítás Hozam: ~20% 45 48 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 8
A ciklodextrinek alkalmazásai: molekuláris csomagolás Ösztradiol Progeszteron Az inklúziós komplexek képződésének vázlata Az apoláris molekulák beilleszkedése az apoláris gyűrűbe energiacsökkenéssel jár. Ampicillin Prosztaglandin F 49 52 Ciklodextrinek alkalmazása Ciklodextrinek alkalmazása Gyógyszerek formulázása: Oldhatóság nő (felszívódás): vízben nem oldható vegyületek is adhatók injekciókban A hozzáférhetőség nő Stabilizál: kevésbé párolog, véd az oxidálás ellen, a hőstabilitás nő Irritáló hatás csökken (indometacin) Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület, stabilizál, oxidálás ellen véd hagyma - β-cd: élelmiszeraromák Alacsony koleszterin tartalmú vaj előállítása: olvadt vaj + β-cd = bezárja a koleszterint Kellemetlen íz, illat eltávolítása: kávé, tea keserű íze; Kávé oldószermentes koffein-mentesítése Kozmetikumok: az illat hosszabb ideig megmarad 50 53 Ciklodextrinek alkalmazása Ciklodextrinek alkalmazása Példák: Prostaglandin E2- β-cd: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E1- α-cd: injekció (érszűkület) Benexate- β-cd: gyomorfekély ( kiékelő molekula: Arg) Fokhagymaolaj β-cd: koleszterin csökkentés Szteroidok Biotechnológia: Mikrobiológiai konverziók szteránvázas vegyületek Lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinná dimetil-β-cd zsírsav komplex Szennyvíz detoxifikálás Biospecifikus elválasztás 51 54 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 9
Mikrobiológiai konverziók 55 Toxikus anyagok megkötése Szennyvíztisztításban, talajmeliorációban. 56 Biospecifikus elválasztás A keményítő szerkezetanalógja, lásd a BIM gyakorlatot. 57 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 10