NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Termékkód : 708102 Javasolt alkalmazás NOVA Lite HEp-2 egy indirekt immunofluoreszcens assay az anti-nukleáris antitestek (ANA) szűrésére és szemikvantitatív meghatározására humán szérumban. Az anti-nukleáris antitestek kimutatása más szerológiai vizsgálatok eredményével és a klinikai adatokkal együtt segíti a szisztémás lupus erythematosus (SLE) és más kötőszöveti vagy reumatikus betegségek diagnózisának felállítását. A teszt összegzése és magyarázata Az anti-nukleáris antitestek fogalommal különböző autoantitesteket jelölnek, amelyek a sejtmag alkotórészeivel reagálnak, ezen belül a nukleinsavakkal (DNS, RNS) valamint számos fehérjével és ribonukleoproteinnel. 1 Ezek az autoantitestek nagy gyakorisággal megtalálhatók a kötőszöveti vagy reumatikus betegségben, különösképpen a szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegekben. Tapasztalat szerint valamennyi SLE beteg ANA pozitív. Ez a nagy diagnosztikai érzékenység vezetett az ANA teszt beépítéséhez a szisztémás lupus erythematosusnak az American College of Rheumatology egyik albizottsága által 1982-ben átdolgozott klasszifikációs kritériumai közé (Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus). 2 Az ANA vizsgálat az SLE kitűnő szűrő módszere, (a negatív teszteredmény gyakorlatilag kizárja az aktív SLE diagnózisát 3 ) specifikusnak azonban nem nevezhető. Más kötőszöveti betegségben - mint amilyen a rheumatoid arthritis, szkleroderma és a dermatomyositis - szenvedő páciensek gyakran ANA pozitívak, és alacsony ANA titer észlelhető más kóros állapotokban és a normál populációban is. Pozitív ANA eredményt láthatunk súlyos égés után, vírusfertőzések kapcsán, és beszámoltak pozitív eredményekről egészségesekben is, különösen idősebb korban. A specificitás hiánya miatt javasolják minden egyes ANA pozitív minta végpontig történő titrálását, és további vizsgálatát specifikusabb tesztekkel duplaszálú DNS (dsdns) és extrahálható nukleáris antigének (ENA) elleni autoantitestek kimutatására. Az indirekt immunofluoreszcencia az ANA vizsgálatok referenciamódszere. Általánosan használt szubsztrátjai rágcsálókból származó szövetek vékony metszetei, vagy különböző típusú sejtvonalak. A szakemberek véleménye megegyezik abban, hogy a sejtvonalak alkalmasabbak, mint a rágcsáló szövetek, mivel ezek a gyorsan osztódó sejtek bizonyos klinikailag lényeges antigéneket nagyobb mennyiségben tartalmaznak, többek között a centromer, SS-A(Ro), Scl-70 és PCNA/Cyclin antigéneket. A szubsztrát típusa mellett három másik faktor lehet kritikus az ANA teszt kivitelezése szempontjából. 1) a lemez előkészítésekor használt fixáló, 2) a fluoreszcein mennyisége a fehérjéhez képest (F/P arány) és 3) a konjugátum immunglobulin alosztály-specificitása. Egyes fixálók, vagy azok kombinációi bizonyos sejtmagi antigéneket tönkretesznek, emiatt használatuk kerülendő. Egy konjugátum szenzitivitása és a nem-specifikus háttérfestődés mértéke függ az F/P aránytól, míg a konjugátum betegség-specificitását annak immunglobulin alosztály reaktivitása határozza meg. 1
Szinte valamennyi klinikailag jelentős autoantitest rendelkezik IgG alosztály specificitással, még akkor is, ha IgA és IgM specifikus ANA is jelen van. 4 Ezzel szemben az egészséges véradókban talált ANA általában kizárólag IgM és IgA alosztályba tartozik. 5 Emiatt az IgG specifikus konjugátumok betegség-specifikusabbak. A NOVA Lite számára kiválasztott HEp-2 ANA szubsztrátum optimálisan fixált humán epitheliális (HEp-2) sejtvonal és a konjugátum affinitás módszerrel tisztított anti-humán IgG, amely gondosan kiválasztott F/P aránnyal rendelkezik. Ezek a reagensparaméterek lehetővé teszik, hogy a NOVA Lite HEp-2 ANA teszt kimutassa a klinikailag releváns autoantitesteket (beleértve az SS-A és az Scl-70 antitestet), amelyek kimutatása nem biztos egyes más kereskedelmi ANA tesztek esetén. Továbbá, az IgG konjugátum specificitása kiküszöböli a fiziológiailag téves pozitív eredményeket a rendszerint előforduló alacsony titerű IgM autoantitestek miatt, amelyek gyakorta jelentkeznek idősebb, de egyébként egészséges betegeknél. A módszer elve Az indirekt immunofluoreszcens eljárás során a mintákat az antigén szubsztráttal inkubáljuk, majd a feleslegben maradt antitestet mosással eltávolítjuk. Ezután a szubsztrátot specifikus fluoreszceinnel jelölt konjugátummal inkubáljuk, majd a reagens-felesleget ismét lemossuk. Fluoreszcens mikroszkóppal megtekintve az autoantitest pozitív minták almazöld fluoreszcenciát mutatnak a sejt vagy a sejtmagok azon területein, ahol az autoantitest megkötődött. 2 Reagensek HEp-2 (humán epitheliális sejt) szubsztrát lemezek; 12 mérőhely/lemez, deszikkánssal Anti-humán IgG konjugátum (kecske), fluoreszceinnel jelölve, DAPI-t és 0,09% nátrium-azidot tartalmazó pufferben ANA titrálható végpont mintázat kontroll, 1 ampulla 0,09% nátrium-azidot és humán szérum HEp-2 elleni antitesteket tartalmazó puffer, előhígított IFA System negatív kontroll, 1 ampulla 0,09% nátrium-azidot és humán szérum HEp-2 elleni antitesteket nem tartalmazó puffer, előhígított PBS koncentrátum, 40x-es töménységű, 2000 ml oldat készítésére elegendő. Rögzítő médium, 0,09% nátrium-azidot tartalmaz Fedőlemezek Figyelmeztetések 1. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kit kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy tesztmódszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért az ANA titrálható végpont mintázat kontroll és az IFA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 6 2. A kit néhány összetevőjének stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 3. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 4. A kiömlött reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. 2
Óvintézkedések 1. Ez a termék In Vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekhez vezethet. 3. Az IFA mérőhelyek nem tökéletes vagy hatástalan mosása magas hátteret okozhat. 4. Az assay adaptációj a automat ikus m int akezelő rendszerek, vag y más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes eg észében vag y részleteiben, a teszt er edm ényeinek elt érését okozhatja a manuális módszerhez képest. Minden labor atór iumnak a saját f elelőssége az alkalmazott autom atizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elf ogadhat ó tart ományon belül legyenek. 5. A teszt teljesítményét több tényező befolyásolhatja. Ilyen a reagensek kezdeti hőmérséklete, a használatban lévő mikroszkóp lámpájának fényereje, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás alapossága és az inkubációs idők hossza az assay során. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. Fény hatására idővel az anti-humán IgG konjugátum színe megváltozhat. Ez a színváltozás azonban a teszt működését nem befolyásolja hátrányosan. 7. Az előírások szigorú betartása javasolt. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A hígított PBS puffer 2 8 C között tárolva 4 hétig stabil. A minta vétele Ezt az eljárást szérummintával kell végrehajtani. A vizsgálandó mintákhoz azidot, vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás szérumok illetve minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. A CLSI (NCCLS) Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. 3
A teszt kivitelezése Rendelkezésre álló anyagok Rendelkezésre álló cikk Mennyiség 12 mérőhelyes HEp-2 szubsztrátlemez 20 x 12 mérőhely FITC Anti humán IgG konjugátum DAPI-val 1 x 15 ml ANA titrálható végpont mintázat kontroll (ANA Titratable Endpoint Pattern Control) 1 x 0,5 ml IFA negatív kontroll (IFA System Negative Control) 1 x 0,5 ml PBS koncentrátum (40x) 2 x 25 ml Rögzítő médium (Mounting Medium) 1 x 7 ml Fedőlemezek 1 x 20 További szükséges anyagok, melyeket a készlet nem tartalmaz Mikropipetták 15 1000 μl méréséhez Desztillált vagy ioncserélt víz Spriccflaskák vagy Pasteur-pipetták Nedveskamra 1 literes edény (a PBS hígításához) Coplin festőedény Fluoreszcens mikroszkóp 495 nm-es gerjesztési és 515 nm-es emissziós szűrővel Módszer Mielőtt hozzákezd: Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. A PBS koncentrátum hígítása: FONTOS: Hígítsa a PBS koncentrátumot 1:40 arányban úgy, hogy a PBS koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. A PBS puffert használja a páciensminták hígítására és mosópufferként. A hígított puffer 2 8 között tartva 4 hétig stabil. 3. A betegek mintáinak hígítása: a. Előszűrés: Hígítsa a betegek mintáit 1:40 arányban a hígított PBS pufferrel (azaz adjon 50 μl szérumot 1,95 ml PBS pufferhez). b. Titrálás Készítsen 2-szeres (vagyis felező) hígítási sort minden egyes pozitív minta eredeti, szűrés céljára készített hígításából (azaz 1:80, 1:160,...) 1:2560). 4
Az assay kivitelezése 1. A szubsztrát lemezek előkészítése: Hagyja a lemezeket szobahőmérsékletűre melegedni, mielőtt a tasakból kiveszi. Jelölje meg ceruzával és helyezze egy alkalmas nedveskamrába. Cseppentsen egy-egy csepp (20-25 μl) hígítatlan pozitív és negatív kontrollt az 1-es illetve a 2-es mérőhelyekbe. A maradék helyekre tegyen egy-egy csepp (20-25 μl) hígított beteg-mintát. 2. A lemezek inkubálása: Inkubálja a lemezeket 30 ± 5 percig nedveskamrában (egy zárt műanyag vagy üvegedény aljára helyezett megnedvesített papírtörlő képes fenntartani a megfelelő páratartalmat). Ne engedje a szubsztrátot kiszáradni az assay kivitelezése közben. 3. A lemezek mosása: Az inkubáció után spriccflaska vagy Pasteur pipetta segítségével óvatosan mossa le a szérumot a lemezről hígított PBS pufferrel. Úgy irányítsa a lemezt és a PBS puffer folyadéksugarat, hogy minimális legyen a minták mosással okozott átszennyeződése az egyes mérőhelyek között. Ne irányítsa a folyadéksugarat közvetlenül a szubsztrátra, mert ez könnyen megsérülhet. Ha szükséges, helyezze a lemezeket további 5 percre hígított PBS pufferbe egy Coplin festőedényben. 4. A fluoreszcens konjugátum felvitele: Rázza le a fölösleges PBS puffert a lemezről. Tegye vissza a lemezt a nedveskamrába és azonnal fedje be minden egyes cella tartalmát egy-egy csepp fluoreszcens konjugátummal. Inkubálja a lemezeket újabb 30 ± 5 percig. 5. A lemezek mosása: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Fedőlemez: A fedőlemezek elhelyezésének technikája laboratóriumonként változó; de javasoljuk az alábbi eljárást: a. Helyezzen egy fedőlemezt egy papírtörlőre. b. Vigyen fel rögzítő médiumot folyamatos vonalban a fedőlemez alsó szélére. c. Rázza le a PBS puffer felesleget, és érintse a tárgylemez alsó szélét a fedőlemez széléhez. Óvatosan süllyessze a tárgylemezt a fedőlemezre úgy, hogy a rögzítő médium a lemez felső éle felé tudjon folyni, levegőbuborékok vagy zárvány képződése nélkül. Minőség-ellenőrzés Az ANA titrálható végpont mintázat kontrollt és az IFA negatív kontrollt is fel kell tenni minden egyes lemezre, hogy ellenőrizhető legyen az összes reagens és az eljárás kifogástalan végrehajtása a teszt kivitelezése folyamán. Alkalmas kiegészítő kontroll szérumok készíthetőek kevert humán szérum minták szétosztásával, és -70 alatt történő tárolásával. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit valósnak tekinthessük, valamennyi alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a teszt eredményeit érvénytelennek kell tekinteni, és az assay-t meg kell ismételni. 1. A hígítatlan ANA titrálható végpont mintázat kontroll legyen > 3+. 2. Az IFA System negatív kontrollnak negatív eredményt kell adnia. Az eredmények értelmezése Negatív Reakció. A mintát akkor tekinthetjük negatívnak, ha a specifikus festődés megegyezik az IFA negatív kontroll festődésével, vagy annál gyengébb. A minták változó mértékű háttérfestődést mutathatnak, ez heterofil antitestek, vagy egyes citoplazma alkotórészek, például kontraktilis fehérjék ellen irányuló, alacsony koncentrációjú autoantitestek jelenlétének tulajdonítható. Pozitív reakció Egy mintát akkor tekintünk pozitívnak, ha az IFA negatív kontrollnál nagyobb specifikus festődése figyelhető meg. A fluoreszcencia mértékét vagy intenzitását a következő kritériumok alapján határozza meg: 4+ Ragyogó almazöld fluoreszcencia 3+ Fényes almazöld fluoreszcencia 2+ Világosan megkülönböztethető pozitív fluoreszcencia 1+ A leggyengébb specifikus fluoreszcencia, ami még lehetővé teszi a specifikus sejtmagi és/vagy citoplazmatikus festődés egyértelmű megkülönböztetését a háttér-fluoreszcenciától. 5
A mintázat értelmezése. A sejtmag és a citoplazma festődésének változatos mintázatai mutatkozhatnak a mintában jelenlévő autoantitestek típusától és relatív mennyiségétől függően. A festődési mintázatok alábbi típusait figyelhetjük meg: Homogén: A sejtmag tömör festődése a nukleolusok látható fedésével vagy anélkül. Jelenlévő nukleáris antigének: dsdns, ssdns, hisztonok Kapcsolódó betegség: A nagy titerek SLE gyanúját vetik fel; az alacsonyabb titerek SLE-re vagy más kötőszöveti betegségekre utalnak. Perifériás: Tömör festődés, elsősorban a sejtmag külső régiói körül, a sejtmag közepe felé gyengülő intenzitással. Jelenlévő nukleáris antigének: dsdns, ssdns, DNP, hiszton Kapcsolódó betegség: A nagy titerek SLE gyanúját vetik fel; az alacsonyabb titerek SLE-re vagy más kötőszöveti betegségekre utalnak. Pettyezett/foltos: A sejtmag finom vagy szemcsés megjelenésű festődése, általában a nukleolusok fluoreszcens festődése nélkül. Jelenlévő nukleáris antigének: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B, és más, még nem karakterizált antigén/ antitest rendszerek. Kapcsolódó betegség: Nagy titerek SLE-re (Sm antitest), kevert kötőszöveti betegségre (RNP antitest), szklerodermára (Scl-70 antitest), vagy Sjögren szindróma-sicca komplexre (SS-B antitest) utalnak; alacsony titerek más kötőszöveti betegség gyanúját keltik. Nukleoláris: Nagy, durva foltos festődés a sejtmagon belül, szám szerint általában kevesebb, mint sejtenként 6, esetlegesen előforduló finom pettyezettséggel vagy anélkül. Jelenlévő nukleáris antigének: 4-6S RNS és más ismeretlen nukleáris antigének. Kapcsolódó betegség: Nagy titer szkleroderma és Sjögren szindróma esetén fordul elő. Centromer: Különálló, foltos festődési mintázat. A sejtmagban lévő pettyek nagyon jól elkülönülnek, és számuk rendszerint a 46-nak valamely többszöröse. Jelenlévő nukleáris antigének: Kromoszóma centromer (kinetochor). Kapcsolódó betegség: Erősen utal a CREST szindrómára, a progresszív szisztémás szklerózis (PSS) egyik változatára. A CREST a PSS olyan formája, amelyre kifejezett calcinosis és Raynaud jelenség, esophagealis dysmotilitás, és a bőr korlátozott részvétele (gyakran csak az ujjakra és az arcra korlátozódva), valamint teleanglectasia jellemző. Mitokondriális: A citoplazma különálló, foltos festődése a nukleáris terület viszonylagos megkímélésével. Jelenlévő antigének: Különböző típusú mitokondriális antigének. Kapcsolódó betegség: A nagy titerek elsődleges biliaris cirrhosis-ra utalnak. Fontos figyelmeztetni a felhasználót, aki elsősorban a mintázatra támaszkodik, hogy a nukleoláris és centromer mintázatok kivételével, amelyek esetében valamennyi antigén jól definiált és a mintázatuk jellegzetes, az antitest specificitásának meghatározása is szükséges. Mivel sok autoantitest illetve azok kombinációi indukálhatnak homogén vagy pettyezett mintázatot, utánvizsgálat végzését javasoljuk specifikus autoantitestre (mint például dsdns és ENA) minden pettyezett vagy homogén mintázatot adó szérumból. 6
A módszer korlátai 1. Nagy titerű ANA kötőszöveti betegségre utal, de nem szabad diagnosztikai értékűnek tekinteni. Az ANA eredményt más szerológiai vizsgálatok eredményével, és a beteg átfogó klinikai kórtörténetével együtt kell értékelni. 2. Az ANA mintázatok gyakran változnak a minta végpontig történő titrálása közben. Ez a jelenség azzal magyarázható, hogy az alacsonyabb titerű antitestek koncentrációja a teszt diagnosztikai küszöbértéke alá csökken, ahogy egyre hígabb mintával dolgozunk. 3. Változatos külső tényezők befolyásolják a teszt érzékenységét, többek között az értékeléshez használt fluoreszcens mikroszkóp típusa, az izzó ereje és életkora, az alkalmazott nagyítás, a szűrőrendszer és a vizsgálatot végző személy. 4. Ha az 515 nm-es band pass szűrő helyett 515 nm-es barrier szűrőt használ, a festődésben nagyobb arányban találkozhat műtermékkel. 5. A lemezek jelölésére kizárólag ceruzát használjon. Bármilyen más íróeszköz használata festődési hibát, műterméket okozhat. 6. A lemezek mosására használt Coplin festőedényeknek valamennyi festékmaradványtól mentesnek kell lenniük. A festékmaradványt tartalmazó Coplin festőedények használata festődési műterméket okozhat. 7. Ezen teszt eredményeit a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 8. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő mátrixok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. A külön kapható lemezek "Analitspecifikus reagensek" osztálybesorolást kaptak. A NOVA Lite HEp-2 ANA Kit DAPI-val rendelkező komponensét leszámítva, az analitikai és teljesítményjellemzőket nem határozták meg. Várható értékek A NOVA Lite HEp-2 ANA teszt kit használatával különféle kötőszöveti betegségekben szenvedő pácienseket, valamint 200 random véradót vizsgáltak. Az eredmények az alábbiakban láthatók: Betegcsoport Tesztelt minták száma Pozitív minták száma SLE 105 101 Gyógyszer-indukált Lupus 24 24 Rheumatoid Arthritis 40 28 Szkleroderma 24 18 Dermatomyositis 14 10 Sjögren szindróma 14 12 Normál 200 5 7
Hivatkozások 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167-239, 1982. 2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. 3. Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964. 4. Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: 1333-1338, 1966. 5. Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: 215-220, 1976. 6. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition Gyártó: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Amerikai Egyesült Államok Technikai ügyfélszolgálat (csak az USA-ban és Kanadában) 877-829-4745 Technikai ügyfélszolgálat (az USA-n kívül) 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Engedéllyel rendelkező képviselő az EU-ban: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Németország Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628102HUN 2012. március 0 átdolgozott változat A NOVA Lite és az INOVA Diagnostics, Inc. bejegyzett védjegy. Copyright 2012 Minden jog fenntartva 8