Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0.6.1. Bakteriális endotoxinok 1 g 1 g,3 g kazein- 3,6 g 7, g foszfát 1000 ml foszfát- hisztidin-hidroklorid pepton (hús- vagy pepton) nátrium-klorid kálium-dihidrogéndinátrium-hidrogéndihidrát tisztított víz Autoklávban, 11 C-on 15 percig sterilezzük. Amennyiben az oldat semlegesítő hatékonysága nem kielégítő, megnövelhetjük a poliszorbát 80 vagy a lecitin koncentrációját. Úgy is eljárhatunk, hogy a.6.13. -. táblázatban feltüntetett semlegesítőszereket használjuk..6.13. -. táblázat Antimikrobás szerek hatását megszüntető szerek (inaktivátorok), amelyeket a nátrium -klorid pepton tompítóoldathoz (ph 7,0) adunk Az antimikrobás szer típusa fenolok szerves higanyvegyületek halogének kvaterner ammóniumvegyületek Inaktivátor Koncentráció Megjegyzés nátrium-laurilszulfát poliszorbát 80 és lecitin tojássárgája nátriumtioglikolát nátrium- Tioszulfát g/l 30 g/l és 3 g/l 5 50 ml/l 0,5 5 g/l 5 g/l A nátriumklorid pepton tompítóoldat (ph 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz Tojássárgája 5 50 ml/l A nátriumklorid pepton tompítolodat (ph 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz 01/010:061.6.1. BAKTERIÁLIS ENDOTOXINOK javított 6.6 A bakteriális endotoxinok vizsgálata (BET= Bakteriális Endotoxin Teszt) a Gram-negatív baktériumokból származó endotoxinok kimutatására vagy mennyiségi meghatározására szolgál; a vizsgálathoz a patkós rák (Limulus polyphemus vagy Tachypleus tridentatus) amöbocitáinak lizátumát használjuk. E vizsgálathoz háromféle módszer áll rendelkezésünkre: a gélképződésen alapuló gél-koagulációs módszer; a turbidimetriás módszer, amely endogén szubsztrátum lehasadásakor fellépő zavarosodáson alapul; és a kromogén módszer, amely egy szintetikus peptid kromogén komplex hasadásakor bekövetkező színképződésen alapul. E fejezetben a következő hat módszer leírása található: A módszer: Gél-koagulációs módszer: határértékvizsgálat B módszer: Gél-koagulációs módszer: kvantitatív vizsgálat C módszer: Turbidimetriás kinetikus módszer D módszer: Kromogén kinetikus módszer E módszer: Kromogén végpont módszer F módszer: Turbidimetriás végpont módszer A vizsgálathoz a hat módszer bármelyike alkalmazható. Kétes vagy vitás esetben az A módszerrel végzett vizsgálat alapján döntünk, hacsak a cikkelyben nincs más előírás. A vizsgálatot úgy végezzük, hogy az endotoxin-szenynyeződés lehetőségét kizárjuk. 1. ESZKÖZÖK Minden üvegeszközt és hőálló eszközt hőlégsterilizátorban, validált eljárással kell pirogénmentesíteni. Az általában alkalmazott minimális idő és hőmérséklet 30 perc és 50 C. Amennyiben műanyag eszközöket, mint pl. a mikrotitráló lemezeket vagy az automata pipettákra illeszthető pipettahegyeket használunk, bizonyítani kell, hogy ezek nem tartalmaznak kimutatható mennyiségű endotoxint, és nem zavarják a vizsgálatot. MEGJEGYZÉS: E fejezetben a kémcső szó egyéb eszközt is jelenthet, pl. a mikrotitráló lemez mélyedését is.. REAGENSEK, VIZSGÁLATI OLDATOK (1) Amöbocita lizátum Az amöbocita lizátum a patkós rák (Limulus polyphemus vagy Tachypleus tridentatus) amöbocitáinak lizátumából nyert liofilizált termék, amely csak az illetékes hatóság szabályozásával összhangban állítható elő. MEGJEGYZÉS: az amöbocita lizátum nem csak endotoxinokkal reagál, hanem bizonyos β-glükánokkal is. Olyan amöbocita lizátum késztmények is beszerezhetők, amelyek glükánokkal nem reagálnak; ezeket úgy állítják elő, hogy az amöbocita lizátumból eltávolítják a glükánokkal reagáló G-faktort, vagy gátolják az amöbocita lizátum G- faktorral reagáló rendszerét. Az ilyen készítményeket glükánok jelenlétében is lehet endotoxin-vizsgálatra használni. () Lizátum oldat Az amöbocita lizátumot BET-vízben vagy tompítóoldatban a lizátum előállítójának ajánlása szerint lassú keverés közben oldjuk. Az oldatot a lizátum előállítójának előírása szerint hűtve vagy fagyasztva tároljuk. (3) BET-víz (bakteriális endotoxinok vizsgálatára alkalmas víz) A BET-víz R injekcióhoz való víz vagy más eljárásokkal előállított víz, amely a lizátummal annak kimutatási határán alkalmazva nem reagál.
.6.1. Bakteriális endotoxinok Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0 3. AZ ENDOTOXIN-STANDARD TÖRZSOLDAT KÉSZÍTÉSE Az endotoxin-standard törzsoldatot a Nemzetközi Standardra beállított endotoxin referenciakészítményből, pl. BRP endotoxin-standardból készítjük. Az endotoxin mennyiségét Nemzetközi Egységben (NE) fejezzük ki. A Nemzetközi Standard NE-ben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet (WHO) állapítja meg. MEGJEGYZÉS: Az endotoxin egy Nemzetközi Egysége (NE) egyenlő egy Endotoxin Egységgel (EE). Az endotoxin-standard törzsoldat elkészítését és tárolását illetően a csomagolásban található tájékoztatón és a feliraton feltüntetett előírások szerint járunk el.. AZ ENDOTOXIN-STANDARD OLDATOK KÉSZÍTÉSE Az endotoxin-standard törzsoldatból, annak erőteljes összekeverése után, megfelelő hígítási sort készítünk. A hígításokhoz BET-vizet használunk. Az oldatokat az adszorpció okozta aktivitáscsökkenés elkerülése érdekében a lehető leghamarabb fel kell használni. 5. A VIZSGÁLATI OLDATOK KÉSZÍTÉSE A vizsgálati oldatok készítéséhez a vizsgálandó hatóanyagokat, illetve gyógyszerkészítményeket BET-vízzel oldjuk, illetve hígítjuk. Egyes anyagok, illetve készítmények oldására vagy hígítására más vizes oldat alkalmasabb lehet. Ha szükséges, a vizsgálati oldat (vagy az abból készült hígítás) ph-ját úgy állítjuk be, hogy a lizátum és a vizsgálati oldat keverékének ph-ja a lizátum előállítója által megadott tartományba essen. Ez általában a 6,0 és 8,0 közötti ph-értékű lizátumokra vonatkozik. A ph-t a lizátum gyártójának javaslata alapján savval, bázissal vagy megfelelő tompítóoldattal állíthatjuk be. A savakat, illetve bázisokat akár tömény oldatból, akár szilárd anyagból állítjuk elő BET-vízzel, és olyan tartályokban készítjük, amelyek nem tartalmaznak kimutatható mennyiségű endotoxint. A tompítóoldatok kimutatható mennyiségű endotoxintól és zavaró tényetőktől való mentességét validálási eljárással kell bizonyítani. 6. A MAXIMÁLIS VALID HÍGÍTÁS MEGHATÁROZÁSA A Maximális Valid Hígítás (Maximum Valid Dilution = MVD) a mintának az a maximálisan megengedhető hígítása, amelynél az endotoxin-határérték meghatározható. Az MVD-t a következő összefüggés alapján határozzuk meg: endotoxin határérték a vizsgálati oldat koncentrációja MVD = λ Endotoxin-határérték: a parenterálisan alkalmazandó hatóanyagok dózis alapján megállapított endotoxin-határértéke: ahol K = az a testtömegkilogrammra számított endotoxin dózisküszöb, ami egy órán belül beadva pirogén hatású, M = a termék testtömegkilogrammra számított, egy órán belül beadható, legnagyobb ajánlott dózisa. Amennyiben a terméket gyakori időközönkén tinjektáljuk, vagy folyamatosan, infúzió formájában juttatjuk be, M az egy órán belül összesen beadható, teljes dózist jelenti. A parenterálisan alkalmazandó hatóanyagok endotoxinhatárértékét a cikkelyek különböző egységekben pl. NE/mlben, NE/mg-ban, NE/biológiai aktivitás egységben stb. adják meg. K M A vizsgálati oldat koncentrációja: mg/ml, ha az endotoxin-határértéket tömegegységre vonatkoztatva (NE/mg) adják meg, Egység/ml, ha az endotoxin-határértéket a biológiai aktivitás egységére vonatkoztatva (NE/Egység) adják meg, ml/ml, ha az endotoxin-határértéket térfogategységre vonatkoztatva (NE/ml) adják meg. λ = gél-koagulácón alapuló vizsgálatban a deklarált lizátumérzékenység (NE/ml); turbidimetriás vagy kromogén módszer alkalmazásakor a standard görbe (kalibrációs görbe) legalsó pontja. 7. GÉL-KOAGULÁCIÓN ALAPULÓ MÓDSZER (A ÉS B MÓDSZER) A gél-koagulációs módszer, amely a lizátumnak endotoxinok jelenlétében szilárd géllé történő alakulásán alapul, az endotoxinok kimutatására vagy mennyiségi meghatározására egyaránt alkalmas. Azt a legkisebb endotoxin-koncentrációt, amely standard körülmények között a lizátum koagulálásához szükséges, deklarált lizátum-érzékenységnek nevezzük. A vizsgálat pontosságának és értékelhetőségének (érvényességének) biztosítása érdekében az 1. Előkészítő vizsgálatok pont szerint ellenőrizzük a deklarált lizátum-érzékenységet és elvégezzük a zavaró faktorokra előírt vizsgálatot. 1. ELŐKÉSZÍTŐ VIZSGÁLATOK a) A deklarált lizátum-érzékenység ellenőrzése A lizátum-oldat NE/ml-ben kifejezett, deklarált érzékenységét (λ) a vizsgálatokhoz való felhasználás előtt négy párhuzamos vizsgálattal ellenőrizzük. A lizátum-érzékenység ellenőrzését akkor végezzük el, ha új gyártási tételt veszünk használatba, vagy ha a kísérleti körülmények úgy változtak, Az Alapelvek (1) előírásait minden cikkelyre és egyéb szövegre alkalmazni kell
hogy az befolyásolhatja az endotoxinvizsgálat eredményét. Az endotoxin-standard törzsoldatból BET-vízzel legalább négy különböző koncentrációjú (λ, λ, 0,5λ és 0,5λ) standard oldatot készítünk. Minden egyes kémcsőben egyenlő térfogatú (pl. 0,1 ml) lizátum-oldatot és standard oldatot elegyítünk. Ha liofilizált lizátumot tartalmazó egyadagos üvegcséket vagy ampullákat használunk, az oldatokat közvetlenül az üvegcsébe vagy ampullába mérjük. A reakcióelegyeket azonos ideig, a lizátum előállítójának ajánlásai szerint (általában 37 ± 1 Con, 60 ± percen át) rázkódásmentesen inkubáljuk. Ezután megvizsgáljuk a gél szilárdságát: az inkubátorból egyenként kivett kémcsöveket lassú, óvatos mozdulattal kb.180 -kal megfordítjuk. Ha a gél a megfordítás után is szilárd és mozdulatlan marad, az eredmény pozitív. Ha nem képződött szilárdan maradó gél, az eredmény negatív. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a legkisebb koncentrációjú standard oldat a párhuzamos vizsgálatok mindegyikében negatív eredményt ad. A végpont a standard endotoxin-koncentrációjú hígítási sorozatban az a legkisebb koncentráció, amely koagulálja a lizátumot. A hígítási sor végpont-koncentrációi logaritmusainak középértékét kiszámítva, meghatározzuk a végpont-koncentráció mértani középértékét, majd a következő kifejezés alapján vesszük ezen érték antilogaritmusát: ahol A végpont-koncentrációk mértani középértéke = antilog Σe = az adott hígítási sorban a végpont-koncentrációk logaritmusainak összege, f = a párhuzamosok száma. Σe f A lizátum-oldat mért érzékenységét (NE/ml-ben kifejezve) a végpont-koncentrációk mértani középértéke jelenti. Ha ez az érték 0,5λ-nál nem kisebb és λ értéknél nem nagyobb, akkor a deklarált érzékenységet elfogadjuk, és minden vizsgálat esetében, amelyhez ezt a lizátumot használjuk, a deklarált értékkel számolunk.
Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0.6.1. Bakteriális endotoxinok.6.1.-1. táblázat Oldat Endotoxin-koncentráció/ az Hígító folyadék Hígítási faktor oldat, amelyhez az endotoxint adjuk Kiindulási endotoxinkoncentráció A párhuzamosok száma A nulla/vizsgálati oldat - - - B λ/vizsgálati oldat vizsgálati oldat 1 8 λ 1λ 0,5λ 0,5λ C λ/bet-víz BET-víz 1 8 λ 1λ 0,5λ 0,5λ D nulla/bet-víz A oldat: a vizsgálandó készítmény oldata, amely nem tartalmaz kimutatható mennyiségű endotoxint, B oldat: zavaró faktorok vizsgálatára szánt oldat, C oldat: a deklarált lizátum-érzékenység ellenőrzésére szánt oldat, D oldat: negatív kontroll (BET-víz). b) Vizsgálat zavaró faktorokra A.6.1.-1. táblázat alapján elkészítjük az A, a B, a C és a D oldatokat. A vizsgálati oldatoknak azt az MVD-nél kisebb hígítását használjuk, amely az 1. Előkészítő vizsgálatok a) pontja (A deklarált lizátum-érzékenység ellenőrzése) szerint eljárva nem tartalmaz kimutatható mennyiségű endotoxint. A B és a C oldat végpont-koncentrációinak mértani középértékét az 1. Előkészítő vizsgálat a) pontjában (A deklarált lizátum-érzékenység ellenőrzése) ismertetett összefüggés alapján számítjuk ki. A zavaró faktorokra vonatkozó vizsgálatot meg kell ismételni, ha a kísérleti körülmények úgy változtak, hogy ez befolyásolhatja a vizsgálat eredményét. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az A és a D oldat párhuzamos csöveinek egyikében sem észlelhető reakció, és a C oldattal kapott eredmény alátámasztja a deklarált lizátum-érzékenységet. Ha a B oldattal meghatározott lizátum-érzékenység 0,5λ-nál nem kisebb és λ-nál nem nagyobb, akkor a vizsgálati oldat nem tartalmaz zavaró tényezőket az alkalmazott kísérleti körülmények között. Ellenkező esetben a vizsgálati oldat zavarja a vizsgálatot. Ha a vizsgált készítmény az MVD-nél kisebb hígításban zavarja a vizsgálatot, a zavaró faktorok vizsgálatát ismételjük meg egy nagyobb, de az MVD-t meg nem haladó hígítással. Nagyobb érzékenységű lizátum alkalmazása lehetővé teszi a vizsgálandó készítmény nagyobb hígítását, és elősegítheti a zavaró faktorok kiküszöbölését. A zavaró faktorok megfelelő validált kezeléssel, pl. szűréssel, semlegesítéssel, dialízissel vagy hőkezeléssel kiküszöbölhetők. Annak érdekében, hogy megbizonyosodjunk a választott kezelés endotoxinveszteség nélküli hatékonyságáról, a vizsgálandó készítményhez endotoxin-standardot adunk, ezzel az oldattal elvégezzük a választott kezelést, majd a kezelés után megismételjük a zavaró faktorokra vonatkozó vizsgálatot.. HATÁRÉRTÉK-VIZSGÁLAT (A MÓDSZER) a) A vizsgálat menete A.6.1. - táblázat alapján elkészítjük az A, a B, a C és a D oldatokat. Az oldatokat, az 1. Előkészítő vizsgálatok a) pontja (A deklarált lizátum-érzékenység ellenőrzése) szerint megvizsgáljuk. Oldat A B C D.6.1.-. táblázat Endotoxin-koncentráció/az oldat, amelyhez az endotoxint adjuk nulla/hígított vizsgálati oldat λ/hígított vizsgálati oldat λ/bet-víz nulla/bet-víz A párhuzamosok száma Az A oldat és a B oldat (a termék pozitív kontrollja) készítésekor ne alkalmazzunk az MVD-nél nagyobb hígítást; az oldatok kezelését az 1. Előkészítő vizsgálatok b) pontja (Vizsgálat zavaró faktorokra) szerint végezzük. A B és a C oldat (pozitív kontrollok) endotoxin-standard koncentrációja a deklarált lizátum-érzékenység kétszerese legyen. A D oldat (negatív kontroll) maga a BET-víz. Az Alapelvek (1) előírásait minden cikkelyre és egyéb Kérjük, szövegre figyeljen alkalmazni az általáno kell s cikkelyekre vonatkozó tájékoztatásra ( belső borító)
.6.1. Bakteriális endotoxinok Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0 b) Értékelés A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a két pozitív kontroll (B és C) oldat mindkét párhuzamos kísérletben pozitív, a negatív kontroll (D) oldat pedig mindkét párhuzamos kísérletben negatív eredményt ad. A készítmény megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha az A oldat mindkét párhuzamos kísérletben negatív eredményt ad. Amennyiben az A oldat mindkét párhuzamos kísérletben pozitív eredményt ad, a vizsgált készítmény nem felel meg a vizsgálat követelményének. A vizsgálatot meg kell ismételni, ha az A oldat két párhuzamos kísérlete közül az egyik pozitív, a másik negatív eredményt ad. Ha a megismételt vizsgálatban az A oldat mindkét párhuzamos kísérlete negatív eredményt ad, a vizsgálandó készítmény megfelel a követelménynek. Ha viszont az A oldat egyik vagy mindkét párhuzamos kisérletben pozitív, a készítmény nem felel meg a követelménynek. Amennyiben a készítmény az MVD-nél kisebb hígításban nem felel meg a követelménynek, a vizsgálat megismételhető nagyobb, de az MVD-t meg nem haladó hígításban. 3. KVANTITATÍV VIZSGÁLAT (B MÓDSZER) a) A vizsgálat menete A vizsgálat során a bakteriális endotoxin tartalmat a vizsgálati oldat adott végpontig történő titrálásával határozzuk meg. A.6.1.-3. táblázat alapján elkészítjük az A, a B, a C és a D oldatokat. Az oldatokat az 1. Előkészítő vizsgálatok a) pontja (A deklarált lizátum-érzékenység ellenőrzése) szerint vizsgáljuk. b) Számítás és értékelés A vizsgálat csak az alábbi három feltétel teljesülése esetén értékelhető: (a) a D oldat (negatív kontroll) mindkét párhuzamos kísérletben negatív eredményt ad, (b) a B oldat (a termék pozitív kontrollja) mindkét párhuzamos kísérletben pozitív eredményt ad, (c) a C oldat végpont-koncentrációinak mértani középértéke 0,5λ és λ közé esik. Az A oldat endotoxin-koncentrációját úgy kapjuk meg, hogy mindegyik párhuzamos hígítási sorra kiszámítjuk a végpont-koncentrációkat úgy, hogy a végpontnak megfelelő hígítási faktort λ-val szorozzuk. A vizsgálati oldat endotoxin-koncentrációja a párhuzamos kísérletek során nyert végpont-koncentráció. Ha a vizsgálatot hígított vizsgálati oldattal végeztük, az eredeti vizsgálati oldat endotoxin-koncentrációjának kiszámításához az eredményt meg kell szorozni a hígítási faktorral. Amennyiben egy értékelhető vizsgálat során a vizsgálati oldat egyetlen hígítása sem ad pozitív eredményt, az endotoxin-koncentrációt úgy kell megadni, hogy az kisebb, mint λ, (vagy, hígított minta vizsgálata esetén, kisebb, mint a λ és a minta legkisebb hígítási faktorának szorzata). Amennyiben.6.1.-3. táblázat Oldat Endotoxin-koncentráció/az /oldat, amelyhez az endotoxint adjuk Hígító folyadék Hígítási faktor Kiindulási endotoxinkoncentráció A párhuzamosok száma A nulla/vizsgálati oldat BET-víz 1 8 B λ/vizsgálati oldat 1 λ C λ/bet-víz BET-víz 1 8 D nulla/bet-víz λ 1λ 0,5λ 0,5λ A oldat: a vizsgálati oldat azon MVD-értékét meg nem haladó hígítása, amelyet a zavaró faktorok vizsgálata során alkalmaztunk A vizsgálati oldat további hígításai sem haladhatják meg az MVD-t. BET-vizet alkalmazva négy csőből álló hígítási sort készítünk, amelyekben a zavaró faktorok vizsgálata során alkalmazott hígításhoz viszonyított hígítási faktorok rendre: 1, 1/, 1/ és 1/8. Más alkalmas hígítások is használhatók. B oldat: λ koncentrációban endotoxin-standardot tartalmazó A oldat (a termék pozitív kontrollja). C oldat: csőből álló hígítási sorozat BET-víz, amely λ, λ, 0,5λ és 0,5λ koncentrációban endotoxin-standardot tartalmaz. D oldat: BET-víz (negatív kontroll). 5 Kérjük, figyeljen az általános cikkelyekre vonatkozó tájékoztatásra (belső borító)
Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0.6.1. Bakteriális endotoxinok a vizsgálati oldat minden hígítása pozitív eredményt ad, az endotoxin-koncentrációt úgy adjuk meg, hogy az egyenlő vagy nagyobb mint a legnagyobb hígítási faktor és λ szorzata (pl. a.6.1.-3. táblázatban ez az érték: a kiindulási hígítási faktor 8 λ). A vizsgált készítmény megfelel a követelményeknek, ha az endotoxin-koncentráció mindkét párhuzamos kisérletben kisebb, mint az egyedi cikkelyben megadott érték. 8. FOTOMETRIÁS KVANTITATÍV MÓDSZEREK (C, D, E ÉS F MÓDSZER) 1. TURBIDIMETRIÁS MÓDSZER (C ÉS F MÓDSZER) Ez a módszer a zavarosság fokozódását mérő fotometriás vizsgálat. A vizsgálat alapelvét tekintve a módszert turbidimetriás végpontmeghatározásnak, illetve turbidimetriás kinetikus vizsgálatnak nevezzük. A turbidimetriás végpontmeghatározás (F módszer) az endotoxin-koncentráció és a reakcióelegy adott inkubációs időszak végén mért zavarossága (abszorbancia vagy transzmisszió) közötti kvantitatív összefüggésen alapul. A turbidimetriás kinetikus vizsgálat (C módszer) során vagy az előre megadott abszorbancia eléréséhez szükséges időt (reakcióidő) vagy a zavarosság kifejlődésének sebességét mérjük a reakcióelegyben. A vizsgálatot a lizátum előállítója által javasolt inkubációs hőmérsékleten (általában 37 ± 1 C-on) végezzük.. KROMOGÉN MÓDSZER (D ÉS E MÓDSZER) Ez a módszer annak a kromofórnak a mérésén alapszik, amely a megfelelő kromogén peptidből az endotoxinok lizátummal létrejövő reakciója során felszabadul. A vizsgálati elvét figyelembe véve, a módszert kromogén végpont-meghatározásnak, illetve kromogén kinetikus vizsgálatnak nevezzük. A kromogén végpont-meghatározás (E módszer) alapja az endotoxin-koncentráció és az inkubációs idő végéig felszabaduló kromofór mennyisége közötti kvantitatív összefüggés. A kromogén kinetikus meghatározás (D módszer) során vagy az előre megadott abszorbancia eléréséhez szükséges időt (reakcióidő), vagy a szín kifejlődésének sebességét mérjük a reakcióelegyben. A vizsgálatot a lizátum előállítója által javasolt inkubációs hőmérsékleten (általában 37 ± 1 C-on) végezzük. 3. ELŐKÉSZÍTŐ VIZSGÁLATOK A turbidimetriás és a kromogén vizsgálat pontosságának, illetve értékelhetőségének biztosítása érdekében előkészítő vizsgálatokat végzünk. Az előkészítő vizsgálatokkal biztosítjuk egyrészt azt, hogy a kalibrációs görbével szemben támasztott követelmények teljesüljenek, másrészt azt, hogy maga a vizsgálati oldat ne zavarja a vizsgálatot. Ha a kísérleti körülmények úgy változtak, hogy ez befolyásolhatja a vizsgálat eredményét, szükség van a vizsgálati módszer validálására. a) A kalibrációs görbével szemben támasztott követelmények teljesítése A vizsgálatot a lizátum reagens minden egyes gyártási tételével el kell végezni. Az endotoxin-standard oldat felhasználásával legalább három különböző endotoxin-koncentrációjú oldatot készítünk a kalibrációs görbe felvételéhez, a lizátum előállítója által jelzett tartományon belül. A vizsgálat keretében minden egyes endotoxin-standard oldat esetén legalább három párhuzamos vizsgálatot végzünk a lizátum előállítójának a térfogatarányokra, az inkubálás időtartamára, hőmérsékletére, a ph-ra, és egyebekre vonatkozó ajánlásai szerint. Ha a kinetikus módszer esetében a szükséges mérési tartomány nagyságrendnél nagyobb, további standard oldatokra van szükség, amelyek a kalibrációs görbén átfogják a teljes mérési tartományt. A korrelációs együttható abszolút értékének ( r ) az endotoxin-koncentráció-tartományban legalább 0,980-nak kell lennie..6.1.-. táblázat Oldat Endotoxin-koncentráció Az oldat, amelyhez az endotoxint adjuk A párhuzamosok száma A Nulla vizsgálati oldat legalább B közepes koncentráció a kalibrációs görbén vizsgálati oldat legalább C legalább 3 különböző koncentráció (a legkisebb koncentrációt λ-val jelöljük) BET-víz minden koncentrációból legalább D Nulla BET-víz legalább A oldat = vizsgálati oldat, amely legfeljebb az MVD-ig hígítható, B oldat = a vizsgálandó készítmény az A oldattal megegyező hígításban, azzal a különbséggel, hogy a kalibrációs görbe közepén vagy annak közelében kiválasztott koncentrációban hozzáadott endotoxint is tartalmaz, C oldat = standard endotoxin-oldatok (pozitív kontrollok) a módszer validálásához használt koncentrációkban, a 3. Előkészítő vizsgálatok a) pontjában (A kalibrációs görbével szemben támasztott követelmények teljesítése) leírtak szerint készítve, Az Alapelvek (1) előírásait minden cikkelyre és egyéb szövegre alkalmazni kell 6
.6.1. Bakteriális endotoxinok Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0 D oldat = BET-víz (negatív konztoll) b) Vizsgálat zavaró faktorokra A kalibrációs görbe közepén vagy annak közelében kiválasztunk egy endotoxin-koncentrációt. A.6.1.-. táblázat alapján elkészítjük az A, a B, a C és a D oldatokat. A vizsgálat során legalább két párhuzamos mérést végzünk a lizátum előállítójának a vizsgálati oldat és a lizátum-oldat térfogatára, térfogatarányára, az inkubálás időtartamára és egyéb körülményekre vonatkozó ajánlásai szerint. A vizsgálatot akkor tekintjük érvényesnek, ha teljesülnek a következő feltételek: a C oldat esetén a kalibrációs görbe korrelációs koefficiensének abszolút értéke legalább 0,980; a D oldat esetén kapott eredmény nem haladja meg az alkalmazott lizátum-reagens leírásában megkívánt üreskisérleti határértéket vagy kisebb, mint az alkalmazott lizátum-reagens endotoxin-kimutatási határértéke. Kiszámítjuk a hozzáadott endotoxin visszanyerésének középértékét: kivonva az oldat (A oldat,.6.1.-. táblázat) átlag endotoxin koncentrációját a hozzáadott endotoxint tartalmazó oldatéból (B oldat,.6.1.-. táblázat). A vizsgálati oldatot akkor tekintjük zavaró tényezőktől mentesnek, ha a vizsgálati körülmények között a vizsgálati oldathoz adott endotoxin mért koncentrációja az endotoxin hozzáadása nélkül kapott endotoxin-érték levonása után az ismert, hozzáadott endotoxin-koncentráció 50 00%-a. Ha az endotoxin visszanyerés a megadott határokon kívül esik, a vizsgálati oldatot nem tekinthetjük zavaró faktoroktól mentesnek.. Ezesetben nagyobb, de az MVD-t meg nem haladó, hígítást alkalmazva, megismételjük a vizsgálatot. Továbbá, a vizsgálati oldat vagy az MVD-t meg nem haladó nagyobb hígítású oldat zavarása, alkalmas validált kezeléssel (mint pl. szűrés, semlegesítés, dialízis vagy hőkezelés) kiküszöbölhető. Annak bizonyítására, hogy a választott kezelés a zavaró faktorokat endotoxinveszteség nélkül hatékonyan kiküszöböli, megismételjük a zavaró faktorokra vonatkozó vizsgálatot, olyan vizsgálandó készítménnyel, amelyhez standard endotoxint adtunk és alávetettünk a választott kezelésnek.. VIZSGÁLAT a) A vizsgálat menete A vizsgálat menete megegyezik a 3. Előkészítő vizsgálatok b) pontjában (Vizsgálat zavaró faktorokra) leírtakkal. b) Számítás A C oldatok eredményeiből (pozitív kontroll sorozat) felvett kalibrációs görbe alapján kiszámítjuk a párhuzamos A oldatok endotoxin-koncentrációit. A vizsgálat csak az alábbi három követelmény teljesülése esetén értékelhető: (1) a C oldattal kapott eredmények feleljenek meg a 3. Előkészítő vizsgálatok a) pontjában (A kalibrációs görbével szemben támasztott követelmények teljesítése) előírt validálási követelményeknek, () az endotoxin-visszanyerés amelyet úgy számítunk ki, hogy a B oldattal kapott endotoxin-koncentrációból kivonjuk az A oldattal kapott endotoxin-koncentrációt 50 00% legyen. (3) A D oldattal (negatív kontroll) kapott erdmény nem haladhatja meg a felhasznált lizátum leírásában a vak értékre megadott határt vagy ez az eredmény kisebb, mint az alkalmazott lizátum-reagens endotoxinkimutatás határa. c) Értékelés A vizsgálandó készítmény megfelel a követelményeknek, ha az A oldat párhuzamosainak endotoxinkoncentrációiból kapott középérték a hígítás és a koncentráció figyelembevételével kisebb, mint a termékre előírt endotoxinhatárérték. A bakteriális endotoxinok vizsgálatára vonatkozó irányelvek az 5.1.10. általános fejezetben találhatók.
.6.1. Bakteriális endotoxinok Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0.6.1.-5. táblázat Milyen hígításban kell alkalmaznunk a készítményt a vizsgálathoz, hogy a negatív eredmény maximális biztonsággal azt jelentse, hogy a készítmény endotoxin-koncentrációja kisebb, mint az endotoxin-határérték, a pozitív eredmény pedig azt, hogy a lizátum által kimutatott endotoxin-koncentráció azonos az endotoxin-határértékkel vagy annál nagyobb? Ezt a hígítást, amely egyrészt az endotoxin-határértéktől, másrészt a lizátum érzékenységétől függ, maximális valid hígításnak (MVD, Maximum Valid Dilution) nevezzük és értékét az alábbi kifejezés alapján számíthatjuk ki: endotoxin határérték a vizsgálati oldat koncentrációja MVD = λ A vizsgálati oldat koncentrációja: mg/ml, ha az endotoxin-határértéket tömegegységre vonatkoztatva (NE/mg) adták meg, Egység/ml, ha az endotoxin-határértéket a biológiai aktivitás egységére vonatkoztatva (NE/Egység) adták meg, ml/ml, ha az endotoxin-határértéket térfogategységre vonatkoztatva (NE/ml) adták meg. λ = gél-koaguláción alapuló vizsgálatban a deklarált lizátum-érzékenység (NE/ml); turbidimetriás vagy kromogén módszernél a kalibrációs görbe legalsó pontja. Ha a maximális valid hígítás nem egész szám, akkor rutin vizsgálatokhoz egy, az MVD-nél kisebb, alkalmas, egész számot használhatunk (azaz a készítmény oldatát kevésbé hígítjuk, mint az MVD érték). Ez esetben a negatív vizsgálati eredmény azt jelenti, hogy a termék endotoxin-koncentrációja a határérték alatt van. Ha a termék endotoxinkoncentrációja kisebb, mint az endotoxin-határérték, ahhoz azonban elég nagy, hogy az adott körülmények között a lizátummal koagulációs reakcióba lépjen, a vizsgálat eredménye pozitív lehet. Ezért, ha a vizsgálat ennek az alkalmas hígítási faktornak az alkalmazásával pozitív eredményt ad, a készítményt az MVD-értékre kell hígítani és a vizsgálatot meg kell ismételni. Bármilyen kétes vagy vitás esetben az MVD-érték alkalmazandó. A fentiek alátámasztják annak fontosságát, hogy meggyőződjünk a lizátum érzékenységéről. M = testtömegkilogrammonkénti, óránkénti legnagyobb humán dózis:15 mg, c = 50 mg/ml, K = 5 NE endotoxin testtömegkilogrammonként, óránként, λ = 0, NE endotoxin/ml. Példa Fenitoin-nátrium 50 mg/ml töménységű, iv. injekciós oldatát kell vizsgálnunk. Határozzuk meg az MVD-t a követke ző adatok alapján: 5 50 MVD = 15 1 0, = 1,67 Rutinvizsgálatokhoz célszerű a vizsgálandó fenitoin-nátrium oldat 1 ml-ét 0 ml-re hígítani (MVD/ a kisebbik szomszédos egész számra kerekítve). Ha azonban az így végzett vizsgálat pozitív eredményt ad, 1 ml oldatot 1,67 mlre hígítva, meg kell ismételni a vizsgálatot. Akkor is 1,67 mlre kell hígítani, ha vitás esetben kell döntést hoznunk. 3. REFERENCIAANYAG Referenciaanyagként BRP endotoxin standard ajánlott, amelynek hatóértékét a WHO Nemzetközi Endotoxin Standardjával szemben határozták meg és endotoxin NE/ampullában fejezik ki. Az endotoxin Nemzetközi Egysége definíció szerint a Nemzetközi Standard meghatározott tömegének specifikus aktivitása. Rutin célokra más endotoxin-készítmény is felhasználható, feltéve, hogy hatóértékét Nemzetközi Endotoxin Standarddal vagy BRP endotoxin standarddal szemben határozták meg, és endotoxin NE-ben fejezik ki. MEGJEGYZÉS: az endotoxin egy Nemzetközi Egysége (NE) egyenlő egy Endotoxin Egységgel (EE).. BET-VÍZ A BET-víz endotoxinmentességének vizsgálatára a nyulakon végzett pirogén-vizsgálati módszer alkalmatlannak bizonyult. Ennek gyakorlati és elméleti okai vannak: a nyúl pirogén vizsgálat nem elég érzékeny ahhoz, hogy az igen alacsony endotoxin-határértékű készítmények vizsgálatához használatos BET -vízben az endotoxint kimutassa; a nyulak hőmérsékletemelkedés-válaszának viszonylagos pontatlansága a vizsgálatok többszöri ismétlését tenné szükségessé; a pirogének és endotoxinok kifejezések nem teljesen egybeeső fogalmakat jelölnek. A bakteriális endotoxinok vizsgálatát leíró szöveg utal arra, hogy BETvíz előállí tására nemc sak a Alkalmazási mód Intravénás Intravénás,radioaktív gyógyszerek Intrathecalis háromszori desztilláció alkalmas. Eredményesen használják pl. a fordított ozmózist is. Mások a háromnál többszöri desztillációt részesítik előnyben. Bármelyik módszert is használjuk, a végtermék nem tartalmazhat kimutatható mennyiségű endotoxint. 5. AZ ELEGY ph-ja K (endotoxin NE testtömegkilogrammonként és óránként) 5,0,5 0, A bakteriális endotoxinok vizsgálata során az elegyekben 6,0 és 8,0 közötti ph-értéknél játszódik le az optimális 8 Kérjük, figyeljen az általános cikkelyekre vonatkozó tájékoztatásra (belső borító)
Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0.6.1. Bakteriális endotoxinok gél-koaguláció. Amikor azonban a lizátumot a mintához keverjük, csökkenhet a ph. 6. A LIZÁTUM VALIDÁLÁSA Fontos, hogy a lizátum-oldatokat a gyártó utasítása szerint készítsük. Az A és B gél-koagulációs módszer alkalmazásakor pozitív eredményt adó, legnagyobb hígítási faktorok logaritmusát képezzük. A logaritmus-értékek gyakorisági eloszlásgörbéje ugyanis sokkal jobban megközelíti a normál eloszlás görbéjét, mint maguknak a hígítási faktoroknak a gyakorisági eloszlása; a hasonlóság oly mértékű, hogy elfogadhatjuk a normál eloszlást, mint matematikai modellt, és a megbízhatósági határok kiszámításához használhatjuk a Studentféle t-próbát. 7. ELŐVIZSGÁLAT ZAVARÓ FAKTOROKRA Egyes termékek nem vizsgálhatók közvetlenül endotoxinokra, vagy azért, mert nem elegyednek a reagensekkel, vagy mert ph -jukat nem tudjuk 6,0 8,0 értékre beállítani, illetve mert gátolják, esetleg aktiválják a gélképződést. Ezért előzetes vizsgálattal ellenőrizni kell, hogy nincsenek-e jelen zavaró faktorok. Ha ilyenek kimutathatók, bizonyítanunk kell, hogy a kiküszöbölésüket célzó eljárás hatékony volt. Az elővizsgálat célja annak a nullhipotézisnek a vizsgálata, amely szerint a lizátum-érzékenység a vizsgálandó készítmény jelenlétében nem tér el szignifikánsan a vizsgálandó készítmény nélkül észlelttől. Az A és a B módszer során egyszerű kritériumot alkalmazunk: a nullhipotézist abban az esetben fogadjuk el, ha a lizátum érzékenysége a vizsgálandó készítmény jelenlétében legalább fele, de legfeljebb kétszerese a lizátum saját érzékenységének. A klasszikus eljárás az lenne, ha az érzékenységre vonatkozó hígítási faktorok logaritmusainak középértékét külön a készítmény jelenlétében és anélkül kiszámolnánk, és a két középérték közti eltérés szignifikanciájának megállapítására a Student-féle t-próbát alkalmaznánk. Az A és B gél-koagulációs módszer alkalmazása során a zavaró faktorok vizsgálatához olyan termékmintára van szükség, amelyben nem mutatható ki endotoxin. Teljesen új termék esetében ez elvi problémát jelent. Emiatt a C, D, E és F mennyiségi módszerekre más megközelítést alkalmaznak. 8. A ZAVARÓ FAKTOROK KIKÜSZÖBÖLÉSE A zavaró faktorok kiküszöbölése céljából végzett műveletek során a vizsgálandó készítmény endotoxintartalma nem nőhet és csökkenhet (pl. adszorpció révén). Ezt helyesen úgy ellenőrizzük, hogy a műveleteket a készítmény olyan mintájával is elvégezzük, melyhez ismert mennyiségű endotoxint adtunk, azután mérjük a visszanyert endotoxin mennyiségét. C és D módszer. Amennyiben a vizsgálandó termék olymódon zavarja a vizsgálatot, hogy azt klasszikus módszerekkel nem tudjuk kiküszöbölni, a kalibrációs görbét megfelelő kezeléssel vagy hígítással endotoxin-mentesített, azonos típusú termékkel vehetjük fel. Az endotoxin vizsgálat elvégzésekor ezt a kalibrációs görbét használjuk összehasonlítóként. Cellulóz-triacetátból készült, asszimmetrikus membránszűrőkön történő ultraszűrés az esetek többségében megfelelőnek bizonyult. Csak megfelelően validált szűrőket használhatunk, ugyanis bizonyos körülmények között a cellulózszármazékok (β-d-glükánok) alkalmazása álpozitív eredményre vezethet. A poliszulfonát szűrők alkalmatlannak bizonyultak, mivel néhány felhasználó álpozitív eredményekről számolt be. 9. A KONTROLLVIZSGÁLATOK CÉLJA A deklarált lizátum-érzékenységhez képest kétszeres koncentrációjú, endotoxin-referenciakészítményből BETvízzel készített kontroll segítségével ellenőrizzük a vizsgálat időpontjában és körülményei között a lizátum aktivitását. A negatív kontrollal azt igazoljuk, hogy a BET-víz nem tartalmaz kimutatható mennyiségű endotoxint. A vizsgálandó készítményt a vizsgálatban előírt koncentrációban tartalmazó pozitív kontroll annak bizonyítására szolgál, hogy a vizsgálat időpontjában és körülményei között gátló tényezőkkel nem kell számolni. 10. AZ EREDMÉNYEK LEOLVASÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE A BET-vízben vagy bármelyik reagensben, illetve anyagban, amely a lizátummal vizsgálat közben érintkezik, igen kis mennyiségben jelen lévő endotoxin mindaddig nem mutatható ki, amíg mennyisége el nem éri a lizátum érzékenységi határát. Ugyanakkor, azáltal, hogy a vizsgálandó készítmény oldatában éppen az érzékenységi határ fölé emelheti az endotoxin-mennyiséget, pozitívvá teheti a reakciót. Hogy ez lehetőleg ne forduljon elő, a BET-víz, valamint az egyéb reagensek és anyagok vizsgálatához a rendelkezésre álló legérzékenyebb lizátumot használjuk, vagy legalábbis érzékenyebbet, mint a készítmény vizsgálatához használt lizátum. Ennek ellenére, az álpozitív reakció előfordulásának kockázata nem zárható ki teljesen. Ebben a vonatkozásban a vizsgálatot garantált biztonságúra tervezték, szemben az olyan vizsgálatokkal, amelyeknek esetleges álnegatív eredménye miatt a betegek egészségét veszélyeztető, nem megfelelő készítmények is forgalomba kerülhetnének. 11. PIROGÉNVIZSGÁLAT HELYETTESÍTÉSE BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLATTAL Azokban a cikkelyekben, amelyek olyan, parenterális felhasználásra szánt termékekre vonatkoznak, amelyek toxikus mennyiségű bakteriális endotoxint tartalmazhatnak, Az Alapelvek (1) előírásait minden cikkelyre és egyéb szövegre alkalmazni kell 9
.6.15. Prekallikrein-aktivátor Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 5.0 vagy a nyulakon végzett pirogénvizsgálatot vagy a bakteriális endotoxin vizsgálatot elő kell írni. Általános irányelvek: 11.1. Az egyedi cikkelyek ha szükség van ilyen típusú vizsgálatra csak az egyik vizsgálatot írják elő, vagy a pirogénvizsgálatot, vagy a bakteriális endotoxin vizsgálatot. 11.. A bakteriális endotoxinok vizsgálatát részesítjük előnyben, hacsak nincs ennek ellentmondó szempont, mivel általános felfogás szerint ez a pirogénvizsgálattal azonos vagy annál nagyobb biztonságot jelent a beteg számára. 11.3. Mielőtt egy cikkelybe beépítésre kerül a bakteriális endotoxin vizsgálat, bizonyítani kell, hogy a.6.1. fejezetben leírt módszerek valamelyike alkalmas az adott termék vizsgálatára. 11.. A szükséges információkat az előállítóktól szerzik be. A vállalatokat felkérik, hogy közöljék a birtokukban lévő validálási adatokat, amelyek az érintett anyagok és készítmények bakteriális endotoxin vizsgálatának alkalmazhatóságára vonatkoznak. Ilyen adatok: a mintaelőkészítés, valamint a zavaró faktorok eltávolítására alkalmazott műveletek részletei. Az előállítóknak rendelkezésre kell bocsátaniuk továbbá a nyulakon végzett pirogénvizsgálatból származó minden párhuzamos adatot, amely hozzájárulhat annak alátámasztásához, hogy a nyulakon végzett pirogén-vizsgálat helyettesíthető a bakteriális endotoxin vizsgálattal. Az alábbi pontok további követelményeket fogalmaznak meg. 1. A CIKKELYBEN ELŐÍRTTÓL ELTÉRŐ BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLAT ALKALMAZÁSA Ha a cikkely bakteriális endotoxin vizsgálatot ír elő, de nem nevezi meg az e fejezetben leírt hat (A-tól F-ig) módszer egyikét sem, akkor az A módszer (a gél-koaguláción alapuló határérték-vizsgálat) a validált módszer az adott termékre. Amikor a cikkelyben a többi (B-től F-ig) módszer közül megnevezik valamelyiket, akkor ez a validált módszer az adott termékre. 13. ALTERNATÍV MÓDSZEREK VALIDÁLÁSA A nyulakon végzett pirogén vizsgálat helyettesítése bakteriális endotoxin vizsgálattal, vagy az előírt, bakteriális endotoxinok vizsgálatára szolgáló módszer helyettesítése más módszerrel úgy tekintendő, mint valamilyen alternatív módszer használata egy gyógyszerkönyvi vizsgálat helyett; erről az 1. Alapelvekben a következő általános állásfoglalást találjuk: Az előírt vizsgálatok és meghatározások képezik azokat a hivatalos módszereket, amelyeken a Gyógyszerkönyv követelményei alapulnak. Az illetékes hatóságok jóváhagyásával más vizsgálati módszerek is alkalmazhatók azellenőrzésben, feltéve, ha ezen módszerek alapján egyértelműen eldönthető, hogy a hivatalos módszerek alkalmazása esetén teljesülnének-e a cikkely követelményei. Kétes vagy vitás esetben kizárólag az Európai Gyógyszerkönyv vizsgálati módszerei mérvadók. előírt módszer helyett más módszer validálása a feladat, a következő eljárások javasolhatók. 13.1. Az eljárást, valamint a módszer során alkalmazott anyagokat és reagenseket a vonatkozó vizsgálatra előírtak szerint validálni kell. 13.. Legalább három, különböző gyártási tételből származó mintán kell ellenőrizni, hogy zavaró faktorok jelen vannak-e, és ha igen, hatékonyak-e a kiküszöbölésükre irányuló műveletek. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy a kromogén peptidet alkalmazó D és E módszerhez szükséges reagensek az A, B, C és az F módszer alkalmazásakor nincsenek jelen, tehát, ha az A, B, C vagy az F módszer szerint a készítmény megfelel a Zavaró faktorok vizsgálat követelményeinek, ez nem terjeszthető ki további vizsgálatok nélkül a D vagy az E módszerre. 1. ÚJ TERMÉKEK VIZSGÁLATÁNAK VALIDÁLÁSA Minden olyan, parenterális alkalmazásra szánt új terméknél, amelyet a Gyógyszerkönyv követelményei szerint vizsgálni kell bakteriális endotoxinok jelenlétére, alkalmazni kell a 13.1. és a 13.. pontban leírt validálási eljárásokat..6.15. PREKALLIKREIN-AKTIVÁTOR A prekallikrein-aktivátor (PKA) a prekallikreint aktiválással kallikreinné alakítja. Meghatározására utóbbinak azt a tulajdonságát használjuk fel, hogy képes kromofór-csoportot lehasítani egy szintetikus peptid-szubsztrátumról; a hasítás sebessége spektrofotometriásan mérhető és így a PKA koncentrációját a Nemzetközi Egységekre beállított referenciakészítményhez viszonyítva kiszámolhatjuk. A Nemzetközi Egység a liofilizált prekallikrein-aktivátorból álló Nemzetközi Standard meghatározott mennyiségének aktivitása. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységekben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet (WHO) állapítja meg. A PREKALLIKREIN-SZUBSZTRÁTUM ELŐÁLLÍTÁSA A véralvadás aktiválódásának megakadályozására a prekallikrein kinyeréséhez használt vér vagy plazma kizárólag műanyagokkal vagy szilikonbevonatú üvegfelületekkel érintkezhet. Ha a bakteriális endotoxinok vizsgálatára a cikkelyben 10 Kérjük, figyeljen az általános cikkelyekre vonatkozó tájékoztatásra (belső borító)