BIOTECHNOLÓGIA SVM II. Mikroorganizmusok azonosítása környezeti mintákból molekuláris ökológiai technikák segítségével BEVEZETÉS Az 1970-es évek elejéig a mikrobiológusok túlnyomó többsége reménytelen, ha nem lehetetlen vállalkozásnak tartotta egy evolúciós alapokon nyugvó prokarióta rendszertan kidolgozását. Mindezek következtében a mikrobiológia nem szervezıdhetett egy természetes, származástanilag helyes rendszertan köré. Ennek a rendkívül fontos evolúciós alapnak a hiánya komoly gátat jelentett a mikrobiológia fejlıdésében. Az 1950-es évektıl már kihasználták azt, hogy egyes molekulák szekvenciái a hordozó fajok evolúciós kapcsolatait tükrözik. A prokarióta mikrobiológia tudománya azonban további évtizedeket várt, mielıtt a molekuláris szekvencia analízisben rejlı lehetıséget felismerte volna. A mai, modern prokarióta rendszertan (és egyre fokozódó mértékben az eukarióta rendszertan is) nagyrészt a 16S rrns szekvenciák összehasonlításán, analízisén alapul. A hagyományos mikrobiológiai technikákkal (izolálás, tiszta tenyészet fenntartása laboratóriumban) tanulmányozható prokarióták aránya a vizsgált környezeti mintáktól függıen 0.01 és 15 % között mozog, a teljes prokarióta élıvilágra kivetítve ez az érték 0.2-0.5 % lehet. A környezeti mikrobiológia, a prokarióták ökológiája gyakorlatilag kizárólag a 16S rrns szekvenciákon alapuló technikákkal tanulmányozható a teljesség igényének feladása nélkül. Az élı szervezetekben felhalmozott szén mennyiségét 1000 x 10 15 g -ra becsülik. Ennek mintegy felét, 350-550 x 10 15 g szenet a prokarióták és archeák tartalmazzák. A teljes biomassza közel felét teszik ki azok a prokarióták, melyeket ma kizárólag a molekuláris ökológia módszereivel lehet vizsgálni. A talajban található prokarióták átlagos generációs idejét 900 napra becsülik, melynek fı oka valószínőleg a megszerezhetı tápanyag korlátozott mennyisége. Az ilyen körülményekhez adaptálódott mikroorganizmusok túlnyomó többsége képtelen a laboratóriumi körülmények között nagy bıségben elé dobott tápanyag hasznosítására, azaz a számottevıen gyorsabb növekedésre. Az ilyen prokarióták hagyományos módszerekkel történı vizsgálata eleve lehetetlen. 1. A 16S rrns technikák alkalmazási területei - Molekuláris rendszertan. - Új izolátumok gyors meghatározása, rendszertani besorolása.* - Nem tenyészthetı baktériumok azonosítása, rendszertani helyének meghatározása. - Molekuláris ökológia*: Ismert baktériumcsoportok kimutatása a környezeti mintákban. In situ PCR és in situ hibridizációs technikákkal jól tanulmányozható a környezeti mintákban az egyes (köztük a laborban nem tenyészthetı) baktériumcsoportok aránya, elhelyezkedése, környezeti stresszekre adott válaszreakciója, a populációk arányának változása, stb. A 16S rrns technikákkal megszerzett információt gyakran kiegészítik egyéb génekre specifikus PCR-el. A legtöbb esetben valamely baktériumcsoportra jellemzı, erısen konzervált kulcsenzim génjét használják. Ez a technika a rendszertani információ mellett arra is választ ad, hogy egy adott életmódot folytató baktériumcsoport jelen van-e a vizsgált mintában, s ha igen, milyen mennyiségben. A PCR termékek szekvencia analízise sokszor a 16S rrns szekvenciákhoz hasonlóan alkalmazható fejlıdéstani kapcsolatok meghatározására is. * a csillaggal jelölt alkalmazásokat fogjuk bemutatni a gyakorlaton
2. ALKALMAZOTT ELJÁRÁSOK 1. Templát preparálás A 16S rrns technikák során a legtöbb esetben a kódoló DNS szakaszról készítenek PCR terméket, és ennek a terméknek a szekvenciáját határozzák meg. A másik lehetıség reverz PCR segítségével közvetlenül a 16S rrns-rıl készíteni PCR terméket. Az elıbbi, általánosan alkalmazott esetben prokarióta genomi DNS-t (gdns-t) kell izolálni, míg az utóbbi esetben teljes prokarióta RNS izolálására van szükség (amit a mindenütt jelenlévı, rendkívül stabil RNáz enzimek megnehezítenek). A templát preparálása során még nincs szükség a következı lépésnél leírt különlegesen tiszta munkára. Ennek az oka, hogy a végeredményként elıálló gdns preparátumot több nagyságrenddel hígítjuk mielıtt PCR templátként alkalmazzuk és így az esetlegesen belekerülı szennyezı DNS annyira kihígul, hogy nem okoz problémát. 2. 16S rrns specifikus PCR Kivitelezése során rendkívül nagy figyelmet kell fordítani a tiszta munkára. A PCR ciklus során alkalmazott denaturációs lépés (94-96 C) a legtöbb baktériumsejtet megöli, és az így felszabaduló baktérium gdns-rıl képzıdı PCR termék hamis eredményekhez vezethet. A legtöbb PCR során olyan primereket alkalmaznak, melyek rendkívül specifikusak a vizsgált baktériumra, vagy baktériumok egy kisebb csoportjára. A 16S rrns specifikus primerek a megvizsgált összes baktériumra nézve univerzálisak, tehát bármilyen baktérium bekerülése a reakcióelegybe hamis eredményhez vezet(het). Az alkalmazott PCR primerek (f27 [5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'] és r1492 [5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3']) tehát az ismert bakteriális világra nézve univerzálisak. Ez nem jelenti azt azonban, hogy különbözı baktériumok DNS-ének keverékébıl álló templát esetén ne kedveznének bizonyos fokig egyik vagy másik
templátnak. Ez egyben azt is jelenti, hogy nem minden esetben igaz az a feltételezés, hogy a különbözı PCR termékek aránya egy az egyben tükrözi a különbözı baktériumfajok/törzsek arányát a vizsgált mintában. A PCR termékek mérete 1450-1500 bp. Escherichia coli esetén ez pontosan 1496 bp, míg a teljes 16S rrns gén 1542 bp hosszú. Egy tipikus PCR során néhány minta mellett egy pozitív és egy negatív kontroll elvégzésére is szükség van. A pozitív kontrollhoz valamilyen korábban készített és már igazoltan tiszta gdns preparátumot, míg a negatív kontrollhoz steril desztillált vizet használunk templátként. A GYAKORLAT CÉLJA ÉS MENETE A 16S rrns az élıvilágban univerzálisan elıfordul, melynek génjében megnyilvánuló fajok közötti különbségek kimutatásával lehetıvé válik ismeretlen baktériumokat tartalmazó mintákból különbözı baktériumok kimutatása. A gyakorlat során a gyakorlat elsı részében izolált baktériumtelepekbıl tervezünk meghatározni két baktériumfajt - a Thiocapsa roseopersicinát és a Methylococcus capsulatust - 16S rrns-technika felhasználásával. A két baktériumfaj 16S rrns génjeiben DNS-szinten megnyilvánuló különbségeket PCR-amplifikációt követı restrikciós emésztéssel (RFLP) (TaqI) mutatjuk ki. A gyakorlat menete I. Genomi DNS tisztítás baktériumkultúrákból Ellenırzés 1% agarózgélen futtatással. 1. Kb. 1ml baktériumkultúrát koncentráljunk össze egy 1.5 ml-es Eppendorf csıben. 2. A baktériumokat szuszpendáljuk fel 500 µl SET pufferben (20% szacharóz, 50 mm EDTA, 50 mm Tris-Cl ph 8.0). 3. Adjunk hozzá 50 µl 10 % SDS-t és 6 µl 20 mg/ml-es proteináz K-t. 60 perc inkubáció 55-60 C-on. 4. A feltárt baktériumszuszpenziót extraháljuk 500 µl Fenol:Kloroform:Izoamilalkohol (25:24:1) keverékkel (adjunk az elegyhez 250 µl fenolt és 250 µl Kloroform-izoamil alkohol 24:1 keveréket). Rázzuk alaposan össze, centrifugáljuk minimum 10.000 x g erıvel 5 percig. 5. A tiszta felülúszó tartalmazza a DNS-t. 6. A tiszta felülúszót 500 µl Kloroform:Izoamilalkohol (24:1) keverékével keverjük össze, centrifugáljuk 2 percig. Ez a lépés a vizes fázisban nyomokban jelen maradt fenol eltávolítására szolgál. 7. A DNS kicsapása: a tiszta felülúszót keverjük össze 50 µl 3M nátrium-acetáttal és 500 µl izopropanollal. Keverés: A csı fel-le fordításával. Centrifugáljuk minimum 10.000 x g erıvel 20 percig. 8. Óvatosan, hogy a csapadékot ne veszítsük el, öntsük le az alkoholt a DNS-rıl, töltsünk rá 1 ml jéghideg 70 %-os etanolt (vigyázzunk, hogy a centrifugacsı falára tapadt csapadékot ne lazítsuk fel) és centrifugáljuk az elıbbi sebességen újabb 5 percig. 9. Öntsük le az alkoholt a csapadékról és szárítsuk: nyitott tetıvel centrifugálva, 5 percig. A DNS-t ha túlszárítjuk, rendkívül nehéz feloldani! 10. Oldjuk fel a DNS csapadékot 20 µl TE pufferben. A DNS oldódását a csı aljának pöcögtetésével lehet segíteni. Az RNS eltávolítására adjunk hozzá 2 µl 100 µg/ml koncentrációjú DNáz mentes RNázA-t, inkubáljuk 37 C-on 10 percig.
11. Agaróz gélen, ismert mennyiségő marker mellett futtassunk meg 10 µl-t és határozzuk meg a DNS koncentrációját. Ellenırzés: 1% agarózgélen futtatással. Reakcióelegy: a mintából 5 ul-t kipipettázunk, 15 ul desztvizet és 4 ul DNSfestéket adunk hozzá, majd gélre visszük II. A 16S rrns-t kódoló DNS-szakasz PCR-amplifikációja génspecifikus primerek használatával. PCR-amplifikációhoz: 5 ul 10x higított templát DNS 5-5 ul primer (f27, r1492) 2 ul 10x puffer 3 ul dntp mix (2.5 mm) 0.5 ul Taq polimeráz enzim 30 ciklus kb. 3 óra 95 C 5 perc 1. 95 C 1 perc 2. 55 C 1 perc 3. 72 C 1 perc 30x Ellenırzés 1% agarózgélen futtatással. reakcióelegy: 5 ul amplifikátum + 15 ul desztvíz + 4 ul DNS-festék III. Az amplifikált DNS-szakaszok TaqI enzimmel történı restrikciós emésztése. 14 ul PCR-termék 0.5 ul TaqI enzim (2.5 U/ul) 1 ul 10x puffer 5 ul H2O 65C 1 óra Ellenırzés 2% agarózgélen futtatással. reakcióelegy: a 20 ul reakcióelegyhez 4 ul DNS-festéket adunk és gélre visszük Megjegyzés: A PCR terméket tisztítás nélkül használjuk. A PCR reakcióhoz használt puffer így 75%-os koncentrációban (14 µl PCR termék 20 µl-ben) jelen lesz az emésztési elegyben. A TaqI enzim által igényelt puffer összetétele minimális, elhanyagolható különbséget mutat a PCR pufferétıl, így azt is a normális végkoncentráció 50%-án alkalmazva (1 µl 10x tömény puffer 20 µl végtérfogatban) a TaqI enzim számára megfelelı pufferhez jutunk. Más enzimek alkalmazásakor szükség lehet a PCR termék tisztítására (a PCR puffer összetevıitıl megszabadulandó).
IV. Az eredmények kiértékelése. A PCR-reakció és a DNS-izoláció termékeit az elızetesen már elkészített 1% agarózgélen ellenırizzük. (A PCR-termékek várható mérete 1.5 kb, az ıssz-dns kb 50 kb). A fragmentek méreteit molekulasúly marker melletti futtatással állapítjuk meg. Ezt követıen meghatározzuk a különbözı DNS-fragmentek méretét "manuálisan" illetve számítógépprogram segítségével. A kapott méreteket összevetjük a számítógépes DNSszekvencia adatbankból letöltött, és egy speciális program segítségével - szintén TaqI enzimmel - "virtuálisan megemésztett" fragmentméretekkel. E lépés során a számítógépes program megkeresi az adott szekvenciákban a TaqI enzim hasítóhelyeit, melynek eredményeképp megkapjuk az adott szekvencia TaqI-fragment méreteit. Amennyiben ez a fragmentmintázat megegyezik valamely, a kísérletek során általunk kapott mintázattal, kijelenthetjük, hogy a baktériumkultúrát azonosítottuk. Megjegyzésként fontos elmondani, hogy a legbiztosabb eredményt természetesen a PCRfragmentek szekvencia analízise, illetve e szekvenciák alapján történı homológiakeresés adná, de egyrészt erre a gyakorlat keretei között nincsen lehetıségünk, másrészt a baktériumtörzsek RFLP-módszeres azonosítása gyorsabb és sokszor elegendı információt szolgáltat.
Jegyzıkönyv SVM, Biotechnológiai Tanszék 2008-2009. I félév 1. Dátum: 2. Név: 3. Csoportszám (párok): 16S rrns vizsgálat céljának tömör összefoglalása (mi a gyakorlat célja?): Azonosítandó baktériumtörzsek, alkalmazott módszerek felsorolása: Eredmények összefoglalása, következtetések: (i.: a gélképek alapján: hogyan sikerültek az egyes lépések: genomi DNS izolálás, PCR, emésztés? ii.: mennyire volt összevethetı a kapott mintázat az adatbázissal a 2 baktérium esetén?, iii.: sikerült-e azonosítanunk a 2 baktériumot? miért?, iv.: egyéni meglátások a gyakorlat eredményét illetıen)
Ábrák helye: 1. DNS-tisztítás kevert kultúrából 2. 16S rrns-specifikus PCR 3. RFLP analízis (TaqI emésztés)