3. Mikroorganizmusok számának meghatározása telepszámlálásos módszerrel A telepszámlálásos módszerek esetében a tenyésztést szilárd táptalajon végezzük, így - szemben az MPN-módszerrel, ahol a csíraszámot indirekt úton, statisztikai módszerrel határoztuk meg - a kifejlıdött telepek közvetlenül megszámolhatók. A telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságának alapfeltétele, hogy a táptalajokon kinıtt telepek egyetlen sejt szaporodásából származzanak, és a telepek számolhatók legyenek, vagyis a cél olyan lemeztenyészetek elıállítása, amelyen az egyedülálló (soliter) telepek száma 10-300 közötti. Akárcsak az MPN-módszerrıl, a telepszámlálásos módszerekrıl is elmondható, hogy - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen - alkalmas mind az összcsíraszám; mind pedig valamely tetszıleges mikrobacsoport számának meghatározására. 3.1. Elısejtszám meghatározás lemezöntéses módszerrel A lemezöntéses módszert fıként kevéssé hıérzékeny, nem obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére használjuk. Alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíra-számának meghatározásához. A vizsgálat elsı lépése - mint miden élıcsíra-szám meghatározást célzó tenyésztéses módszer esetében - a megfelelıen elıkészített mintából decimális hígítási sor készítése. Ezt követıen a hígítási sor tagjaiból 2-2 - egyértelmő jelzéssel (mintaszám, leoltás dátuma, alkalmazott táptalaj rövidített neve, hígítás foka) ellátott - Petri-csészébe 1-1 ml szuszpenziót kell pipettázni steril pipettával a legmagasabb hígítástól kezdve a nagyobb sejtsőrőségő tagok felé haladva. A sterilezett, 45-50 C hımérséklető, táptalajból kb. 15 ml mennyiséget öntünk a megemelt fedelő Petri-csészékbe, majd egyenletes rotáló mozgatással a - még folyékony - táptalajt alaposan elkeverjük a Petri-csészében lévı szuszpenzióval. Ügyelni kell arra, hogy mozgatás közben a tápközeg ne kerüljön a Petri-csésze falára és tetejére, valamint ne szennyezze a környezetet. A tápközeg megszilárdulása után a Petri-csészéket meg kell fordítani úgy, hogy a lemez kerüljön felülre. Ennek célja egyrészt a képzıdı kondenzvíz visszacsöpögésének, a gyors kiszáradásnak, valamint a telepek elvándorlásának megakadályozása. A lemezeket ezt követıen megfelelı hımérséklető termosztátba kell helyezni, és elıírt ideig tenyészteni. Az inkubálás lejárta után a lemezeket kivesszük a termosztátból, és a rajtuk kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Csak azokat a lemezeket vonjuk be az értékelésbe, amelyeken a telepszám 10-300 (nagymérető telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszámot az értékelésbe bevont lemezeken megszámlált telepszámok súlyozott átlagaként adjuk meg a hígítási fok figyelembe vételével az alábbi képlet alapján: ahol c =telepszám súlyozott középértéke c C = n + 0,1 n ) * V * d ( 1 2
Σc=a számításba bevont valamennyi lemez telepeinek összege (legalacsonyabb és az azt követı kiértékelhetı hígítási fokok) n 1 =az elsı kiértékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n 2 =az elsı kiértékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d=az elsı kiértékelt hígítási szint hígítási foka V=a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 1 ml) A kapott értéket minden esetben normál alakba hozva adjuk meg eredményként. Ennél a vizsgálati módszernél célszerő az alkalmazott táptalajt úgy megválasztani, hogy az tiszta, áttetszı legyen, mert az opálos színő táptalajok zavarhatják a kolóniák felismerhetıségét. 3.1.1. Pasztırözött tej összcsíra-számának meghatározása lemezöntéses módszerrel Összcsíraszám alatt értjük azoknak az élı mikroorganizmusoknak a számát, amelyek 30 C hımérsékleten aerob körülmények között 48-72 óra alatt telepet képeznek (összes élı, aerob és fakultatív anaerob, mezofil és fakultatív pszichrotróf mikrobák száma). A vizsgálatot szilárd alaptáptalajon kell végezni, mint pl. a triptont, élesztıkivonatot és glükózt tartalmazó Plate-Count agar GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: 90 ml steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 ml-es steril pipetta, 5 x 9 ml steril hígítóvíz kémcsıben, 1 ml-es steril pipetta, 6 db steril Petri-csésze, olvasztott Plate-Count agar Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 ml-ét bemérjük 90 ml steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígításokat készítünk 10-5 hígítási fokig. A hígítási sor utolsó három tagjából 1-1 ml t pipettázunk higításonként 2; azonosítható jelöléssel ellátott steril Petri-csészébe, majd felolvasztott és 45 C-ra visszahőtött Plate-Count agarral lemezt öntünk. Szilárdulás után a lemezeket 48-72 órára 30 C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 ml-ére vonatkoztatott összcsíraszámot. Ha valamely képletrıl szabad szemmel nem tudjuk eldönteni, hogy telepe, célszerő lupéval is megvizsgálni. Megjegyzés: a módszer alkalmas az aerob spóraszám meghatározására is, ha a mintát vagy a hígítási sor tagjait 80 C-on 10 percen át kezelve a vegetatív alakokat elpusztítjuk. Eredmények:
3.2. Élısejtszám meghatározása felületi szélesztéssel A felületi szélesztés alkalmazható hıérzékeny, obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére is. Ennél a módszernél alkalmazhatunk opálos színő (általában tojássárgaemulziót tartalmazó) táptalajokat, mivel a mikrobaszaporodás a táptalaj felszínén történik, így a telepek szabad szemmel is jól láthatók. A felületi szélesztéses módszer - akár az MPN, vagy a lemezöntéses eljárás - alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíraszámának meghatározásához. A felületi szélesztéses eljárás során a már elıre leöntött és megszilárdított, szikkasztott felülető lemez felületére pipettázunk hígításonként 0,1 ml szuszpenziót. A táptalaj szikkasztására azért van szükség, mert a nedves felülető lemezen nehéz a szélesztés, és a kifejlıdı telepek szétfutnak. Beoltás után a megfordított lemezeket megfelelı körülmények között meghatározott ideig inkubáljuk. Az inkubációs idı letelte után a kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Az értékelésbe csak azokat a lemezeket vonjuk be, amelyeken a telepszám 10-300 (nagy telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszám meghatározása súlyozott átlag számításával az alábbi képlet alapján történik: c C = n + 0,1 n ) * V * d ( 1 2 ahol c =telepszám súlyozott középértéke Σc=a számításba bevont valamennyi lemez telepeinek összege (legalacsonyabb és az azt követı kiértékelhetı hígítási fokok) n 1 =az elsı kiértékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n 2 =az elsı kiértékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d=az elsı kiértékelt hígítási szint hígítási foka V=a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 0,1 ml) A fenti képletet összehasonlítva a lemezöntéses módszernél megadott képlettel, látható, hogy a felületi szélesztéses módszernél még egy 10-es szorzófaktor is szerepel(1/0,1). Ennek magyarázata, hogy míg a lemezöntéses módszernél az inokulum mennyisége 1 ml, a felületi szélesztéses módszer esetében 0,1 ml. Az eredményt minden esetben normál alakba hozva kell megadni. A fentiekbıl következik, hogy szilárd minták esetében, a vizsgálat érzékenysége legalább 10 2 mikroba/g, folyékony minták esetében pedig; 10 1 mikroba/ml. Elıfordulnak azonban olyan vizsgálati minták, amelyekben a keresendı mikroorganizmus ennél kisebb számban, fordul elı. Ezek kimutatását célozza az un. "három-lemez"-módszer. Ennek lényege, hogy a hígítási sor elsı tagjából - szilárd minták esetében ez az l-es hígítás (alapszuszpenzió), folyékony minták esetében pedig maga a minta (0-s hígítás) - összesen 1ml mennyiséget három lemez felületén oszlatunk el, majd a megfelelı inkubálás eltelte után a telepeket
mindhárom lemezen megszámláljuk, és a kapott értékeket összeadjuk. Ez a szám megmutatja, hogy - szilárd minták esetében - az alapszuszpenzió, illetve - folyékony minták esetében - a minta 1 ml-ében hány mikroba található. 3.2.1. Pasztırözött tej összes Staphylococcus-, és feltételezhetıen Staphylococcus aureus számának meghatározása felületi szélesztéses módszerrel A Staphylococcus nemzetség tagjai megtalálhatók az ember és az állatok bırén, felsı légutaiban, a húgy és nemi szervek nyálkahártyáin, illetve egyes fajaik a tejben és tejtermékekben is. Élelmiszerhigiéniai szempontból legjelentısebb képviselıjük a Staphylococcus aureus, amely enterotoxin-termelése révén az ételmérgezı mikroorganizmusok közé tartozik. A Staphylococcusok szelektív tenyésztésére a szulfamethazin-tojássárga-tellurit tartalmú szelektív és differenciáló agarlemezt alkalmazzuk. A szulfamethazin visszaszorítja a kísérı mikroflórát, a tellurit a Staphylococcusokra jellemzı tellurit-redukció kimutatását célozza, amelynek eredményeként a telepek fekete vagy grafitszürke színben tőnnek föl. A táptalajon vizsgálható a Staphylococcus aureusra jellemzı lipáz-lecitináz aktivitás. A lipáz pozitívak azok a telepek, amelyek felülete a keletkezı zsírsavak miatt gyöngyházfényő. A lecitináz aktivitást az un. Nagler-reakció mutatja. Ennek lényege, hogy a lecitin elbontása miatt a telepek körül - a tojássárga-tartalom miatt - egyébként opálos táptalaj feltisztul. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: 90 ml steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 ml-es steril pipetta, 9 ml steril hígítóvíz kémcsıben, 1 ml-es steril pipetta, 4 db Baird-Parker agarlemez, steril Wassermann-csövek Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 ml-ét bemérjük 90 ml steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígítást készítünk 10-2 hígítási fokig. A hígítási sor tagjaiból 0,1 0,1 ml-t pipettázunk hígításonként 2, azonosítható jelöléssel ellátott steril Baird-Parker agarlemezre. A lemezeket 24-48 órára 37 C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött fekete vagy grafit szürke telepeket, valamint ezek közül a gyöngyházfényő és Nagler-reakciót mutató telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 ml-ére vonatkoztatott Staphylococcus-, valamint feltételezett Staphylococcus aureus-számot 3.3. Membránszőréses módszer A membránszőréses módszert alacsony csíraszámú folyadék- és gázminták vizsgálatára alkalmazzuk. A minta meghatározott mennyiségét membránfilteren átszívatva annak pórusain a mikrobák visszamaradnak. A membránfiltert táptalajra helyezve a filteren átdiffundáló tápanyagok révén a telepek magán a filteren alakulnak ki.
A membránszőréses módszer alkalmazásáról és technikai kivitelezésérıl részletesen a "Víz összes csíraszámának meghatározása membránszőréses módszerrel" címő gyakorlat keretében lesz szó.