A Notch jeltovábbító rendszer és a galektin-1 molekula szerepe a vérképző őssejt niche működésének szabályozásában Vas Virág Témavezető: Professzor Dr. Pálóczi Katalin Országos Gyógyintézeti Központ 2005 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Klinikai Orvostudományok Doktori Program, Klinikai Haematológia Alprogram Doktori szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Füst György Doktori szigorlati bizottsági tagok: Prof. Dr. Demeter Judit Dr. Masszi Tamás Doktori értekezés védésének elnöke: Prof. Dr. Csermely Péter Doktori értekezés opponensei: Dr. Magyar Attila Dr. Réz Gábor
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK 4 1 BEVEZETÉS 6 1.1 A SZÖVETI ŐSSEJTEK 6 1.2 AZ ŐSSEJT PLASZTICITÁS LEHETSÉGES MECHANIZMUSAI 8 1.3 A VÉRKÉPZŐ ŐSSEJTEK 11 1.3.1 A vérképző őssejtek felszíni markerei 14 1.3.2 A vérképző őssejtek mikrokörnyezete 14 1.4 A VÉRKÉPZÉS MOLEKULÁRIS SZABÁLYOZÁSA: A DÖNTÉSHOZÓ MOLEKULÁK 16 1.4.1 A Notch hatásmechanizmusa: gátlás és indukció. 16 1.4.2. A Notch jelátvitel folyamata 18 1.4.3. A Notch jelátvitelt befolyásoló molekulák 21 1.4.4. Notch szabályozás a vérképző rendszerben 23 1.4.5. A Notch rendszer patológiás elváltozásai 26 1.5. A GALEKTINEK BEMUTATÁSA 29 1.5.1. A galektin-1 szerteágazó hatásai 30 1.6. A VÉRKÉPZŐ ŐSSEJTEK VIZSGÁLATI MÓDSZEREI 32 2 CÉLKITŰZÉSEK 34 3 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 36 3.1 KÍSÉRLETI ÁLLATOK ÉS ŐSSEJT TRANSZPLANTÁCIÓ 36 3.2 REKOMBINÁNS JAGGED-1 FEHÉRJE ELŐÁLLÍTÁSA 36 3.2.1 Transzfekció 36 3.2.2 A Jagged-1 fehérje tisztítása 37 3.3 A GALEKTIN-1 FEHÉRJE ELŐÁLLÍTÁSA 38 3.4 SEJTSZEPARÁLÁS 39 3.5 SEJTKULTÚRÁK 40 3.5.1 Lágy-gél kultúrák 40 3.5.2 Macskakő-képző kultúrák 40 3.5.3 A vérsejtfejlődési sorra jellemző markerekre negatív (Lin - ) sejtek expanziós kultúrája 42 3.6 ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁS MÉRÉSEK 42 3.7 KOMPETITÍV CSONTVELŐ REPOPULÁCIÓS TESZT 44 3.8 FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ (FISH) 46 3.9 POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓS TESZT 47 4 EREDMÉNYEK 49 4.1.1 A vérsejtfejlődési sorokra jellemző antigéneket nem hordozó (Lin - ) sejtfrakció jellemzése 49 4.1.2 A Notch jelzés megnöveli az elkötelezett vérképző progenitor sejtek citokin-indukálta proliferációját 54 4.1.3 A szolubilis Jagged-1 fehérje hatása a macskakő-képző kultúrákra 55 4.1.4 A multivalens Jagged-1 fehérje segíti a vérképző őssejtek túlélését és proliferációját in vitro 58 4.1.5 A szolubilis Jagged-1 fehérje gátolja a multivalens Notch ligandum vérképző őssejtekre gyakorolt, proliferációt segítő hatását 60 4.1.6 A multivalens Jagged-1 fehérje jelenléte a Lin - sejt kultúrákban megnövelte az in vivo tartós repopulációra képes sejtek mennyiségét 63 4.2.1 A rekombináns galektin-1 kötődése a csontvelői sejtekhez 66 4.2.2 A galektin-1 bifázikusan modulálja az elkötelezett vérképző progenitor sejtek osztódását 68 4.2.3 A galektin-1 hatása a macskakő-képző sejtek osztódására 71 2
5 MEGBESZÉLÉS 75 6. KÖVETKEZTETÉSEK 84 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 86 IRODALOMJEGYZÉK 87 A SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 101 MAGYAR ÖSSZEFOGLALÓ 102 SUMMARY 103 3
RÖVIDÍTÉSEK bhlh: bázikus hélix-kanyar-hélix tipusú transzkripciós faktor (basic helix-loop-helix) BMP: csont morfogén fehérje (bone morphogen protein); CAFC: macskakő-képző kultúrában kolóniát képző sejt (Cobblestone Area-Forming Cell); CSL: CBF-1/RBp-Jκ, Suppressor of Hairless, Lag1 fehérjék; DSL: Delta/Serrate/Lag2 fehérjék; EGF: epidermális növekedési faktor (Epidermal Growth Factor); FCS: fötális borjú savó; FGF: fibroblaszt növekedési faktor (Fibroblast Growth Factor); FL: Flk-2/Flt-3 ligandum; FITC: Fluorescein-izotiocianát; GVHD: graft versus host betegség; HES: Hairy/Enhancer of Split fehérje; Lin - : vérsejtfejlődési sorra jellemző markerekre negatív (lineage negative); LNR: Lin12 Notch ismétlődés (repeats); LP: lymphoid progenitor sejt; LTRA: tartós repopulációra képes sejtek (long-term repopulating ability); MHC: fő hisztokompatibilitási komplex (Major Histocompatibility Complex); MP: myeloid progenitor sejt; NCR: Notch Cytokine Response domén; Notch EC: Notch receptor extracelluláris része; Notch IC: Notch receptor intracelluláris része; PAS: paraaorticus splanchnopleura; PE: phycoerythrin; PBS: foszfáttal pufferelt sóoldat; RIP: regulált intramembrán proteolízis; SCF: őssejt faktor (stem cell factor); Shh: sonic hedgehog morfogén; sjg1 ECD : szolubilis Jagged-1 fehérje extracelluláris doménje; STRA: rövid repopulációra képes sejtek (short-term repopulating ability); 4
TACE: tumor necrosis faktor α-konvertáló enzim; TAD: transcriptional activation domen; TCR: T-sejt receptor; TGF-β: transzformáló növekedési faktor β (Transforming Growth Factor β); TPO: thrombopoetin; Wnt: a név a Drosophila Wingless mutációjára utal, egy pleiotrop hatású morfogén fehérje; 5
1 BEVEZETÉS 1.1 A szöveti őssejtek Az embrionális fejlődés korai stádiumában a sejtek még minden irányban képesek differenciálódni. A felnőtt szervezetben erre már csak kisszámú, ún. szöveti őssejt képes, és az is csak részben. Ezek a szöveti őssejtek fontos szerepet töltenek be a sérülések regenerációjában és a folyamatosan megújuló szövetek (például a vérképzőrendszer) fiziológiás működésében. Sorsukat a közvetlen környezetükből, az őssejt niche-ből érkező proliferációs, differenciációs és túlélési jelzések határozzák meg. A folyamat mechanizmusa azonban mindmáig tisztázatlan. A felnőtt szöveti őssejtek ugyanis különböző fejlődési irányokba képesek differenciálódni, sokszor még fejlődéstanilag sem rokon sejttípusokká is át tudnak alakulni. Számos szervben sikerült azonosítani őssejteket, amelyek nagyon kis mennyiségben vannak jelen a felnőtt szöveti sejtek között, egér csontvelőben például tízezer-százezer sejt közül csak egy az őssejt, éppen ezért nehéz őket izolálni. Ráadásul azonosításuk is sok nehézségbe ütközik, hiszen nincs olyan sejtfelszíni vagy sejten belüli marker, amely az összes felnőtt őssejtre jellemző lenne. Kevés és nem szomatikus őssejt az, ami morfológiailag megkülönböztethető a környezetétől (1). Egy-egy szöveti őssejtnek Őssejt nagyon sokféle döntést kell hoznia a szervezetben. Az első és Differenciálódás legfontosabb, hogy életben Programozott sejthalál maradjon-e (szükség van-e rá) vagy (apoptózis) elpusztuljon? Ha életben marad, Elvándorlás (migráció) milyen életutat válasszon? Osztódás Önfenntartás Transzdifferenciálódás? vagy differenciálódás, helyben maradás vagy elvándorlás? 1. ábra. Amit egy szöveti őssejtnek tudni kell Mi legyen az osztódás során keletkező leánysejtek sorsa? Továbblépjenek-e a fejlődésben (differenciálódás), vagy őrizzék meg a "fiatalságukat" (önfenntartás)? Ezeket a döntéseket az őssejtek hozzák, de mindenképpen meg kell felelniük az adott szövet és az egész szervezet igényeinek - biztosítaniuk kell a homeosztázis fenntartását (1. ábra) (2). 6
Ez az igény - legalábbis mennyiségileg - nagyon eltérő feladatokat ró az egyes szöveti őssejtpopulációkra. A folyamatosan megújuló szövetek, például a vér fiziológiás működése naponta néhányszor 10 11 új vörösvérsejtet és granulocitát igényel. Ráadásul a vérképző őssejteknek a szervezetet érő stresszhelyzetekre - fertőzés, sérülés, tartós oxigénhiány stb. - is rugalmasan kell reagálniuk, növelve (vagy néha csökkentve) az érett vérsejtek számát a keringésben. Aligha véletlen, hogy őssejtátültetés után éppen a vérképző rendszer regenerálódik a leggyorsabban és a legteljesebb mértékben a recipiens(ek) szervezetében. (3) Ugyanakkor - és ez a másik véglet - az ún. állandósult szövetekben, például a központi idegrendszerben található idegi őssejtek fiziológiás körülmények között szinte észrevehetetlenek. Felnőtt korban új idegsejtek csak kis számban, és valószínűleg csak az agy bizonyos területein (például: hippocampus, bulbus olfactorius) keletkeznek. A sérült vagy pusztuló idegsejtek pótlására általában nem, vagy legfeljebb minimális mértékben képesek (4,5). Őssejt glosszárium Őssejtnek nevezünk minden olyan klonogén sejtet, amely önnfentartásra és egy vagy több differenciálódott sejttípus, illetve sejtfejlődési sor létrehozására képes. Az őssejtek legalábbis populációs szinten változatlan formában történő fenntartását és egyidejű differenciálódását asszimetrikus sejtosztódás(ok) biztosítják. A megtermékenyített petesejt, a zigóta első leánysejtjei totipotens őssejtek, belőlük intra- és extraembrionális szövetek (embriótest és embrionális burkok) egyaránt kialakulhatnak. A beágyazódás előtti blastocysta belső sejtcsomójából (embrioblast) izolálható embrionális őssejtek pluripotensek, az embrió minden szövete és szerve kifejlődhet belőlük, de extraembrionális szövetek létrehozására már nem képesek. Ilyen a legtöbb un. ES (embryonic stem = embrionális ős) sejt, illetve sejtvonal. A multipotens szöveti őssejtek egy-egy szövetet, esetleg szervet alkotó különböző típusú sejtekké képesek differenciálódni. A hemopoetikus őssejtekből például legalább hétféle érett vérsejt, a neuronalis őssejtekből neuronok és gliasejtek, az izom (myogen) őssejtekből izomrostok keletkeznek. A progenitor/elkötelezett elődsejt, blasztsejt, tranziens-sejt(populáció) kifejezések azonos, vagy legalábbis közel azonos jelentésűek és általában szinonimákként meglehetősen következetlenül - használják őket. Az őssejtekből differenciálódott, valamely sejtfejlődési sor irányába elkötelezett, korlátozott önfenntartóképességű, de megfelelő induktorok jelenlétében gyorsan osztódó és differenciálódó (érő) sejteket nevezzük így. 7
1.2 Az őssejt plaszticitás lehetséges mechanizmusai Amikor a szöveti őssejtek plaszticitását emlegetjük tulajdonképpen két dologra gondolhatunk. Néhányan ortodox plaszticitásnak nevezik azt a folyamatot, amikor egy szöveti őssejtből az adott szövetnek megfelelő, különböző sejtfejlődési sorokba tartozó érett sejtek a hemopoetikus őssejtekből különböző vérsejtek, a neuronalis őssejtekből oligodendrocyták, astrocyták és neuronok keletkeznek. A plaszticitás másik nem ortodoxnak nevezett formája, amelynek során a hemopoetikus őssejtekből epithelsejtek és hepatocyták, a csontvelői stroma őssejtekből neuronok és gliasejtek, stb. keletkeznek (6,7) (2.ábra). Haránt csíkolt izom (szívizom) Vázizomzat Myogen őssejt Máj Csirke vagy egér embrió Mindhárom csíralemez Érett vérsejtek Stroma, csont, porc, inak, simaizom Haematopoeticus őssejtek? Stroma (mesenchymalis) őssejtek) Neuronalis őssejtek Csontvelő Központi idegrendszer 2. ábra. Néhány szöveti őssejt plaszticitása. A fehér nyilak az ortodox, a vastag szürke nyilak a nem ortodox plaszticitást mutatják. A csontvelőben található két (hemopoetikus és stroma) őssejtpopuláció viszonya kérdéses. A további részletes magyarázatot lásd a szövegben. Idegszövet (neuronok és gliasejtek) 8
A szöveti őssejtek nem ortodox plaszticitásának mechanizmusát nem ismerjük. Az ilyen típusú plaszticitás létezésére utaló adatok jórészt in vivo állatkísérletekből és csontvelő transzplantált betegek vizsgálatából származnak. Elsősorban myeloablatív vagy myeloszuppresszív kezelés (besugárzás és/vagy kemoterápia) után csontvelői sejtekkel oltott egerekben, patkányokban és betegekben jelennek meg donor eredetű hepatocyták, gliasejtek és neuronok (8,9,10). In vitro kultúrában csak kevés nem ortodox őssejt-átalakulást sikerült megfigyelni. Így a folyamat mechanizmusát illetően is csak találgatásokra vagyunk utalva. Modelleket tudunk alkotni, amelyek többékevésbé megfelelnek a rendelkezésünkre álló adatoknak, de természetesen egyik ilyen modell sem tökéletes vagy kizárólagos (3.ábra). A, B, C, Pluripotens őssejt Pluripotens őssejt A szövet B szövet Dedifferenciálódás Redifferenciálódás A szövet B szövet A szöveti őssejt B szöveti őssejt A szöveti őssejt B szöveti őssejt 3. ábra. Az őssejt plaszticitás lehetséges mechanizmusai A, Minden szövetben, így a csontvelőben és az izomban is van egy kis, az embrionális fejlődés korai szakaszából származó őssejt populáció, amely pluripotens sejtekből áll. B, A szöveti őssejtek, ha mikrokörnyezetük megváltozik, képesek dedifferenciálódni, majd az új niche-nek megfelelő irányba redifferenciálódni. C, Egy szöveti őssejtek a külső feltételek megváltozása esetén közvetlenül transzdifferenciáció révén képes más típusú szöveti sejtté alakulni. 9
A modell: egy egységes őssejt-elmélet: Lehetséges, hogy minden szövetünkben vannak olyan rendkívül fiatal, a csíralemezek kialakulása előtti állapotban szunnyadó vagy inkább lassan osztódó pluripotens őssejtek, amelyek az őket körülvevő mikrokörnyezettől függően még bármilyen irányba képesek differenciálódni (3.A ábra). Hemopoetikus, myogen vagy neuronalis őssejtek helyett tehát inkább a vérképzőrendszerben, az izomzatban, a központi idegrendszerben és más szövetekben található őssejt kompartmentekről beszélhetünk, amelyek pluripotens sejteket is tartalmaznak (11). Ez a modell elsősorban azért vonzó, mert rendkívül egyszerű. Az is kétségtelen, hogy vannak a szervezetünkben olyan igaz nem szomatikus őssejtek, amelyeknek az eredete és fejlődése egyaránt független a három csíralemeztől, ilyenek a primordiális csírasejtek. B modell: dedifferenciálódás és redifferenciáció: Jóval merészebbnek tűnik ez, a szöveti őssejtek de- és redifferenciálódásán alapuló modell (3.B ábra). Főként azért, mert a differenciálódási folyamat(ok) visszafordíthatatlansága sokáig a fejlődéstan egyik alaptörvényének számított. Dolly és a többi klónozott állat megszületése óta erről már nincs szó (12). A dedifferenciálódás in vivo nem ismeretlen jelenség. A vázizmok fejlődését a MyoD családba tartozó, bhlh típusú transzkripciós faktorok, az ún. myogen szabályozó fehérjék irányítják. A myogen őssejtek a Myf5 és a MyoD expressziójával válnak gyorsan osztódó myoblasztokká. Van azonban egy gén, a homeodomén tartalmú fehérjét kódoló Msx1, amely legalábbis a regeneráció kutatóinak többsége szerint képes megállítani, sőt visszafordítani a myogenezist (13). Azt jól tudjuk, hogy a halak és kétéltűek egy része képes pótolni elvesztett végtagjait (úszót, lábat). (Emberben ez a regenerációs képesség az utolsó ujjpercekre korlátozódik és azokra is csak nagyon fiatal 1-2 éves - korig). Feltételezik, hogy a csonkulás helyén a hámsejtek nagy mennyiségű FGF-et (fibroblaszt növekedési faktor) termelnek, az FGF a környező izomrostokban Msx1 expressziót indukál, és a rostok dedifferenciálódnak. (A gerincesek többségében ez a jeltovábbító út nem, vagy csak nagyon fiatal korban működik). Ezekből a rostokból blasztéma keletkezik - olyan plasztikus sejtek (őssejtek?) halmaza amiből hamarosan kifejlődik az új végtag: csontok, erek, izmok, idegek keletkeznek (14). 10
C modell: transzdifferenciálódás: A transzdifferenciálódás és a szöveti őssejtek plaszticitása egyaránt a sejtek elkötelezettségének megváltozására visszavezethető jelenség, egyik sem jár átmeneti (két különböző sejtfejlődési sorra jellemző markereket egyidejűleg hordozó) sejtalakok megjelenésével. A transzdifferenciálódás nem ismeretlen jelenség a pathológusok számára. Vesefibrózis során például a vesetubulusok hámsejtjei myofibroblasztokká alakulnak (epithelialis mesenchymalis transzdifferenciálódás), és így a vese működésképtelenné válik. Más szervek a tüdő, a máj fibrózisának is hasonló a mechanizmusa (15). Lehetséges tehát, hogy a szöveti őssejtek nem ortodox plaszticitása a sejtek megváltozott környezeti feltételek hatására bekövetkező transzdifferenciálódásával magyarázható. Csak a következő években fog kiderülni, hogy a fenti három modell mely elemei helytállóak, azaz pontosan mi az őssejtek nem ortodox plaszticitásának a magyarázata. Meg kell említenünk, hogy megjelentek olyan közlemények is, melyek kétségbe vonják az őssejt plaszticitás eddig ismertetett lehetséges módjait, és a jelenséget a szöveti őssejtek - embrionális őssejtek fúziójával magyarázzák (16,17). A fúziós elmélet ellen szól, hogy kromoszóma vizsgálatokkal bizonyították, hogy az új környezetbe került őssejtek differenciációjuk során megőrizték diploid genetikai állományukat. Ezen kívül az is régóta ismert tény, hogy egyes szöveti őssejtek képesek transzdifferenciációra in vitro. Például a csontvelői mesenchymális őssejtek megfelelő kultúrakörülmények között képesek izomsejtek, porcsejtek, csontállomány létrehozására sejtfúzió és embrionális őssejtek jelenléte nélkül, tehát pusztán a környezeti hatások révén. 1.3 A vérképző őssejtek Az elmúlt években jelentős mértékben megváltozott a hemopoetikus őssejtek biológiai sajátosságairól alkotott képünk (18,19). Bebizonyosodott, hogy az első klasszikus értelembe vett - hemopoetikus őssejtek nem a szikzacskóban, hanem az embrió testében keletkeznek. Az emlősök ontogenezise során számos szerv, illetve szövet rendelkezik rövidebb-hosszabb ideig vérképző aktivitással. Közülük legfontosabbak: a szikzacskó, a paraaorticus splanchnopleura (PAS), az aorta-gonadmesonephros (AGM) régió (azon belül is feltételezhetően az aorta fala rendelkezik vérképző aktivitással), a máj, a lép és a thymus (20). Az embrionális vérképzés 11
tulajdonképpen az embrió testén kívül, a szikzacskó falában történik, de az itt elhelyezkedő sejteket nem tartják igazi vérképző őssejteknek (21,22). Ennek oka az, hogy az ún. embrionális vérképző sejtek folyamatosan osztódnak ugyan, de differenciációs képességük erősen korlátozott. Főként primitív erythrocytákat és makrofágokat hoznak létre in vivo. Végül a foetalis élet kezdetén programozott sejthalállal elpusztulnak (23). A szikzacskóban folyó primitív hemopoesissel párhuzamosan a PAS/AGM régiókban jelennek meg az első, - szupraletálisan besugárzott állatokban teljes vérképző rendszerének helyreállítására képes - valódi hemopoetikus őssejtek. Az ontogenezis során ezek az őssejtek telepítik be a foetalis és felnőttkori vérképző szöveteket és szerveket. Az őssejtkészletnek a foetalis májban, majd a csontvelőben megfigyelhető közel exponenciális növekedése az AGM régióból e két szervbe bevándorló őssejtek gyors osztódásának és nem új hemopoetikus őssejtek in situ keletkezésének az eredménye. A felnőttkori őssejtkészlet tehát valójában az AGM régióból származó néhány tucat, talán száz (a pontos sejtszámot jelenleg még becsülni sem tudjuk) hemopoetikus őssejt utódaiból, ún. leánysejtjeiből áll (24,25). Egy több évtizedes elképzelés szerint a szervezetben található őssejteknek alig néhány százaléka vesz részt a felnőttkori fiziológiás vérképzésben. Valójában az őssejt-készlet egyetlen tagja sincs teljes nyugalomban. Több munkacsoport igazolta, hogy körülbelül 30 nap alatt minden hemopoetikus őssejt jelölhető bróm-dezoxiuridinnal (BrdU) in vivo, azaz legalább egyszer áthalad a sejtciklus S fázisán. Tehát viszonylag hosszú ciklusidővel ugyan, de minden hemopoetikus őssejt folyamatosan osztódik fiziológiás körülmények között (26,27). Általánosan elfogadott, hogy a nem immortalizált eukaryota sejtek osztódása egyben öregedésüket is jelenti. A mitózisról mitózisra történő telomera-rövidülés addig folytatódik, amíg el nem ér egy kritikus értéket. A telomera hossza az egyik legfontosabb mitotikus óra a sejtek számára. A telomeráz enzim képes megnyújtani a kromoszómák végét, ezáltal lassítani, illetve immortalizált sejtekben megállítani e mitotikus óra ketyegését (28,29). A hemopoetikus őssejtek rendkívüli önfenntartó és proliferációs képessége - többek között - ennek az enzimnek az aktivitására vezethető vissza. A foetalis májból származó őssejtekben még igen magas, az érett felnőttkori csontvelőből izolált sejtekben viszont már meglehetősen alacsony a telomeráz aktivitás. Ezzel párhuzamosan csökken a hemopoetikus őssejtek kromoszómáinak végén található telomerák hossza (30,31,32). Közben az őssejtek funkcionálisan is öregednek. Egy 12
adott csontvelőt általában legfeljebb háromszor lehet sorozatosan transzplantálni. A harmadik átültetés után az őssejtek elvesztik önnfentartó és ezzel együtt repopulációs képességüket is (33). A hemopoetikus - tartós csontvelői repopulációt biztosító (LTRC = long-term repopulating cells) -őssejtek sokféleségével kapcsolatban bevezettek egy új fogalmat: az őssejt-minőséget. A jelenlegi legelfogadottabb elmélet szerint a vérképző őssejtek öregedése a nagy önfenntartó képességű őssejtek minőségének az életkor előrehaladtával bekövetkező folyamatos romlására vezethető vissza (4. ábra). A jó minőségű őssejtek potenciálisan még nagyszámú osztódásra képesek, a gyengébb minőségű őssejteknek viszont már kiterjedtebb a telomera veszteségük, mitotikus órájuk lejáróban van. Az öregedéssel együtt járó folyamatnak tekinthető, hogy a jó minőségű őssejtek elfogynak és ettől kezdve - megfelelő utánpótlás hiányában a gyengébb minőségű őssejtkészlet is kimerül. Egyre több őssejt kerül át a kizárólag átmeneti, rövid ideig tartó hemopoesist biztosító kompartmentbe (STRC = short-term repopulating cells), és hamarosan bekövetkezik a csontvelő halála. A hemopoetikus őssejtek minősége tehát az egyed biológiai korának egyik fontos meghatározója (34,35). Jó Minőségű őssejtek Foetalis máj 95% Fiatal csontvelő Idős csontvelő 50 / 1500 10/5000 Csontvelőhalál 0 Gyengébb Minőségű őssejtek 5% 1450 / 1500 4990 / 5000 csökkenés Jól osztódó progenitorok Közepesen osztódó progenitorok Rosszul osztódó progenitorok Csökkenő sejtkiáramlás 4. ábra. A tartós csontvelő repopulációra képes őssejt kompartment öregedése Ha a foetális májban található, tartós repopulációra képes sejtek összességét 100%-nak tekintjük, ebből mintegy 95% a jó és 5% a gyengébb minőségű őssejt. A fiatal felnőtt csontvelőben körülbelül tizenötször, az időskoriban pedig, ötvenszer akkora az LTRC kompartment, mint a foetalis májban. E növekvő kompartment azonban egyre kevesebb jó minőségű őssejtet tartalmaz. Végül a jó minőségű őssejtek elfogynak és ettől kezdve megfelelő utánpótlás hiányában a gyengébb minőségű őssejtkészlet is rohamosan fogyni kezd. Az őssejtek átkerülnek a kizárólag átmeneti, STRC kompartmentbe, és hamarosan bekövetkezik a csontvelő halál. 13
Természetesen minden a vérképző rendszert károsító hatás vagy beavatkozás mérgezés, sugárártalom, kemo- és radioterápia, őssejt transzplantáció stb. gyorsítja az öregedési folyamatokat. Más szóval krízishelyzetben a hemopoetikus őssejtek ún. akcelerált öregedése figyelhető meg. Az őssejt-állomány minőségének romlása azonban fiziológiás körülmények között is nyilvánvaló. Jól ismert például, hogy időskorban csökken a szervezet védekező képessége és a vérképzést érintő daganatok gyakoriságának növekedése, ami ugyancsak az őssejtek öregedésével függhet össze (36). 1.3.1 A vérképző őssejtek felszíni markerei A hemopoetikus őssejtek morfológiailag viszonylag kisméretű blastsejtek, amelyekben kevés mitochondrium van, sejtmagjukban több nucleolus található. A csontvelőben igen sok hasonló sejt van, amelyek közül legfeljebb minden százezredik lehet őssejt. Olyan sejtfelszíni markert, mely kizárólag a hemopoetikus őssejtek felszínén expresszálódik, nem ismerünk. Az emberi csontvelőben található vérképző őssejtek például jórészt CD34 ++ (pozitív), c-kit ++, IL-6 receptor ++, Thy-1 +, CD45RA +, Flt3 +, DR - (negatív) fenotípusúak. Hozzá kell tennünk, hogy a csontvelői sejtek 1-3 százaléka, szinte minden elkötelezett elődsejt, valamint a kiserek endothelsejtjei is CD34-pozitívak (37). Magának a CD34-nek azonban, ami adhéziós molekula, nincs meghatározó szerepe a hemopoesisben. Az egerek vérképző őssejtjei CD34 gyengén pozitívak vagy negatívak (38), a CD34 hiányos egerek egészségesek, vérképzésükben csak minimális zavarok észlelhetők (39,40). 1.3.2 A vérképző őssejtek mikrokörnyezete Kérdés, hogyan képes egy őssejt legalábbis a populáció szintjén megőrizni önfenntartó képességét? A válasz, amit csak részben ismerünk, az őssejtek mikrokörnyezetében keresendő. Az őssejt niche koncepciója közel 30 évvel ezelőtt a hematológiában alakult ki. Lényege, hogy a hemopoetikus őssejtek és az őket körülvevő csontvelői stroma sejtek, valamint az extracelluláris mátrix egy funkcionális egységet alkotnak (3. ábra)(41). A csontvelői stroma egy fibroblasztszerű sejtekből, adipocytákból, endothelsejtekből, simaizomsejtekből, makrofágokból, illetve ezek termelte extracellularis mátrixból álló hálózat. Ez a speciális 14
mikrokörnyezet alkalmas a csontvelői őssejtek fenntartására és így a vérképzés élethosszig tartó biztosítására (42) (5. ábra). Stroma (réskapcsolatok) Túlélés (SCF és más cytokinek) Önfenntartás (Notch) Hemopoetikus őssejt Migráció (SDF-1) Extracelluláris matrix VEGF termelés Adherencia (integrinek és más EM fehérjék) Osztódás (szolubilis és kötött cytokinek, Notch) Differenciálódás (szolubilis és kötött cytokinek, Notch) 5.ábra. A hemopoetikus őssejt niche Az őssejteket különböző stroma sejtek, fejlődő vérsejtek, valamint gazdag sejtközötti állomány, extracelluláris mátrix veszi körül. A stroma sejtek részben közvetlen sejt-sejt kölcsönhatások, részben az általuk termelt szolubilis és/vagy az extracelluláris mátrixhoz kötött cytokinek, kemokinek és morfogének segítségével befolyásolják (vagy inkább irányítják?) az őssejtek sorsát. (VEGF = ér-endothel növekedési factor) Az őssejt ebből a niche-ből kiemelve rövid idő alatt elveszíti önfenntartó képességét, és besugárzott recipiensbe oltva nem képes annak vérképzőrendszerét repopulálni (43). Az őssejt-lét szempontjából kulcsfontosságú a niche-ben termelődő őssejt faktor (SCF = stem cell factor), amely az őssejtek c-kit receptoraihoz (egy tirozin-proteinkináz receptor) kötődik (44). Az SCF-nek és receptorának - a c-kit-nek - a felfedezése óta szinte megszámlálhatatlan cytokinnek írták le az őssejtek életére, illetve a hemopoesisre gyakorolt hatását. Ezek mind szolubilis fehérjék vagy glikoproteinek, de gyakran kötődnek az extracelluláris mátrixban található proteoglikánokhoz (kondroitin-szulfát, heparán-szulfát, stb), vagy a bazális membrán lamininjéhez. Az így felfűzött cytokinek multivalens ligandumot képeznek, és 15
keresztkötéseket hoznak létre az őssejtek megfelelő receptorai között, ami jócskán felerősíti a hatásukat (45). Az extracelluláris mátrixot alkotó molekuláknak azonban nem csak ez a funkciójuk. Maguk is ligandumai számos sejtadhéziós molekulának, melyek nagy számban fordulnak elő az őssejtek felszínén. A legfontosabbak közülük az integrinek. Funkciójuk nem korlátozódik az őssejtek helyhez kötésére, jelzéseket is eljuttatnak a sejtek belsejébe, amelyek számos különböző például cytokin receptorokat kódoló gén expresszióját befolyásolhatják (46). 1.4 A vérképzés molekuláris szabályozása: a döntéshozó molekulák A hemopoetikus őssejtek és a különböző vérsejtfejlődési sorok irányába differenciálódott elődsejtek minden osztódása döntés is egyben. Döntés arról, hogy mi legyen az osztódás során keletkezett leánysejtek sorsa. Tovább lépjenek-e a fejlődésben (differenciálódás), vagy őrizzék meg a fiatalságukat (önfenntartás)? A döntések molekuláris szinten születnek meg egy a cytokinek és kemokinek tengerében úszó, ráadásul speciális szöveti környezetbe (foetalis máj, csontvelő, thymus stb.) ágyazott sejtben (47,48). A Notch egy filogenetikailag ősi sejtmembrán receptor-ligandum rendszer, ami szükséges minden soksejtű szervezet fejlődéséhez, differenciálódásához. A csontvelői őssejtek felszínén egyaránt előfordulnak Notch receptorok és ligandumok, a stroma sejtek csak a ligandumokat expresszálják. A Notch receptornak döntő szerepe van a stroma - őssejt interakciókban: a csontvelői őssejtek önmegújító osztódásai és a differenciálódás közti egyensúly fenntartásában. A Notch szignál az őssejtek érését gátolja, elősegíti azok önfenntartó osztódásait, ezzel az őssejt-kompartment bővülését, a fiatal alakok felszaporodását. 1.4.1 A Notch hatásmechanizmusa: gátlás és indukció. A Notch jelátvitel hatásmechanizmusát két leegyszerűsített modell alapján mutatjuk be. (49,50) Az egyik folyamat a Notch jel generálta laterális gátlás (6.A, ábra). Ez akkor lép fel, amikor azonos mennyiségű Notch receptort és ligandot hordozó sejtek csoportjából, amelyek ily módon azonos fejlődési potenciállal rendelkeznek, az idő előrehaladtával különböző sejtalakok jönnek létre. Ha lokálisan felborul a Notch receptor-ligand arány két szomszédos sejt felszínén, akkor sorozatos visszacsatolások révén ez az átmeneti arányeltolódás felerősödik. A folyamat eredményeként az egyik sejtben a ligand, a másik sejtben, pedig a receptor 16
kifejeződése gátlódik. Az eredetileg azonos fenotípusú sejtek csoportjában tehát létrejönnek olyan kizárólag Notch ligandumot hordozó sejtek, amelyek jeladókká válnak és elköteleződnek egy adott sejtfejlődési sor irányába, míg a körülöttük lévő Notch receptort hordozó - sejtek differenciációja gátlódik. A, Laterális gátlás Kölcsönös differenciáció gátlás Oldal irányú differenciáció gátlás B, Indukció Differenciációs jelzés 6.ábra: A Notch rendszer hatásmechanizmusa A, Laterális gátlás. A Notch receptorok és ligandumaik egyenlő mennyiségben oszlanak el az azonos fejlődési potenciállal rendelkező sejtek felszínén. Minden sejt azonos mennyiségű Notch jelet küld és fogad egyszerre, így kölcsönösen gátolják egymás differenciációját. Ha a receptor-ligand egyensúly felborul, akkor bizonyos sejtek (fekete) elköteleződnek egy sejtfejlődési sor irányába és a körülöttük lévő sejteknek több ligandumot mutatnak be, mint receptort, így gátolja a környező sejteket (szürke), hogy elköteleződjenek adott differenciációs út felé. B, Indukció. Az induktív Notch jelzés a modell szerint nem ekvivalens sejtek között alakul ki. Ebben az esetben a (szürke) Notch ligandumot kifejező sejtek a környező (fehér) sejtekben új sejtfejlődési út(ak) választását indukálják. 17
A másik, a Notch rendszer működésén alapuló folyamatot indukciónak nevezzük. (6.B, ábra) Ebben az esetben két olyan sejt kerül kapcsolatba, amelyek közül az egyik túlnyomórészt Notch receptorokat hordoz a felszínén, a másik sejt pedig ligandumokat. Így a Notch jelet fogó sejt tartósan megőrzi fiatalságát, sorsa több sejtfejlődési sor irányába is folyamatosan nyitott marad. Ez a mechanizmus teszi lehetővé például, a megfelelő minőségű hemopoetikus őssejt készlet fenntartását egész életünkön keresztül (51,52). 1.4.2. A Notch jelátvitel folyamata A Notch receptor jelátviteli útja a sejtben egyfelől egyszerűnek tekinthető, mivel nem másodlagos hírvivő molekulák vesznek részt benne, hanem a ligandum kötés után a receptor intracelluláris része közvetlenül a sejtmagba jut. Másfelől viszont számtalan - eddig még teljes egészében fel nem térképezett - szabályozó molekula teszi végtelenül komplexszé a jeltovábbítás minden szintjét. A Notch receptor egy transzmembrán doménnel rendelkező, ~300-kD-os sejtfelszíni molekula. Extracelluláris része (EC) 29-36 egymást követő epidermális növekedési faktor (EGF) domént tartalmaz, amelyek a ligandum kötését teszik lehetővé és három LIN12/Notch ismétlődést, amelyek valószínűleg a szabad receptor stabilizálásához szükségesek. A Notch receptor intracelluláris része (IC) szükséges a jeltovábbításhoz, nukleáris lokalizációs szignált tartalmaz a sejtmagba jutáshoz, RAM és cdc10/ankyrin ismétlődéseket fehérje-fehérje kölcsönhatások közvetítéséhez, a C- terminálison pedig PEST domént, ami a Notch lebontásához szükséges. Az emlősökben kimutatott négy Notch receptor (Notch 1-4) az EGF domének számában különbözik egymástól, ezen kívül a Notch1 és 2 receptor IC részén transzkripció aktivációs domén (TAD) is található. A Notch4 kivételével notch cytokin response (NCR) elemet is tartalmaznak (7. ábra). Emlősökben mint már említettük - legalább 5 ligandum létezik: Jagged-1, 2 és Delta-1, 3, 4 elnevezésűek. Miként a Notch receptor, a ligand is transzmembrán molekula. A ligand EC részén EGF ismétlődések és egy egyedi cystein-gazdag (Delta, Serrate, Lag2) domén található, emiatt a speciális domén miatt a Notch ligandumokat DSL fehérjéknek is nevezzük. IC részük rövid, nem konzerválódott szakasz, de nélkülözhetetlen a jeltovábbításhoz. Kiesése a Notch jelátvitel megszakadásához vezet. 18
EXTRACELLULÁRIS DOMÉNEK INTRACELLULÁRIS DOMÉNEK RECEPTOROK: EGF-ismétlődés Notch 1 LNR RAM Ankyrin NCR TAD PEST Notch 2 Notch 3 Notch 4 LIGANDUMOK: Delta 1 Delta 3 Delta 4 Jagged 1 Jagged 2 DSL 7.ábra: A Notch receptorok és ligandumaik felépítése A négy emlős Notch receptor heterodimérként kerül a sejt felszínre. Mindegyik Notch receptor tartalmaz különböző számban (29-36) EGF (Epidermal Growth Factor) ismétlődést, a membránhoz közel LNR (Lin12 Notch Repeats) részt, a sejtmagba jutáshoz RAM doméneket és Ankyrin ismétlődéseket, a C-terminálison pedig PEST szekvenciát. A Notch 1-3 tartalmaznak még NCR (Notch Cytokine Response) domént, a Notch 1-2 receptorokban ezen kívül még TAD (Transcriptional Activation Domen) is található. A három Jagged és két Delta ligandumok egyszerűbb felépítésűek, speciális részük a DSL (Delta, Serrate, Lag2) domén. A Notch receptor molekula egy polipeptid láncként szintetizálódik majd az úgynevezett poszt-golgi kompartmentben a furin nevű proteáz hasítja (S1), és így egy heterodimer fehérje jön létre, amelyet Ca 2+ koordinálta diszulfid-kötés tart össze. A Notch receptor csak ilyen formában kerülhet a sejt felszínére, mint funkcióképes jelfogó. Ha a ligand a receptorhoz kapcsolódik még két hasítás történik, amit szabályozott intramembrán proteolízisnek nevezünk (53,54,55). A RIP mechanizmusát nemrégiben fedezték fel, lényege, hogy az aktivált molekula jeltovábbító része egy membránhoz közeli és egy intramembrán hasítás (S2 és S3) eredményeként eltávolodhasson a sejtmembrántól. Ligand kötéskor a Notch receptor olyan változáson megy keresztül, melynek következtében megtörténhet a második hasítás, amit az ADAM metalloproteázok végeznek el, név szerint a Disintegrin- 19
metalloproteáz tumor necrosis factor α-konvertáló enzimje (TACE) és a Kuzbanian metalloproteáz (56,57,58). Ez az S2-hasítás közvetlenül a Notch membránhoz közeli extracelluláris részén történik. Így a NotchEC domének a ligandhoz kötődnek és a ligandot bemutató sejt ezt az egész komplexet endocitózissal bekebelezi (59,60,61). Még nem tisztázott, hogy a ligand kötés önmagában okozza-e az S2 hasításhoz vezető konformáció változást, vagy az endocitózis húzóereje teszi lehetővé az S2 hely feltárulását (8. ábra). Endocitózis Jeladó sejt Notch ligand Jelfogó sejt Notch receptor S1 S2 ADAM/ TACE Furin (transz-golgi) Sejtmag S3 γ-szekretáz (Presenilin) Szabad IC Domén 8.ábra: A Notch jeltovábbítás modellje A Notch receptort szintézise során a furin proteáz hasítja a transz-golgi hálózatban (S1), így a receptor dimerként kerül a jelfogó sejt felszínére. Ha a jeladó sejt felszínén lévő Notch ligandum (Jagged vagy Delta) kapcsolódik a receptorhoz, akkor újabb proteolítikus lépések következnek. Az ADAM metalloproteáz hasítja a Notch receptort a membránhoz közeli EC részen (S2). Így a NotchEC domének a ligandhoz kötődnek, és a jeladó sejt ezt az egész komplexet endocitózissal bekebelezi. A Notch receptoron feltárul a Presenilin γ-szekretázok hasítási helye és az S3 hasítás után a Notch receptor IC része elválik a sejtmembrántól, a nukleáris lokalizációs szignál segítségével pedig a sejtmagba jut. A jelátadáshoz egy további S3 hasítás szükséges a Notch receptor sejtmembránon belül lévő részén. Ezt a hasítást γ-szekretázok katalizálják, mégpedig 20
a Presenilin/nicastrin komplex. Így a Notch receptor IC része elválik a sejtmembrántól és a nukleáris lokalizációs szignál segítségével a sejtmagba jut (62). A nucleusban a levált IC rész RAM és Ankiryn doménjén keresztül kapcsolatba lép a CSL transzkripciós faktorral. (A CSL név a nagyfokú homológiát mutató CBF1/RBP-Jκ (emlős), a Suppressor of Hairless (Drosophila) és a LAG-1 (C. elegans) transzkripciós faktorok nevének kezdőbetűiből tevődik össze) A CSL transzkripciós faktor alapállapotban egy korepresszor komplex részeként a DNS-hez van kötve, így gátolja bizonyos gének átírását. Ezen géneket HES géneknek nevezik (a Drosophila Hairy and Enhancer of Split után), amelyek ugyancsak transzkripciós faktorokat kódolnak (63). A sejtmagba bejutó, a CSL-hez kapcsolódó Notch IC rész a represszor fehérjék helyére lép a komplexben, így az koaktivátor komplexé alakul és megkezdődik a HES gének átírása mrns-re. Emlősökben a HES géncsaládnak nyolc tagja van, ezek közül a HES1 és a HES5 áll Notch szabályozás alatt. A HES gének termékei számos, különböző differenciálódási út során nélkülözhetetlen sejtfejlődési sor-specifikus gén átírását gátolják. A HES1 transzkripciós faktorról például igazolták, hogy a MyoD myogenezist szabályozó fehérje és a MASH1 neurogenezist szabályozó fehérje expresszióját gátolja. A Notch jelzés során tehát lényegében a HES génekről átíródó transzkripciós faktorok fejtik ki hatásukat, gátolva bizonyos differenciációs utakat. 1.4.3. A Notch jelátvitelt befolyásoló molekulák A Notch jelátvitelt extracelluláris, citoplazmatikus és sejtmagi szabályozó fehérjék befolyásolják. A Notch receptor ligandkötő képessége például nagymértékben függ a receptor extracelluláris részén lévő EGF domének cukor oldalláncainak mennyiségétől és típusától (64). A Fringe elnevezésű glikozil-transzferáz extra fukóz oldalláncokat köthet a Notch molekulák EGF motívumaira (65,66). Ezáltal a Notch receptor feltehetően inkább a Delta ligandumokat képes kötni, a Jagged ligandumokat kevésbé (67,68). Feltevések szerint a Neuralized fehérje viszont csökkenti a Delta ligandumok kötődési lehetőségét a Jaggeddel szemben, mivel a lebontást katalizáló ubiquitin ligázokat a Delta fehérjékhez irányítja, ezzel csökkentve féléletidejüket és jelenlétüket a sejtfelszínen (9. ábra). A citoplazmában jelen lévő moduláló fehérjék a Numb és a Deltex (69). A Numb egy membránhoz kötött fehérje, amely a Notch 21
Notch receptor oldalláncokkal Szabad Notch IC Domén Numb Sejtfelszín Fringe Citoplazma Korepr. Deltex CSL CSL RNS pol. Koakt. HES Sejtmag 9.ábra: A Notch jelátvitelt befolyásoló molekulák A Notch receptor szintézise során az EGF-ismétlődésekre a Fringe (fukóz specifikus β-1,3-nacetilglükózamin-transzferáz) cukor oldalláncokat rak, ezzel a Jagged típusú ligandumokhoz csökkenti, míg a Delta típusú ligandumokhoz potenciálisan növeli a receptor affinitását. A Numb fehérje a Notch IC részéhez kapcsolódva gátolja annak működését. A Deltex gátolja a HES gének átírásához szükséges nukleáris komplex létrejöttét, így a Notch jelet is. A sejtmagba jutva a Notch IC rész koaktivátor komplexet hoz létre a CSL transzkripciós faktorral és a HES gének átírásához lehetővé teszi az RNS polimeráz bekötését. receptor IC részéhez képes kötődni és blokkolni azt. A Numb fehérje az aszimmetrikus osztódás során keletkezett két leánysejten egyenlőtlenül oszlik el. Emiatt az egyik leánysejten (ahova kevesebb Numb szegregálódott) több működőképes Notch receptor lesz jelen, a másik leánysejtben viszont a Numb fehérje gátolja a Notch működését. A Deltex molekula szabályozó szerepe korántsem ilyen egyértelmű. A vizsgálatok Drosophila esetében azt mutatták, hogy a Deltex elősegítve a Notch IC rész bejutását a sejtmagba pozitívan szabályozza a Notch-jeltovábbítást. Ezzel szemben egér thymusban a Deltex molekula gátolta a HES gének átírásához szükséges nukleáris komplex létrejöttét, így a Notch jelet is (70). Mint már láttuk a sejtmagba jutva a Notch IC része koaktivátor komplexet hoz létre a CSL transzkripciós faktorral és lehetővé teszik a HES gének aktiválását. A 22
koaktivátor komplexnek számos elemét ismerjük, ezek közül most csak a Mastermind koaktivátor molekulát emeljük ki. A Mastermind nem köti közvetlenül a DNS-t, hanem a Notch IC részének ankiryn doménjéhez kapcsolódva, a sejtmagba kialakuló aktivátor komplexet stabilizálja (71). 1.4.4. Notch szabályozás a vérképző rendszerben Az emlős vérképzés hierarchikus modellje szerint a vér összes sejtes eleme a vérképző őssejtek leszármazottjának tekinthető és működésük teszi lehetővé a folyamatos vérképzést. Az őssejt aszimmetrikus osztódása során az egyik leánysejt elveszíti őssejt-tulajdonságát és differenciálódni kezd, ugyanakkor a másik leánysejt megőrzi fiatalságát, nem differenciálódik és így az őssejt állomány fenntartásához járul hozzá. Önfenntartó (szimmetrikus) osztódás után mindkét leánysejt az őssejtállományt gazdagítja (72). Az elmúlt néhány év eredményeinek tükrében ma már tudjuk, hogy a Notch rendszer kulcsszerepet tölt be a lympho-hemopoesis szabályozásában (73,74). Kiderült, hogy a Notch receptorok az őssejtek mellett előfordulnak a myeloid, erythroid és lymphoid elődsejteken, T- és B- lymphocytákon, monocytákon és granulocytákon (75,76). Ligandumaik (a DSL fehérjék) pedig minden a lympho-hemopoesisben fontos szerepet játszó szervben, illetve szövetben a foetális májban, csontvelőben, lépben és a thymusban megtalálhatók (77). A Notch ligandumok fontos elemei a vérképzést támogató mikrokörnyezet kialakításának, nagymértékben hozzájárulnak az őssejtek sorsának alakulásához. A csontvelőben a vérképző őssejtek fejlődési potenciálját befolyásoló mikrokörnyezetet az őssejt niche-t a stroma állomány elemei, a mátrix fehérjék, bizonyos növekedési faktorok és az adhéziós molekulák bonyolult komplexe alakítja ki. Úgy tűnik, hogy ebben az összetett rendszerben a Notch jelpályának irányító szerepe van. Ha a vérképző őssejt Notch receptorán keresztül elegendő jelet kap egyidőben más környezeti hatásokkal, akkor önfenntartó osztódással újabb őssejteket hoz létre. Azok az őssejtek viszont, amelyek a stroma sejtekkel való találkozáskor gyengébb Notch jelzést kapnak, osztódnak és differenciálódnak (78). A vérképző őssejt differenciációja során a következő döntés, hogy a myeloid vagy a lymphoid sejtfejlődési utat választja-e (10. ábra). Ezt a felszínükön található Notch1 és Notch2 receptorok aránya, valamint a környezetükben található cytokinek mennyisége és minősége együttesen határozza meg. A Notch2>Notch1 receptor arány 23
a myeloid, fordítottja a lymphoid irányú fejlődésnek kedvez (79). Biokémiai ismereteink szerint nagyon hasonló a Notch1 és Notch2 receptor. A biokémiai egyezésen túl a receptorok szöveti megoszlása is nagymértékben fedi egymást. Ennek ellenére jelentős különbséget kell feltételeznünk a két molekula között, annak ismeretében, hogy bármelyik receptor hiánya (KO) egérben letális, tehát nem helyettesítik egymást in vivo. Nem ismerjük teljesen a Notch jeltovábbító út és más szignalizációs útvonalak kapcsolódási pontjait, de bizonyított, hogy az un. kanonikus úton kívül - legalább három további jeltovábbító úttal áll kapcsolatba a Notch receptor által elindított jelzés. Tehát lehetséges, hogy a kétféle receptor által közvetített jel a sejten belüli különböző szignálutak ki vagy bekapcsolása révén másmás hatást indukálhat. A továbbiakban mind a myeloid, mind a lymphoid elődsejtek csoportjában hasonló törvényszerűségek érvényesülnek: az adott pillanatban kevesebb Notch receptort kifejező sejtek differenciálódnak tovább, míg a több Notch jelet kapó sejtek fenntartják az elkötelezett elődsejtek állományát. A lymphoid elődsejtnek, ha a differenciáció útjára lép, újabb döntést kell meghoznia: T-sejt vagy B-sejt irányba köteleződjön-e el? Úgy tűnik, hogy a Notch1 fehérje mennyisége és a jelzés mértéke meghatározó ennek a döntésnek a kimenetelében is. Ha újszülött egerekben kiütik (knock-out) a Notch1 gént, akkor ezek thymusát éretlen B-sejtek telepítik be, a T-sejt érés pedig leáll. A T-sejtté válás tehát egyértelműen Notch1 függő folyamat, Notch1 jelzés hiányában a lymphoid elődsejt inkább B-sejt irányba differenciálódik, függetlenül attól, hogy milyen mikrokörnyezetbe kerül (80). Ha a lymphoid elődsejt nem kap Notch1 jelzést, akkor a csontvelőben marad és éretlen B-sejtté alakul (81). De ha kilép a véráramba, és a thymus mikrokörnyezetében kap egy újabb erős Notch1 ingert, akkor éretlen T-sejtté differenciálódik (82). Ha ezek után csökken a Notch1 jelzés a T-sejt előalakban, akkor a T-sejt receptorához (TCR) szükséges génátrendeződések során γδ láncok kerülnek kiválasztásra és γδ TCR fog a sejtfelszínen megjelenni (83,84). De ha továbbra is magas szinten kapja Notch1 receptorán keresztül a thymocyta a jelzést, akkor αβ T- sejt receptort fog kifejezni a felszínén (85). Az αβ TCR+ sejteknek újabb két fejlődési út között kell választani: CD4+ (szabályozó) vagy CD8+ (ölő) T- sejtekké differenciálódjanak-e? A Notch1 receptorok fokozott jelenléte a CD8+ ölősejtek irányába tolja el a thymocyták fejlődését, életben maradásukhoz pedig a megfelelő MHC molekulákkal való kapcsolódás (pozitív szelekció) szükséges (86,87,88). 24
CSONTVELŐ THYMUS HSC Notch1 Notch2 MP Notch1 Notch2 LP Notch1 Notch1 Notch1 LP prot Notch1 Notch1 prob LÉP γδt Notch1 αβt Notch1 CD4 CD8 prob Bsejt Bsejt?Notch 10. ábra: Notch receptorok kifejeződése a lymphocyta fejlődés során A csontvelői mikrokörnyezetben az őssejtek osztódását és differenciálódását a jelen lévő citokinek és a strómasejtek felszínén található Notch ligandumok (első sorban Jagged-1) együttesen szabályozzák. Azok az őssejtek, amelyek a citokin jelzésekkel egy időben erőteljes Notch jelzést is kapnak csak osztódnak, de nem differenciálódnak, tehát az őssejtkompartment fenntartását biztosítják. Azok az őssejtek viszont, amelyek gyengébb Notch1 jelzést kapnak lymphoid irányba (LP: lymphoid progenitor sejt) elköteleződnek, míg ha gyengébb Notch2 jelzés éri őket a myeloid irányba (MP: myeloid progenitor sejt) kezdenek differenciálódni. A továbbiakban mind a MP és LP kopartmenten belül hasonló törvényszerűségek érvényesülnek. Az adott pillanatban kevesebb Notch receptort kifejező sejtek differenciálódnak tovább, míg a több Notch jelet kapó sejtek fenntartják az elkötelezett elődsejtek állományát. A lymphocyták korai fejlődéséhez tehát nélkülözhetetlenek a Notch rendszer elemei. Noha a legtöbb munka a sejtek kezdeti differenciációs útválasztásának során vizsgálja a Notch receptorok irányító szerepét meg kell említenünk, hogy a Notch jelnek komoly szerepe van az érett sejtek életében és az immunrendszer működésének szabályozásában is (89,90,91,92). 25
1.4.5. A Notch rendszer patológiás elváltozásai A Notch rendszernek a fejlődési folyamatok szabályozásában meghatározó szerepe van, így nem meglepő, hogy a jelátviteli útban résztvevő molekulák meghibásodása súlyos betegségek forrása lehet (1. táblázat) (93,94). Általánosságban elmondhatjuk, hogy a megnövekedett Notch receptor/ligand kifejezés a sejtfelszínen, vagy a Notch jel idejét meghosszabbító mutációk túlélési előnyt biztosítanak a sejtnek. Mint számos anti-apoptótikus molekula, a folyamatos Notch szignál is megvédi a sejtet a pusztulástól, lehetőséget adva ezzel a transzformációnak (95). A Notch jel differenciációt gátló hatása ugyancsak fokozza a daganatok életképességét, hiszen hozzásegíti a beteg sejteket, hogy fiatal állapotban maradjanak. Emberben T- sejtes akut lymphoblastos leukémiában (T-ALL) és lymphomában írták le először a Notch1 receptor létezését, mint TAN1 onkogént, olyan transzlokáció kapcsán, amely során a Notch IC része a T sejt receptor β láncának promótere mögé helyeződik, ezzel állandóan átírásra kerül a Notch receptor jeltovábbító része (96). Állatkísérletek igazolták, hogy a Notch1-et nagy mennyiségben kifejező csontvelői sejtek transzplantációja után a recipiens egerek közel felében T-sejtes leukémia alakul ki. Hogy a transzlokáció pontosan milyen módon váltja ki a T-ALL kifejlődését még nem tudjuk, de nagyon valószínűnek tűnik, hogy az állandóan aktív Notch szignál gátolja a T sejtek érését a CD4 +, CD8 +, TCR low (ún. kettős pozitív) stádiumban és lehetővé teszi olyan mutációt hordozó sejtek túlélését is, amelyek a betegséghez vezetnek. B sejtes akut lymphoblastos leukémiában is szerepet tulajdonítanak a Notch rendszernek. A Notch2 receptor magas kifejeződése elősegíti a fokozott CD23 termelést és az apoptózisra rezisztens állapot létrejöttét (97). A Notch4 molekulát egér emlőtumor vírus részeként (mint int3 gént) azonosították. Ebben a retrovírusban integrálódott a Notch4 intracelluláris része és közvetlen kapcsolat mutatható ki a malignitás és a Notch IC mennyiségének tartós megemelkedése között. A Notch jelátvitel időben és térben precízen összehangolt rendszerét megzavarva tehát kóros fejlődési folyamatok indulhatnak el. Nem csak a megnövekedett Notch jelzés okozhat zavarokat, de a csökkent jelátvitel is. A Notch3 gén egyes mutációi CADASIL (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencepathy) szindrómához vezetnek. Ebben a betegségben a Notch3 receptor extracelluláris része abnormálisan nagy mennyiségben jelenik meg a felszínen, de a ligand kötés nem jön létre, a jeltovábbítás blokkolódik. 26
Még nem tisztázott, hogy egyszerűen a jelátviteli út kiesésének vagy a sérült receptor sejtfelszínen való felhalmozódásának van-e nagyobb szerepe a betegség kialakulásában (98,99). Az abnormális fehérje akkumuláció még számos neurológiai elváltozásban okoz problémát. Az Alzheimer kórban az amyloid protein lerakódása vezet a neuronális léziók kialakulásához. Az amyloid prekurzor proteint a nemrégiben felfedezett presenilin γ-szekretáz komplex hasítja, ennek az enzimnek a túlműködése vezet az amyloid protein felhalmozódásához. Mint azt már említettük a presenilin γ- szekretáz enzim komplex hasítja a Notch receptort az S3 helyen, tehát a megváltozott presenilin aktivitás Alzheimer kór esetén megváltozott Notch jelátvitelt is jelent (100,101,102). Az idegrendszert érintő betegségek közül a sclerosis multiplexet említhetjük még, amelyben a Notch rendszer érintettsége bizonyított. A központi idegrendszer fejlődése során is a Jagged-Notch-Hes útvonal irányítja a sejtek differenciációs útválasztását (103). A fejlődő agyi struktúrákban a myelinizáció kialakulásához oligodendrocytáknak kell a megfelelő neuronok környékére vándorolni. A folyamat során az oligodendrocyták Notch1 receptort fejeznek ki felszínükön, míg a neuronok Jagged1 ligandumokat. Így az oligodendrocyták még éretlen állapotban vándorolnak a myelinizáció helyszínére, ahol az axonok már nem fejeznek ki Jagged1-t és kialakulhat rajtuk a myelin burok. Sclerosis multiplex esetén gyulladás alakul ki az agy bizonyos területén, amit a gyulladáscsökkentő hatású TGFβ termelés követ. De a TGF-β újra aktiválja az érett sejtekben a Notch útvonalat, tehát az astrocyták Jagged1 pozitívakká válnak, míg az oligodendrocyták Notch1 receptort kezdenek kifejezni. Ennek hatására a remyelinizáció nem történhet meg, hiszen Notch szignál az oligodendrocytákban gátolja a további differenciációt, így a myelin képzését is (104). Nem csak az idegsejtek és a vérsejtek fejlődésében, hanem az izomszövet kialakulásában is bizonyított a Notch útvonal alapvető szerepe. A legújabb vizsgálatok az öregedési folyamatok kapcsán azt mutatják, hogy az idővel fokozatosan gyöngülő regenerációs képesség hátterében ugyancsak a Notch rendszere, pontosabban annak csökkenő aktivitása áll. Az izomszövetben az őssejt-állományt a szatelit sejtek képezik. A szatelit sejtek nem-osztódó állapotban vannak az izomrostok között, de sérüléskor aktiválódnak, osztódni kezdenek. A létrejövő sejtek képezik a regenerálódó izom sejtjeit. A folyamat során a Delta ligandum a sérülés helyén kifejezésre kerül a myofibrillumok felszínén. Erre reagálnak azon sejtek, amelyek Notch receptort fejeznek ki. Kísérletek bizonyítják, hogy fiatal egerek 27