A ferrilhemoglobin szerepe az LDL oxidációjában MTA-DEOEC Hemosztázis,Trombózis és Vaszkuláris Biológiai Kutató Csoport Belgyógyászati, Gyermekgyógyászati Intézet Vaszkuláris Biológiai Kutató Laboratórium Potor László
Bevezetés Az LDL szubendotheliális térben történő oxidatív modifikációja az egyik első lépés az atheroszklerózis kialakulásában. In vitro LDL oxidation: 1.átmeneti fémek- vas;réz 2.hemproteinek- hemoglobin;cöruloplazmin;mioglobin 3.enzimeket-lipoxigenáz;mieloperoxidáz;tormaperoxidáz. Kutatócsoportunk korábban megállapította,hogy in vivo körülmények között a hem előidézi az LDL oxidációját. A reakció során a hem gyűrű (protoporfirin IX) felnyílik és vas szabadul fel,mely katalizálja az LDL oxidációját. Az oxidált LDL toxikus a legtöbb vaszkuláris sejtre nézve,így fokozza az endothelium károsodását is. LDL oxidációs termékek -konjugált diének -lipid-hidroperoxidok - tiobarbitursav reaktív anyagok
AZ LDL oxidatív modifikációja: Lipid peroxidáció mechanizmusa: 1.Iniciációs szakasz: hidrogén elvonás alkil gyök képződése átrendeződés mezoméria stabilizált konjugált dién 2.Propagáció: (szabadgyök képződés láncreakciószerű kiteljesedése) oxigén jelenlétében peroxil gyök hidrogén elvonás lipid-hidroperoxid Fe 2+ alkoxil gyök 3.Termináció: hidrogén elvonás gyökök stabilizálódnak zsírsav fragmentáció dialdehidek keletkeznek
Anyagok és módszerek LDL szeparálása: Felnőtt egészséges donortól származó vénás vér Plazma inkubálása1 órán át 37oC-on: 1. Natív LDL 2. 80uM Hemmel 3. 80uM Ferrylhemoglobin 4. 160uM Ferrylhemoglobin Egy lépéses gradiens ultracentrifugálás LDL frakció begyűjtése. Ferrylhemoglobin előállítása: Felnőtt egészséges donortól származó vénás vér hemoglobin preparálás tisztítás ioncserés kromatográfiával és dializálással ferrylhemoglobin preparálása 10* moláris mennyiségű H2O2-al dializálás Vizsgálati módszerek: 1.LDL oxidatív rezisztenciájának mérése hem eltűnés,lag-time mérés 2.LDL oxidatív módosulásának mérése konjugált dién keletkezés 3.LOOH tartalom mérés 4.Tiobarbitursav reaktív anyagok mérése malondialdehid keletkezés
t at Max V Az LDL hem/h2o2-al történő oxidációjának és t at Max V t at Max V t at Max V konjugált diének keletkezésének kinetikája B4 C4 0,260 1,500 0,240 1,400 0,220 1,300 0,200 1,200-5,324 mod/m OD 0,180 0,160 0,140 OD at Max V OD 1,100 1,000 0,900 OD at Max V 24,713 mod/m 0,120 0,800 0,100 0:00:00 0:20:00 0:40:00 1:00:00 1:20:00 1:40:00 2:00:00 0,210 0,200 0,190 0,180 Time B11 0,700 0:00:00 0:20:00 0:40:00 1:00:00 1:20:00 1:40:00 2:00:00 1,250 1,200 1,150 Time D11 OD 0,170 OD at Max V 0,160 0,150 0,140-2,909 mod/m OD 1,100 1,050 OD at Max V 1,000 13,476 mod/m 0,130 0,120 0,950 0,110 0:00:00 0:10:00 0:20:00 0:30:00 0:40:00 0:50:00 1:00:00 1:10:00 1:20:00 1:30:00 1:40:00 Time 0,900 0:00:00 0:10:00 0:20:00 0:30:00 0:40:00 0:50:00 1:00:00 1:10:00 1:20:00 1:30:00 1:40:00 Time
A hem és a konjugált dién (lipidperoxidációs termék) koncentrációjának változása spektrofotometriásan követve: LDL oxidatív rezisztenciájának változása (405nm) 80 70 ΔT at Vmax 60 50 40 30 20 10 natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb. 0 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 19.nap LDL oxidatív módosulása (konjugált dién keletkezés;uv-234nm) ΔT at Vmax 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 19.nap natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb.
Lipid-hidroperoxid és malondialdehid tartalom mérése LOOH tartalom Concentration (um/mg protein) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb. 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 15.nap 16.nap Malondialdehid mérés tiobarbitursavas módszerrel Concentration (um/mg protein) 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 natív LDL 80uM Hem 80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb. 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 15.nap
LDL szeparálása: Na 2 EDTA-val alvadásgátolt vénás vér (50ml) Plazmát (23ml) 1 órán át inkubáltam 37 o C-on: 1. Natív LDL 2. 80uM Hemmel 3. 80uM Ferrylhb. 4. 160uM Ferrylhb. A plazma sűrűségét KBr-dal beállítottam (1,3g/ml) Quick-Seal csőben kétrétegű grádiens fiz.só-val. LDL szeparálás: egy lépéses gradiens ultracentrifugálással (302000G ;4 o C; 2hour; VTi 50.2 rotor,beckman Instrument) Fehérje tartalom mérés: BCA protein módszerrel (mg fehérje/ml) hemoglobin preparálás: Önkéntestől származó alvadás gátolt vérből tisztítás ioncserés kromatográfiával (DEAE- Sepharose CL-6B oszlopon. Oxidált hemoglobin: 1,5* moláris mennyiségű káliumferricianiddal inkubálás 30percig dializálás. Oxidált hemoglobin inkubálás H2O2-al amíg a methemoglobin 70%-a át nem alakul ferrylhemoglobinná (spektrofotometriás nyomonkövetés). LDL oxidatív rezisztenciájának és módosulásának detektálás: Biotek Synergy4 Microplate readeren végeztem. LDL oxidatív rezisztenciáját:405nm-en detektáltam.(hemeltűnés), LDL oxidatív módosulását:uv- 234nm en detektáltam. Anyagok és módszerek 1.
Anyagok és módszerek 2. LDL lipid-hidroperoxid tartalma: Ferrous Oxidation in Xilenol Orange (FOX) módszerrel. A mintákat ELISA plate readeren 580nm-en fotometráltam. Tiobarbitursav reaktív anyagok meghatározása: (malondialdehid) Tiobarbitursav reagenssel(2-tiobarbitursav;hcl;tca) Extrahálás után a minták felűlúszóját 532nm-en fotometráltam. MTT-assay on HUVEC cells: Köldökzsinórból szeparált endotél sejteket toxicitási tesztnek vetettem alá. Toxicitási teszt:1 órás hemes vagy ferrilhemoglobinos előkezelés kezelés h2o2-al. LDL oxidatív rezisztenciájának (hem eltűnés) és módosulásának (konjugált dién keletkezés) kinetikája: El nem oxidált LDL kinetikája: Hem eltűnés Hem eltűnés Oxidált LDL kinetikája: Konj.dién keletkezés Konj.dién keletkezés