Ambrózy Zsuzsanna 1 Deák Konrád 1 Vizi Bernadett 2 Helyes Lajos 3 Daood Hussein 4 Különböző szamóca fajták antocianin tartalmának vizsgálata nagy hatékonyságú folyadék kromatográfiával (HPLC) Examination of anthocyanin content in different strawberry cultivars using high performance liquid chromatography (HPLC) ambrozy.zsuzsanna@mkk.szie.hu 1 Szent István Egyetem, Kertészeti Intézet, PhD hallgató 2 Szent István Egyetem, MKK-Kertészmérnök B.Sc., 3 Szent István Egyetem, Kertészeti Intézet, intézetigazgató 4 Szent István Egyetem, Regionális Egyetemi Tudásközpont, főkutató A szezonális kertészeti termékek közül a fogyasztók körében a szamóca az egyik legközkedveltebb gyümölcs Magyarországon. Vajon a szamóca csak a kulináris élvezetek miatt fontos? Valóban csak az ízéért és a zamatáért érdemes fogyasztani? Cassidy és munkatársai (2013) kutatásai alapján megállapították, hogy a szamóca fogyasztása a szív- és érrendszeri betegségek megelőzése szempontjából is igen hasznos, amit főként a benne lévő antocianinok okoznak. Ezért célunk volt különböző szamócafajták összehasonlítása az antocianin tartalom kvalitatív és kvantitatív meghatározása szempontjából. Kísérletünket randomizált elrendezésben a gödöllői Szent István Egyetem kertészeti tanüzemének területén állítottuk be. Négy különböző fajtájú szamócát vizsgáltunk, melyek a Joly F 1, a Dely F 1 a Marmolada F 1, és az Antea F 1, fajták voltak. A méréseket a Szent István Egyetem Regionális Tudásközpontjának Analitikai Laborjában HPLC technikával végeztük. Az antocianinok mennyiségi és minőségi meghatározását ecetsavas-metanolos kivonás után HPLC-vel, gradiens elúciós módszerrel és diódasoros detektor segítségével végeztük. (HPLC: Merck Hitachi-Chromaster; Oszlop: Nucleodur 100-5 C18, szemcseméret: 5µm, hossz: 250 mm, belső átmérő: 4,6 mm; eluensek: A: 1%-os hangyasav, B: acetonitril, C: metanol; Chromaster 5430 diódasoros detektor). A mérés számítógépes irányítását EZChrom Elite kromatográfiás adatkezelő szoftverrel végeztük. Az antocianinokat 520 nm-en határoztuk meg. A szamóca antocianinjai közül 4 komponenst sikerült szétválasztani. Vizsgálataink során arra az eredményre jutottunk, hogy az antocianin tartalom nagymértékben függ a fajtától is. KULCSSZAVAK: Szamóca, antocianin, HPLC 62
BEVEZETÉS A tavasz beálltával a szamóca az első friss gyümölcs hazánkban. Ennek köszönhetően piaci jelentősége igen nagy. Ezt a Fruitveb adatai is alátámasztják, hiszen hazánkban 2012-ben 680 hektáron 6,9 ezer tonna termést állítottak elő belőle. Napjainkban a szamóca népszerűségét nem csak frissességének, zamatos ízének, hanem az egyre inkább kutatott antioxidáns kapacitásának és betegségek megelőzését segítő szerepének tulajdoníthatjuk. Ezt a pozitív hatást nagyban az antocianinok okozzák. Ezért is van szükség arra, hogy a szamócában lévő antocianinokat minél magasabb szinten megismerjük, elválasztásukat, azonosításukat, mennyiségüket és egymáshoz viszonyított arányukat alapul véve. Stój et al., 2006 szerint a HPLC technika a legkiválóbb módszer az antocianinok meghatározásához. Az antocianinok kromatográfiás profilja, mint egy ujjlenyomat működik a HPLC-s szétválasztás után (Versari et al., 1997). Egyazon fajon belül viszont a különböző fajták különböző kromatográfiás profilt adnak (Hofsommer, 1995). Így a HPLC technika alkalmas a fajták és a termesztő körzetek beazonosítására, melynek a nyomon követhetőség szempontjából is óriási szerepe van. Az antocianinok antioxidáns tulajdonsága azt jelenti, hogy kémiai szerkezetükből is kifolyólag képesek semlegesíteni a szabadgyököket (hidrogénperoxid, H 2O 2, szuperoxid O 2 -). Több kutatás is rámutat arra, hogy a szív- és érrendszeri betegségek megelőzése szempontjából is igen hasznosak ezek a vegyületek (Jennings et al., 2012), (Cassidy et al., 2013), (Garcia-Alonso et al., 2004). Liu et al., 2005-ben tumor megelőző és a rákos sejtek körüli véredényképződést megakadályozó hatásukról írtak. Sharma kutatásai alapján (2001) megállapította, hogy az UV-B sugárzás (290-300 nm) ellen is nyújtanak védelmet az antocianinok, közülük is a cianidineknek tulajdonítható ez a hatás. Az antocianinok polifenol vegyületek, azon belül is a flavonoidokhoz tartoznak (Harbone et al., 1964), (Mazza&Miniati, 1993). A szamóca piros színéért felelősek. Ezeket a jó vízoldékonyságú pigmenteket a növények a pentózfoszfát-ciklus, flavonoid és sikimisav szintézis útján termelik (Pascual-Teresa et al., 2008). Mennyiségüket a növényekben befolyásolhatják a környezeti tényezők, a fajta, a termesztési körülmények és az árúvákészítés módja és ideje. Az antocianinok tulajdonképpen másodlagos anyagcseretermékek, melyek a sejtek vakuólumában halmozódnak fel glikozidok formájában. Egy aglikonból - egy nem cukor jellegű szerves molekulából - és egy vagy több cukormolekulából állnak. A cukormolekula általában glükóz, de egyéb szénhidrátok (xilóz, ramnóz és rutinóz stb.) is előfordulnak. Az antocianinok leggyakoribb aglikonjai a pelargonidin, a cianidin, a delfinidin, a malvidin és a peonidin (Oancea & Oprean, 2011). Tanulmányok szerint az antocianinok nem stabil vegyületek (Rivas-Gonzalo, 2003), az alacsony hőmérsékleten való tárolás azonban növeli stabilitásukat (Delgado-Vargas et al., 2003). 63
ANYAG ÉS MÓDSZER A 2013-as évben kísérletünket véletlenszerű elrendezésben a göd gödöllői Szent István Egyetem kertészeti tanüzemének területén állítottuk be. A terület barna erdőtalaját alacsony vízkapacitás, de jó vízelvezető képesség jellemzi. A talajvíz 5 méternél mélyebben helyezkedik el, amely a növények számára már hozzáférhetetlen.. A hőmérsékleti adatokról és a csapadékmennyiség alakulásáról a kísérleti téren elhelyezett meteorológiai mérőál mérőállomás szolgáltatta az adatokat. Mivel a virágképződéstől a betakarításig általában 30 nap telik el, a szedések előtti utolsó hónap meteorológiaii adatait vettük alapul kísérletünkhöz (1. Ábra). 1. Ábra. A szedések előtti időszak meteorológiai adatai 2013 2013-ban. Négy különböző fajtájú szamócát vizsgáltunk bakhátas termesztésből, melyek a Joly F1, a Dely F1 a Marmolada F1, és az Antea F1, fajták voltak. A minták szedését négy ismétlésben végeztük, két elkülönített területről, így 32 32-es mintaszámmal dolgoztunk. A szedéseket 3 naponta végeztük, összesen három szedés volt a szamóca termés terméshozásának csúcsán. Ezt követően a mintákban lévő antocia antocianinok mennyiségi és minőségi meghatározását a Szent István Egyetem Regionális Tudásközpontjának Analitikai Laborjában HPLC technikával végeztük. A mintákat homogenizáltuk majd 5 gg-nyi lemérését követően 4:1 arányú ecetsavas-metanolos kivonás után 5 percre szobahőmérsékletű ultrahangfürdőbe helyeztük 64
őket. Másnap a szűrőpapírral átszűrt mintákat HPLC szűrővel (0,45µm) tisztítottuk. Az antocianinok mennyiségi és minőségi meghatározását HPLC készülékkel, gradiens elúciós módszerrel és diódasoros detektor segítségével végeztük. (HPLC: Merck Hitachi-Chromaster; Oszlop: Nucleodur 100-5 C18, szemcseméret: 5µm, hossz: 250 mm, belső átmérő: 4,6 mm; eluensek: A: 1%-os hangyasav, B: acetonitril, C: metanol; Chromaster 5430 diódasoros detektor). A mérés számítógépes irányítását EZChrom Elite kromatográfiás adatkezelő szoftverrel végeztük. Az antocianinokat 520 nm-en határoztuk meg. Az egyes antocianinok beazonosítását a spektrum, az elúciós sorrend és az irodalmak alapján határoztuk meg. A hullámhossz maximuma (λ max) a látható tartományban szorosan összefügg az antocianin hidroxilációs mintázatával. A pelargonidin származékokat (λ max=502nm) így meg tudjuk különböztetni a cianidin (λ max=516-520nm) és a delfinidin (λ max=525-528nm) származékoktól (Bakker et al., 1994), (Goiffon et al., 1991). A cukor természete nincs lényeges hatással a spektrum alakulására (Hong & Wrolstad, 1990), (Versari et al., 1997). Az aglikonok elúciós sorrendje a következő: delfinidin, cianidin majd pelargonidin. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK Az antocianinok mennyiségi meghatározásához rutin standard volt segítségünkre. A szamóca antocianinjai közül mindegyik mintában minimum 4 komponenst sikerült szétválasztani. Az első csúcs cianidin-3-glükozid, a második pelargonidin-3-glükozid, a harmadik és negyedik csúcsok cianidin- és pelargonidin származékok voltak. Megfigyeltük, hogy az 1. szedéshez képest a 2. és a 3. szedéseknél a komponensek száma növekedett, ezzel párhuzamosan arányuk változott. Ez azt jelenti, hogy antocianin-összetétel nagyban megváltozott az első szedéstől az utolsó szedésig. Ezt az antocianin-bioszintézis szabályozásában szerepet játszó enzimek aktivitásának változása okozta. Szakirodalmak alapján a szamóca antocianin-tartalma 120-200 µg/g-ra tehető (García-Viguera et al., 1999), (Gil et al., 1997), (Zheng et al., 2005). Ezzel szemben kísérletünkben a Marmolada F 1 fajtában 318,56 µg/g antocianin volt, mely kiugróan magas értéknek számít. Meglepő, hogy a Joly F 1 fajtában már csak átlagosan 163,88 µg/g-ot találtunk. Ezt követte a Dely F 1 128,44 µg/g-mal és végül az Antea F1 (kevesebb, mint a Marmolada F 1 harmadával), 108,09 µg/g-mal (2. ábra). 65
µg/g 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Dely Marmolada Anthea Joly 2. Ábra A vizsgált fajták antocianin-tartalma (µg/g) A szedések előrehaladtával az antocianin-tartalom egyre növekedett, míg az első szedésnél összesen 141,01 µg/g-ról beszélhetünk, addig a második szedésnél már 164,97- µg/g-ról, a harmadik szedésnél pedig már 245,69 µg/g-ról. Az első szedésnél több mint 100 µg/g-mal kevesebb volt átlagosan az antocianin-tartalom! Mivel a fajták, a termesztési körülmények és a betakarítás módja minden szedésnél megegyezett, ezt a változást valószínűleg a környezeti tényezőkben bekövetkezett változásokra vezethetjük vissza. A szedéseket megelőző hónapok hőmérsékleti és csapadék adatait összevetve a következőket állapítottuk meg: Az első szedést megelőző hónap átlagos napi középhőmérséklete 15,4 C volt, ami a 2. szedésnél 15,7 C-ra, a 3. Szedésnél 15,9 C-ra növekedett. A csapadék szempontjából elhanyagolható volt a különbség az egyes szedéseknél. A hőmérséklet és a besugárzás mértékének növekedése okozhatta az antocianin-tartalom növekedését a szamóca mintákban. Ezek pontos tisztázására további vizsgálatok szükségesek. A kutatást a TÁMOP-4.2.1. B-11/2/KMR-2011-0003 és a Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi Kar 9910-3/2013/TUDPOL és a KTIA-AIK-12 projectek támogatták. 66
IRODALOMJEGYZÉK 1. BAKKER J., BRIDLE P., KOOPMAN A. (1992): Strawberry juice color: the effect of some processing variables on the stability of anthocyanins. J. Sci. Food. Agric., 60, 471-476. 2. CASSIDY A., MUKAMAL K. J., LIU L., FRANZ M., ELIASSEN A. H., RIMM E. B. (2013): High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation, 127,188-196. 3. DE PASCUAL-TERESA S., SANCHES-BALLESTA M.T. (2008): Anthocyanins: from plant to health. Phytochemistry Rev., 7, 281-299. 4. DELGADO-VARGAS F., PAREDES-LÓPEZ O. (2003): Anthocyanins and betalains. In Natural Colorants for Food and Nutraceutical Uses. CRC Press, Boca Ration, pp: 167-219 5. GARCIA-ALONSO M, RIMBACH G., RIVAS-GONSALO J.C. (2004): Antioxidant and cellular activities of anthocyanins and their corresponding vitisins A studies in platelets, monocytes, and human endothelial cells. J. Agric. Food Chem., 52, 3378-3384. 6. GARCIA-VIGUERA C., ZAFRILLA P., ROMERO F., ABELLÁN P., ARTÉS F., TOMÁS-BARBERÁN F.A. (1999): Color stability of strawberry jam as affected by cultivar and storage temperature. Journal of Food Science, 2, 243-247. 7. GIL M. I., HOLCROFT D. M., KADER A. A. (1997): Changes in strawberry anthocyanins and other polyphenols in response to carbon dioxide treatments. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 1662-1667. 8. GOIFFON J.P, BRUN M., BOURRIER M. J. (1991): High-performance liquid chromatography of red fruit anthocyanins. J. Chromatogr., 537, 101-121. 9. HARBONE J.B., HALL E. (1964): Plant polyphenols. 13. The systematic distribution and origin of antocyanins containing branched trisaccharides. Phytochem. 3, 453-463. 10. HOFSOMMER H.J. (1995): Determination of anthocyanins and carotinoids in fruit juices. Fruit Processing, 4, 90-93. 11. HONG V., WROLSTAD R.E. (1990): Use of HPLC separation/photodiode array detection for characterization of anthocyanins. J. Agric. Food. Chem., 38, 708-715. 12. JENNINGS A., WELCH A. A., FAIRWEATHER-TAIT S. J., KAY C., MINIHANE A.M., CHOWIENCZYK P., JIANG B., CECELJA M., SPECTOR T., MACGREGOR A., CASSIDY A. (2012): Higher anthocyanin intake is associated with lower arterial stiffness and central blood pressure in women. American Journal of Clinical Nutrition, 96: 4, 781-788. 67
13. LIU Z., SCHWIMER J., LIU D. (2005): Black raspberry extract and fractions contain angiogenesis inhibitors. J. Agric. Food Chem., 53, 3909-3915. 14. MAZZA G., MINIATI E. (1993): Anthocyanins in Fruits, Vegetables and Grains. Boca Raton: CRC Press Inc., 1-28. 15. OANCEA S., OPREAN L. (2011): Anthocyanins, from biosynthesis in plants to human health benefits. Food Technology, 1, 3-15. 16. RIVAS-GONSALO J.C. (2003): Analysis of Antocyanins. In: Santos-Buelga C., Williamson G. Methods in polyphenol analysis. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003. 17. SHARMA R. (2001): Impact of Solar Uv-B on tropical ecosystems and agriculture. Case study: effect of UV-B on rice, Proceedings of SEAWIT98 and SEAWPIT2000, 1, 92-101. 18. STÓJ A., MALIK A., TARGONSKI Z. (2006): Comparative analysis of anthocyanin composition of juices obtained from selected species of berry fruits, Pol. J. Food Nutr. Sci. 4, 401-407. 19. VERSARI A., BERBANTI D., BIESENBRUCH S., GARNELL P.J. (1997): Analysis of anthocyanins in red fruits by use of HPLC spectral array detection. Ital. J. Food Sci., 9, 141-147. 20. ZHENG Y., WANG S. Y., WANG C. Y., ZHENG W. (2007): Changes in strawberry phenolics, anthocyanins, and antioxidant capacity in response to high oxygen treatments, Swiss Society of Food Sci. And Tech., 40, 49-57. 68