DNS molekulák elválasztása agaróz gélelektroforézissel és kapilláris elektroforézissel Gyakorlat helye: BIOMI Kft. Gödöllő, Szent-Györgyi A. u. 4. (Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ épülete volt MBK) Gyakorlatvezető: Brozsó Beáta, Mohr Anita A biológiai, biokémiai munkák során az elektroforézis az egyik leggyakrabban alkalmazott elválasztástechnikai módszer, mely során egyenáramú elektromos erőtérben, annak törvényszerűségei alapján megy végbe a töltéssel bíró molekuláknak az ellenkező polaritás irányába történő elmozdulása. Elmozdulásuk mértéke lehetőséget ad elválasztásukra, azonosításukra. A molekuláris biológiai munkák során elengedhetetlen, hogy információt kapjunk a mintában jelenlévő DNS fragmentumok méretéről, amelyhez a mindennapi gyakorlatban az agaróz gélelektroforézist alkalmazzuk. A DNS molekula szekvenciájának meghatározására a kapilláris elektroforézis nyújt megfelelő technikai lehetőséget. A gyakorlat célja, hogy megismerkedjenek ezen elválasztástechnikai módszerekkel DNS molekulákat tartalmazó minták vizsgálata esetén. Agaróz gélelektroforézis Az agaróz gélelektroforézis különböző makromolekulák méret vagy töltés szerinti elválasztására alkalmas. A gyakorlaton DNS fragmentek méret szerinti elválasztását fogjuk elvégezni. Az agaróz gél pufferből és agarózból tevődik össze. Az agar-agar (agaróz) egy tengeri vörös algából kivont poliszacharid, mely melegítés hatására feloldódik az elektroforézis pufferben. Az így kapott oldatot megfelelő formába öntjük, mely 32-40 C körüli hőmérsékletre hűlve megszilárdul, térhálós szerkezetet alkot oly módon, hogy a lineáris polimer szálak dupla helikális szerkezetbe rendeződnek, melyeket a jelen lévő vízmolekulák stabilizálnak, hidrogén-híd kötésekkel (1. ábra). 1. ábra: Az agaróz térhálós szerkezete
Szilárdulás után a puffertankba tesszük a gélt, ezután felvisszük a mintákat az erre a célra kialakított un. zsebekbe. A mintákat közvetlenül a betöltés előtt egy speciális töltő pufferrel kell összekeverni, mely rendszerint kétféle festékanyagot (ált. brómfenol-kéket és xiléncianolt), valamint glicerint tartalmazó vizes oldat. A nagy sűrűségű glicerin a mintákat a zsebek alján tartja, amíg a DNS bevándorol a gélbe, a két festék segítségével pedig megállapíthatjuk hol tart az elektroforézis. A brómfenolkék mobilitási tuljdonságai a legjobbak, ezért ez a sötétkék szín a futási frontot jelzi, míg a világosabb xilén cianol igen lassan halad a gélben így a futás legvégét mutatja meg. Ezután elektromos térbe helyezzük a gélt, melyben a DNS mivel semleges ph közelében negatív töltésű az anód (+) felé vándorol. A nagyobb méretű fragmentumok lassan, míg a rövid méretűek gyorsan haladnak a gélben így ezek vándorolnak legtávolabb a zsebektől. A DNS mozgási sebességét több faktor is befolyásolhatja, ezek a következők: A DNS mérete: Nagyobb molekulák lassabban mozognak, mint a kisebbek. Ez a nagyobb súrlódási ellenállással magyarázható, valamint azzal, hogy a nagyobb molekulák átjutása a gél pórusain nehezebb. Az agaróz koncentrációja: Ez határozza meg a gél sűrűségét és a pórusok méretét. (Általában 0,5-3% között). Agaróz mennyisége a gélben (% w/v) Elválasztási tartomány (lineáris, dsdns-re, kilobázispár) 1,0 0,5-7 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2 A DNS szerkezete: Azonos molekulasúlyú gyűrűs, szuperhelikális gyűrűs, valamint lineáris DNS molekulák eltérő sebességgel vándorolnak agaróz gélben (2. ábra). 2. ábra: Különböző szerkezetű és méretű Nukleinsav molekulák képe agaróz gélben Elektroforézis puffer összetétele: A DNS elektroforetikus mobilitása függ az elektroforézis puffer összetételétől és ionerősségétől is. Ionok hiányában (pl. ha tévedésből valaki nem elektroforézis puffert használ a gél elkézítéséhez) az elektromos
vezetőképesség minimális és a DNS csak lassan, vagy egyáltalán nem mozog. Ha a puffer ionerőssége túl magas (pl. ha tévedésből valaki 10x töménységű elektroforézis puffert használ), a vezetőképesség nagyon nagy lesz, ami jelentős hőképződéssel jár. Legrosszabb esetben a gél megolvadhat, és a DNS denaturálódhat. A DNS láthatóvá tehető egy speciális fluoreszcens jelölő molekulával, mely interkalálódik a kettős szálú nukleinsav molekulákba és UV fénnyel gerjesztve látható fényt emittál (3.ábra). A talán leginkább elterjedt ilyen molekula az Etídium-Bromid (EtBr), mely pont e miatt a tulajdonsága miatt erősen mutagén, ezért újabban egyre inkább elterjednek a sokkal modernebb, egészségre kevésbé ártalmas dsdns festékek használata. A festéket kétféle módon alkalmazhatjuk: a gél utólagos festésével vagy közvetlenül gélöntéskor adjuk az elegyhez. 3. ábra: EtBr interkalálódása a dsdns molekulába. Az ábrán látható, hogy az EtBr beépülésekor eltorzítja a DNS cukor-foszfát gerincét, ezzel megváltoztatva annak számos tulajdonságát. A láthatóvá tett DNS fragmentumok méretét molekulasúly markerekhez történő viszonyítással határozhatjuk meg. A molekulasúly markerek egyszerre több, ismert méretű fragmentumokat tartalmaznak (4. ábra). 4. ábra: GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) futási képe
Mivel a mobilitás fordítottan arányos a molekulasúly 10-es alapú logaritmusával, az ismeretlen fragmentumok mérete egyszerű számolással meghatározható a vándorlási hossz ismeretében. Kalibrációs egyenest készítünk, melyen az x tengelyen a PCR fragmentek vándorlási hosszát (mm), az y tengelyen a fragmentumok méretének 10-es alapú logaritmusát ábrázolja (4.ábra) 4. ábra: kalibrációs egyenes készítése, példa Az egyenes egyenlete alapján a kérdéses fragmentum vándorlási hosszának ismeretében meghatározható a mérete. GYAKORLAT A gyakorlathoz szükséges anyagok, eszközök 1xTBE puffer 6x loading puffer agaróz fluoreszcens gélfesték molekulasúly marker elektromos tápegység elektroforézis tank gélöntő forma gélöntő tálca fésű mikropipetta géldokumentáló rendszer vizsgálni kívánt minta A gyakorlat menete: 1. Állítsa össze a gélöntő tálcát. Illessze be a műanyag fésűt az öntőmintába. (4. ábra). (A megszilárdult gélben, a fésű eltávolításával létrejött mélyedésekbe un. zsebek kerül majd a minta.)
2. Erlenmeyer lombikba mérjen 0,6 g agarózt, adjon hozzá 60 ml 1xTBE puffert, mikrohullámú sütőben melegítse óvatosan, gyakran kevergetve, míg az agaróz teljesen felolvad. (ált. pár másodperc forralás szükséges) Ezután hűtse vissza kb. 60 C-ra, és adjon hozzá 6 µl fluoreszcens festéket, alaposan keverje össze. 3. Ezt követően óvatosan, buborék-mentesen öntse az agaróz oldatot az előkészített gélöntő tálcába. 4. 30-40 perc alatt az agaróz gél megszilárdul, ekkor nagyon óvatosan, hogy a minta felvitelére szolgáló zsebek ne sérüljenek, távolítsa el a fésűt. 5. Töltse fel az elektroforézis tankot (5. ábra) 1xTBE pufferrel, tegye bele a gélt a gélöntő tálcával együtt, úgy hogy a minta felvitelére szolgáló zsebek a katód (-) felé helyezkedjenek el, majd öntsön még a tartályba annyi puffert, hogy a gélt 1-2 mm magasan ellepje. agaróz gél keresztmetszet puffertank 5. ábra: agaróz gél keresztmetszet és a puffer tank 6. A kapott mintákból 5 mikrolitert pipettával keverjen össze 3 µl töltő pufferrel, majd az így előkészített mintákat egyenként óvatosan pipettázza a gélzsebekbe. (Minden mintához új hegyet használjon és vigyázzon, hogy a felvitelnél a minták ne keveredjenek!) SORREND FELJEGYZÉSE!! 7. Vigyen fel 2µl molekulasúly markert a minták után. A molekulasúly marker: 100 bp léptékű, amely 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 bp nagyságú DNS fragmenteket tartalmaz (5. ábra). 8. A puffertartályra helyezze rá a tetejét, és az elektromos vezetékekkel csatlakoztasa a tápegység kimeneteihez, kapcsolja be a tápegységet, és állítsa be 100 V-ra a feszültséget. Addig futtassa a gélt, amíg a futási frontot jelző festék a gél kb. kétharmadáig elér. 9. A tápegység kikapcsolása után vegye ki a gélt a tálcával együtt, majd UV megvilágítás alatt fotózza le a gélt. 10. A molekulasúly fragmentumok vándorlási hosszának lemérésével készítsen kalibrációs görbét (ahol az x tengelyen a fragmentek vándorlási hosszát (mm), az y tengelyen a fragmentumok méretének 10-es alapú logaritmusát ábrázolja (4.ábra) 11. Az egyenes egyenlete segítségével számolja ki az egyes minták DNS fragmentumainak méretét.
FELADAT A gyakorlaton ismeretlen méretű mintákat kap, melyet agaróz gélelektroforézis segítségével elválasztunk. Mérje le a minták vándorlási hosszát és készítsen kalibrációs egyenest, majd számolja ki a fragmentumok méretét. A jegyzőkönyvben rögzítendők az alábbi tételek: 1. Feliratozott gélkép 2. Minták vándorlási hossza 3. Kalibrációs görbe és egyenlete 4. A kapott eredmény (fragmentumok hossza bp) 5. a számolás menete Fluoreszcensen jelölt DNS molekulák elválasztása kapilláris gélelektroforézis segítségével - DNS szekvenálás 1. Kapilláris gélelektroforézis A kapilláris gélelektroforézis (CE) viszonylag új elválasztási technika. Előnye, hogy töltéssel rendelkező és töltés nélküli molekulák elválasztására egyaránt alkalmas, jellemző rá a nagy elválasztási hatékonyság, rövid analízis idő, kis mennyiségű minta (ng-pg-nyi mennyiségek) és puffer térfogat, kevés hulladékképződés, egyszerű szerkezeti felépítés és kezelhetőség, valamint az automatizálhatóság. Egy CE berendezés leegyszerűsítve (1.ábra) két, elektródát tartalmazó pufferkádból áll, amelyhez az ömlesztett kvarc kapilláris végei csatlakoznak. A kapilláris 10-100 µm belső átmérőjű, 36-80 cm hosszú, amelynek szilárdságát külső polimer bevonat biztosítja. Az elválasztani kívánt minta feszültség hatására jut be a kapilláris belsejébe, amely polimerrel van feltöltve. Nagyfeszültség (5-30 kv) hatására az elválasztani kívánt molekulák elektroforetikus mobilitásuk különbözősége miatt a kapilláris vége felé vándorolnak, így elválaszthatók töltésük/méretük alapján. Mielőtt elérnék a külső puffer tartályt, detektálásra kerülnek a kapillárison belül. 1. ábra Kapilláris elektroforézis berendezés felépítése 2. DNS szekvencia meghatározás lépései
2.1. Mintaelőkésztés, a jelölő PCR reakció összeállítása A DNS szekvenálás célja ismeretlen DNS molekula nukleotid sorrendjének meghatározása. A szekvencia sorrend meghatározás első lépése egy speciális összetételű PCR reakció összeállítása, amelyet először Sanger alkalmazott 1977-ben. A reakcióban a DNS templáton, primeren, deoxi-nukleotid keveréken (dntp mix) és DNS polimerázon kívül limitált mennyiségben fluoreszcens festékkel jelölt dideoxi-nukleotidok (ddntp mix) is jelen vannak. A dideoxi-nukleotid 3 vége nem tartalmaz OH csoportot, így a DNS szálhoz kapcsolódva leállítja a képződő szál növekedését. Mivel mind a négy nukleotidnak megfelelő dideoxi-nukleotid részt vesz a reakcióban, ezért mindegyik bázis pozíciójában megakadhat a DNS szál szintézise. Miután a dideoxi-nukleotidok beépülése véletlenszerű, ezért a meghatározandó szekvencia teljes méret tartományában kapunk rövidebb-hosszabb DNS fragmenteket, melyek 3 végükön fluoreszensen festékkel jelöltek. A készülék ezeket a végjelölt fragmenteket a kapilláris elektroforézis útján elválasztja egymástól, és a detetektálja a floureszcens festék típusát. A PCR reakció lépései a következők (2.ábra): 1. Denaturálás: 94 ºC-on az egymáshoz tapadt DNS láncok szétnyílnak, és minden más enzimatikus reakció leáll. 2. Primer feltapadás (annealing): 50 ºC-on hidrogén-híd kötések alakulnak ki az egyszálú primer és az egyszálú DNS lánc bázisai között. A szekvenálási reakciókban csak egy primert használunk, így a DNS egyik szála íródik át. A primer feltapadás helyét a bázissorrend határozza meg. 3. Lánchosszabbítás (extension): A nukleotidok a primer 3 végéhez kapcsolódnak, és a polimeráz enzim elkezdi a DNS szál szintézisét. De véletlenszerüen a fluoreszcensen jelölt dideoxi-nukleotidokat is beépülnek a képződő szálba, megakadályozva további nukleotidok kapcsolódását. 2. ábra A szekvenáláshoz szükséges PCR reakció Az előzőleg ismertetett három lépés 30 cikluson keresztül ismétlődik.
2.2. A szekvenálási reakció termékek tisztítása A PCR reakciótermékeket az elválasztás előtt meg kell tisztítani a reakcióban jelenlévő puffer, MgCl 2, Taq polimeráz enzim és be-nem-épült dntp és ddntp maradványoktól. Erre a rutinszerűen alkalmazott módszer az un. etanolos DNS precipitálási módszer. A PCR termékek beszárítását követően, nagy tisztaságú/deionizált formamidban való feloldás következik, így biztosítható a DNS molekulák negatív töltését és megakadályozható a DNS szálak összetapadása a denaturálás után. 2.3. A DNS fragmentek elválasztása és detektálása, az adatok feldolgozása A DNS molekulák kapillárisba történő injektálása után elkezdődik az elválasztás, amelynek paraméterei a készülék vezérléséhez használt programban állíthatók be, 1000 bázis leolvasásához kb. 2 órás elválasztás körülbelül szükséges. A negatív töltésű DNS darabkák a pozitív elektród (anód) felé vándorolnak. A kis méretű fragmensek gyorsabban, míg a nagy méretűek lassabban haladnak az elektromos térben, így azok méretük szerint elválnak egymástól (3. ábra). 3. ábra: Az elválasztás folyamata az idő függvényében A detektáló cellán keresztül haladó különböző típusú fluoreszcens festékkel jelölt DNS molekulákat 488-515 nm hullámhossz tartományban argon-ion lézerfény gerjeszti. A visszasugárzott 500-650 nm hulláhosszú sugarakat egy CCD kamera érzékeli és digitális információkká alakitja át. (4. ábra)
4. ábra: A detektáló egység felépítése Az elválasztás detektálása on-line módon történik. A nyers adatokat a szekvenáló berendezéshez kapcsolt számítógép menti el. A speciális kiterjesztésű (*.ab1) adatfile-ok tartalmazzák az elválasztási paramétereket, az elektroferogram-ot. GYAKORLAT A gyakorlathoz szükséges anyagok és eszközök: BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction mix 5x BigDye Terminator Sequencing Buffer M13rev primer pgem3zf templát DNS MQ H 2 O 3M Nátrium-Acetát (ph 5.20) 96%-os és 70%-os etanol oldatok Hi-Di Formamid 96 mintahelyes PCR reakció plate PCR reakció plate tető PCR reakció plate septum PCR készülék Juan CR12-es plate centrifuga 3130xl ABI Gentetikai Analizátor Vákum bepárló berendezés A gyakorlat menete 1. A PCR reakció összemérése: A reakció egy 96 mintahelyes PCR reakció plate-ben fog végbemenni. Első lépésként a PCR reakció összetevőket kell bemérni a plate adott pozíciójába (well-be)
A 20 µl reakciótérfogathoz hoz szükséges anyagok és mennyiségük: 200ng templát DNS pgem 3Zf plazmid (1 µg /µl, Promega) 3.2 pmol primer - M13rev (10 pmol/µl) 4 µl BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction mix 4 µl 5x BigDye Terminator Sequencing Buffer 20µl-re kiegészítve H 2 O Annak érdekében, hogy a reakcióedény falán ne maradjanak cseppek, egy gyors centrifugálást végzünk. 2. PCR reakció elindítása A plate-t behelyezzük a PCR készülékbe és elindítjuk az előre megírt programot. 3. Etanolos precipitálás A PCR lefutását követően a keletkezett PCR termékeket meg kell tisztítani a reakcióban jelenlévő puffer, MgCl 2, Taq polimeráz enzim és be-nem-épült dntp és ddntp maradványoktól. Ehhez a kövekező vegyszerek és azok mennyiségek kell a a PCR termékekhez mintánként hozzákeverni: 1,5 µl 3 M-os Nátrium-Acetát (ph 5.2) 7,5 µl H 2 O 31 µl 96%-os etanol A 15 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után, a plate-t 15 perc alatt lecentrifugáljuk 3500 rpm-en. A centrifugálás után a felülúszót óvatosan leöntjük, egy papírtörülközö felületére. A mintát tartalmazó well-be ezt követően 200 µl 70%-os etanolt pipettázunk és felszuszpendáljuk a benne lévő DNS-t. Ezt a lépést az előzől lépésben ismertetett centrifugálási lépés követi, a felülúszót ismét leöntjük. A DNS-t tartalmazó plate-et 15 percre vákuum bepárló berendezésbe helyezzük, az alkohol maradékok eltávolítása céljából. 4. Minták feloldása Hi-Di Formamid-ban és denaturálás: A beszárított DNS mintákat 11 µl Hi-Di Formamid-ban felszuszpendáljuk és a plate-et egy speciális tetővel (septa) lezárjuk. Annak érdekében, hogy a well falán ne maradjanak cseppek, egy gyors centrifugálást végzünk, majd a PCR készülékben 96 C-on 3 percig denaturáljuk. 5. Szekvenálás a genetikai analizátoron: A plate-t egy speciális tartóba fogatjuk és a Applied Biosystems 3130xl-as típusú genetikai analizátorba helyezzük. A vezérlő szoftver segítségével elindítjuk a kapilláris elektroforézist. 6. Adatok elemzése: A szekvenáló program lefutását követően a szekvencia adatokat az Applied Biosystems Sequencing Analysis v5.3.1 software segítsével kiértékeljük. 7. A szekvencia adatok adatbázisban történő ellenőrzése
A mintafile-ból kimásolt szekvenciát a National Center for Biotechnology Information honlapján (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) található BLAST adatbázis segítségével ellenőrizzük FELADAT: A kapott 16S rrns gén szekvencia BLAST adatbázisban történő illesztése és az eredmény rögzítése a mérési jegyzőkönyvben. A jegyzőkönyvben táblázatos formátumben rögzítendők az alábbi paraméterek az első 5 találatra vonatkozóan: 1. NCBI adatbázisban azonosított találatok neve (első 5) 2. Első 5 találat NCBI azonosítószáma (GI..) 3. Első 5 találat találat hasonlósági % 4. Első 5 találat nukleotid különbségek száma 5. Első 5 találat nukleotid hossza (bázisban)