MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA Előadások témája: Elsősorban a DNS, a gének és genomok molekuláris biológiája Előadásokra járni kötelező, de nincs névsor olvasás. Zárthelyi dolgozat nincs. Vegyész és hidrobiológus MSc hallgatóknak az első kilenc előadás az anyag. Tételsorok mindenkinek a honlapon: Genetika / Hallgatóknak (oktatási anyagok) usrname/passwd: genetika/mendel Az előadások anyaga PDF-ben szintén itt megtalálható. A honlapra az előadások elhangzása után kerül fel a frissített anyag. SEGÍTSÉG A TANULÁSHOZ: Bálint Miklós: Molekuláris biológia I. II. Műszaki Könyvkiadó, Budapest 2006. Szeberényi József: Bevezetés a molekuláris sejtbiológiába, Dialóg-Campus, 2011. További ajánlott könyvek: Hídvégi Egon (szerk.) A genom 2003 Budapest, Széphalom Könyvműhely Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter: Molecular Biology of the Cell, 5th Edition Garland Science, New York 2008. Sandy B. Primrose, Richard Twyman: Principles of Gene Manipulation and Genomics, 7th Edition January 2006, Wiley-Blackwell MolCellBiol5: www.ttk.pte.hu/biologia/genetika/mbiol/molcellbiol5.pdf 1-1
Molekuláris biológia mindaz, ami a molekuláris biológusokat érdekli (F. Crick) MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA Az életjelenségek molekuláris hátterének megértése. 1865-1910: Az öröklődés kromoszomális elmélete (Mendel, Morgan) 1938: A molekuláris biológia elnevezés Warren Weaver amerikai matematikustól ered, aki a Természettudományi Osztály igazgatója is volt a Rockefeller Alapítványnál. 1930-40-es évek: több fizikus is a biológia felé fordul 1940-es évek: Beadle és Tatum - a gének a bioszintézis utak enzimeit határozzák meg - egy gén egy enzim 1944: Erwin Schrödinger: What is Life? (a gén aperiodikus kristály, kovalens kötésekben hordozza a genetikai információt fehérje?) 1944: Avery a transforming principle a DNS 1952: Hershey és Chase perdöntő bizonyíték: a bakteriofágok szaporodásakor csak a DNS jut be a sejtbe 1953: Watson és Crick a DNS szerkezete alkalmas az információ tárolásra és a másolásra. 1-2
DNS SZERKEZET ÉS REPLIKÁCIÓ GRIFFITH és AVERY kísérleti rendszere 1868. - Friedrich MIESCHER: nuklein 1928. - Frederick GRIFFITH: transzforming principle Streptococcus (Pneumococus) 1944. - Oswald AVERY: a DNS a transforming principle Frederick Griffith 1928-ban fedezte fel a jelenséget Streptococcus (Pneumococus) törzsekkel végzett kísérletezés közben. A Streptococcus pneumoniae S variánsa (smooth = síma) a beoltott egereket megbetegítette, míg az R variáns (rough = rücskös) nem. Ha az S variánst hőkezelte, szintén nem okozott betegséget, de a hőkezelt S és az élő R variáns összekeverése után megjelent ismét a patogén S variáns. Az anyagot, amely az R variánst S variánssá alakította Griffith "transforming principle" néven emlegette. Kémiai természetéről nem volt fogalma. Oswald Avery bizonyította 1944-ben, hogy ez az anyag a DNS. Lásd még: Genetika web jegyzet 1-3
DNS SZERKEZET ÉS REPLIKÁCIÓ 1944. - Oswald AVERY: a DNS a transforming principle AVERY kísérlete: Az S virulens baktériumtörzs tisztított lizátumával is lehet transzformálni. Ha az egyes komponenseit (fehérjék, RNS, DNS) külön-külön megemésztik, akkor a transzformáló képesség csak a DNS degradáció hatására szűnik meg. " Így egy ismert kémiai anyaggal megjósolható örökletes változások idézhetők elő a sejtekben. Ez volna a genetikusok régi álma!... olyan ez a DNS mintha egy vírus volna, vagy maga a gén." A tudományos közvélemény még kételkedik (1944). A DNS szerepét bizonyító döntő kísérletet Hershey és Chase végezte el 1952-ben. Lásd még: Genetika web jegyzet 1-4
1952. - Alfred HERSHEY és Martha CHASE T2 fágokkal végzett perdöntő kísérletet. vagy 35S izotópot alkalmazva P 32 1953. - James D. WATSON és Francis CRICK (Rosalind Franklin, Maurice Wilkins) Lásd még: Genetika web jegyzet HERSHEY és CHASE kísérlete: 32P -jelölt DNS vagy 35S izotóppal jelzett fehérjeburok T2 fágoknál E. coli sejtek fertőzése és centrifugálás csak a DNS jut be, a fehérjék a felülúszóban maradnak. 1-5
A nukleinsavak alkotó elemei Guanine (G) RIBOSE DEOXYRIBOSE DNS N-tartalmú bázisok (A, T, G, C) dezoxiribóz foszforsav foszfodiészter kötés 3 -OH, 5 (P) RNS ribóz, és T helyett U 1-6
1953. - James D. WATSON és Francis CRICK (Rosalind Franklin, Maurice Wilkins) Chargaff-szabályok Röntgen diffrakciós eredmények Modell építés 1-7
TAUTOMER FORMÁK guanin és timin: oxo és ritkán enol forma adenin és citozin: amino és ritkán imino forma 0,01 % arányban, ami 1/10.000 rész 1 óra alatt 0,36 sec. rossz bázispárosodás mutációk (lásd Genetika anyag) 1-8
DNS komplementer, kettős szálú antilparalel irányultság (5 3 ) H-híd kötések RNS egyszálú (de kettős szálú részek a másodlagos szerkezetben) Lásd még: Genetika web jegyzet Watson: A kettős spirál 1-9
Milyen a replikáció? konzervatív? szemikonzervatív? diszperzív? Meselson és Stahl kísérlete. E. coli sejtek, 15N jelölés egyensúlyi sűrűséggrádiens ultracentrifugálás, egy illetve két osztódás után. Milyen sűrűségű DNS keletkezik? 1-10
A DNS-polimerázok jellemzői 5'-3' polimeráz aktivitás 5'-3' exonukleáz 3'-5' exonukleáz aktivitás Az új szál szintéziséhez kell: templát DNS primer (szabad 3 OH) dntp (datp, dctp, dgtp, dttp) új szál primer 5 3 3 3 templát 5 A pol III enzimkomplex 1000 bázis/sec. sebességgel halad (60 kb/min = 1800 kb/ 30 min = két irányban 3600 kb). Az E. coli kromoszóma 4700 kb. Osztódás 40 percenként. Ha a DNS-t vasúti sínnek tekintjük (talpfa = bázispár), akkor a polimeráz olyan vonat, amely 3600 km/óra sebességgel halad! 1-11
Replikáció szemikonzervatív: mindkét régi szállal szemben új szál szintetizálódik (Messelson-Stahl kísérlet). vezető szál: folyamatosan szintetizálódhat 5-3 irányban (a szintézis iránya megegyezik a replikációs villa haladási irányával). követő szál: szakaszosan épül fel (a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa haladási irányával). A "követő szál" szintézise mindig RNS primer (5-60 nt) szintézisével kezdődik, és egy 1000-2000 bázis hosszú DNS-szakasz szintézisével folytatódik. Felfedezőjük után Okazaki fragmenteknek nevezzük őket. Az Okazaki fragmentek folyamatos szállá kapcsolásában az első lépés az RNS-primerek eltávolítása, amelyet a DNS polimeráz I enzim végez (5'-3' exonukleáz aktivitás), a második lépés pedig a két szomszédos DNSfragment között a foszfodiészter kötés kialakítása, amelyet a DNS-ligáz enzim katalizál. 1-12
DNS-ligáz által katalizált reakció ATP energiájának felhasználásával helyreállítja a cukor-foszfát gerinc folytonosságát (foszfodiészter kötés kialakítása). Az enzim előbb egy aktivált ligáz-amp formává alakul, ami elég energiával rendelkezik a kovalens kötés létrehozásához. A ligázoknak fontos szerepe van a génsebészetben is a különböző eredetű DNS-szakaszok összekapcsolásában (lásd később). 1-13
Az ábra térben kiterítve mutatja a replikációs villát. A valósághoz közelebbi kép a 11-30 ábrán látó. alkotóelemek: topoizomeráz helikáz SSB fehérjék primosoma, primase, DnaB, DnaC, DnaT pria, prib, pric primer DNS polimeráz III DNS polimeráz I DNS ligáz 1-14
1-15
DNS topoizomerázok I-es típus: csak az egyik szálat vágja II-es típus: mindkét DNS-szálat elvágja (pl. giráz) 1-16
E. coli egy kezdőpont (oric), két irányba DnaA protein kötőhelyek Terminus vagy ter szekvenciák (terda és tercb) jelzik a replikáció végét terda tercb 1-17
Eukarióta sajátságok több, lineáris kromoszóma, nagyságrendekkel nagyobb DNS állomány, kromatin szerkezet hisztonok Legalább tízszer lassabb a replikáció sebessége, mint prokariótáknál. A kromoszóma kitüntetett részei az ARS (autonomously replicating sequences) mellett a centromeron és a két telomer szekvencia 1-18
A telomeráz egy rendhagyó DNS polimeráz. Saját RNS templátot hordoz, ismétlődő, rövid szekvenciát szintetizál a telomerekben (gerinceseknél TTAGGG). Az RNS templát génben hibás egér mutáns 4-6 generáció után szaporodásképtelen. A rendszer a testi sejtekben inaktív, a daganatos sejtekben újra aktív. 1-19
A GENOM MEGISMERÉSÉNEK MÓDSZEREI 1-20
DNS-izolálás alkoholos kicsapás feltárás, fehérje mentesítés CsCl sűrűséggradiens ultracentrifugálás affinitás kromatográfia A kromoszómális DNS és a plazmid DNS elkülöníthető PLAZMID 1-21
PLAZMIDOK kromoszóma A plazmidok a kromoszómától függetlenül, önállóan replikálódó cirkuláris DNS molekulák, amelyek nagyon sok baktériumfajban természetes módon előfordulnak. Általában olyan, különleges tulajdonságokat kódoló géneket hordoznak, amelyek a környezethez való jobb alkalmazkodást segítik, de nem szükségesek minden körülmények között a gazdaszervezet életben maradásához (nehézfém rezisztencia, toxin termelés, antibiotikum rezisztencia, speciális anyagcsere utak, restrikciós-modifikációs rendszerek, patogenitás és szimbiózis... ). A baktériumok konjugáció segítségével géncsomagokat adhatnak át egymásnak, amikor a DNS a donor sejtből átjut a recipiensbe. A konjugációt meghatározó gének plazmidon helyezkednek el. (konjugatív plazmidok). Ha egy plazmid csak azonos vagy közel rokon baktériumfajok egyedeibe képes bejutni, akkor szűk gazdaspecifitással, ha távoli rokon fajok között is képes közlekedni, akkor széles gazdaspecifitással bír. A plazmidoknak jelentős szerepe van a horizontális (fajok közötti) géntranszferben (lásd antibiotikum rezisztenciák elterjedése). 2010.09.21. plazmid Egy plazmid mérete néhány kilobázistól (103 bp) a megabázis (106 bp) nagyságrendig terjedhet, azaz meg is haladhatja egy kisebb baktériumkromoszóma méretét. Egy plazmidból általában több példány, akár több száz kópia is lehet egy sejtben. Vannak kis és nagy kópiaszámú plazmidok. Általában igaz az, hogy a nagy plazmidok kis kópiaszámúak. Többféle plazmid is lehet ugyanabban a sejtben. Ha két plazmid nem képes egy sejten belül együtt megmaradni, replikálódni, azaz "nem összeférhetőek" (inkompatibilisak), akkor azonos inkompatibilitási csoportba tartoznak. A csoportba tartozás például incp, incq, incw... stb. a replikációs kontroll mechanizmustól függ. 2-22
VÍRUSOK MESTERSÉGES PLAZMIDOK Napjainkban számtalan, mesterségesen "összeállított" plazmid létezik. A DNS-klónozás és szekvenálás, a génexpresszió vizsgálata, fehérjék termeltetése terén egyaránt hasznos eszközök. Ezekről később lesz szó. 2010.09.21. A sejtekben önállóan, a kromoszómáktól függetlenül nagy példányszámban replikálódó egységek a vírus genomok is. A baktériumok vírusainak, a bakteriofágoknak jelentős szerepe van a klónozásban, de eukarióta rendszerek is ismertek. Ezekről is később esik majd szó. 2-23
A plazmid DNS A plazmidok a baktériumsejtben kovalensen zárt, cirkuláris DNS molekulaként vannak jelen, amelyek még önmagukra is fel vannak csavarodva. Ezt a formát kovalensen zárt cirkuláris (CCC, covalently closed circular) formának hívjuk. Különböző enzimek vagy fizikai erők hatására törés keletkezhet az egyik szálon, és ekkor a plazmid nyitott cirkuláris formát (OC, open circle) vehet fel, kitekeredik. Durvább fizikai behatásra vagy restrikciós endonukleázok alkalmazásával a plazmid DNS lineáris molekulává tehető, illetve több lineáris fragmentté darabolható. A CCC, OC és a lineáris formák, bár molekulatömegük (hosszuk) azonos, különböző sebességgel mozognak az agaróz gélben, mert más a térkitöltésük. A CsCl grádiensen is elválasztható a CCC és a többi forma, ha etídium bromidot keverünk az oldatba. Az etídium bromid kevésbé tud behatolni a zárt CCC formába, ezért az tömörebb marad, és nagyobb marad a fajsúlya. A lineáris és OC formák sokkal több etbr molekulát kötnek meg és a fajsúlyuk ezért lényegesen kisebb lesz. 2010.09.21. 2-24
Jóslatok és a valóság a molekuláris biológiában. Mennyire látható előre a tudomány fejlődése? 1968 Simone de Beauvoir "Minden ember halandó" 1-25
G. R. Taylor: Biológiai pokolgép 1968 1-26
Bakteriofág tarfoltok (plakkok) a baktérium pázsiton. Egy fáglizátumban lévő fágok száma higítások készítésével meghatározható. Akár 1011/ml fágrészecske is lehet. Megítélhető-e, hogy milyen tudományos eredmény fog idővel milliárdokat hozni? Az alábbi kísérlet gyakorlati hasznát nem látta senki előre. A restrikció - modifikáció felfedezése Az E. coli K törzsön növesztett lambda fág jól fertőzi az E. coli C törzset is. Azonos eredményt ad a fágszám (fágtiter) meghatározás (EOP=1, efficiency of plating, lemezelési hatékonyság). Az E. coli C törzsön növesztett fág titere csak töredéke a valóságos fágszámnak, ha a K törzsön titráljuk (EOP= 10-4). A K törzs korlátozza a C törzsön keletkezett fágok fertőzését. Csak minden 1/10.000. fágrészecskét lehet kimutatni (képes elszaporodni). Hogyan? 1-27
1968. -amikor a Taylor könyv is megjelent... modification is accompained by the appearance of 6-methylamino purine at a limited number of sites within the DNA. The absence of this methylation might then allow an appropriate restriction activity to alter the DNA such that its biological activity is destroyed. 1-28
A rekombináns DNS technológia a DNS szakasz azonosítása, izolálása A különböző DNS-szakaszok izolálására, vágására, összekapcsolására és megsokszorozására, a génszabászkodásra, a legegyszerűbb használatban lévő kifejezés a klónozás. Ezen azonban több dolgot is érthetünk. A klón valaminek a tökéletes mása, így a klónozás alatt a biológiában érthetjük az ivartalan szaporítást (dugványozás), de a sok vitát kiváltott legújabb technikát, a reproduktív klónozást is. A DNS-klónozás, vagy az in vitro rekombináns DNS technika már pontosabb kifejezés, csak nehézkes. Angolban a genetic engeneering vagy genetic manipulation meghatározásokat is alkalmazzák, de magyarra fordítva egyik sem hangzik valami jól. A gén manipuláció egyenesen valami rosszat sejtet, pedig erről szó nincs. Maradjunk a DNSklónozásnál. Ahhoz, hogy egy DNS-szakasz (gén) szerkezetét, működését megismerjük, el kell különíteni azt a genom többi részétől és meg kell sokszorozni. hordozóba építése VEKTOR + DNS-fragment REKOMBINÁNS DNS-molekula BEJUTTATÁS gazdasejtbe, pl.:transzformáció ELSZAPORÍTÁS TISZTÍTÁS és vizsgálat (DNS-szekvencia meghatározás és egyebek) 1-29
A restrikciós endonukleázok W. Arber feltárta a fágszaporodás korlátozását okozó jelenséget és felfedezte a restrikciós-modifikációs rendszereket A restrikciós rendszerek darabolják az idegen DNS-t, specifikus DNS-metiláz és endonukleáz aktivitások vannak a sejtben. A metiláz véd, a restrikciós endonukleáz pedig hasít, ha nincs metilálva a DNS. H. Smith - az első enzimek tisztítása, jellemzése (HindII) Werner Arber D. Nathans felhasználás, a fizikai térképezés ötlete Hamilton O. Smith 1978 Daniel Nathans D. E. Berg - felhasználás, az első DNS-klónozás megvalósítása SV40::lambda fág, 1972, klónozási moratórium INDULAKUTYASATYUKALUDNI Paul Berg INDULAKUTYASATYUKALUDNI 1980 1-30
A restrikciós modifikációs (RM) rendszerek feltehetően a bakteriofág fertőzések megakadályozására alakultak ki. Az RM gének megtalálhatók sok baktérium kromoszómáján, vagy a bennük természetesen előforduló plazmidokon (lásd később), esetleg profágon. A rendszert kódoló gének egymás mellett helyezkednek el. Sok bakteriofág rendelkezik antirestrikciós rendszerrel. Ezek között van saját DNS módosító enzim (hidroximetil citozin), SAM hidrolizáló enzim, restrikciót gátló és metilálást gyorsító fágfehérje is. De van olyan baktériumtörzs is, amelyben a PvuRtsI1 enzim csak a hidroximetil citozin bázisokat tartalmazó DNS-t hasítja. 1-31
A restrikciós endonukleázok (röviden restrikciós enzimek) a kettős szálú DNS molekula meghatározott bázissorrendű szakaszait ismerik fel és ha az nincs a megfelelő módon metilálva akkor mindkét cukor-foszfát láncot egy adott ponton hidrolizálják ("hasítják"). Több típusuk van aszerint, hogy a felismerés és hasítás hol és hogyan történik. (lásd az előző táblázatot). Nevezéktan: A restrikciós enzimek arról a mikroorganizmusról kapják nevüket, amiből izolálták őket. Az első három betű a faj latin nevéből ered (Hin), a következő néhány betű/szám a törzsre utal (d), az elnevezés végén a római szám pedig a törzsben lévő többféle enzim megkülönböztetésére szolgál (lásd HindII, HindIII). A 3 adeninnél metilált szekvenciát az EcoRI restrikciós enzim nem hasítja. 1-32
A II. típusú restrikciós enzimek leggyakrabban 4-es vagy 6-os ún. palindrom szerkezetű (pontszimmetrikus) felismerőhellyel rendelkeznek és azon belül, az enzimre jellemző módon hasítanak. A keletkezett DNS fragmenteknek a hasítás következtében tompa végük (blunt end), vagy ragadós végük (cohesive vagy sticky end) lesz. 5 ragadós vég: ha a hasítás után az egyszálú szekvencia az 5 végen található. 3 ragadós vég: ha a hasítás után az egyszálú szekvencia az 3 végen található. A ragadós végeket csak hidrogénhíd kötések tartják össze, ezért gyorsan elválnak egymástól, de időlegesen össze is kapcsolódhatnak. Ez a folyamat a hőmérséklettől is függ. 1-33
Fragmentek összekapcsolása: ligálás Az oldatban lévő DNS-fragmentek összekapcsolódása csak a végek szerkezetétől függ. Bármilyen eredetű két vagy több DNS-fragment összekapcsolódhat, ha megfelelő, ún. kompatibilis ragadós véggel rendelkezik. Az időleges kapcsolatot a foszfodiészter kötés kialakításával a DNS-ligáz enzimek stabilizálhatják. A reakcióban részt vevő ATP csak energiát szolgáltat! A kovalens kötés létrehozásának feltétele az 5 -P és a 3 -OH csoportok megléte. A különböző restrikciós enzimekkel létrehozott ragadós végek lehetnek kompatibilisek a ligálás szempontjából, de a létrejövő hibrid szekvenciát nem biztos, hogy a fragmentek létrehozására használt enzimek felismerik. Tehát a kompatibilitás nem jelenti feltétlen a ligálás után a korrekt felismerési hely helyreállását. Az MboI (4-es felismerő hely, lásd előbb) által létrehozott vég összeillik a BamHI véggel (6-os felismerési szekvencia), de a létrejövő fúziós szekvenciát biztosan csak az MboI enzin tudja ismét hasítani. A SalI és XhoI enzimekkel létrehozott végek összekapcsolódhatnak, de egyik enzim sem ismeri fel a hibrid hely szekvenciáját (CTCGAC, nem palindrom). 1-34
1-35
A különböző restrikciós endonukleázok adatait tartalmazza a REBASE adatbázis. Ma több mint 3500 különböző mikroorganizmusból tisztított II-es típusú, enzimet ismerünk, ami 239 féle különböző felismerési szekvenciát jelent. Tehát sok ismert enzimnek azonos a felismerési, hasítási szekvenciája, de különböző mikroorganizmusból származnak. Ezeket izoskizomereknek nevezzük. Variációk egy témára: 4 betű 4 pozíció - 44 = 256 4 betű, 6 pozíció - 46 = 4096 4 betű, 8 pozíció - 48 = 65536 Tehát elvben 4096 különböző specifitású, 6-os felismerési szekvenciával rendelkező enzim lehetséges*. Egy szekvencián belül pedig átlagosan minden 4096. bázisnál fordul elő egy adott, 6-os felismerési szekvenia. *A lehetséges palindrom szekvenciák száma ennél jóval kisebb. Egy hatos szekvencia esetében valójában 3 pozíció változhat csak szabadon, a többi az első 3 betű által meghatározott. GAT esetén GATatc lehet csak TGC esetén TGCgca lehet csak 1-36
A restrikciós enzimek ma már kereskedelmi forgalomban kaphatók. Sok esetben már nem az elnevezésüket adó törzsből tisztítják őket, mert ez költséges. A megfelelő géneket expressziós vektorba építve (lásd később) mesterségesen termeltetik a fehérjét. Így sokkal nagyobb mennyiségben és olcsóbban állíthatók elő. 1-37