A szívizomzatban termelõdõ urocortin fehérje jelentõsége az ischaemiásreperfúziós

A szívizomzatban termelõdõ urocortin fehérje jelentõsége az ischaemiásreperfúziós károsodásokkal szemben Az ischaemiás szívbetegség (ISZB) napjainkban az egyik fõ morbiditási és mortalitási tényezõ a fejlett országokban. Számtalan hatékony terápiás protokoll létezik, mégis nagyon fontosak azok a kutatások, melyek a prevenció lehetõségeit vizsgálják, így megoldást keresnek az érintett rizikócsoportokban a súlyos szövõdmények kivédésére. Ezért vizsgálatainkban hangsúlyt helyeztünk a szívizom endogén adaptációjára, mely a mai tanulmányok szerint a hatékonyan növeli a miokardium ellenálló képességét ischaemiás-reperfúziós (I/R) károsodásokkal szemben, ezáltal limitálja a fellépõ irreverzibilis károsodásokat, továbbá csökkenti az akut miokardiális infarktus (AMI) utáni súlyos szövõdményeket. Cserepes Barbara Petz Aladár Megyei Oktató Kórház, Gyõr A SZÍVIZOMZAT ENDOGÉN ADAPTÁCIÓJA Az adaptációnak a szervezet, a szövetek, szervek, illetve a sejt szintjén megnyilvánuló különböző mechanizmusait ismerjük. A prekondicionálás (PC) a szervezet egyik leghatékonyabb endogén adaptációs mechanizmusai közé tartozik, melyben rövid ideig tartó különféle stressz-ingerek (mint pl. a hipoxia, különböző fizikai és farmakológiai inzultusok) ellenállóvá teszik a szervezetet hosszan tartó, letális inzultussal szemben. 19-ban Murry és munkatársai (1) írták le első ízben, hogy rövid ideig tartó ischaemiás stimulusokkal csökkenthető a koszorúér elzáródását követő szívizominfarktus kiterjedése. A jelenséget ischaemiás PC-nak nevezték el, mely hatékony védelmet nyújt I/R-károsodásokkal szemben, azonban a klinikai gyakorlatban való alkalmazását korlátozta, hogy csak tervezett beavatkozások esetén valósulhatott meg. Ennek következtében számos olyan vizsgálatot végeztek, melynek során új endogénvédő fehérjék indukálását kívánták elérni. 3-ban Vinten-Johansen és munkatársai arra lettek figyelmesek, hogy tartósan fennálló ischaemiát követően a reperfúziós periódus kezdetén alkalmazva a rövid intermittáló hipoxiás stimulusokat, ugyancsak megfelelő védelemi reakció indul el a szívizomszövetben. () A jelenséget a prekondicionálás mintájára ahhoz hasonlóan, posztkondicionálásnak (PS) nevezték el. A PS mechanizmusának létrejöttében a következő elméletek játszanak szerepet (3): a mechanikai elmélet szerint PS során csökken az intravazális nyomás és a mikrovaszkuláris károsodás, illetve csökken a folyadék érpályából történő kiáramlása. A celluláris elmélet alapján az intracelluláris oxidánsok és Ca+ szint csökken, illetve a mitokondriális permeability transition pore (mptp) nyitása gátlódik, ezek által csökken az apoptózis és nekrózis kialakulása. A molekuláris magyarázat szerint a PI3-kináz, p-akt, ERK 1/-túlélést segítő (survival) jelátviteli utak aktiválása; antiapoptotikus enzimek termelődése vezet az ischaemiás károsodás kivédéséhez. AZ UROCORTIN 1995-ben Vaughan és munkatársainak () patkány-középagyból sikerült egy aminosavból álló fehérjét izolálni, mely 5%-ban azonos szekvenciájú a corticotrophin releasing-faktorral (CRF), és szerkezetében hasonlít a halakban termelődő urotensin hormonhoz. Ez a magyarázata, hogy a CRF faktorcsalád legújabb tagjaként, urocortinnak (UCN) nevezték el. A CRF-család polipeptidjei a hypothalamus hipofízis mellékvese tengelyen keresztül szerepet játszanak a szervezet viselkedési formáinak kialakításában, illetve a különböző stressz-ingerre adott válaszreakciókban. (5) Felfedezése óta az UCN-t az emberi központi idegrendszeren () kívül kimutatták a petefészekben (7), a tüdőben, a placentában (), Cserepes Barbara a mellékvesében, a gasztrointesztinális traktusban (9), a limfocitákban (), és nem utolsósorban a szív- és érrendszerben is (11). Szövettani vizsgálatok szerint szívelégtelenségben szenvedő betegek miokardiumából kivett mintákon az UCN intenzívebben expresszálódik, mint egészséges szívizomszöveten. () A CRF-család fehérjéi a sejtfelszínen elhelyezkedő CRF-receptorokhoz CRF-R1 és CRF-R kapcsolódnak, és G-proteineken keresztül az adenilát-cikláz enzimet aktiválják. Az UCN és CRF egyenlő mértékben kötődik a CRF-R1-hez, melyet elsősorban az agyban és a hipofízisben mutattak ki (13); ezzel szemben a -es receptorhoz az UCN -szer erősebb affinitással képes kapcsolódni, mint a CRF. Izolált szívizomsejteken végzett kutatások szerint UCN-nal kezelve a sejteket az ischaemiát megelőzően, illetve a reoxigenizáció kezdetén, hatásos sejtvédelmi reakcióutak aktiválódnak a mitogén aktivált protein kináz (MAPK) jelátviteli kaszkádrendszeren keresztül. (1) A p/p MAPK foszforilációjának gátlásával megszűnik az UCN infarktus területcsökkentő hatása Langendorff-modellen végzett vizsgálatok alapján. (15) További kutatások igazolták, hogy az UCN indukálva a protein kináz C (PKC)-t és ATP-szenzitív I MAGYAR ORVOS

K + (K + ) csatornát, az ischaemiás PC-hoz ATP hasonló kardioprotekciót vált ki. (1) CÉLKITÛZÉSEINK Kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogy az urocortin milyen mértékben nyújt hatásos védelmet ischaemiás-reperfúziós károsodásokkal szemben összehasonlítva az ischaemiás posztkondicionálással újszülött patkányból izolált szívizomsejt-tenyészeten. ANYAG ÉS MÓDSZER 1. ábra. Kísérleti csoportjaink protokollja A/1 csoport A/ csoport A/3 csoport A/ csoport B/1 csoport B/ csoport B/3 csoport B/ csoport A protokoll SZÍVIZOMSEJTEK IZOLÁLÁSA Újszülött Wistar patkányokból ( napos) kipreparált szívek kamrai területét egy korábban leírt módszer alapján (17) előkészítettük, majd az így nyert szövetet -es típusú kollagenáz (GIBCO) emésztésnek tettük ki. Miután a sejtek teljesen szétválasztódtak, oldatukat µm nylonhálón (BD Biosciences Cell Strainer) szűrtük át. Ezt követően a sejtszuszpenzió a következő anyagokat tartalmazó tápoldatba került: DMEM/F- (GIBCO), IU/ml penicillin,,1 mg/ml streptomycin (GIBCO), 1,% mm L-Glut (GIB- CO), % fetal bovine serum (FBS, GIBCO). Majd a filtrált sejtoldatot centrifugáltuk, és a sejteket DMEM/F- % FBS sejtmédiumot tartalmazó mm átmérőjű műanyag Petri-csészében 5 percen keresztül inkubátorba helyeztük (5% CO, 95% levegő, 37 C). A gyorsan letapadó nem miokardiális eredetű sejtek letapadnak, ezáltal a szívizomsejtek elkülöníthetők más típusú sejtektől. Ezt követően a sejtoldatot lyukú tenyésztőedénybe (BD Falcon) vittük át, ügyelve a sejtek egyenletes eloszlására. óra elteltével a sejteken tápoldatot komplett szérummentes médiumra (CSFM) (DMEM/F-,,5 mg/ ml BSA, 1 µm insulin, 5, µg/ml transferrin, 3 nm szelenium,, mm Na-piruvát,,1 1 nm T 3, IU/ml penicillin,,1 mg/ml streptomycin) cseréltük, mely egyrészt gátolta a sejtszuszpenzióban maradt más sejttípus proliferációját, másrészt tartalmazta a szívizomsejtek aktív összehúzódásához szükséges tápanyagokat. nap elteltével egysejtrétegű spontán dobogó szívizomsejt-tenyészet jött létre. POSZTKONDICIONÁLÁS ISCHAEMIÁS STIMULUSSAL ÉS UROCORTINNAL Izolált szívizomsejteken a hipoxiás stresszingert egy korábban leírt ischaemiás pufferben (1) történő inkubálással valósítottuk meg. Ischaemiás pufferben tartva a sejteket, az alacsony ph-érték és a jelen lévő glükózantimetabolit hatására lejátszódó reakciók megfelelnek az oxigénhiányos állapotokra adott válaszreakcióknak. Az ischaemiás puffer összetevői a következők: 137 mm NaCl, 3,5 mm KCl,, mm CaCL, H O,,51 mm MgSO 7H O, 5,55 mm D-glucose, HEPES, % FCS, mm -deoxy-d-glükóz and mm DL-laktát (ph,5). Komplett szérummentes médium 3 ischaemia 3 ischaemia 3 ischaemia B protokoll Komplett szérummentes tápoldat ischaemia ischaemia ischaemia = perc urocortin kezelés = perc ischaemia = reperfúzió Amíg a vizsgált sejtek szimulált hipoxiás környezetben az ischaemiás pufferben inkubálódtak, a kontrollsejteket CSFM mediumban tartottuk. Hosszan tartó ischaemiát követően (ischaemiás puffer) perc reperfúzió után a szívizomsejteket percre ischaemiás pufferben, illetve UCN-nal kiegészített sejtoldatban inkubáltuk, melyet óráig tartó reperfúzió követett normál, a sejtek számára optimális tápoldatban. LAKTÁT DEHIDROGENÁZ (LDH) ENZIMMÉRÉSEK A kísérlet végén a szívizomsejt-tenyészetről származó sejtmédiumot folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd spektrofotometriás módszerrel a 3 nm-es tartományban határoztuk meg a sejtek által médiumba bocsátott nekrózis enzimszintjét. NEKRÓZIS- ÉS APOPTÓZIS-VIZSGÁLATOK A médium eltávolítását követően a miokardiális sejteket,5%-os tripszin és, %-os EDTA keverékében 37ºC-on feloldottuk a tenyésztőedény aljáról, majd centrifugálást követően PBS-sel mostuk át a sejtszuszpenziót. A sejtoldat 5 µl-hez 5 µl tripán kék festéket adva az élő és a tripán kék pozitív halott sejteket a Bürker-kamra 1 mm -es területén számoltuk meg, és a sejthalál mértékét a tripán kék pozitív sejtek százalékos arányában adtuk meg. Az Annexin V-FITC festési eljárással meghatározható azon sejtek mennyiségi aránya, melyek az apoptózis folyamatán mennek keresztül. Az apoptózis, vagyis programozott sejthalál során a membránban levő foszfolipid-poszfatidilszerin (PS) az intracelluláris felszínről a külső, extracelluláris felszínre transzlokálódik, ezáltal az Annexin V mely nagy affinitással képes kötődni a PS-hez képes az apoptózisban lévő szívizomsejthez kapcsolódni. A Propidium-jodid (PI) festék a már nem élő, membránkárosodott sejteket képes megjelölni. A megfestett szívizomsejteket flow cytometriával (FACS Calibur flow cytometer; BD, USA) detektáltuk, és számszerűen fejeztük ki az apoptotizált, illetve nekrotizált sejtek számát. Minden sejttenyészet-mintából 5 sejt került megszámolásra, majd a festett sejtek számát az összes leszámolt sejtek számához viszonyítva adtuk meg a sejtkárosodás mértékét. KÍSÉRLETI CSOPORTOK A PROTOKOLL Az A/1 csoportban a sejteket normál, CSFM médiumban tartottuk. Az A/ csoportban 3 percig ischaemiás pufferben inkubáltuk a miokardiális sejteket, ezt órás reperfúzió követte normál sejtoldatban. Az A/3 csoportban a 3 MAGYAR ORVOS I 1

LDH-tartalom a médiumban (U/I) 3 perc ischaemia (A/ csoport) (A/ csoport) Tripán kékkel festõdött halott sejtek 7 5 3 3 perc ischaemia (A/ csoport) (A/ csoport) LDH-tartalom a médiumban (U/I) 1 perc ischaemia Tripán kék pozitív sejtek (%) 5 3 perc ischaemia. ábra. A szíviziomsejtek által a médiumba bocsátott laktát dehidrogenáz (LDH) enzim szintje (U/l) spektrofotometriával mérve. Az oszlopok az átlagokat és a standard hibát jelenítik meg. (*p<,5 vs A/ és B/ csoport) (PS-prekondicionálás). perces ischaemiás stressz-ingert perces reperfúzió követett, mely után perces ischaemiás pufferben tartottuk a sejteket ezáltal biztosítva a posztkondicionáló stimulust, majd újra normál tápoldatra cseréltük a sejtmédiumot óráig. Az A/ csoportban a 3 perces ischaemia és a perces reperfúzió után percig UCN-nal kiegészített sejtmédiumban inkubáltuk a sejteket, melyet órás reperfúzió követett. B PROTOKOLL A B/1 csoportban a sejteket normál sejtmédiumban tartottuk. Az B/ csoportban perces ischaemiát órás reperfúzió követte normál sejtoldatban. Az B/3 csoportban a perces ischaemiás stressz-ingert perces reperfúzió követte, mely után perces ischaemiás pufferben tartottuk a sejteket ezáltal biztosítva a posztkondicionáló stimulust, majd újra normál tápoldatban inkubáltuk a sejteket órán keresztül. Az B/ csoportban a perces ischaemia és a perces reperfúzió után percig UCN-nal kiegészített sejtmédiumban inkubáltuk a sejteket, melyet órás reperfúzió követett. STATISZTIKAI ANALÍZIS A vizsgálatokat 7 különböző szívizomsejt-tenyészeten végeztük el. Valamennyi adatot átlag és szórással együtt adtunk meg. Az átlagok összehasonlítását kétmintás-t próbával végeztük a különbségeket következetesen akkor tekintettük szignifikánsnak, ha P-értéke kevesebb volt, mint,5. EREDMÉNYEK POSZTKONDICIONÁLT CSOPORTOK (1. ábra) A sejtmédiumba bocsátott LDH szintje az A/ csoportban,1±,73 IU/l volt. Az ischaemiával posztkondicionált csoportban az LDH szintje szignifikánsan csökkent 3,57±, IU/l-re. Az UCNnal posztkondicionált csoportban (A/ csoport) az enzim szintje szintén csökkenést mutatott (,±1,7 IU/l), mely csökkenés azonban nem érte el a szignifikancia szintjét. A normál tápoldatban tartott szívizomsejtek médiumából mért LDH szintje 3,±,3 IU/l volt. Az LDH enzim értékei szignifikánsan csökkentek ischaemiás posztkondicionálás (B/3 csoport: ±,75 IU/l.) és UCN-nal történt PS után is (B/ csoport: 3,±,1 IU/l.), a csupán perc ischaemiának kitett B/ csoporthoz képest (11,71±, IU/l). A B/1 csoportban 3,±,3 IU/l LDH szintet mértünk. A tripán kékkel festődött sejtek száma A/1 csoportban 3,1±,7%, az A/ csoportban 55,±1,9%-os volt. Az A/3 csoportban 39,1±,7%, az A/ csoportban 1,33±,39%-os értékeket mértünk, melyek jelentős csökkenést jelentenek a halott sejtek arányának tekintetében a posztkondicionálás nélküli csoporthoz (A/) képest. A B protokoll szerint kezelt csoportokban a tripán kékre pozitívan festődött sejtek aránya a következők szerint alakultak: B/1 csoportban 3. ábra. Tripán kékkel festõdött halott sejtek %-os aránya. Az oszlopok az átlagokat és a standard hibát jelenítik meg. (*p<,5 vs. ischaemiás csoport) 3,1±,7%, a B/ csoportban 53,±1,57%, a B/3 csoportban,7±1,93%, a B/ csoportban 3,±1,99%. Az Annexin V-FITC-vel jelölődött sejtek aránya mely az apoptózis mértékét mutatja az A/1 csoportban, 7±1,3%-os értéket mutatott. Az A/ csoportban az apoptotizált sejtek aránya,97±,7%-os volt. A különböző módszerekkel végzett posztkondicionálásokat követően az apoptózis mértéke szignifikánsan csökkent: az ischaemiával posztkondicionált csoportban 3,91±,9%-ra, az UCN-nal kondicionált csoportban 5,±1,1%-ra. A B protokoll szerinti B/1 csoportban az Annexin V-tel festődött sejtek aránya, 7±1,3%-ot mutatott. A perces ischaemia és órás reperfúziót követően a B/ csoportban az apoptózis mértéke 3,19±,93%-os volt. Az ischaemiás PS-t követően a B/3 csoportban az apoptózis mértéke szignifikánsan csökkent,9±,%- ra, mely tendencia ugyancsak megfigyelhető volt az UCN-nal posztkondicionált csoportban is (B/): 3,7±,7%. A Propidium-jodiddal megjelölt szívizomsejtek százalékos aránya mely a nekrózis mértékét mutatja szintén csökkenést mutatott a posztkondicionált csoportokban az ischaemiás (A/) csoporthoz képest (11,±,5%): az A/3 csoportban,75±,1%-os, az A/ csoportban 9,±1,9%-os volt a PI pozitív sejtek aránya. A nem kezelt A/1 csoportban a nekrózis mértéke 5,17±,5%-os volt. I MAGYAR ORVOS

Annexin V-FITC pozitív sejtek (%) 7 5 3 3 perc ischaemia (A/ csoport) (A/ csoport) Propidium jodid pozitív sejtek (%) 1 3 perc ischaemia (A/ csoport) (A/ csoport) 1 Annexin V-FITC pozitív sejtek (%) 9 7 5 3 perc ischaemia Annexin V-FITC pozitív sejtek (%) 1 perc ischaemia. ábra. Apoptózis mértéke (flow citometriával mérve az Annexin V- FITC-vel jelölõdött szívizomsejteket) Az oszlopok az átlagokat és a standard hibát jelenítik meg. (*p<,5 vs iszkémiás csoport) 5. ábra. Nekrózis mértéke (flow citometriával mérve a propidium-jodid pozitív sejtek arányát). Az oszlopok az átlagokat és a standard hibát jelenítik meg. (*p<,5 vs ischaemiás csoport) A perces ischaemiának kitett szívizomsejtekben mért nekrózis kiterjedése 1,±,%-os értéket mutatott. Az ischaemia, illetve UCN indukálta PS-nak köszönhetően a B/3 és B/ csoportokban a PI-dal festődött sejtek aránya szignifikáns csökkenést mutatott: a B/3 csoportban,5±,73%, a B/ csoportban,9±,53% volt a PI-dal pozitívan jelölt szívizomsejtek aránya. MEGBESZÉLÉS Az urocortin felfedezését követően a kutatások CRF-ral való hasonlóságának köszönhetően a szervezetet ért stressz-hatásokkal szembeni védelemben betöltött szerepére irányultak. A szívizomzatot érő stresszhatások közül elsősorban az ischaemiás stressz szerepét vizsgálták. Miokardiális sejteket ért hosszan tartó ( órás) hipoxiát követően 1 óra elteltével már kimutatható az UCN fehérjének transzkripciója, majd az újonnan képződött fehérje endokrin/ parakrin módon kapcsolódva a szívizomsejtek és endotheliális sejtek CRF R1-es és CRF R- es sejtfelszíni receptoraihoz, kifejti kardioprotektív hatását. (19) Újszülött patkányból nyert szívizom-sejttenyészeten első ízben vizsgáltuk a stresszszabályozásban jelentős szerepet játszó urocortin sejtvédő szerepét, összehasonlítva az ischaemiás PS-sal. A miokardium ischaemiás kondicionálásával legyen az a pre- vagy a posztkondicionálás rendkívül hatékony adaptációs mechanizmusok indukálódnak, mellyel jelentősen fokozható a szívizom stressz-toleranciája. Amióta ismert, hogy ez az adaptációs válasz nemcsak ischaemiás-reperfúziós ciklusokkal, hanem az I/R hatására keletkező mediátorok (adenozin (), bradikinin (1), opioidok (), prosztaglandinok (3), nitrogén-monoxid (), reaktív oxigén intermedierek (5)) exogén adásával is kiváltható, a jelenség kilépett a kísérletes kardiológia kizárólagos hatóköréből, és fontos helyet kapott a szívgyógyászati gyakorlatban. Ugyancsak elsőként mutattuk ki szívizomsejttenyészeten, hogy a stressz-szabályozásban jelentős szerepet játszó urocortin hatásos védelmet nyújt hosszan tartó ( perces) ischaemiát követően az I/R okozta károsodásokkal szemben, mely protektív hatás összehasonlítható az irodalomban ischaemiás posztkondicionálásnak leírt protektív mechanizmussal. Kísérleteinkben az 1995-ben felfedezett, majd UCN I-nek jelölt fehérje kardioprotektív hatását kutattuk a korai PC folyamatában. Az UCN felfedezése óta a CRF-családnak két újabb tagját is kimutatták: az UCN II-t (stresscopin related peptide) és UCN III-at (stresscopin), melyek a legújabb eredmények szerint szívizomsejteken hatékonyabb antiapoptotikus és antinekrotikus védelmi reakciót indítanak el I/R károsodás esetén főként a CRF -es típusú receptoron keresztül (), azonban értágító hatásuk kevésbé jelentős, mint az UCN-é (7). Vizsgálatainkban szívizomból nyert sejtkultúrákon a nem letális, reverzibilis ischaemiás károsodást egy puffer segítségével idéztük elő, amely hasonlóan az in vivo hipoxiához, metabolikusan gátló miliőt jelentett a sejtek számára. A szívizomból nyert sejttenyészeteinket percre UCN-nal kiegészített médiummal kezeltük, majd 3 órás teszt-ischaemiával és az azt követő órás reperfúzióval vizsgáltuk a kezelés eredményét. Eredményeink alapján elmondható, hogy az UCN, mint farmakológiai ágens, valóban megnövelte a sejtek ellenállását és túlélését hosszan tartó ischaemiás stresszel szemben. Humán vizsgálatokban rövid ischaemiás stimulus, illetve adenozin exogén adásával csökkenthetők a perkután coronaria-intervenció (PCI) során fellépő hipoxia által okozott mechanikai és metabolikus károsodások. (). Mindezek alapján megfontolás tárgyát képezi az UCN terápiás felhasználása tervezett szívsebészeti beavatkozások esetén, mint pl. a coronaria bypass-műtét, szívtranszplantáció, vagy PCI-s coronaria-sztentelés. Összefoglalóan azt mondhatjuk, hogy az urocortinnal végzett prekondicionálás jelentősen csökkenti a sejtkárosodás mértékét tenyésztett szívizomsejteken ischaemiás-reperfúziós inzultus során. Az UCN-nak eddig ismert szív- és érrendszeren kifejtett klinikai hatásai értágító; pozitív inotróp; agyi és pitvari nátriuretikus fehérjetermelés-fokozó; coronaria-vérátáramlást növelő tekintetében és eredményeink alapján megfontolás tárgyát képezi az UCN használata MAGYAR ORVOS I 3

ischaemiás szívbetegségben szenvedő betegek kezelésében. A tudományos munka a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Karának Sebészeti Kutató és Oktató Intézetében történt prof. dr. Rőth Erzsébet programvezető és dr. Jancsó Gábor segítségével. IRODALOMJEGYZÉK 1. Murry C. E., Jennings R. B., Reimer K. A.: Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 19Nov;7(5):1 113.. Zhao Z. Q., Corvera J. S., Halkos M. E., Kerendi F., Wang N. P., Guyton R. A., Vinten-Johansen J.: Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 3Aug;5():H579 5. Erratum in: Am J Physiol Heart Circ Physiol. Jan;. 3. Vinten-Johansen J., Zhao Z. Q., Zatta A. J., Kin H., Halkos M. E., Kerendi F.: Postconditioning. A new link in nature s armor against myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Res Cardiol. 5Jul;():95 3. Epub 5. Mar 3. Review.. Vaughan J., Donaldson C., Bittencourt J., Perrin, M. H., Lewis K., Sutton S., Chan R., Turnbull A. V., Lovejoy D., Rivier C. K.: Urocortin, a mammalian neuropeptide related to fish urotensin I and to corticotrophin-releasing factor. Nature. 1995;37:7 9. 5. Vale W., Spiess J., Rivier C., Rivier J.: Characterization of a 1-residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta-endorphin. Science. 191Sep1;13(51):139 1397.. Takahashi K., Totsune K., Sone M., Murakami O., Satoh F., Arihara Z., Sasano H., Iino K., Mouri T.: Regional distribution of urocortin-like immunoreactivity and expression of urocortin mrna in the human brain. Peptides. 199;19():3 7. 7. Muramatsu Y., Sugino N., Suzuki T., Totsune K., Takahashi K., Tashiro A., Hongo M., Oki Y., Sasano H.: Urocortin and corticotropinreleasing factor receptor expression in normal cycling human ovaries. J Clin Endocrinol Metab. 1;:13 139.. Leitch I. M., Boura A. L., Botti C., Read M. A., Walters W. A., Smith R.: Vasodilator actions of urocortin and related peptides in the human perfused placenta in vitro. J Clin Endocrinol Metab. 199Dec;3():5 513. 9. Muramatsu Y., Fukushima K., Iino K., Totsune K., Takahashi K., Suzuki T., Hirasawa G., Takeyama J., Ito M., Nose M., Tashiro A. Hongo M., Oki Y., Nagura H., Sasano H.: Urocortin and corticotropin-releasing factor receptor expression in the human colonic mucosa. Peptides. Dec;1():1799 19.. Bamberger C. M., Wald M., Bamberger A. M., Ergun S., Beil F. U., Schulte H. M.: Human lymphocytes produce urocortin, but not corticotropin-releasing hormone. J Clin Endocrinol Metab. 199Feb;3():7 711. 11. Kimura Y., Takahashi K., Totsune K., Muramatsu Y., Kaneko C., Darnel A. D., Suzuki T., Ebina M., Nukiwa T., Sasano H.: Expression of urocortin and corticotropin-releasing factor receptor subtypes in the human heart. J Clin Endocrinol Metab. Jan;7(1):3 3.. Nishikimi T., Miyata A., Horio T., Yoshihara F., Nagaya N., Takishita S., Yutani C., Matsuo H., Matsuoka H., Kangawa K.: Urocortin, a member of the corticotropin-releasing factor family, in normal and diseased heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. Dec;79():H331 339. 13. Dautzenberg F. M., Kilpatrick G. J., Hauger R. L., Moreau J.: Molecular biology of the CRH receptors in the mood. Peptides. 1May;(5):753 7. 1. Brar B. K., Jonassen A. K., Stephanou A., Santilli G., Railson J., Knight R. A., Yellon D. M., Latchman D.S.: Urocortin protects against ischemic and reperfusion injury via a MAPK-dependent pathway. J Biol Chem. Mar;75():5 51. 15. Schulman D., Latchman D. S., Yellon D. M.: Urocortin protects the heart from reperfusion injury via upregulation of p/p MAPK signaling pathway. Am J Physiol Heart Circ Physiol. Oct;3():H11 H1. Epub Jun 13. 1. Gordon J. M., Dusting G. J., Woodman O. L., Ritchie R. H.: Cardioprotective action of CRF peptide urocortin against simulated ischemia in adult rat cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 3Jan;(1):H33 33. Epub Sep 19. 17. Tokola H., Salo K., Vuolteenaho O. and Ruskoaho H.: Basal and acidic fibroblast growth factor-induced atrial natriuretic peptide gene expression and secretion is inhibited by staurosporine. Eur J Pharmacol. 199; 7:195. 1. Gordon J. M., Dusting G. J., Woodman O. L., Ritchie R. H.: Cardioprotective action of CRF peptide urocortin against simulated ischemia in adult rat cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 3Jan;(1):H33 33. Epub Sep 19. 19. Kageyama K., Furukawa K., Miki I. et al.: Vasodilative effects of urocortin II via protein kinase A and a mitogen-activated protein kinase in rat thoracic aorta. J Cardiovasc Pharmacol. 3;:51.. Baxter G. F., Marber M. S., Patel V. C. and Yellon D. M.: Adenosine receptor involvement in a delayed phase of myocardial protection hours after ischemic preconditioning. Circulation. 199;9:993 3. 1. Jaberansari M. T. Baxter G. F. Muller C. A. L et al.: Angiotensin-converting enzyme inhibition enhances a subthreshold stimulus to elicit delayed preconditioning in pig myocardium. J Am Coll Cardiol. 1Jun137;(7):199 1.. Schultz J. E. L., Rose E., Yao Z. et al.: Evidence for the involvement of opioid receptors in the ischemic preconditioning in rat hearts. AM J Physiol. 1995;:H157 11. 3. Szekeres L., Szilvassy Z., Udvary E. et al.: 7-oxo-PGI-induced late appearing and long lasting electrophysiological changes in the heart in situ of the rabbit, guinea pig, dog and cat. J. Mol. Cell: Cardiol. 199;1:55 55.. Bolli R., Manchikalapudi S., Tang X. L. et al.: The protective effect of late preconditioning against myocardial stunning in conscious rabbits are mediated by nitric oxide synthase: evidence that nitric oxide acts both as trigger and as a mediator of the late phase of ischaemic preconditioning. Circ Res. 1997;1:9 17. 5. Tritto I., Scognamiglio A., Elia P. P. et al.: Oxygen radicals may mediate preconditioning in isolated hearts. Circulation 1993;(suppl. I):59.. Chanalaris A., Lawrence K. M., Stephanou A. et al.: Protective effects of the urocortin homologues stresscopin (SCP) and stresscopin-related peptide (SRP) against hypoxia/reoxygenation injury in rat neonatal cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 3;35:95. 7. Kageyama K., Furukawa K., Miki I. et al.: Vasodilative effects of urocortin II via protein kinase A and a mitogen-activated protein kinase in rat thoracic aorta. J Cardiovasc Pharmacol. 3;:51.. Leesar M. A., Stoddard M. F., Xuan Y. T. et al.: Nonelectrocardiographic evidence that both ischemic preconditioning and adenosine preconditioning exist in humans. J Am Coll Cardiol. 3Aug;(3):37 5. I MAGYAR ORVOS