COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS

COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tests P/N: 03500756 190 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: 03502295 001 FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System (HPS) egy in vitro nukleinsavamplifikációs vizsgálat a hepatitis B vírus (HBV) DNS mennyiségi meghatározására humán szérumban vagy plazmában. A vizsgálat a manuális minta előkészítésre High Pure System Viral Nucleic Acid Kit-et, az automatizált amplifikálásra és detektálásra COBAS TaqMan 48 Analizátort használ. A COBAS TaqMan HBV Test nem való vér vagy vérkészítményekben HBV jelenlétének szűrésére, illetve diagnosztikus vizsgálatként HBV-fertőzés jelenlétének megerősítésére. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A hepatitis B vírus (HBV) a vírushepatitist okozó számos ismert vírus egyike. Több mint kétmilliárd HBVfertőzött ember van a világon, közülük több mint 350 millió krónikusan fertőzött hordozó 1. A krónikus hordozók magas kockázatúak a fertőzés olyan hosszú távú szövődményeire nézve, mint a krónikus hepatitis, a cirrhosis és a hepatocelluláris karcinóma 2,3,4. Az akut és krónikus HBV-fertőzés diagnosztikus és/vagy prognosztikus indikátoraiként szerológiai markerek használatosak. A HBV-fertőzés legközönségesebb markere a HBV felületi antigén (HBsAg) jelenléte. Bár a hordozókban eltűnhet a HBsAg és HBsAg-ellenes antitest lehet jelen, úgy tűnik, hogy ők továbbra is magas kockázatúak a későbbi élet során megjelenő májszövődményekre nézve 5,6. A HBV e antigén (HBeAg) általánosan használatos, mint másodlagos marker a progresszív májbetegséggel összefüggő aktív HBV-replikáció kimutatására. A HBeAg eltűnésének elmaradása úgy tűnik, hogy növeli a végstádiumú májbetegség kockázatát 7,8. A HBV különböző törzsei vagy termelnek ugyan HBeAg-t, de az nem mutatható ki a szérumban, vagy elveszthetik a HBeAg-termelő képességüket, még akkor is, amikor aktív fertőzés van jelen 9. Ezért ennek a markernek a használata a betegség progressziójának monitorozására korlátozott haszonnal bír 10. Irodalmi adatok szerint a HBV DNS kimutatása a szérumban prognosztikus értékű az akut és krónikus HBV-fertőzések kimenetelét tekintve 11,12,13,14. A módszer lehetővé teszi a HBV DNS kimutatását a HBsAg eltűnését követően 15, illetve a szerológiai marker hiányos HBV kimutatását 16. Mindazonáltal a szerológiai markerek és a HBV DNSszintek közti kapcsolat még nem ismert. A HBV-fertőzött betegek kezelésére alkalmazott antivirális terápia hatékonysága ugyancsak értékelhető szerológiai markerek, illetve májenzimfunkciók mérése révén. Ugyanakkor úgy gondolják, hogy a virális replikáció legközvetlenebb és legmegbízhatóbb mérése a HBV DNS szérumban, illetve plazmában való mennyiségi meghatározása 13,17,18,19. Az alfa-interferon, lamivudin vagy ganciclovir kezelésben részesülő betegekben észlelt HBV DNS-szintek gyors és tartós eséséről kimutatták, hogy prediktív értékű a kedvező kezelési kimenetelre nézve 10,20,21,22,23,24. A HBV DNS-szintek monitorozása alapján megjósolható lehet a lamivudin-rezisztencia kialakulása 25. Emiatt a HBV DNS mérésének mennyiségi vizsgálata egy értékes eszköz, amely más szerológiai markerekkel együtt használható a HBV-fertőzés gondozása során. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS TaqMan HBV Test két fő lépésből épül fel: 1) manuális minta-előkészítés a HBV DNS izolálására; (2) a target DNS automatikus PCR-amplifikálása HBV specifikus komplementer primerek segítségével és a hasított, kettősen jelölt oligonukleotid próbák kimutatása, amely lehetővé teszi a HBV target amplifikált termék (amplikon) és a (mintával egyidejűleg feldolgozott, amplifikált és detektált) HBV belső kontroll DNS mennyiségi meghatározását. A master mix reagens a HBV DNS-re és a HBV mennyiségi standard DNS-re egyaránt specifikus primer párokat és próbákat tartalmaz. A master mixet HBV A-G genotípusok ekvivalens mennyiségi meghatározásának biztosítására fejlesztették ki. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és mennyiségi standard-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a HBV amplikon és a HBV mennyiségi standard amplikon független azonosítását. A HBV DNS mennyiségi meghatározása során HBV mennyiségi standardot kell használni. A HBV mennyiségi standard egy nem fertőző linearizált plazmid, amely a HBV DNS targethez és egy, a HBV mennyiségi standard amplikon és a HBV target amplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbához kötődő régióval identikus primer kötő helyeket tartalmaz. A HBV mennyiségi standard minden egyes mintához és kontrollhoz A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 03584933044-07HU 1

ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, majd a HBV targettel együtt a minta-előkészítési, PCR-amplifikációs és kimutatási lépéseken keresztül megy. A COBAS TaqMan 48 Analizátor a vizsgálati mintákban levő HBV DNS-titert a HBV-szignálnak a HBV mennyiségi standard szignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta és kontroll esetén. A HBV mennyiségi standard kompenzálja a gátló hatásokat, és az előkészítési és amplifikációs folyamatok szabályozásával lehetővé teszi a HBV DNS pontos mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. Minta előkészítése A COBAS TaqMan HBV Test plazma- és szérummintákat dolgoz fel, és HBV DNS-t izolál egy üvegszálakhoz való nukleinsav kötődésen alapuló generikus manuális minta-előkészítés révén. A HBVvíruspartikulumokat magas hőmérsékleten való inkubálás során lizálják egy proteáz és egy olyan chaotrop lízis/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett HBV DNS-t a plazmában és a szérumban lévő DNázoktól. A HBV mennyiségi standard DNS molekulák ismert száma kerül a lízisreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. Ezt követően izopropanol lesz a líziskeverékhez adva, majd egy üvegszálas szűrőbetétes oszlopon az egész lecentrifugálásra kerül. A centrifugálás során a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS az üvegszálas szűrő felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejt eredetű szennyezések a centrifugálás révén eltávolításra kerülnek. Az adszorbeált nukleinsavak mosása és eluálása egy vizes oldattal történik. Az egyszer használatos eszközök 12 minta, illetve ismétlés párhuzamos feldolgozását teszik lehetővé. A HBV DNS-t és HBV mennyiségi standard DNS-t tartalmazó feldolgozott minták az amplifikációs/ kimutatási keverékhez kerülnek hozzáadásra. A HBV target DNS és a HBV mennyiségi standard DNS amplifikálását és kimutatását azután a COBAS TaqMan 48 Analizátor végzi el a teszt készletben biztosított amplifikálási és kimutatási reagensek segítségével. PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A target DNS-szekvencia kiválasztása valamennyi HBV-genotípus genomban a maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik. Következésképpen a primerek és a próba megfelelő kiválasztása kritikus ahhoz, hogy a vizsgálat valamennyi klinikailag releváns HBV-genotípust detektálni tudja. A genotípusok között a részben egyszálú, cirkuláris HBV-genom egy régiója a legnagyobb fokban konzervált DNS-szekvencia. A COBAS TaqMan HBV Test a HBV-genom nagyfokban konzervált pre-core/core régiójában lévő szekvenciáknak megfelelő PCR-amplifikációs primereket használ. Targetamplifikáció A mintákat az amplifikációs csövekben (K-csövekben) lévő amplifikációs keverékhez adják, itt megy végbe a PCR-amplifikáció. A COBAS TaqMan 48 Analizátorban lévő PCR-készülék felhevíti a reakcióelegyet, hogy denaturálja a kettős szálú DNS-t, és hozzáférhetővé tegye a specifikus primer szekvenciákat a HBV cirkuláris DNS genomon és a HBV mennyiségi standard DNS-en. A keverék kihűlésével a primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. A hőstabil Thermus species Z05 DNS-polimeráz (Z05) Mn 2+ és dezoxinukleozid-trifoszfátok (dntps), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin-, dezoxiuridin (timidin helyett)-trifoszfátok feleslegének jelenlétében a kapcsolódott primerhez a target templátnak megfelelően kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak neveznek. A COBAS TaqMan 48 analizátor a folyamatot adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli, ahol az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódik. A szükséges ciklusok számát a COBAS TaqMan 48 analizátor programja tartalmazza. Az amplifikálás a HBVgenomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes HBV-genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A COBAS TaqMan HBV Test a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a mintából AmpErase (uracil-nglikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 26, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dntp-k egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. Továbbá bármilyen nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti mangán okozta aktiválódása után képződik, az AmpErase enzim lebont, javítva ezáltal a specificitást és az érzékenységet. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribózlánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le az amplifikálás során képződött targetamplikont. A PCR-termékek kimutatása COBAS TaqMan Test során A COBAS TaqMan HBV Test valós idejű 27,28 PCR-technológiát alkalmaz. A kettősen jelölt fluoreszcens próbák használata biztosítja a PCR-termék halmozódásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. A HBV-re és 03584933044-07HU 2

a HBV mennyiségi standardra specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző- és egy blokkolófestékkel jelöltek. A COBAS TaqMan HBV Test során a HBV és HBV mennyiségi standard próbák különböző fluoreszcens jelzőfestékkel vannak jelölve. Amíg a fluoreszcens festékkel kettősen jelölt próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája a Förster-féle energiatranszfer jelenség révén a blokkolófesték közelsége miatt gátolt. PCR során a próba hibridizál egy target szekvenciával, és az 5' 3' nukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS polimeráz hasítja. Ha egyszer a jelző- és blokkolófestékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. A HBV DNS és a HBV mennyiségi standard DNS amplifikációja egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon van mérve. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden egyes ciklusban jelentősen növekedve az adott jelzőfestékek emissziós intenzitása, ezáltal lehetővé téve a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS független azonosítását. A szignálok intenzitása a PCR kezdetekor jelenlévő kiindulási anyag mennyiségével mutat összefüggést. A COBAS TaqMan HBV Test mennyiségi meghatározás alapjai A COBAS TaqMan HBV Test pontos kvantitatív eredményeket nyújt egy nagyon széles dinamikus tartományon, mivel az amplikon monitorozása az amplifikáció exponenciális fázisa során történik. Minél magasabb a minta HBV-titere, annál korábban emelkedik a HBV próba jelző festékének fluoreszcenciája az alap fluoreszcenciaszint fölé (lásd 1. ábra). Mivel a HBV mennyiségi standard (QS) DNS mennyisége állandó valamennyi mintában, a HBV QS próba jelzőfestékének fluoreszcenciája valamennyi minta esetén ugyanazon ciklus során kell megjelenjen (lásd 2. ábra). Azokban az esetekben, ahol a QS amplifikálását és kimutatását gátlás vagy rossz mintavisszanyerés befolyásolja, a fluoreszcencia később jelenik meg, ezáltal lehetővé válik a HBV target DNS számított titerének megfelelő módosítása. A specifikus fluoreszcens szignál megjelenését kritikus küszöbértéknek (Ct) nevezik. A kritikus küszöbérték definíció szerint az a tört alakú ciklus szám, amelynél a jelző festék fluoreszcenciája meghalad egy előre meghatározott küszöbértéket (a kijelölt fluoreszcencia szintet), és megkezdődik ezen szignál exponenciális növekedési fázisa (lásd 3. ábra). Egy magasabb kritikus küszöbérték a kiindulási HBV target DNS egy alacsonyabb titerét jelzi. Egy 2-szeres titeremelkedés a target HBV DNS kritikus küszöbértékének 1-gyel való csökkenésével korrelál, míg egy 10-szeres titeremelkedés a kritikus küszöbérték 3,3-del való csökkenésével korrelál. Az 1. ábra egy vírus hígítási sor target növekedési görbéit ábrázolja az 5-log 10 tartományon. Ahogy a víruskoncentráció nő, a növekedési görbék korábbi ciklusokra tolódnak. Emiatt a legbaloldalibb növekedési görbe a legmagasabb vírustiterszinthez tartozik, a legjobboldalibb növekedési görbe pedig a legalacsonyabb vírustiterszinthez tartozik. 1. ábra 9,00 8,00 7,00 Normalizált fluoreszcencia 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 Legmagasabb titer 1,00 0,00 Legalacsonyabb titer -1,00 0 10 20 30 40 50 60 Ciklusszám 03584933044-07HU 3

A 2. ábra egy vírushígítási sorból származó minták mennyiségi standard növekedési görbéit ábrázolja az 5-log 10 tartományon. A mintákhoz adott mennyiségi standard mennyisége állandó minden egyes reakcióban. A mennyiségi standard kritikus küszöbértéke a vírustitertől függetlenül hasonló. 2. ábra 35,00 30,00 Legalacsonyabb titer 25,00 Normalizált fluoreszcencia 20,00 15,00 10,00 5,00 Legmagasabb titer 0,00-5,00 0 10 20 30 40 50 60 Ciklusszám A 3. ábra egy példát mutat be arra, hogyan történik az egyes növekedési görbék összes ciklusban mért fluoreszcencia értékeinek normalizálása. A tört alakú ciklusszámot (Ct) abból határozzák meg, hogy hol keresztezi a fluorszcens szignál a kijelölt fluoreszcenciaszintet. 1 0,9 3. ábra Normalizált fluoreszcencia 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Rögzített fluoreszcenciaszint Ct-érték = 27,1-0,1 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Ciklusszám A HBV DNS mennyiségi meghatározása A COBAS TaqMan HBV Test a HBV vírus DNS mennyiségét egy második targetszekvencia (HBV mennyiségi standard) segítségével határozza meg, amely minden egyes mintához ismert koncentrációban hozzá van adva. A HBV mennyiségi standard egy nem fertőző olyan HBV-szekvenciadarabokat tartalmazó linearizált plazmid DNS konstrukció, amelyek a HBV-targetszekvencia kötő régióival identikus primer kötő régiókat tartalmaznak. A HBV mennyiségi standard szintén előállít egy, a HBV target DNS-sel azonos hosszúságú és bázisösszetételű amplifikációs terméket. A HBV mennyiségi standard amplikon kimutatási próbakötő régióját úgy módosították, hogy a HBV mennyiségi standard amplikon különbözzön a HBVtargetamplikontól. 03584933044-07HU 4

A COBAS TaqMan 48 Analizátorban a PCR annealing fázisa során a mintákat szűrt fénnyel világítják meg és gerjesztik, és minden egyes minta szűrt emissziójú fluoreszcens adatait gyűjtik. Ezután a műszer ingadozásai miatt minden egyes minta leolvasási értéke korrigálva lesz. Ezeket a fluoreszcencia leolvasási adatokat a készülék az AMPLILINK szoftverre küldi, és eltárolja egy adatbázisban. Előellenőrzések történnek annak meghatározására, hogy a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS adatok érvényes sorokat mutatnak-e, és az előre megadott határokon kívülre eső adatok jelzőket kapnak. Valamennyi előellenőrzés befejezése után a készülék a fluoreszcens leolvasásokat feldolgozza, és kritikus küszöbértékeket hoz létre a HBV DNS és a HBV mennyiségi standard DNS számára. A COBAS TaqMan HBV Test mellé biztosított tételspecifikus kalibrációs állandókat használja a készülék a minták és kontrollok titerértékeinek kiszámításához a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS kritikus küszöbértékek alapján. A COBAS TaqMan HBV Test standardizálása nukleinsav-amplifikációs technikákra (NAT) vonatkozó WHO HBV nemzetközi standarddal (97/746 29 ) történt, és a titereredmények nemzetközi egység [International Unit (IU)]/ml-ben vannak kifejezve. REAGENSEK High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 teszt High Pure System vírusnukleinsav kit (P/N: 03502295 001) LYS 2 x 25 ml (lízis-/kötőpuffer) trisz 50% (w/w) guanidin-hcl < 1% urea 19% (w/w) Triton X-100 CAR 2 x 2 mg (RNS, liofilizált) PK 2 x 100 mg (proteináz K, liofilizált) 64% (w/w) proteináz K, liofilizált IRB 1 x 33 ml (inhibitor eltávolító puffer) trisz 65% guanidin-hcl (adjon hozzá 20 ml etanolt) WASH 1 x 20 ml (mosópuffer) trisz NaCl (adjon hozzá 80 ml etanolt) ELB 1 x 30 ml (eluáló puffer) RS 4 x mindegyikből (High Pure System vírusnukleinsav állvány szett) lízisállvány szűrőcsőállvány rögzített hulladék állvánnyal eluáló állvány állványfedél WR 8 x mindegyikből (High Pure System vírusnukleinsav hulladék állvány) 03584933044-07HU 5

COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS (P/N: 03500756 190) Mintaelőkészítő és kontroll reagensek HBV QS (COBAS TaqMan HBV mennyiségi standard) trisz-hcl puffer EDTA < 0,001% linearizált, duplaszálú, inzertet tartalmazó plazmid DNS. A DNS inzert HBV primerkötő szekvenciákat és egy egyedi próbakötő régiót tartalmaz. amarántvörös festék < 0,005% poli-ra RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid HBV H(+)C [HBV magas (+) kontroll] < 0,001% linearizált, duplaszálú, HBV szekvenciákat tartalmazó plazmid DNS Negatív humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR technikával nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer HBV L(+)C [HBV alacsony (+) kontroll] < 0,001% linearizált, duplaszálú, HBV szekvenciákat tartalmazó plazmid DNS Negatív humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR technikával nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer CTM ( ) C [COBAS TaqMan negatív kontroll (humán plazma)] Negatív humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR technikával nem mutatható ki 0,1% ProClin 300 tartósítószer Amplifikációs és kimutatási reagensek HBV MMX (COBAS TaqMan HBV master mix) tricin puffer kálium-hidroxid kálium-acetát glicerin < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% upstream és downstream primerek a HBV Pre-Core/Core régiójához < 0,001% fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próba, specifikus HBV-re és a HBV mennyiségi standardra < 0,001% oligonukleotid aptamer < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan mangánoldat) < 1,2% mangán-acetát jégecet 0,09% nátrium-azid 48 teszt 2 x 1,0 ml 2 x 1,0 ml 2 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 2 x 24 teszt 2 x 1,4 ml 2 x 24 teszt 2 x 1,0 ml 03584933044-07HU 6

FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. Csak humán EDTA-s plazmamintákhoz és humán szérumhoz alkalmazható. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, laboratóriumi köpenyt és szemvédőt a minták és tesztreagensek kezelése közben. A minták és tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. E. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. F. Steril, egyszer használatos pipetták és DNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt. G. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. H. Ne keverje a különböző kitekből származó reagenseket. I. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. J. A kitet ne használja a lejárati ideje után. K. A biztonsági adatlapok (SDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Roche irodában. L. A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 és a CLSI Dokumentum M29-A3 31 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. MEGJEGYZÉS: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátriumhipoklorit oldatnak. M. FIGYELEM: A CTM ( ) C, HBV L(+)C és HBV H(+)C emberi vérből származó humán plazmát tartalmaz. A forrásanyag US FDA által hitelesített tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak Hepatitis B felületi antigénre (HBsAg), HIV-1/2 és HCV antitestekre, valamint HIV p24 antigénre. A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A CTM ( ) C, HBV L(+)C és HBV H(+)C fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 és a CLSI Dokumentum M29-A3 31 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. N. A HBV MMX, HBV QS és CTM Mn 2+ nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. O. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le bő vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. Ezen reagenseket kiömlés esetén szárazra törlésük előtt vízzel hígítsa. 03584933044-07HU 7

TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK Mintaelőkészítő reagensek A. Tárolja a High Pure System vírusnukleinsav reagenseket 15 25 C-on a megérkezést követően. B. Tárolja az eluáló puffert (ELB) és a lízis/kötő puffert (LYS) 15 25 C-on. Felbontást követően tartsa az ELB és LYS puffereket 15 25 C-on. A felbontott ELB és LYS puffereket 30 napon belül vagy a lejárati dátumig fel kell használni, amelyik előbb következik. C. Miután a hordozó RNS-hez és a proteináz K-hoz hozzáadta az eluáló puffert (ELB), a fel nem használt feloldott hordozó RNS-t (CAR) és a fel nem használt feloldott proteináz K-t (PK) tárolja -15 C és -25 C között. Feloldást követően a hordozó RNS-t és a proteináz K-t 30 napon belül vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, fel kell használni. D. Az etanol hozzáadását követően az inhibitor eltávolító puffert (IRB) és a mosópuffert (WASH) 15 25 C-on tárolja. Ezek a munkaoldatok 30 napig vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, stabilak. E. A roncsoló/kötő munkaoldatot [roncsoló/kötő puffer plusz hordozó RNS, proteináz K és HBV QS] elkészítést követően azonnal fel kell használni. A maradékot ki kell dobni. Amplifikációs és kimutatási reagensek A. A reagenseket és kontrollokat ne fagyassza le. B. A HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS és CTM Mn 2+ 2 8 C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati időn belül stabilak. Egy 12 mintát tartalmazó tételhez való mennyiség eltávolítása miatt felnyitott alábbi oldatok maradéka 2 8 C-on tárolandó: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS és CTM Mn 2+. Felbontást követően a HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS és CTM Mn 2+ 2 8 C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. Felbontást követően a fel nem használt CTM ( ) C kontrollt ki kell dobni. C. A master mix munkareagenst CTM Mn 2+ -t HBV MMX-hez hozzáadva készül) 2 8 C-on sötétben kell tárolni. Az előkészített mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez annak elkészítésétől számított 2 órán belül hozzá kell adni. D. A feldolgozott minták és kontrollok 20 30 C-on legfeljebb 3 óráig, 2 8 C-on legfeljebb 24 óráig, illetve -20 C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig stabilak. E. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenshez adásától számított 3 órán belül meg kell kezdeni. A KÉSZLET TARTALMA Mintaelőkészítő reagensek A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit High Pure System vírusnukleinsav kit (P/N: 03502295 001) LYS (lízis-/kötőpuffer) CAR (hordozó RNS) PK (proteináz K) IRB (inhibitor eltávolító puffer) WASH (mosópuffer) ELB (eluáló puffer) RS (High Pure System vírusnukleinsav állvány szett) WR (High Pure System vírusnukleinsav hulladék állvány) 03584933044-07HU 8

Amplifikációs és kimutatási reagensek B. COBAS TaqMan HBV Test (P/N: 03500756 190) HBV QS (COBAS TaqMan HBV mennyiségi standard) HBV H(+)C [HBV magas (+) kontroll] HBV L(+)C [HBV alacsony (+) kontroll] CTM ( ) C [COBAS TaqMan negatív kontroll (humán plazma)] HBV MMX (COBAS TaqMan HBV master mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan mangánoldat) HBV HPS SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver COBAS TaqMan 48 Analizátor AMPLILINK szoftver, 3.3-as vagy 3.4-es verzió AMPLILINK szoftver Vezérlőegysége Készülék és szoftver kézikönyvek: - COBAS TaqMan 48 analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra - AMPLILINK szoftver 3.3-as verziójának alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, COBAS TaqMan analizátorral, COBAS TaqMan 48 analizátorral, COBAS AMPLICOR analizátorral, valamint a cobas p 630 készülékkel való használatra vagy - AMPLILINK szoftver, 3.4-es verzió alkalmazási kézikönyve Vizsgálatdefiníciós fájl (Test Definition File, TDF). A TDF neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. K-cső kupakrögzítő (P/N:03516539001) K-tálca kupakozó eszköz (P/N: 03339904001) COBAS TaqMan 48 Analizátor K-hordozó (P/N: 28150397001) K-hordozó szállító (P/N: 03341488001) K-hordozó tartó (P/N: 03287696001) K-hordozó transzporter (P/N: 03517519001) Egyszer használatos anyagok K-cső doboz,12 x 96 db-os (P/N: 03137082001) K-tálca doboz, 24 db-os (P/N: 03343146001) Centrifuga követelmények Sigma 4-15C asztali centrifuga vagy ezzel ekvivalens mikrotiter lemezcentrifuga, amely képes 4600 g centrifugális erő biztosítására Sigma kilendülő fejes centrifugarotor P/N: 11118 (2 edénnyel P/N: 13218 és 2 lemeztartóval P/N: 17978), vagy ekvivalens 03584933044-07HU 9

EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK izopropanol (> 99%) az ACS feltételeknek megfelelő, vagy jobb etanol (96 100%) az ACS feltételeknek megfelelő, vagy jobb állítható pipetták*: (250 μl és 1000 μl kapacitású), aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz mentes hegyekkel pipetta segédeszköz: Drummond (P/N: 4-000-100), vagy ekvivalens vízfürdő 50 C (± 2 C)-os száraz fűtőblokk 70 C (± 2 C)-os steril, egyszer használatos szerológiai pipetták: 5, 10 és 25 ml steril, polipropilén kúpos csövek; 15 ml és 50 ml: Corning (P/N: 430052 és P/N: 430290), vagy ekvivalens steril, 2,0 ml mikrocentrifuga csövek: Sarstedt (P/N: 72.693.005), vagy ekvivalens vortex keverő csőállványok egyszer használatos kesztyűk, púdermentes kalibrált hőmérők vízfürdőhöz és száraz fűtőblokkhoz * A pipetták pontossága a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNázmentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését. A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát és kontrollt fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. A minta levétele A COBAS TaqMan HBV Test szérum vagy plazma mintákkal való használatra alkalmas. A BD SST szérumvételező csövekbe vagy EDTA (levendulakék kupak) véralvadásgátlót tartalmazó csövekbe kell levenni. A vért ne hagyja 2 25 C-on 1 napnál tovább. EDTA-s plazma vagy szérum használata megközelítőleg ekvivalens vizsgálati eredményeket fog adni. Az 4. ábra mutatja a mátrix típusának hatását a betegminták HBV DNS eredményeire. 4. ábra EDTA-s plazma és szérum mintatípusok összehasonlítása 12,00 Plazmaminták Átlagos eredmény (Log HBV DNS IU/ml, n = 2) 10 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Szérumminták Átlagos eredmény (Log 10 HBV DNS IU/ml, n = 2) 03584933044-07HU 10

A szérumot vagy a plazmát a levételtől számított 1 napon belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással (800 1600 g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a szérumot vagy a plazmát egy steril polipropilén csőben. Az 5. ábra ilyen minta levételi vizsgálatokból származó adatokat mutat. 5. ábra HBV stabilitása EDTA véralvadásgátlóval levett teljes vérben vagy szérumvételező csőben plazma-, illetve szérumszeparálás előtt 4,5 Átlagos HBV DNS-eredmény (Log 10 HBV DNS IU/ml, n = 2) 4,0 3,5 3,0 2,5 < 1 óra 25-30 C 6 óra 25-30 C 24 óra 25-30 C 48 óra 25-30 C 72 óra 25-30 C < 1 óra 2-8 C 6 óra 2-8 C 24 óra 2-8 C 48 óra 2-8 C 72 óra 2-8 C 2,0 Plazma-1 Plazma-2 Plazma-3 Plazma-4 Plazma-5 Szérum-1 Szérum-2 Mintaazonosító B. A minta transzportja A teljes vér, szérum vagy plazma transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak 32. A teljes vér 2 25 C-on transzportálandó, és a levételtől számított 1 napon belül fel kell dolgozni. A plazma, illetve szérum 2 8 C-on vagy -20-80 C-ra fagyasztva transzportálandó. C. A minta tárolása A szérum- vagy plazmaminták szobahőmérsékleten 3 napig, 2 8 C-on 7 napig, illetve -20-80 C-ra fagyasztva legalább hat hétig tárolhatóak. A minták tárolása 800 900 μl részletekben 2,0 ml-es polipropilén csavarókupakos csövekben javasolt (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). Az 6. ábra ilyen minta tárolási vizsgálatokból származó adatokat mutat. 4,5 6. ábra A HBV stabilitása EDTA-s plazmában vagy szérumban Idő 0 Átlagos HBV DNS-eredmény (Log 10 HBV DNS IU/ml, n = 2) 4,0 3,5 3,0 2,5 1 nap szobahőm. 3 nap szobahőm. 5 nap szobahőm. 7 nap szobahőm. 1 nap 2-8 C 3 nap 2-8 C 5 nap 2-8 C 7 nap 2-8 C 2,0 Plazma-1 Plazma-2 Plazma-3 Plazma-4 Plazma-5 Szérum-1 Szérum-2 Mintaazonosító 6 hét -80 C A szérum- és plazmaminták legfeljebb öt alkalommal olvaszthatók és fagyaszthatók HBV DNS-veszteség nélkül. A 7. ábra ilyen fagyasztás/olvasztás vizsgálatok adatait mutatja. 03584933044-07HU 11

7. ábra HBV-eredmények öt fagyasztás-olvasztás ciklus után Átlagos eredmény (Log 10 HBV DNS IU/ml, n = 2) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Plazma-1 Plazma-2 Plazma-3 Plazma-4 Szérum-1 Szérum-2 Kontroll 1 F-O 2 F-O 3 F-O 4 F-O 5 F-O Mintaazonosító HASZNÁLATI UTASÍTÁS MEGJEGYZÉS: A részletes üzemeltetési utasításokat, az eredmények nyomtatását, valamint a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezését a következő kézikönyvekben találja: (1) a COBAS TaqMan 48 analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra; (2) az AMPLILINK 3.3-as verziójú szoftver alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékhez, COBAS TaqMan analizátorhoz, COBAS TaqMan 48 analizátorhoz, COBAS AMPLICOR analizátorhoz és cobas p 630 készülékhez, vagy (3) az AMPLILINK szoftver 3.4-es verziójú alkalmazási kézikönyve. MEGJEGYZÉS: Valamennyi amplifikációs és kimutatási reagensnek használat előtt környezeti hőmérsékletűnek kell lennie; legalább 30 perccel használat előtt vegye ki azokat a tárolási 2 8 C-ról. MEGJEGYZÉS: A szérum és plazma mintákat 15 30 percig hagyni kell, hogy felhasználás előtt felvegyék a szobahőmérsékletet. MEGJEGYZÉS: Ahol előírt, használjon szűrős vagy pozitív kiszorításos hegyeket a pipettákhoz. A szennyeződés elkerülésének érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi, legfeljebb 24 mintát és kontrollt tartalmazó futtatásnak egy CTM ( ) C, HBV L(+)C és HBV H(+)C kontrollt kell tartalmaznia (lásd Minőség-ellenőrzés rész). Az amplifikációs és kimutatási reagensek 24 tesztre elegendő, kétszer használatos palackokban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. Minta- és kontroll-előkészítés MEGJEGYZÉS: Fagyasztott szérum vagy plazma minták használatakor tegye a mintákat szobahőmérsékletre, amíg azok teljesen fel nem olvadnak, majd felhasználás előtt vortexelje őket 5 10 másodpercig. MEGJEGYZÉS: Felhasználás előtt hagyja a reagenseket, hogy elérjék a szobahőmérsékletet. A tisztítási reakciók megkezdése előtt fűtse fel a fűtőblokko(ka)t 70 C (± 2 C), és a vízfürdőt 50 C (± 2 C) hőmérsékletre. 03584933044-07HU 12

A. Reagens-előkészítés MEGJEGYZÉS: A lízis/kötő munkaoldatot csak azután készítse el, amikor valamennyi mintát és kontrollt 15 30 percig állni hagyta, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 1. Készítse el az inhibitor eltávolító puffert 20 ml 96 100% etanol inhibitor eltávolító pufferhez (IRB) pipettázásával. A cső 5 10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Ez a feloldott inhibitor eltávolító puffer 48 teszthez elegendő. 2. Készítse el a mosópuffert 80 ml 96 100% etanol mosópufferhez (WASH) pipettázásával. A cső 5 10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Ez elegendő feloldott mosópuffer 48 teszthez. 3. Melegítse elő az eluáló puffert (ELB) 70 C (± 2 C) hőmérsékleten egy 2,0 ml-es csavarkupakos centrifugacsőben. Több csövet is használhat. A mintánkénti eluáló térfogat 75 μl. Melegítse elő az alábbi táblázatban felsorolt, a vizsgálatok számának megfelelő térfogatot. Ismétlések száma Reagens 12 24 Eluáló puffer (ml) 2,0 4,0 4. Pipettázza az alábbi táblázatban felsorolt, a vizsgálatok számának megfelelő térfogatú izopropanolt egy tiszta steril csőbe. Ismétlések száma Reagens 12 24 Izopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Pipettázzon 0,5 ml eluáló puffert (ELB) a hordozó RNS-hez (CAR). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi hordozó RNS fel nem oldódik. A feloldott hordozó RNS 24 teszthez elegendő. A feloldott hordozó RNS fel nem használt térfogata -15 és -25 C között legfeljebb 30 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. 6. Pipettázzon 5,0 ml eluáló puffert (ELB) a proteináz K-hoz (PK). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi proteináz K fel nem oldódik. A feloldott proteináz K 24 teszthez elegendő. A feloldott proteináz K fel nem használt térfogata -15 és -25 C között legfeljebb 30 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. 7. Készítse el a lízis/kötő munkaoldatot az alábbiak szerint úgy, hogy a feldolgozandó minták és kontrollok számának megfelelően a következő táblázatban felsorolt térfogatokat pipettázza: Ismétlések száma Reagensek 12 24 Lízis/kötő puffer (ml) 7,0 14,0 Hordozó RNS (μl) 140 280 HBV QS (μl) 39 78 Proteináz K (ml) 1,4 2,8 MEGJEGYZÉS: A HBV QS térfogata meghatározott a COBAS TaqMan HBV Test vizsgálatra. MEGJEGYZÉS: A feloldva fagyasztott hordozó RNS vagy proteináz K használata esetén olvassza fel szobahőmérsékleten, és többször döntögesse át használat előtt. Mérje a lízis/kötő puffer jelzett térfogatát egy tiszta steril 50 ml-es csőbe. Adja a feloldott hordozó RNS jelzett térfogatát a lízis/kötő puffert tartalmazó csőhöz. Vortexelje a HBV QS reagenst 3-5 másodpercig, és adja a HBV QS jelzett térfogatát a lízis/kötő puffert és a feloldott hordozó RNS-t tartalmazó csőhöz. Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10 15-szöri döntögetéssel keverje össze. Vortexelni TILOS - a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. Adja a feloldott proteináz K jelzett térfogatát a lízis/kötő puffert tartalmazó csőhöz. Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10 15-szöri döntögetéssel keverje össze. Vortexelni TILOS - a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. A proteináz K-nak a lízis/kötő pufferhez való hozzáadását és elkeverését követően azonnal kezdje meg a lízis/kötő munkaoldat adagolását. A fel nem használt lízis/kötő puffer (LYS) 15 25 C-on legfeljebb 30 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. A fel nem használt lízis/kötő munkaoldatot ki kell dobni. 03584933044-07HU 13

B. Minta- és kontroll-előkészítés MEGJEGYZÉS: Aeroszol-rezisztens hegyekkel ellátott állítható pipetták használata javasolt ehhez a művelethez. MEGJEGYZÉS: Az 1., 14., 16., 19. és 22. lépésekhez megfelelő méretű steril kombi-hegyekkel ellátott ismétlő pipetta használható. Mindamellett különös gondot kell fordítani a reagensek kiloccsanásának és a keresztszennyeződés elkerülésére. MEGJEGYZÉS: A teljes eljárás során kerülje el, hogy lízis/kötő munkaoldat, minta, kontroll és izopropanol kerüljön a lyukak karimájánál a lyuk és a fedél közti lezáró területre. MEGJEGYZÉS: A kesztyű pontosan illeszkedjen a felhasználó kezére. Többször is cseréljen kesztyűt, különösen a pozitív kontrollok kezelése, valamint a lízisállvány teli csöveinek felnyitása után. Soha ne érjen belülről a fedőkhöz (például a nyitás vagy zárás során). MEGJEGYZÉS: A kit kontrolljainak és a betegminták kezelése során először a negatív kontrollt töltse be, azután következzenek a pozitív kontrollok. 1. Pipettázzon 625 μl lízis/kötő munkaoldatot a lízisállvány minden egyes lyukába (I, átlátszó). Kerülje el, hogy cseppek kerüljenek a lyukak karimájánál a lyuk és a fedél közti lezáró területre. Óvatosan nyomja le a fedeleket fedő állásba. Ne rápattintós technikát alkalmazzon. 2. Egy alkalommal egy lyukat kinyitva pipettázzon körültekintően 500 μl mintát vagy kontrollt a megfelelő lyukba. Kerülje el, hogy cseppek kerüljenek a lyukak karimájánál a lyuk és a fedél közti lezáró területre. Minden minta vagy kontroll hozzáadása után a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 3. Valamennyi minta és kontroll bemérését követően mintegy 10 másodperces vortexeléssel keverje meg a feltöltött lízisállványt. Ne vortexeljen túl erőteljesen. Vizuálisan ellenőrizze, hogy a vortexelés során valamennyi lyuk jól meg lett keverve. 4. Óvatosan helyezze a lízisállványokat előmelegített 50 C (± 2 C)-os vízfürdőbe, kerülje el a fröccsenést. Inkubálja 10 percig a lízisállványt. Inkubáció alatt a lízisállvány bele kell, hogy merüljön a vízbe, de nem szabad lebegnie benne. Bizonyosodjon meg arról, hogy a lízisállvány tetejének felszíne a lyukak között szárazon marad az inkubáció alatt. Gondosan törölje szárazra a lízisállvány tetejét és alját is, miután a vízfürdőből eltávolította. 5. Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10 20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 6. Egyszerre egy lyukat nyisson ki úgy, hogy a rápattintott fedő sarkára gyakorolt gyenge nyomással engedje fel azt, majd emelje fel a lyukról, és pipettázzon 250 μl izopropanolt minden egyes lyukba. Minden hozzáadás után a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. MEGJEGYZÉS: Az izopropanol térfogata specifikus minden COBAS TaqMan Test vizsgálatra. 7. Szemmel ellenőrizze, hogy minden állvány szorosan le van zárva. Keverje össze a mintákat az állvány háromszori fordítgatásával, majd vortexelje az állványt mintegy 10 másodpercig. Ne vortexeljen túl erőteljesen. Vizuálisan ellenőrizze, hogy a vortexelés során valamennyi lyuk jól meg lett keverve. 8. Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10 20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 9. Egyszerre egy lyukat nyisson ki úgy, hogy a rápattintott fedő sarkára gyakorolt gyenge nyomással engedje fel azt, majd emelje fel a lyukról, és pipettázzon 750 μl minta- vagy kontrollkeveréket a filtercsőállvány (II, sárga) rögzített hulladék állvánnyal (fehér) megfelelő lyukaiba. Minden minta vagy kontroll keverék hozzáadása után a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 10. Valamennyi minta és kontroll bemérését követően centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 11. Egyszerre egy lyukat nyisson ki úgy, hogy a rápattintott fedő sarkára gyakorolt gyenge nyomással engedje fel azt, majd emelje fel a lyukról, és pipettázza a maradék minta- vagy kontrollkeveréket a filtercsőállvány megfelelő lyukaiba. Minden minta vagy kontroll keverék hozzáadása után a sarkánál kezdve óvatosan rányomva zárja le a lyuk fedelét, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és pattintsa rá a fedőt. Dobja ki megfelelő módon a lízisállványt. 03584933044-07HU 14

12. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 13. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra. 14. Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét, és pipettázzon be 400 μl inhibitor eltávolító puffert (IRB) minden egyes lyuk oldala mentén. Ne érjen a lyukak oldalához. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta az inhibitor eltávolító puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a fedőt. 15. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 16. Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét, és pipettázzon be 700 μl mosópuffert (WASH) minden egyes lyuk oldala mentén. Ne érjen a lyukak oldalához. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta a mosó puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a fedőt. 17. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 18. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra. 19. Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét, és pipettázzon be 700 μl mosópuffert minden egyes lyuk oldala mentén. Ne érjen a lyukak oldalához. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta a mosó puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a fedőt. 20. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 21. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Helyezze a szűrőcsőállványt az eluáló állványra (IIIA, kék), és pattintsa a szűrőcsőállványt az eluáló állványra. Dobja ki megfelelő módon a hulladék állványt. 22. Nyissa fel valamennyi fedelet a szűrőcsőállványon, és pipettázzon 75 μl előmelegített eluáló puffert (ELB) minden egyes szűrő közepére anélkül, hogy a szűrőhöz érne. MEGJEGYZÉS: Ne az üreg oldala mentén adagolja az eluáló puffert. Miután valamennyi lyukhoz hozzáadta az eluáló puffert, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 23. Inkubálja az eluáló állványt szobahőmérsékleten az eluáló puffernek az utolsó lyukhoz való hozzáadását követően legalább 3 percig, a sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le a lyukat. 24. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 g-n a mikrotiter lemezcentrifugában. Szemmel ellenőrizze minden lyukban a folyadékszintet, hogy nem történt-e szivárgás. Ha szivárgást észlel, ne folytassa a vizsgálatot. 25. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt az eluáló állványról. Dobja ki megfelelő módon a szűrőcsőállványt. 26. Helyezze az állvány fedelet (IIIB, kék) az eluáló állványra (IIIA, kék). Nyomja le határozottan, és pattintsa a kapcsokat az eluáló állványra. A sarkánál kezdve óvatosan nyomja rá a fedőt, folytassa az óvatos nyomkodást a fedő közepén át, és rápattintós technikával szorosan zárja le valamennyi fedőt. 27. A feldolgozott minták és kontrollok közvetlenül PCR-re kerülnek felhasználásra. A feldolgozott minták és kontrollok 50 μl-ét használja amplifikálásra. A minta- és kontroll-előkészítést követő 3 órán belül adja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkaoldathoz. Ha a feldolgozott minták és kontrollok nem kerülhetnek felhasználásra az előkészítésüktől számított 3 órán belül, akkor tárolhatja a feldolgozott mintákat és kontrollokat 2 8 C-on legfeljebb 24 óra hosszat a lefedett eluáló állványban vagy -20 C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig steril 2,0 ml-es csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). A minták és kontrollok master mix munkaoldathoz adását követő 3 órán belül amplifikálja a mintákat és kontrollokat. 03584933044-07HU 15

Amplifikálás és kimutatás MEGJEGYZÉS: A K-hordozókat/K-tálca hordozókat és a K-hordozó/K-tálca hrdozó tartót 70%-os izopropanol oldattal nedvesített, szálmentes ruhával le kell törölni. C. Reagens-előkészítés MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan HBV master mix (HBV MMX), a Master Mix munkareagens (MMX munkareagens) és a master mix munkareagens plusz feldolgozott minták és kontrollok fényérzékenyek. Ezek a reagensek fénytől védve tartandók. MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan HBV master mix (HBV MMX) és a COBAS TaqMan mangánoldat (CTM Mn 2+ ) oldatokat legalább 30 percig hagyni kell, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet a master mix munkareagens elkészítése előtt. MEGJEGYZÉS: Az MMX munkareagenst a minta- és kontroll-előkészítés befejeztével készítse el. MEGJEGYZÉS: Az MMX munkareagenst az elkészítést követő 2 órán belül fel kell használni. MEGJEGYZÉS: Ha egyszer a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez mérte, akkor az amplifikálást 3 órán belül meg kell kezdeni. 1. Hagyjon egy fiola HBV MMX és egy fiola CTM Mn 2+ oldatokat legalább 30 percig, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 2. Helyezzen egy K-hordozót/K-tálca hordozót egy K-hordozó/K-tálca hordozó tartóba. 3. Helyezzen új K-csöveket vagy egy új K-tálcát a K-hordozóba/K-tálca hordozóba úgy, hogy ne érjen hozzá a K-csövek falához. MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. K-tálca használatakor nincs szükség a PCR-készülék kiegyensúlyozására. 4. Távolítsa el a K-csövek kupakját, ha rendelkezésre áll, a K-cső kupakrögzítő segítségével. Helyezze a kupakokat a K-cső tárolóhelyén a tartóba. 5. Készítse el az MMX munkareagenst a következők szerint: 24 teszt esetén mérjen 191 μl CTM Mn 2+ oldatot egy fiola HBV MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot az üvegre, és 10-szeri átfordítással keverje jól össze. Az MMX munkareagenst ne vortexelje. A MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 2 órán belül fel kell használni. 12 teszt esetén vegyen ki 660 μl HBV MMX reagenst és tegye egy 2 ml-es csőbe. Mérjen 90 μl CTM Mn 2+ oldatot a HBV MMX reagenst tartalmazó 2 ml-es csőbe, csavarja rá a kupakot, majd 10-szeri döntögetéssel keverje jól össze. A MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 2 órán belül fel kell használni. A HBV MMX és CTM Mn 2+ oldatok maradéka az eredeti fiolákban 2 8 C-on tárolható. Felbontást követően a HBV MMX és CTM Mn 2+ 2 8 C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. MEGJEGYZÉS: A CTM Mn 2+ térfogata specifikus a COBAS TaqMan HBV Test vizsgálatra. 6. Pipettázzon 50 μl MMX munkareagenst minden K-csőbe, vagy a K-tálca lyukaiba. MEGJEGYZÉS: Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten mielőtt a 7. lépéssel folytatná. 7. Mérjen szűrős vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott mikropipettával minden egyes feldolgozott mintából vagy kontrollból 50 μl-t a megfelelő, MMX munkareagenst tartalmazó K-csőbe vagy a K-tálca lyukaiba. Minden mintát és kontrollt mikropipetta segítségével háromszori fel-le pipettázással óvatosan keverjen össze anélkül, hogy buborékokat okozna. 8. Ismételje meg a 7. lépést minden egyes feldolgozott minta és feldolgozott kontroll esetében, amíg az összeset át nem vitte a K-csövekbe vagy a K-tálca lyukaiba. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Szemmel ellenőrizze, hogy nincsenek-e buborékok, és szükség esetén távolítsa el azokat. Zárja le a K-csöveket vagy K-tálcát egy K-cső kupakrögzítő/k-tálca kupakozó eszköz segítségével. Szemmel ellenőrizze, hogy valóban a megfelelő térfogatok lettek-e összemérve. 9. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak az MMX munkareagenst tartalmazó K-csövekbe/ K-tálcába való bemérésétől számított 3 órán belül meg kell kezdeni. D. A COBAS TaqMan 48 Analizátor betöltése és működtetése 1. Kapcsolja be a számítógépes munkaállomást, majd jelentkezzen be a Microsoft Windows operációs rendszerbe a megfelelő felhasználónévvel és jelszóval. 2. Kapcsolja be a COBAS TaqMan 48 Analizátort. Ellenőrizze, hogy a készülék inicializálódik-e és használatra kész-e. Ha az előző futtatás(ok)ból K-hordozók vagy K-tálca-hordozók maradtak bármelyik PCR-készülékben, távolítsa el azokat a K-hordozó szállító segítségével. 03584933044-07HU 16

3. Indítsa el az AMPLILINK szoftvert a számítógépen. A megfelelő felhasználóazonosítóval és jelszóval jelentkezzen be. 4. Hogy megadja a K-hordozó vagy K-tálca hordozó vizsgálandó mintáinak sorrendjét, kattintson az Orders ikonra. Válassza ki a Sample fület, majd kattintson az New gombra és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigyen be egy mintasorszámot. Válassza ki a COBAS TaqMan HBV Test vizsgálatdefiníciós fájlját. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. Ismételje meg ezt mindegyik minta esetében. Kattintson a Save gombra. MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 5. A minőség-ellenőrzési adatok beviteléhez kattintson az Orders ablakban a Quality Control fülre. Kattintson a New gombra, és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be a készlet mellé biztosított COBAS TaqMan HBV Test kontroll értékkártyáról a vonatkozó adatokat. Adja meg a megfelelő mezőkbe a COBAS TaqMan HBV Test tételszámát, lejárati dátumát, az alacsony (+) és magas (+) kontroll tartományokat, valamint a tétel specifikus kalibrációs együtthatókat. Kattintson az OK gombra. 6. Az Orders ablakban a K-Carrier fülre kattintva rendeljen a futtatáshoz egy K-hordozó/K-tálca számot. A K-Carrier ablakban kattintson a New gombra. A K-Carrier ID jobb oldalán levő cellába a billentyűzet vagy vonalkódolvasó segítségével adja meg a K-hordozón/K-tálcán található vonalkódból a K-hordozó/K-tálca számát. Ha K-tálcát használ, jelölje ki a K-Tray négyzetet a K-Carrier ID mező alatt. Válassza ki a COBAS TaqMan HBV Test vizsgálatdefiníciós fájlját az ablak alsó részén lévő vizsgálati panelből. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. MEGJEGYZÉS: Az ugyanezen K-hordozó azonosítóhoz rendelt korábbi futtatás eredményeit el kell fogadni. 7. A Worklist listában jelölje ki a Type (T) oszlop első sorát. Jelölje ki ezt a mezőt, majd a megjelenő legördülő listából válassza ki a kívánt kontrolltípust. Ezután kattintson kétszer a mintaazonosító mezőre ugyanabban a sorban. A LookUp Control ablak megjelenik valamennyi lehetséges kontrollt feltüntetve. Amikor a kontrollt kiválasztja, a megfelelő kalibrációs és kontroll értékek megjelennek a jobb alsó információs mezőben. Ismételje meg ezt a folyamatot valamennyi szükséges kontroll esetén. 8. Ha mintákat akar a Worklist munkalistához adni, kattintson kétszer az első pozícióra (sorra) a minta beviteléhez. Meg fog jelenni a hozzárendelt mintasorrendet tartalmazó Lookup Sample ablak. Egynél több sorszám kijelölését a Shift + Nyíl gombokkal végezheti el. Ellenőrizze, hogy minden sorszámhoz hozzárendelte-e a COBAS TaqMan HBV Test vizsgálatdefiníciós fájlt. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. 9. A K-hordozóhoz/K-tálca hordozóhoz rendelt sorszámok mentéséhez kattintson a Save gombra. MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. K-tálca használatakor nincs szükség a PCR-készülék kiegyensúlyozására. E. Amplifikálás és kimutatás 1. Válassza ki a System fül Systems ikonját; a PCR-készülék kinyitásához kattintson az Open gombra. Ha a PCR-készülék teteje teljesen kinyílott, és a Systems ablakban a Ready to Load felirat látható, emelje meg és nyissa ki a PCR-készülék fedelét. A K-hordozó/K-tálca hordozó transzporter segítségével vigye át a kupakkal lezárt, master mix munkareagenst és mintákat, illetve kontrollokat tartalmazó K-csövekkel/K-tálcával betöltött K-hordozót/K-tálca hordozót a PCR-készülékbe. Csukja le a készülék fedelét. 2. A PCR-készülék tetejének zárásához és a futtatás elindításához kattintson a Start gombra a Systems ablakban a TC ikon alatt. 3. A COBAS TaqMan 48 analizátor az amplifikálást és kimutatást automatikusan elvégzi. 03584933044-07HU 17

EREDMÉNYEK Eredmények kiszámítása A COBAS TaqMan 48 Analizátor automatikusan meghatározza a minta vagy a kontroll HBV DNS titerét. A HBV DNS titer nemzetközi egység [International Unit (IU)]/ml-ben vannak kifejezve. A HBV kópia/ml és a HBV nemzetközi egység (IU)/ml közti váltószám 5,82 kópia/iu a nukleinsav-amplifikációs technikákra (NAT) vonatkozó WHO HBV nemzetközi standardot (97/746 29 ) alkalmazva. A COBAS TaqMan 48 Analizátor: Meghatározza a HBV DNS és a HBV mennyiségi standard DNS ciklus küszöbértékét (Ct). Meghatározza a HBV DNS-titert a HBV DNS és HBV mennyiségi standard DNS küszöbértékek, valamint a tételspecifikus kalibrációs együtthatók alapján. Meghatározza, hogy a számított HBV L(+)C és HBV H(+)C IU/ml titerek a megadott tartományba esnek-e. Futtatás validálása AMPLILINK 3.3-as és 3.4-es verzió Ellenőrizze az AMPLILINK szoftver eredmény ablakában vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön futtatás érvényességéről. A futtatás akkor érvényes, ha a COBAS TaqMan HBV kontrollok egyike sem kap jelzőt. A futtatás nem érvényes, ha a COBAS TaqMan HBV kontrollok az alábbi jelzők bármelyikét kapják: Negatív kontroll: Jelző Eredmény Magyarázat NC_INVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy érvényes eredmény, amely nem volt negatív a HBV targetre HBV alacsony pozitív kontroll: Jelző Eredmény Magyarázat LPCINVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik HBV magas pozitív kontroll: Jelző Eredmény Magyarázat HPCINVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes futtatást, a minta- és kontroll-előkészítést, amplifikálást és kimutatást is beleértve. Az eredmények értékelése: Érvényes futtatáshoz ellenőrizzen minden mintát az eredménylapon, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést. Az alábbiak szerint értelmezze az eredményeket: Egy érvényes futtatás mind érvényes, mind érvénytelen mintaeredményeket is tartalmazhat, az egyes mintákra vonatkozó jelzőktől és/vagy megjegyzésektől függően. 03584933044-07HU 18

A minta eredmények az alábbiak szerint értékelendőek: Titer eredmény Target Not Detected < 6.00E+00 IU/mL 6.00E+00 IU/mL és < 2.90E+01 IU/mL 2.90E+01 IU/mL és 1.10E+08 IU/mL > 1.10E+08 IU/mL Magyarázat A HBV kritikus küszöbérték meghaladja a vizsgálati korlátot, vagy nincs HBV küszöbérték. Adja ki az eredményt, mint Nincs kimutatható HBV DNS. A számított IU/ml a vizsgálat kimutatási határa alatt van. Adja ki az eredményeket, mint HBV DNS kimutatható, kevesebb, mint 6 HBV DNS IU/ml. A számított IU/ml eredmények a vizsgálat lineáris tartományának alsó határa alatt vannak. Ezek az eredmények nagyfokú szórást mutatnak, és ezért nem véleményezhetőek pontosnak. Ezek az eredmények fokozott óvatossággal értékelendőek. A 29 IU/ml-nél nagyobb vagy egyenlő és 1,10E+08 IU/ml-nél kisebb vagy egyenlő számított eredmények belül esnek a vizsgálat lineáris tartományán. A számított IU/ml a vizsgálat mérési tartománya felett van. Adja ki az eredményeket, mint nagyobb, mint 1,10E+08 HBV DNS IU/ml. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményeire van szükség, az eredeti mintából HBVnegatív humán plazmával vagy szérummal (az eredeti minta mátrixától függően) hígítást kell készíteni, és megismételni a vizsgálatot. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. MEGJEGYZÉS: A vizsgálat mérési tartománya feletti minták, amelyek QS_INVALID jelzővel ellátott érvénytelen (Invalid) eredményt adnak, nem adhatók úgy ki, mint > 1,10E+08 IU/ml. Az eredeti mintát HBV-negatív humán plazmával vagy szérummal (az eredeti minta mátrixától függően) való hígítást követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. 03584933044-07HU 19

MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi 24 mintából és kontrollból álló futtatásnak egy CTM ( ) C, egy HBV L(+)C és egy HBV H(+)C kell tartalmaznia. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében, a vizsgálatot végző használjon további házon belüli kontrollokat minden alkalommal, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú megbízhatósággal nem képes elvégezni. Nincs előírás a kontrollok K-hordozóban/K-tálcában való elhelyezkedését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a futtatás érvényességéről. Negatív kontroll A CTM ( ) C kontrollnak Target Not Detected eredményt kell adnia, azaz a HBV DNS kritikus küszöbérték meghaladta a vizsgálat korlátait, vagy nincs HBV DNS küszöbérték, ugyanakkor a HBV belső kontroll DNS érvényes küszöbértékkel rendelkezik. Ha a CTM ( ) C kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a CTM ( ) C kontroll következetesen nem érvényes, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével. Pozitív kontrollok A HBV L(+)C és HBV H(+)C kontrollokhoz tartozó kijelölt tartomány specifikus minden egyes tételre, és a kittel adott COBAS TaqMan HBV Test kontroll értékkártyán van feltüntetve. Ezek a tartományok felkerülnek az AMPLILINK szoftver Vezérlőegységére. A HBV L(+)C és HBV H(+)C kontrollok HBV DNS IU/ml értékeinek a készlettel adott COBAS TaqMan HBV Test kontroll értékkártyán feltüntetett tartományba kell esnie. Ha egyik vagy mindkettő pozitív kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta-és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha egyik vagy mindkettő pozitív kontroll számított HBV DNS titere rendszeresen kívül esik a kijelölt tartományon, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK 1. Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas analitikai érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szigorúan ellenőrizni kell. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. A vizsgálatot humán szérum vagy EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazma használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata téves, álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat. 2. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik. 3. A COBAS TaqMan HBV master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a HBV-pozitív kontrollokból vagy klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és a Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. 4. A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. 5. Ez a termék csak COBAS TaqMan 48 Analizátorral használható. 6. A HBV DNS kimutatása a mintában jelen lévő vírus partikulumok jelenlététől függ, ezért befolyásolhatják a mintalevételi módszerek és betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte és/vagy a fertőzés stádiuma). 7. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a vizsgálat primerei és/vagy próbái által lefedett virális genom nagyfokban konzervált régióiban lévő mutációk következtében a vírusmennyiség kevesebbnek adódik, vagy a vírus kimutatása sikertelen lesz. 8. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség számszerűsíthető legyen. 03584933044-07HU 20