DIGITÁLIS MIKROSZKÓPIA AZ EMÉSZTŐRENDSZERI SZÖVETI MINTÁK DIAGNOSZTIKÁJÁBAN Doktori tézisek Ficsór Levente Semmelweis Egyetem, 2. sz. Belgyógyászati Klinika Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Programvezető: Témavezető: Hivatalos bírálók: Dr. Tulassay Zsolt, D.Sc. Dr. Molnár Béla, Ph.D. Dr. Juhász Márk, Ph.D. Dr. Cserni Gábor, D.Sc. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Kopper László, D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Dinya Elek, D.Sc. Dr. Nyúl László, Ph.D. BUDAPEST, 2009
BEVEZETÉS A digitális mikroszkópia fontos eszközzé vált a patológusok számára a telekonzultáció, az oktatás és kutatás területén. A digitális patológia jelentős hozadéka, hogy a tárgylemezek továbbítása nem kell, hogy fizikailag megtörténjen. A telepatológiai rendszerekben például a képi információ az internetre csatlakoztatott szervereken kerül tárolásra. Az alapvetően képek, tárgylemezek megosztására fejlesztett telepatológiai rendszerek egyben előkészítik az utat a képfeldolgozó algoritmusok magasabb integráltságához. A képanalizáló megoldások beépítése a digitális patológiai környezetbe adhatja a technológia fejlődésének következő lépcsőfokát. A szövettani diagnosztikával szemben rohamosan növekvő mennyiségi és minőségi igények szükségessé teszi a számítógép által automatizált szűrő rendszereket. Ahhoz, hogy teljes mértékben automatizáljuk az analízist, magas szintű képelemző eljárások szükségesek, mint a mirigyek és a felszíni hám precíz szerkezeti mérése. Az eddigi eljárások alapvetően csak kis szöveti részleteket tartalmazó képeken működtek. Thompson tudás-vezérelt szegmentáló algoritmusa különböző szöveti komponensekre darabolta a vastagbél biopsziás képeket, ahol a mirigyek 85%-os pontossággal kerültek felismerésre. E tudás-vezérelt metodikát Bartels és mtsai. adaptálták prosztata mintákra és bemutatták, hogy alkalmas a progresszív és regresszív elváltozások mérésére. Hamilton és mtsai. textúra analízis alapú eljárást mutattak be a vastagbél minták diszplasztikus elváltozásainak lokalizálására. E tanulmány rámutat arra, hogy az automatikus lokalizáció kis nagyításon és a tudásalapú kép-szegmentálás nagy nagyításon együttesen alkalmas arra, hogy automatikus döntéstámogató rendszert alkossunk. Esgiar és mtsa. mutatottak be egy új morfológia és textúra analízis alapú megoldást vastagbél daganat azonosítására, mellyel 90%-os klasszifikációs pontosságot értek el, szintén csak mikroszkópos képeken. Négy évvel később e kutatócsoport fraktál analízissel egészítette ki az előbb említett metódust, mellyel 95%-ra növelték a találati hatékonyságot. A kolorektális szövetminták rutinszerű kiértékelésében is megmutatkozhatnak a digitális mikroszkópia előnyei. A vastagbél szövetminták hagyományos
mikroszkópiával való kiértékelése során egy-egy blokkból csak néhány metszet vizsgálata lehetséges. A nem teljes mintavételezés miatt a mintának csak kis része kerül megtekintésre. A minták helytelen orientációja is diagnosztikus hibához vezethet, mert számos intézet véletlenszerűen végzi a beágyazást. CÉLKITŰZÉSEK Alapvető célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a digitális mikroszkópiát, mint lehetséges diagnosztikus eszközt, továbbá olyan új technológiák kifejlesztése, melyek növelik az emésztőrendszeri szöveti minták kiértékelésének hatékonyságát. Kutatási és fejlesztési céljaink között szerepelt: 1. a digitális metszet-szkenner és digitális mikroszkóp használata rutin környezetben, emésztőrendszeri mintákon hagyományos üvegalapú tárgylemez és mikroszkóppal történő kiértékeléssel történt összehasonlításban. 2. a hagyományos és a digitális mikroszkópia telekonzultációs célú összehasonlítása. 3. hatékony képfeldolgozó algoritmusok kifejlesztése a magasabb rendű struktúrák, mint a mirigyek és felszíni hám detektálására és mérésére. 4. szöveti kvantitatív paraméterek kidolgozása, melyek képesek karakterizálni az emésztőrendszeri minták morfológiai és strukturális elváltozásait. 5. az előbb leírt algoritmusok vizsgálata abból a célból, hogy alkalmasak-e a gyomor és vastagbél biopsziás minták megfelelő osztályozására a digitális tárgylemezek alkalmazásával. 6. 3-dimenziós sorozat metszet rekonstrukció alkalmazása a vastagbél biopsziás minták diagnózisára, továbbá annak vizsgálata milyen különbségek mutatkoznak a hagyományos és a digitális út között a kiértékelés idejét és költségét tekintve.
ANYAG ÉS MÓDSZER - A tárgylemezek digitalizálására a MIRAX Scan rendszert használtuk. MIRAX Scan 300 tárgylemez automatikus digitalizálására képes, továbbá a teljes rendszer alkalmas a digitális tárgylemezek tárolására, ábrázolására, akár távoli szerver alkalmazásával is. - 79 gyomor és 69 vastagbél biopsziás 5 mikron vastag, formalin-fixált, parafinba ágyazott, hematoxilin-eozin jelölt archív mintát vizsgáltunk. A 69 vastagbél minta közül 24 ép volt, 11 aspecifikus gyulladást, 25 colitis ulcerosa-t és 9 Crohn betegséget mutatott. A 79 gyomor mintából 14 esetben volt ép a nyálkahártya, 35 esetben chronikus gastritis (ebből 17 tartalmazott atrófiát, 12 intesztinális metapláziát), 30 mintánál pedig daganat (adenocarcinoma) a diagnózis. A referencia vizsgálat hagyományos optikai mikroszkópiával készült. - A szöveti analízis újonnan kidolgozott koncepciója a sejtmagok, mirigyek és a felszíni hám detekciójára épít. A sejtmagok szegmentálása a képi adat színi, telítettségi és intenzitásbeli tulajdonságainak kiértékelésén alapszik. A mirigy és felszíni hám detektálás az azonosított sejtmagok koordinátáit veszi alapul, előállítva egy újonnan kidolgozott sejthálót a megfelelő alakfelismeréshez. - A felismert és megmért szöveti struktúrák (sejtmag, mirigy, hám) alapján származtatott tulajdonságokat számolunk ki, hogy a teljes mintára jellemző szöveti változókat állíthassunk elő. Ezeknek az ún. szövet-citometriai paramétereknek az összefüggését vizsgáltuk a hagyományos patológiai diagnosztikus osztályozással. - Egy vastagbél biopsziás mintából (vastagbél-polip klinikai diagnózissal) készült 50-es metszetsorozatot elemeztünk hagyományos optikai mikroszkóppal és a digitális tárgylemez alapú 3-dimenziós rekonstrukcióval, hogy megállapíthassuk a vizsgálat költség és idő igényét, továbbá a diagnosztikai pontosságot mindkét módszerrel.
EREDMÉNYEK - A digitális mikroszkópia használhatóságának értékelése a rutin diagnosztikában: o A 103 esetből 98 esetben volt (95,1%) klinikailag ekvivalens diagnosztikai egyezőség. Az optikai mikroszkópos kiértékelés hasonló mértékű (97%) egyezőséget mutatott a konszenzus diagnózishoz, mint a digitális módszer (96,1%). Összesen 7 esetben mutatkozott eltérés a digitális mikroszkópos, a hagyományos kiértékelés és a konszenzus diagnózis között. Négy esetben a hagyományos kiértékelés és 3 esetben digitális mikroszkópos eredmény volt helyes. - Az automatikus képanalízis vizsgálatok eredményei: o A detektált mirigyek elliptikus forma faktora és az SpCN (mirigy felület per mirigyben talált sejtek száma) paramétere szignifikáns különbséget mutat a vizsgált főbb gyomor csoportok között, mely jól tanúsítja, hogy megvalósítható a mirigyek elváltozásainak kvantitatív mérése. A gyomor minták osztályozásában fontos szerepet játszott a Bio/Gland CC (összes sejtmagszám osztva a mirigyekhez tartozó sejtmag számmal) szövet-citometriai paraméter (ép 4.53 ± 1.52; gastritis 9.85 ± 5.93; daganat 18.50 ± 7.57) p<0.01). A szövet-citometriai paraméterek alkalmasak a vizsgált gyomor minták megkülönböztetésére, 86%-os pontosságot adtak a diszkriminancia analízis által meghatározott klasszifikációban az összes csoportra nézve. A gyomor minták közül a daganatos eseteket lehetett a legnagyobb százalékban (100%) helyesen atonosítani. A különböző gyulladásos minták között 77%-ban sikerült helyes automatikus besorolást adni, ahol az atrófiás minták mutatták a legnagyobb különbözőséget a többi csoporttól.
o A szövet-citometriai paraméterek alkalmazhatósága a vastagbél minták esetében is bizonyított, ahol 88%-os klasszifikációs rátát sikerült elérni a gyulladások bélelváltozások felismerésében, elkülönítésében. A legnagyobb biztonsággal az ép minták klasszifikálhatók (96%), ugyanakkor a Crohn-betegség felismerése bizonyult (56%) a legnehezebbnek. A Bio/Gland CC paraméter (ép 7,48 ± 6,29; aspecifikus kolitisz 8,00 ± 4,90; colitis ulcerosa 9,86 ± 6,27; Crohn-betegség 12,39 ± 12,55) szignifikáns (p<0.05) eltérést mutatott a vizsgálat betegcsoportok között. - A 3-dimenziós rekonstrukció eredményei: o A 3-dimenziós rekonstrukció alkalmazásával sikerült a vizsgált mintát rosszul orientált nyálkahártyát virtuális rekonstrukcióval helyes (horizontális) irányba orientálttá rekonstruálni. Az így nyert virtuális metszetek épnek mutatkoztak. A hagyományos kiértékelés 42%-kal több időt igényelt, mint a digitális tárgylemez alapú 3- dimenziós rekonstrukció. KÖVETKEZTETÉSEK - A digitális mikroszkópia alapú telekonzultációs módszer megbízhatóbb diagnosztizálást tesz lehetővé az emésztőrendszeri minták távoli kiértékelésekor, mint a korábban alkalmazott statikus kép alapú megoldások. - A digitális mikroszkópia alkalmazása klinikai telepatológiai eszközként jól használható és nem veszélyezteti a diagnózis helyességét. - A bemutatott mirigy és felszíni hám detektáló algoritmusok az első publikált megoldások, melyek nem a közvetlen képi információ alapján, hanem a detektált sejtek koordinátái alapján végzik a szegmentálást. Ez a módszer új utat nyit a teljes tárgylemezes analízisekhez, hogy a komplikált szöveti struktúrákat is azonosíthatók legyenek.
- A sejtmagok morfológiai paraméterei nem elegendők a minták megbetegedésük szerinti osztályozására. - A szövet-citometriai paraméterek alkalmazása új szakaszt nyit a hisztocitometriában és alapvető fontossággal bír a gyomor minták ép, gyulladásos és daganatos csoportokba való besorolásában. - Az említett szövet-citometriai paraméterek alkalmazhatók a vastagbél biopsziás minták klasszifikálására is a vizsgált megbetegedési csoportokban (ép, aspecifikus kolitisz, ulceratív kolitisz, Croh-betegség) - A minta teljes lemetszése, a 3-dimenziós rekonstrukció és a digitális mikroszkópia együttesen képessé teszik a patológust, hogy nagyon gyorsan vizsgálhassanak át mintákat és a nem megfelelően beágyazott szövetet jól orientált, vizsgálható formában jelenítsék meg és értékelje ki virtuális metszetek alapján.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném mindenkinek a segítségét megköszönni, aki hozzájárult PhD munkám elkészítéséhez: - Program- és témavezetőmnek, Prof. Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak és Dr. Molnár Béla tudományos főmunkatársnak, laborvezetőnek, hogy lehetővé tették és támogatták PhD munkám elvégzését a Semmelweis Egyetem II. számú Belgyógyászati Klinika Sejtanalitikai Laboratóriumában - Az SE II. számú Belgyógyászati Klinika és a Sejtanalitikai Laboratórium összes munkatársának, hogy segítettek megérteni az emésztőrendszeri megbetegedések orvosi alapjait, továbbá biztosították a kísérletekhez szükséges szöveti tárgylemezek készítését kiemelendő Kónyáné Gabriella. - Dr. Gombás Péternek és Dr. Fónyad Lászlónak, akik bemutatták és magyarázták az emésztőrendszeri mintákon mutatkozó morfológiai elváltozásokat. - A 3DHISTECH Kft.-nek, aki biztosította a digitális mikroszkópia rendszeréhez való hozzáférést, különösen köszönöm Tagscherer Attila és Varga Viktor Sebestyén segítségét programozói munkám korai fázisában. - Szüleimnek, akik stabil hátteret biztosítottak az életben való induláshoz és motiváltak korábbi tanulmányaimban. - Végül, de nem utolsósorban feleségemnek, aki támogatott engem, hogy kellő időm legyen munkám végzéséhez és kellő türelmet mutatott, amikor késő éjszakákig dolgoztam.
Összesített IF: 12,917 Citációk össz/független.: 5/3 PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK Témához kapcsolódó cikkek és könyvfejezetek Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies. Wu ML, Varga VS, Kamaras V, Ficsor L, Tagscherer A, Tulassay Z, Molnar B. Arch Pathol Lab Med. 2005 Apr;129(4):507-10. IF: 1,587 Citációk össz/független.: 2/1 Automated virtual microscopy of gastric biopsies. Ficsor L, Varga V, Berczi L, Miheller P, Tagscherer A, Wu ML, Tulassay Z, Molnar B. Cytometry B Clin Cytom. 2006 Nov 15;70(6):423-31. IF: 2,065 Citációk össz/független.: 2/1 Automated classification of inflammation in colon histological sections based on digital microscopy and advanced image analysis. Ficsor L, Varga VS, Tagscherer A, Tulassay Z, Molnar B. Cytometry Part A 73A: 230-237, 2008 IF: 3,259 Citációk össz/független.: 1/1 Automatic Classification of Histological Gastric Slides Adopting State of The Art Image Analysis Techniques Ficsór L, Molnár B, Tulassay Z Joint Hungarian-Austrian Conference on Image Processing and Pattern Recognition; 2005. Oesterreichische Computer Gesellschaft; ISBN 3-85403-192-0
Digital Slide and Virutal Microscopy - Based Routine and Telepathology Evaluation of Gastrointestinal Biopsy Specimen Molnár B, Berczi L, Ficsor L, Varga VS, Tagscherer A, Tulassay Z Kumar S, Dunn B Telepathology, Springer 2009 ISBN: 978-3-540-85785-3; e-isbn: 978-3-540-85786-0 Automated Disease Classification of Colon and Gastric Histological Samples Based on Digital Microscopy and Advanced Image Analysis Ficsor L, Molnar B Methods of Cancer Diagnosis, Therapy and Prognosis, Springer, in press Témához nem kapcsolódó cikkek Proliferation/apoptosis determination by tissue cytometry in gastrointestinal fresh frozen sections using triple labeling and automated scanning fluorescence microscopy Bocsi J, Sipos F, Ficsor L, Varga VS, Tulassay Z, Tarnok A, Molnár B Proc. SPIE 6088, 60880I (2006) Collagen XVII/BP180 Protein Expression in Squamous Cell Carcinoma of the Skin Detected With Novel Monoclonal Antibodies in Archived Tissues Using Tissue Microarrays and Digital Microscopy. Stelkovics E, Korom I, Marczinovits I, Molnar J, Rasky K, Raso E, Ficsor L, Molnar B, Kopper L, Krenacs T Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2008 Oct;16(5):433-41. IF: 1,487 The Potential of Digital Microscopy in Breast Pathology Krenacs T, Zsakovics I, Diczhazi Cs, Ficsor L, Varga VS, Molnar B Pathol. Oncol. Res. 2009; 15(1):55-8. IF: 1,260 Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry Cytometry Part A 2009 in press Varga V; Ficsor L; Kamarás V; Jonás V; Virag T; Tulassay Z; Molnár B IF: 3,259 (2008)