MULTIDROG REZISZTENCIA IN VIVO KIMUTATÁSA PETEFÉSZEK TUMOROKBAN MOLEKULÁRIS LEKÉPEZÉSSEL Dr. Krasznai Zoárd Tibor Debreceni Egyetem OEC Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Debrecen, 2011. 10.17.
Bevezetés A petefészek hám eredetű rosszindulatú daganatai Incidencia 1276 eset, 24.1/ 100 000* Mortalitás Felismeréskor 70% III- IV stádium Kezelés: sebészi (maximális tumorredukció) kemotherápia (Taxol 175 mg/m 2 + Carboplatin 6AUC) (GOG111-1996) I.- II.-III. vonalbeli kezelések (Doxorubicin, paclitaxel, platina, topotecan, gemcitabin, etoposid, Bevacizumab) Progresszió- ascites megjelenése Citokinek, növekedéi faktorok, neovaszkularizáció, direkt limfatikus blokád, érpermeabilitás, haemodinamikai okok * Nemzeti rákregiszter 2006 Progresszió okai
Bevezetés A petefészek hám eredetű rosszindulatú daganatai Incidencia 1276 eset, 24.1/ 100 000* Mortalitás Felismeréskor 70% III- IV stádium Kezelés: sebészi (maximális tumorredukció) kemotherápia (Taxol 175 mg/m 2 + Carboplatin 6AUC) (GOG111-1996) I.- II.-III. vonalbeli kezelések (Doxorubicin, paclitaxel, platina, topotecan, gemcitabin, etoposid, Bevacizumab) Progresszió- ascites megjelenése Citokinek, növekedéi faktorok, neovaszkularizáció, direkt limfatikus blokád, érpermeabilitás, haemodinamikai okok * Nemzeti rákregiszter 2006 Progresszió okai
A P-glikoprotein MDR1 gén által kódolt Pgp (ABCB1) 170 kd glycoprotein, 1280 aminosav ABC transzporter család tagja 7q (28 exon, 100 kb) 12 transzmembán hélix, linker szakasz ATP kötő hely Fiziológiás funkció (máj, vese, bél, vér- agy gát) Csökkent intracelluláris drogkoncentráció Topoizomeráz inhibítorok (Hycamtin) Taxánok (Taxol, Taxotere) Anthracyclinek (Doxorubicin, Daunorubicin) Vinca alkaloidok (Vinblastin, Vincristin) Antibiotikumok Egyéb hidrofób anyagok (pl. Rhodamin 123, digoxin, quinidine)
A Pgp működésének hidrofób porszívó modellje Aktív drog efflux Beoldódás a membránba Pgp Pgp szubsztrátok: pl. antraciklinek, vinca alkaloidok, epipodophyllotoxinok Kioldódás a membránból
Biológiai rendszerek funkcionális vizsgálata Molekuláris szintű Celluláris, szöveti szintű Élő szervezet szintjén PET/CT, SPECT/CT PET/MRI
Szöveti aktivitás glükóz metabolizmus
Előzetes kutatási eredményeink 1. Áramlási citometriás módszert dolgoztunk ki a multidrog rezisztenciáért (MDR) felelős Pgp expressziójának kimutatására, valamint pumpa funkciójának vizsgálatára hám eredetű petefészek tumorban szenvedő betegek asciteséből származó sejteken. 2. Vizsgáltuk a kemoterápiás szerek akut hatását a tumordiagnosztikai radiofarmakonok felvételére MDR pozitív és MDR negatív tumorsejteken.
Petefészekrákos betegek asciteséből származó sejteken kimutatott különböző mértékű Pgp expresszió (konfokális fluoreszcens mikroszkópos felvétel) Ascites sejtek jelölése: (a) FITC-MM6.15 antitesttel (b) PI-al (c) Transzmissziós fénymikroszkópos felvétel (d) fluoreszcens és transzmissziós képek fúziója
A Pgp pumpa különböző mértékű expressziójának kimutatása petefészek tumoros betegek asciteséből származó sejteken áramlási sejtanalizátoros méréssel A B 120,00 izotipikus kontroll+fitc RAMIG UIC2+FITC RAMIG MM615+FITC RAMIG 120,00 izotipikus kontroll+fitc RAMIG UIC2+FITC RAMIG MM615+FITC RAMIG 100,00 100,00 80,00 80,00 Sejtszám 60,00 Sejtszám 60,00 40,00 40,00 20,00 20,00 0,00 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluorescencia intenzitás (arb. unit) 0,00 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluorescencia intenzitás(arb. unit) Pgp + =70% Pgp + =28%
A Pgp pumpa működésének vizsgálata R123 akkumulációjával R123 (Pgp szubsztrát) NIH 3T3 MDR1 G185 (Pgp+) (A) NIH 3T3 (Pgp-) (B) sejteken teszteltük 2 μm R-123 20 μm cyclosporin A A B Sejtszám Sejtszám 160,00 120,00 80,00 40,00 MDR+ kontroll MDR+ CSA 0,00 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluoreszcencia intenzitás ( arb. unit ) 200,00 160,00 120,00 80,00 MDR- kontroll MDR- CSA 40,00 0,00 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluorescencia intenzitás ( arb. unit )
A Pgp pumpa expressziójának és működésének párhuzamos vizsgálata áramlási sejtanalizátoros méréssel Pgp kimutatás MM6.15 MAB+ FITC RAMIG (Pgp + =58%) A Sejtszám 160 120 80 40 izotipikus kontroll+fitc RAMIG MM6.15+FITC RAMIG 0 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluoreszcencia intenzitás (arb. unit) Pumpa funkció vizsgálat R123 (CSA) (Pgp + =60%) B Sejtszám 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 R123 kontroll R123 CSA 0,00 1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00 Fluoreszcencia intenzitás (arb. unit)
A Pgp pumpa expressziójának és funkcionális vizsgálatának eredményei nyolc petefészek tumoros beteg ascites mintájában Betegek sorszáma Sejt koncentráció x 10 5 ml -1 R MM6.15 Pgp + sejt % (MM6.15) R R123 R123 + sejt % PI + % 15 0.1 9 28 1.57 20 10 16 0.4 6 43 1.4 30 8 17 5.5 18 76 2.1 70 5 18 0.5 14 47 2.6 40 7 19 1 17 21 2 20 3 21 1.2 8 58 2.8 60 3 22 0.7 11 67 1.3 60 10 23 3.7 16 89 2.5 70 10 R MM615 = az MM6.15 antitesttel jelölt átlagos FI és az izotipikus kontroll FI aránya R R123 = a CSA jelenlétében mért átlagos R123 FI és a kezeletlen kontroll FI aránya
A Pgp pumpa expressziójának és funkcionális vizsgálatának eredményei nyolc petefészek tumoros beteg ascites mintájában Betegek sorszáma Sejt koncentráció x 10 5 ml -1 R MM6.15 Pgp + sejt % (MM6.15) R R123 R123 + sejt % PI + % 15 16 17 18 19 21 22 23 0.1 0.4 5.5 0.5 1 1.2 0.7 3.7 6 18 14 17 8 11 16 43 76 47 21 58 67 89 1.57 R MM615 = az MM6.15 antitesttel jelölt átlagos FI és az izotipikus kontroll FI aránya R R123 = a CSA jelenlétében mért átlagos R123 FI és a kezeletlen kontroll FI aránya 9 28 1.4 2.1 2.6 2 2.8 1.3 2.5 20 30 70 40 20 60 60 70 10 8 5 7 3 3 10 10 r=0.976 p =3.2X10-5
Az általunk kidolgozott áramlási citometriás módszer alkalmas a Pgp kimutatására és funkciójának élő sejteken történő detektálására. Az ascitesből származó sejtek Pgp expressziós ill. funkcionális különbségei nem a sejtek eltérő proliferációs aktivitásának következményei. Klinikai vizsgálatokban először mutattuk ki, hogy a petefészek tumoros betegek asciteséből származó sejtekben a Pgp fehérje különböző mértékben jelen van. Anticancer Res. 25, 1187-11892. 2005.
Kemoterápiás szerek hatása a tumordiagnosztikai radiofarmakonok akkumulációjára Pgp pozitív és negatív daganatos sejtekben 18 FDG szénhidrát anyagcsere 18 FDG-6P 11 C-kolin kolin metabolizmus tumorokban fokozott kolin kináz aktivitás 99m Tc-MIBI perfúziós SPECT tracer Lipofil kation Pgp szubsztrát 11CH 3 CH 3 N+ CH 2 CH 2 OH CH 3
Paclitaxel hatása A2780AD és A2780 sejtek 18 FDG felvételének kinetikájára % FDG felvétel / millió sejt 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A2780AD kontroll A2780AD paclitaxel (25 µm) A2780AD paclitaxel (50 µm) A2780 kontroll A2780 paclitaxel (25 µm) A2780 paclitaxel (50 µm) 0 10 20 30 40 50 60 70 Idő (perc)
Paclitaxel hatása A2780AD és A2780 sejtek 99m Tc-MIBI felvételének kinetikájára % Tc-MIBI felvétel / millió sejt 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 A2780AD kontroll A2780AD paclitaxel (25 µm) A2780AD paclitaxel (50 µm) A2780 kontroll A2780 paclitaxel (25 µm) A2780 paclitaxel (50 µm) 0 10 20 30 40 50 60 70 Idő (perc)
Paclitaxel kezelés hatása A2780A (Pgp + ) és A2780 (Pgp - ) valamint JY (Pgp - ) sejtek 99m Tc- MIBI felvételére Tc-MIBI felvétel (kontroll %-ban) 2100 1800 1500 1200 900 600 300 0 A2780AD A2780 JY 0 20 40 60 80 Paclitaxel cc (µm)
Kezelés A2780AD R123 felvétel a kontroll %-ban DNR felvétel a kontroll %- ban 99m Tc-MIBI felvétel a kontroll % -ban 18 FDG felvétel a kontroll % -ban CSA (20 µm) 2100 120 * 550 15 * 1700 70 * 140 11 # 101 3 VER (50 µm) 1200 63 * 800 21 * 92 7 145 12 # 52 5 ** Paclitaxel (10 µm) Paclitaxel (25 µm) Paclitaxel (50 µm) 180 10 ** 150 11 ** 120 9 120 8 98 4 210 10 ** 150 6 ** 250 8 ** 130 11 102 4 208 13 ** 150 11 ** 1200 110 * 165 20 ** 97 6 Paclitaxel (70µM) 212 11 ** 150 11 ** 1600 130 * 160 20 ** 95 7 A2780 CSA (20 µm) 108 5 92 6 180 8 ** 145 12 # 103 3 VER (50 µm) 91 13 96 8 130 7 92 12 49 6 ** Paclitaxel (10 µm) Paclitaxel (25 µm) Paclitaxel (50 µm) 86 6 92 11 110 8 111 8 97 4 80 7 91 6 150 6 ** 123 11 97 5 83 9 88 11 180 15 ** 140 12 # 102 6 Paclitaxel (70µM) 80 11 75 5 210 17 ** 145 17 # 96 7 11 C-kolin felvétel a kontroll % - ban
Kezelés A2780AD R123 felvétel a kontroll %-ban DNR felvétel a kontroll %- ban 99m Tc-MIBI felvétel a kontroll % -ban 18 FDG felvétel a kontroll % -ban CSA (20 µm) 2100 120 * 550 15 * 1700 70 * 140 11 # 101 3 VER (50 µm) 1200 63 * 800 21 * 92 7 145 12 # 52 5 ** Paclitaxel (10 µm) Paclitaxel (25 µm) Paclitaxel (50 µm) 180 10 ** 150 11 ** 120 9 120 8 98 4 210 10 ** 150 6 ** 250 8 ** 130 11 102 4 208 13 ** 150 11 ** 1200 110 * 165 20 ** 97 6 Paclitaxel (70µM) 212 11 ** 150 11 ** 1600 130 * 160 20 ** 95 7 A2780 CSA (20 µm) 108 5 92 6 180 8 ** 145 12 # 103 3 VER (50 µm) 91 13 96 8 130 7 92 12 49 6 ** Paclitaxel (10 µm) Paclitaxel (25 µm) Paclitaxel (50 µm) 86 6 92 11 110 8 111 8 97 4 80 7 91 6 150 6 ** 123 11 97 5 83 9 88 11 180 15 ** 140 12 # 102 6 Paclitaxel (70µM) 80 11 75 5 ** 145 17 # 96 7 11 C-kolin felvétel a kontroll % - ban
Az A2780AD (Pgp + ) ovárium carcinóma sejtvonal 18 FDG felvétele magasabb, mint a Pgp - A2780 párjáé, ennek oka a pumpa működése következtében a Pgp + sejtek fokozott energia igénye A paclitaxel (Pgp szubsztrát) megnöveli mind a Pgp + mind a Pgp - sejtek 18 FDG felvételét, de nincs hatással a 11 C- kolin felhalmozódásra Paclitaxel kezelés revertálta a 99m Tc-MIBI akkumulációját a Pgp + sejtekben és csak kismértékben változtatta meg a Pgp- sejtek 99m Tc-MIBI felvételét Eur. J. Pharm.Sci.28, 249-256, 2006
Antraciklin származékok csökkentik a 11 C-kolin felhalmozódását és nem befolyásolják az 18 FDG felvételét a petefészek daganatos sejtekben 11 C-kolin felvétel (a kontroll %-ban) 11C-kolin felvétel (a kontroll %-ban) 120 100 80 60 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0 ^ 0 2 4 6 8 10 12 ^^ ^ Daunorubicin concentráció (µm) ^ A2780AD A2780 A2780AD A2780 0 2 4 6 8 10 12 Doxorubicin koncentráció (µm) Izotóp felvétel (kontroll %-ban) 140 120 100 80 60 40 20 0 * 1 µm DNR (choline) 1 µm DNR (FDG) 5 µm DNR (choline) 5 µm DNR (FDG) ^ * * A2780AD A2780 KBV-1 KB-3-1 JY DDT1 MF2 ^ * ^ * ^ * Antraciklin terápia befolyásolhatja a 11 C-kolin-PET tumor diagnosztika eredményét, amit a helyes diagnozis felállításánál fegyelembe kell venni Appl.Radiation Isot. 67, 1806-1811, 2009
UIC2/FITC Fluoreszcencia intenzitás Tc-MIBI felvétel (cpm / millió sejt) Kombinált kezelés (Pgp specifikus UIC2 antitest + Pgp blokkoló) hatékonyan blokkolja a Pgp pumpát a petefészek tumoros sejteken 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 A2780AD A2780 0 5 10 15 20 25 CSA koncentráció (µm) 0 A C A2780AD CSA A2780AD CSA+UIC2 (wash) A2780 CSA+UIC2 (wash) 0 5 10 15 20 25 CSA koncentráció (µm) R123 fluoreszcencia intenzitás DNR fluoreszcencia intenzitás 600 500 400 300 200 100 0 300 250 200 150 100 50 0 A2780AD CSA A2780AD CSA+UIC2 (wash) A2780 CSA+UIC2 (wash) 0 5 10 15 20 25 CSA concentration (µm) D B A2780AD CSA A2780AD CSA+UIC2 (wash) A2780 CSA+UIC2 (wash) 0 5 10 15 20 25 CSA koncentráció (µm)
A kombinált kezelés hatása nyomonkövethető tumordiagnosztikai tracerekkel FDG felvétel a kontroll %-ában 120 100 80 60 40 20 A2780AD A2780 * * Tc-MIBI felvétel a kontrol %-ában 1200 1000 800 600 400 200 A2780AD A2780 # # 0 CSA Pacl UIC2 CSA+UIC2 Pacl+UIC2 0 CSA Pacl UIC2 CSA+UIC2 Pacl+UIC2 Eur.J.Pharm.Sci. 41, 665-669. 2010
Szodoray pályázat kutatási célkitűzései 1. Citosztatikumok hatása a PET tumordiagnosztikai tracerek szöveti akkumulációjára- in vivo vizsgálatok Pgp pozitív és Pgp negatív tumorok esetén
Szodoray pályázat kutatási célkitűzései II. Xenotranszplantációs kísérleti állatmodell kialakítása SCID BC-17 egér Multidrog rezisztens és szenzitív daganat In vivo mini PET kamera (1mm) Statikus és dinamikus vizsgálatok
Tumordiagnosztika és terápia mini-pet kamerával Xenograft állatmodell Pgp pozitív és Pgp negatív humán daganatok in vivo vizsgálatára Pgp negatív Pgp pozitív
Szodoray pályázat kutatási célkitűzései III. Petefészekrákos betegek primer műtéti anyagából származó minták vizsgálata Áramlási cytometriás vizsgálatok (immunfluorescens technika, UIC2 jelölés, R123- funkcionális vizsgálatok) Ascites Szöveti minták Pgp státusz összefüggése a progressziómentes túléléssel (standard) 11C- verepamil in vitro mérésekkel történő validálása az in vivo minipet mérésekhez
Várható tudományos eredmények Eredményeink hozzájárulnak: A petefészek tumoros betegek kemoterápiájának hatékonyabb tervezését lehetővé tevő módszer kidolgozásához. Petefészek tumoros betegek izotópdiagnosztikai vizsgálata során nyert információk helyes értelmezését elősegítő eljárás kialakításához.
Kollaborációs kapcsolatok DE OEC Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Nőgyógyászati Onkológiai Tanszék DE OEC Nukleáris Medicína Intézet DE OEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet DE EOC Pathológiai Intézet
Köszönet nyilvánítás DEOEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet Dr. Goda Katalin, Prof. Szabó Gábor DEOEC Nukleáris Medicina Intézet Prof. Trón Lajos, Prof. Galuska László, Dr. Balkay László, Dr. Mikecz Pál, Dr. Trencsényi György, Nagy Tamás DEOEC Szülészet és Nőgyógyászati Klinika Prof. Hernádi Zoltán, Prof. Tóth Zoltán Továbbá: közös publikációink társszerzőinek
Köszönöm a figyelmet!