I. Csatornák, receptorok Kapcsoltság, Ca ++ Ioncsatornák Kapcsoltság Aquaporinok Glia szincícium Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release Neurotransz mitter/neuro modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Citokin és kemokin receptorok Endotelin receptorok Komplement rendszer Purinoreceptorok Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca ++, Ca ++ hullámok Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok
Glia szincícium (syncytium) Kapcsoltság 1968-69 Gerschenfeld H.M. elsők közt írta le, hogy a gliasejtek karakterisztikus sajátsága, hogy rés-kapcsolatokon át kapcsoltak - a neurotranszmitterek ezt a kapcsoltságot modulálják, neuron-asztro kommunikáció izom egy, többmagvú sejt szívizom több sejt, gap junctions pan-glial syncytium asztro-odc-ependyma.. recently Christian Giaume Ken McCarthy Cx43 asztro tenyészet..glial cells are not organized as a syncytium, as initially proposed, but rather as networks of communicating cells with defined spatial organization and plasticity, as their modalities of intercellular communication are controlled by endogenous signals in normal and in pathological situations..
active contribution of glia to information processing Kapcsoltság glial cells have developed mechanisms alternative to synaptic transmission that is characteristic of neurons gap junction channels (GJ) gap junctional plaques gap junction kifejezés: gap : 2-2,5 nm rés a sejtek között Connexins Cx Pannexins Panx hemichannels (HCs) Giaume, Liu 2011 http://www.cytochemistry.net/cell-biology/membrane2.htm
Gap junctions http://www.unmc.edu/biochemistry/ Paul Sorgen - két sejt közti rés csak 2-2,5 nm - connexinek (6 db) connexon - ~20 altípus (26-62 kda; pl. Cx43 43 kda) - minden connexinben 4 TM domén - homomer vagy heteromer connexonok - homocelluláris vagy heterocelluláris kapcsolat - 1,5 nm pórus: relatív nagy, akár 1 kda molekulák is átjuthatnak, Ip3, ATP, vitaminok és ionok elektromos kapcsoltság is - open - closed állapotok - hemichannels
GJ csatorna nyitását szabályozza: - nagy Ca ++ ic : permeabilitás - ph : permeabilitás - connexin foszforiláltság, diszulfid hidak.. - feszültségfüggés Gap junctions Asztroban is van Hiánya: congenital deafness Plug gating model for transjunctional voltagedependent gating of the Cx26 gap junction channel. Maeda 2011 A: ha nincs feszültségklbség a két sejt között: N-terminális hélixek (NTH) az 1 TM régióhoz simulnak hidrofób módon B: pozitív elektromos mező kihúzza az Asp2-t (ez negatív töltésű-), NTH a pórusba kerül, dugót képez.
GJ open/close állapot szabályozása gap junction coupling functions to achieve isopotentiality in astrocytic networks, whereby a constant extracellular environment can be powerfully maintained for crucial functions of neural circuits humán postmortem HC minták MDD és kontroll betegekből (post mortem) génexpr. study - downregulation of GJ gene expr.
Connexinek - Pannexinek PanX - gerinctelen innexinekkel homológok így azonosítják őket - tulképp nagy transzmembrán csatornák: csak hemichannel-t képeznek Kapcsoltság Asztro: - PanX: van (több in vitro adat) - Connexin: főleg: Cx43, Cx30, kevesebb: Cx26, Cx40, Cx45 - Cx43 embrionális kortól, Cx30-2. posztnat héttől csak szürkeállományban Mikroglia: - aktivációra Cx43, illetve Panx1, Cx32 Neuronok: - Cx26, Cx32, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, Cx47 illetve Cx43 és Cx32 is jelen lehet - Cx36 csak neuronokban! Oroszok Schwann sejt - myelináló sejt: Cx32 - éretlen Schwann: Cx46 NG2 glia: - nem kapcsolt (nincs erre jelenleg adat) - Panx1 is jelen van több neuronális populációban és PSD95-tel kolokalizál: szinaptikus funkcióban is szerepe lehet, szintje már születés környékén magas - Panx2 is jelen van neuronokban, főleg felnőttben Giaume, Liu 2011
Kapcsoltság Astrocyte astrocyte (A/A) coupling pan-glial network - Cx30 és Cx43 kolokalizál asztro GJ plakkokban - variációk: Cx30/Cx30, Cx43/Cx30, and Cx43/Cx43 - eddigi elfiz adatok: kolokalizáció ellenére inkább homotipikus GJ valószínű (nagyobb festékterjedés, ha csak Cx30-at vagy Cx43-at expresszáltatnak pl. HeLa sejtekkel) Astrocyte oligodendrocyte (A/O) coupling Lásd még: 3. előadás! - GJ-t sokkal inkább a szomszédos asztrokkal képeznek, mint más ODC-kal - A/O kapcsolat heterotipikus kell legyen, mert ODC-k más Cx-ket expresszálnak, mint asztrok: Cx29, Cx32, Cx45, Cx47 Oligodendrocyte oligodendrocyte (O/O) coupling - újabban van csak néhány adat O/O GKJ kapcsolatra (corpus callosumban) - Cx32 és Cx47 vesz részt ezekben az O/O kacsolatokban Neuron-glia coupling - kevés bizonyíték van neuron-glia GJ kapcsoltságra - neuron-neuron inkább? Neuronális kapcsoltság nő, ha neuron sérül! Giaume, Liu 2011 Orthmann-Murphy 2008
Kapcsoltság - átlagosan egy asztro-pár a szürkeállományban 230 GJ-vel kapcsolt: magas fokú kapcsoltság!! 300 um slice - Lucifer yellow, Alexa dyes (~450 kda), biocitin: 1 asztroba injektálva 50-100 szomszédos asztro jelölődik - kapcsoltság mértéke agyterületenként nagyon eltér: cortexben szinte teljes kapcsoltság (~100%); látóidegben 80%, HC-ban csak 50%, corpus callosumban szinte semmi 50 um slice Astrocytic coupling in the neocortex and in the corpus callosum. Biocytin. GFAP-GFP mice
Kapcsoltság P11 egér Sulforhodamine B Asztro biocitin jelölése cortexben Asztro azonosítás morfológia/elfiz alapján Houade, Giaume 2006
P11 egér, Asztro biocytin jelölése HC-ban, CA1 Kapcsoltság A1,A2: stratum radiatum közepén - koncentrikus B1 C2: stratum radiatum közel a piramissejt-réteghez : ekkor 2 féle jelölés B1,B2: biocytin jelölés megáll a pirmissejt-rétegben C1,C2: biocytin megjelöl asztrokat a stratum oriens-ben is - asztrociták a CA1-ben jobban (dye- coupled) kapcsoltak, mint CA3-ban - ennek funkcionális jelentősége még?? - de: CA1 kevés kapilláris CA3-hoz képest: metabolikus szignálok jobban terjedhetnek a kevésbé vaszkularizált területeken így?? Houade, Giaume 2006
Glia szincícium (syncytium) Kapcsoltság vizsgálata Kapcsoltság - elektrofiziológia, ionáramok, inhibitorok: carbenoxolone, GRA,.. - dye coupling - intracellular calcium imaging - flash photolysis of caged compounds - recovery after photobleaching (FRAP) slide - local activation (LAMP) of fluorescent probes
Kapcsoltság barrel cortex: szomatoszenzoros kéreg IV. réteg http://www.bacofun.medizin.uni-mainz.de/102.php
Kapcsoltság Such anatomofunctional organization offers an ideal model to study how astrocytic networks are organized in reference to neuronal compartments A: akut szelet, infravörös megvilágítás B: morfológia és méret alapján kiválasztott asztro egy patch pipetta végén C, D: biocytin immunfestés, P5 és P10 E: carbenoxolone (100M) F: biocytin+ sejtek számolása: P5- P10 közt nagy váltás
Kapcsoltság A C: Barrel cortex, már P6-nál több a Cx43 a barrelekben. Diffúz, stellate pattern. D-E: Cx43 koronális és tangenciális metszeten, P10 F, G, Cx43 koronális metszeteken a barreleken belüli és azokon kívüli területeken, P20 H: Cx30 tangenciális metszeten, P20 I K: Cx43 és Cx30 fenőttben megmarad. Houades 2008
Kapcsoltság A1-A2: festékterjedés 20 perccel sulphorodamin beadása után, barrelen belüli asztrociták közt B1-B2, festékterjedés 20 perccel sulphorodamin beadása után, barrelek közti septumban levő asztrociták közt Houades 2008 P10, biocytin és sulforhodamine B-vel kapott kapcsoltság nagyon más!!! : kapcsoltsági csoportok mérete: Biocytin: 73 +-17 és SB:15+-1 astrocytic networks parallel the columnar compartmentalization of neurons in the somatosensory cortex Houades 2008
Kapcsoltság Kína - Cx43 KO ellenére anatómiailag normál barrel struktúra - de in vivo elektrofiziológia szerint a vibrisszákon nagy frekvenciával, ritmikus stimulálással (100 Hz, 1s) kiváltott LTP válaszok eltűntek a Cx43 KO egérben - viselkedési vizsgálatok szerint a bajusszőrök általi környezet-érzékelés képessége romlott (de nem tűnt el)
Kapcsoltság - asztrok kapcsoltak glomerulusokon belül, de glomerulusok között nem - KO egerek: Cx30 végzi itt a kapcsolást bár Cx43 is van
Asztro network térbeli/időbeli szabályozásának szintjei milyen connexint expresszálnak Cx kipakolódás/visszavétel szabályozása Cx kompatibilitás (homo/heterotipikus kapcs) csatorna szelektivitása (tradicionálisan poorly selective channels de a dye spreading nem azonos biomolekulák átjutásával!! ) csatorna feszültség-függése GJ nyitottság szabályozása: neuronális aktivitás, más agyi sejtek által termelt faktorok, glia-aktiváció : neurotranszmitterek, endotelinek (gátlás!), citokinek Giaume, Liu 2011! Cx43 átengedi: Kapcsoltság - camp, InsP3 - Ca ++ - AS: glutamate, aspartate and taurine - nukleotidok: ADP, ATP, CTP, NAD - energia-metabolitok: glucose, glucose-6-phosphate and lactate - kis peptidek pl. glutathione - RNS Cx30 átengedi: - kevesebb info, eddig: -ATP, InsP3, aspartate, glutamate, glucose and lactate - selective for cations over anions Cx30/Cx30 és Cx43/Cx43 és Cx30/Cx43 csatornák is feszültségfüggőek (konduktanciájuk a transzmembrán feszültségtől függ) - sejtek izolálhatják magukat pl. sérült sejtektől
I. Csatornák, receptorok Kapcsoltság, Ca ++ Ioncsatornák Kapcsoltság Aquaporinok Glia szincícium Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release Neurotransz mitter/neuro modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Citokin és kemokin receptorok Endotelin receptorok Komplement rendszer Purinoreceptorok Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca ++, Ca ++ hullámok Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok
Ca ++ szignalizáció nagyon általános, rengeteg minden szabályozza ic Ca ++ szintet: térben/időben nagyfokú szabályozottság kell! Ca ++ szabad Ca ++ kevés a sejtben! NMDA rec! LTP...
Ca ++ homeosztázis fő útvonalai/komponensei * excess Ca++ removal * Ca ++ Store operated Ca ++ channel (SOOC) vagy capacitative Ca ++ entry ic Ca ++ raktár kiürülése Ca ++ influxot indukál Verkhratsky Butt 2007 NCX Na + /Ca 2+ exchanger; PMCA Plasmalemmal Calcium ATP-ase; Ca 2+ BP Ca 2+ binding proteins; InsP3R Inositol-1,4,5-trisphosphate Receptor/Inositol-1,4,5-trisphosphate-gated Ca 2+ channel; RyR Ryanodine Receptors/Ca 2+ -gated Ca 2+ channel; SERCA Sarco(Endo)plasmic Reticulum Calcium ATPase. Intra-ER Ca 2+ binding proteins also act as Ca 2+ dependent chaperones, which are enzymes controlling protein folding into the tertiary structure. PTP permeability transition pore (fiziológiásan zárva, patológiás esetben nyitva)
* Calcium-induced Ca ++ release koffein! ic Ca ++ koncentráció : RyR2, RyR3 receptorokat (csak ez a szignál!) aktiválja: ER-ból is Ca ++ release citoszolba * Depolarization-induced Ca ++ release Depolarizáció RyR1 receptor-aktiváció * InsP3-induced Ca ++ release ha ic Ca ++ : InsP3-Rec érzékenysége nő InsP3-ra * Ca ++ spark, puff egyetlen RyR vagy Insp3R nyitása miatt bekövetkező citoszolikus Ca ++ és ez továbbadódhat: * propagating intracelllular Ca ++ wave * Ca ++ excitotoxicity ha túl sokáig magas az ic Ca ++ gliában ez a fő útvonal DE: gliában RyR szerepe Ca ++ signalingban kicsi vagy semmi Ca ++ RyR és InsP3 Ca ++ érzékenysége miatt alakulhat ki ez a tovaterjedő Ca ++ hullám nem maga a Ca ++ ion terjed tova, hiszen ez azonnal kikötődik Ca ++ kötő fehérjékhez hanem újabb és újabb Ca ++ efflux történik!
- Ca ++ influx érett gliába: főleg ligand-gated csatornákon: ionotróp glutamát receptor, P2X purinoreceptor - metabotrop receptorok Ca ++ hullám indításában fontosak Ca ++ metabotrop receptorok InsP3 InsP3Rec aktiváció ER magas Ca ++ szint tovább fennmarad, mint maga a stimulus ER kimerül Ca ++ influx (SOOC) ER-ből Ca ++ release citoszolba - ez lehet egyszeri (peak), több száz mp-ig tartó Ca ++ plateau - vagy ismétlődő oszcilláció!! - glia neuron közti különbség: gliasejtekben ritka a feszültségfüggő Ca ++ csatorna: legtöbb érett gliában (asztro, ODG, Schwann) nincs, progenitorokban van éréskor eltűnik - másik különbség: glia ER-ben a Ca ++ konc.:100-300 um (neuronban: 300-800uM) Ca ++ wave tengeri csillag pete (starfish egg) Carroll 1997
Asztroglia monolayer in vitro
propagating intercelllular Ca ++ wave Ca ++ calcium hullám átugrik a sejtmentes sávon Ca ++ hullám a stimulált sejt körül ATP Ca ++ hullám amit a perfúzió eltérít Hassinger 1996 InsP3
propagating intercelllular Ca ++ wave fenntartása: Ca ++ waves A: intracell InsP3 diffúzió B: regeneratív Ca ++ - függő gliotransmitter release és extracell diffúzió C: fokális gliotranszmitter release, mely nagy távolságra diffundál (több száz um-re is, ~15-20 um/sec) Asztrocitahálózatok az agy klb területein máshogy szabályozódnak: Pl. Cx43 KO esetén kéregben nincs hullám de HC-ban megmarad Neuronális akciós potenciál: ms Asztro Ca ++ hullám: sec-min!
Ca ++ waves Spontán calcium oszcillációk asztrocitákban. Hippocampus, CA1. A: Calcium Green AM B: GFAP/S100 immunostaining. C: overlay D: average fluorescence intensities from boxes 1 5 normalized to baseline level, and plotted over time. Four of the 5 cells exhibited spontaneous calcium oscillations and all cells responded to tacpd (mglur agonist) application with a calcium increase. s.r., stratum radiatum; s.p., stratum pyramidale
Ca ++ waves Ca ++ oszcillációk HC asztro nyúlványaiban Oregon Green BAPTA-1 töltés A: regions of interest (ROI) B: a 4 nyúlvány elég különböző Ca ++ jeleket ad C. II. csoport kinagyítva: Ca ++ ROIs 9-10 területén kezdődött, innen ic. calcium hullám halad végig a nyúlványon Nett 2002
Ca++ waves Nucleus accumbens, Patkány agyszelet Fluo-4AM töltött sejtek, ATP hatás Molnár, Kardos 2011
Na de mire jók ezek a Ca ++ hullámok?
Intercelluláris Ca ++ hullámok : - normál felnőtt agyban, in vivo :??? - ahol kimutatták: - in vitro - in vivo a fejlődő agyban - specializált szövetekben (pl. retina) - patológiás esetekben (pl. Alzheimer kór, epilepszia) ha szinaptikus aktivitást gátolják és fesz.függő Ca ++ csatornákat blokkolják neuronokon akkor is kilakulhat lassú neuronális depolarizáció: photolysis of caged Ca ++ elegendő gliális Ca ++ szint növekedés kiváltásához gliális Glutamát release epileptikus aktivitás http://www.rikenresearch.riken.jp/eng/research/7018
...By using 2-photon microscopy in rodent cerebellar cortex labeled with fluorescent indicator dyes or the calcium-sensor protein G-CaMP2, we discovered spontaneous calcium waves that filled approximately ellipsoidal domains of Bergmann glia processes. Waves spread in 3 dimensions at a speed of 4-11 microm/s to a diameter of approximately 50 microm, slowed during expansion, and were reversibly blocked by P2 receptor antagonists. Consistent with the hypothesis that ATP acts as a diffusible trigger of calcium release waves, local ejection of ATP triggered P2 receptor-mediated waves that were refractory to repeated activation. Transglial waves represent a means for purinergic signals to act with local specificity to modulate activity or energetics in local neural circuits... genetically encoded calcium indicator Please check: https://www.youtube.com/watch?v=_cbfwon2myq..we monitored calcium activity simultaneously from hundreds of mouse hippocampal astrocytes in vivo and found that almost all astrocytes participated en masse in regenerative waves that propagated from cell to cell (referred to here as glissandi ). Glissandi emerged depending on the neuronal activity and accompanied a reduction in infraslow fluctuations of local field potentials and a decrease in the flow of red blood cells. This novel phenomenon was heretofore overlooked, probably because of the high vulnerability of astrocytes to light damage; glissandi occurred only when observed at much lower laser intensities than previously used...
Glial calcium waves constitute a means to spread signals between glial cells and to neighboring neurons and blood vessels. These waves occur spontaneously in Bergmann glia (BG) of the mouse cerebellar cortex in vivo. Here, we tested three hypotheses: (1) aging and reduced blood oxygen saturation alters wave activity; (2) glial Ca(2+) waves change cerebral oxygen metabolism; and (3) neuronal and glial wave activity is correlated. We used two-photon microscopy in the cerebellar cortexes of adult (8- to 15-week-old) and aging (48- to 80-week-old) ketamine-anesthetized mice after bolus loading with OGB-1/AM and SR101. We report that the occurrence of spontaneous waves is 20 times more frequent in the cerebellar cortex of aging as compared with adult mice, which correlated with a reduction in resting brain oxygen tension. In adult mice, spontaneous glial wave activity increased on reducing resting brain oxygen tension, and ATP-evoked glial waves reduced the tissue O(2) tension. Finally, although spontaneous Purkinje cell (PC) activity was not associated with increased glia wave activity, spontaneous glial waves did affect intracellular Ca(2+) activity in PCs. The increased wave activity during aging, as well as low resting brain oxygen tension, suggests a relationship between glial waves, brain energy homeostasis, and pathology.
I. Csatornák, receptorok Kapcsoltság, Ca ++ Ioncsatornák Kapcsoltság Aquaporinok Glia szincícium Gliotranszmisszió Gliotranszmitterek Nem vezikuláris release Vezikuláris release Neurotransz mitter/neuro modulátor receptorok Glutamát receptorok GABA receptorok Citokin és kemokin receptorok Endotelin receptorok Komplement rendszer Purinoreceptorok Gap junctions Hemichannels Asztro network térbeli/időbeli szabályozása Gliális Ca ++, Ca ++ hullámok Transzporterek, egyéb glia eredetű faktorok Gliális neurotranszmitter transzporterek Glutamát transzporterek GABA transzporterek Glycin transzporterek Egyéb transzporterek Ozmolitikumok Glia eredetű neuropeptidek Glia eredetű növekedési faktorok
Volterra, Meldolesi 2005 Gliotranszmitterek Asztrocitákban!
Nem vezikuláris release Gliotranszmitterek I. II. Hemichannels Glu, Asp, ATP release P2X7 purinoreceptorok nagy pórus ATP release patológiás esetekben, ha extracell ATP szint magas III. Volume-activated anion channels glutamát és taurin ürülése; hipozmotikus körülmények közötti asztro swelling hatására nyílnak Pl.: pituicitákból taurin release, ez VP/OT neuronok glicinreceptoraival kerül kapcsolatba: VP/OT release: a test ozmotikus homeosztázisának szabályozása IV. Transzporterek megfordulása pl. Glu release asztroból csak patológiás esetekben
Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) - lokális!! Ca ++ indukálja a plazmamembrán/vezikula fúziót - vezikuláris Ca ++ szenzor: synaptotagmin I - vezikuláris még: synaptobrevin II - plazmamembrán: syntaxin, SNAP25 - ezek alkotják együtt a SNARE komplexet - asztroban minden komponens jelen van - VGLUT is van asztroban - szinaptikus-szerű mikrovezikulák... stb, persze sokkal komplexebb...
ELMI: szinaptikus-szerű mikrovezikulák (SLMVs) asztrocitában (hippocampus) Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) méretre és formára is hasonlítanak a szinaptikus vezikulákhoz Volterra, Meldolesi 2005
Gliotranszmitterek Vezikuláris release (exocitózis) Asztro glutamát release-t stimulálhatják: - P2YR, mglur, bradykinin, BDNF receptor aktiváció - Ca ++ kelátorok (pl. BAPTA-AM) teljesen gátolják - neuron: feszültségfüggő Ca ++ influx: gyors - glia: Ca ++ belső raktárakból: lassú, de hosszan tartó Asztro szekretálhat D-serine-t is, ez speciális gliotranszmitter, glia gyártja L- serin-ből racemase enzim révén: NMDAR glycin kötő-helyeit stimulálja Asztro/neuron kommunikáció! - HC asztrocitákban speciális exocitózis: kiss and run exocitózis: vezikula rövid ideig (~2 ms) nyit, aztán zár nem ürül ki teljes tartalma!
Gliotranszmitterek Glutamát exocitózis asztrocitákból TIRF mikroszkópia 2004 Bezzi, Paola [Ca ++ ] ic hatására FM-64 kiürül a vezikulumokból VGLUT EGFP TIRF FM-64 festék együtt Volterra, Meldolesi 2005
video astrocytes expressing the fluorescent synaptobrevin 2 derivative, synapto-phluorin