Szabadgyök-reakciók és az antioxidáns rendszer gasztroenterológiai betegségekben és diabetes mellitusban dr. Szaleczky Erika

Szabadgyök-reakciók és az antioxidáns rendszer gasztroenterológiai betegségekben és diabetes mellitusban dr. Szaleczky Erika Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető: Dr. Prónai László Ph.D. Dr. Somogyi Anikó Ph.D. Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A hepatológia szabadgyökös és immunológiai vonatkozásai 2000 1

Tartalomjegyzék oldal Bevezetés 3 A nitrogén-oxid és a peroxinitrit 5 Az oxidatív stressz és a daganatok kialakulása 6 Az oxidatív stressz és a diabetes mellitus 6 A szabadgyökös reakciók vizsgálatának lehetőségei 8 Célkitűzések 9 Irodalmi háttér 12 1. Szabadgyökök és antioxidánsok 12 2. Az antioxidáns védelem 12 2.1. Az antioxidáns enzimek 13 2.2. A nem-enzimatikus antioxidáns védelem 14 2.2.1. Antioxidáns vegyületek 14 2.2.2. Antioxidáns tulajdonságú vitaminok 15 3. A nitrogén-oxid 17 3.1. A nitrogén-oxid biokémiája 19 3.2. A nitrogén-oxid bioszintézise 20 3.3. A nitrogén-oxid molekuláris hatásai 22 3.4. A nitrogén-oxid fiziológiás és toxikus hatásai 22 3.5. A citosztatikus és citotoxikus nitrogén-oxid 23 3.6. A nitrogén-oxid szerepe az immunitásban és a gyulladásban 24 3.7. A nitrogén-oxid fiziológiás és patofiziológiás szerepe a gyomor-bélrendszerben 24 3.7.1. NO felszabadulás a gyomor-bélrendszerben 25 3.7.2. Az NO és a nonadrenerg, nonkolinerg (NANC) beidegzés 25 3.7.3. Az NO és a gyomor-bélnyálkahártya védelem 27 3.7.4. Az NO szerepe bélbetegségekben 27 4. Az oxidatív stressz és a gyulladásos bélbetegségek 28 5. Összefüggések a cukorbetegség és a szabadgyökös folyamatok között 30 5.1. Etiológia 31 5.2. A prooxidáns és antioxidáns tényezők változásai a diabetest kísérő anyagcsere eltérések tükrében 33 5.2.1. Hiperglikémia-glikoziláció 34 5.2.2. Oxidált termékek 35 5.2.3. Diszlipémia 36 I

5.2.4. Sorbitol pathway - a poliol út 38 6. Az antioxidáns rendszer diabetes mellitusban 39 6.1. Az antioxidáns enzimrendszer változásai diabetes mellitusban 39 6.1.1. Elméleti lehetőségek az antioxidáns enzimek aktivitás változásaira diabetes mellitusban 39 6.1.2. Kísérletes és klinikai megfigyelések 41 6.2. Az antioxidáns vegyületek változásai cukorbetegségben 46 6.3. Az antioxidáns vitaminok koncentrációjának alakulása diabetes mellitusban 47 6.3.1. C vitamin 47 6.3.2. E-vitamin 52 6.3.3. A-vitamin 53 7. Az antioxidáns terápia lehetőségei diabetes mellitusban 53 7.1. E-vitamin 53 7.2. C-vitamin 53 7.2.1. Aszkorbinsav és protein glikáció 53 7.2.2. Kísérleti eredmények 54 Módszerek 57 (A) A gasztroenterológiai betegségekben szenvedők szabadgyökreakcióinak és antioxidáns státuszának vizsgálatakor alkalmazott módszerek 57 Betegek 57 1. Felső gasztrointesztinális kórképekben szenvedő betegek plazmamérések 57 2. Felső gasztrointesztinális kórképekben szenvedő betegek - szövetminta-mérések 58 3. Colorectalis carcinomában szenvedő betegek 58 4. Colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegek 59 5. Szöveti oxigén szabadgyök-scavengerek és a nitrát/nitrit szint vastagbél adenocarcinomában 62 6. Peroxinitrit kimutatása 62 Módszerek 62 1. Nitrát/nitrit meghatározás 62 2. Szuperoxid gyökfogó aktivitás mérése 63 3. Teljes szulfhidril tartalom meghatározás 63 4. Nitrotirozin meghatározás 64 II

5. Antioxidáns enzimmeghatározások 64 6. Plazma össz-scavenger kapacitás mérése 64 7. Fehérjemeghatározás 65 8. Statisztikai számítások 65 (B) A cukorbetegek antioxidáns védelmének vizsgálatakor alkalmazott módszerek 66 Betegek 66 1. Jól kontrollált 1. típusú cukorbetegek 66 2. Elfogadhatóan kontrollált 1. típusú cukorbetegek 67 3. A cukorbetegség időtartamának antioxidáns rendszerre gyakorolt hatásának vizsgálatában résztvevő betegek 68 4. Az intravazális antioxidáns védelem vizsgálatban résztvevő, inzulinnal kezelt cukorbetegek 69 5. 2. típusú, inzulinnal kezelt cukorbetegek 69 6. 2. típusú cukorbetegek plazma vitaminszintjének vizsgálata 70 7. 1. típusú cukorbetegek - plazma lipidfrakciók A és E vitamin koncentrációja 71 8. C vitamin pótlás vizsgálatban résztvevő cukorbetegek 71 Módszerek 72 1. Antioxidáns enzimek és vegyületek meghatározása 72 2. Vitaminszintek vizsgálata 74 3. Lipidperoxidáció meghatározása 75 4. Klinikai laboratóriumi paraméterek 75 5. Statisztikai számítások 76 Eredmények 77 (A) Oxigén és nitrogén központú szabadgyökreakciók és az antioxidáns rendszer vizsgálata gasztroenterológiai betegségekben 77 1. Emelkedett plazma nitrát/nitrit szint krónikus gastritisben és peptikus fekélybetegségben, összefüggés a Helicobacter pylori státusszal és a Helicobacter pylori eradikációval 77 2. Helicobacter pylori státusz és szöveti nitrát/nitrit szintek, szuperoxid gyökfogó aktivitás és szulfhidril csoportok peptikus fekélybetegségben vagy funkcionális dyspepsiában szenvedő betegekben 77 3. A plazma nitrát/nitrit szintek colorectalis carcinomában szenvedő betegekben 79 4. A plazma nitrát/nitrit szint és az antioxidáns védelem colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségekben 81 III

5. Colorectalis tumorszövet szuperoxid gyökfogó aktivitása, nitrát/nitrit és szulfhidril csoport tartalma 84 6. Peroxinitrit kimutatása colorectalis tumorszövetben 85 7. Antioxidáns védelem colorectalis daganatokban 86 (B) Az antioxidáns rendszer vizsgálata diabetes mellitusban 88 1. Intenzifikált inzulin kezelésben részesülő 1. típusú cukorbetegek antioxidáns státusza 88 1.1. Jól kontrollált (HbA1c=6,06±0,48%) 1. típusú cukorbetegek antioxidáns státusza 88 1.2. Megfelelően kontrollált (HbA1c=7,89±2,53%) 1. típusú cukorbetegek antioxidáns státusza 90 2. A cukorbetegség klinikai fennállási időtartamának hatása a vér antioxidánsaira 91 3. Az intravazális antioxidáns védelem vizsgálata inzulinnal kezelt cukorbetegekben 92 4. A plazma redukált C vitamin és glutation szintje elfogadható anyagcsere - egyensúlyú cukorbetegekben 94 5. A plazma antioxidánsai - az antioxidáns vitaminok és a kis molekulasúlyú antioxidánsok - 2. típusú cukorbetegekben 95 6. A zsíroldékony antioxidáns vitaminok koncentrációja a plazma lipidfrakciókban hiperlipidémiában és 1. típusú diabetes mellitusban 100 6.1. Az E-vitamin koncentrációja hiperlipidémiában és 1. típusú diabetes mellitusban 100 6.2. Az A-vitamin koncentrációja hiperlipidémiában és 1. típusú diabetes mellitusban 101 7. Hosszú távú, nagy dózisú aszkorbinsav szupplementáció hatása a glikozilált haemoglobinszintre 102 Megbeszélés (A) Oxigén és nitrogén központú szabadgyökreakciók és az antioxidáns rendszer vizsgálata gasztroenterológiai betegségekben 106 1. A plazma nitrát/nitrit szint magasabb peptikus fekélybetegségben és/vagy krónikus gastritisben - az emelkedés független a Helicobacter pylori státusztól vagy eradikációtól 106 2. Magasabb nitrogén-oxid koncentráció és alacsonyabb oxigén szabadgyök scavenger mennyiség Helicobacter pylori pozitív peptikus fekélybetegekből nyert gyomorszövetben 107 3. A plazma nitrát/nitrit szintek colorectalis carcinomában 107 IV

4. Emelkedett plazma nitrát/nitrit szintekhez alacsonyabb oxigén szabad gyökök elleni védelem társul colorectalis carcinomában és gyulladásos bélbetegségekben 109 5. Szulfhidril csoportok, szuperoxid gyökfogó aktivitás és nitrát/nitrit szintek colorectalis tumorszövetben 110 6. Nitrotirozin a tumorszövetben, mint az in vivo peroxinitrit képződés bizonyítéka colorectalis carcinomás betegekben 110 7. Csökkent plazma antioxidáns szintek colorectalis carcinomás betegekben 111 (B) Az antioxidáns rendszer vizsgálata diabetes mellitusban 113 1. Kielégítő antioxidáns védelem 1. típusú cukorbetegségben 113 2. A cukorbetegség klinikai fennállási időtartamának hatása a vér antioxidánsaira 114 3. Az intravazális antioxidáns védelem inzulinnal kezelt 1. és 2. típusú cukorbetegekben 116 4. A plazma redukált C-vitamin és glutation szintje elfogadható anyagcsere-egyensúlyú cukorbetegekben 116 5. A plazma antioxidánsai - az antioxidáns vitaminok és a kis molekulasúlyú antioxidánsok - 2. típusú cukorbetegekben 117 6. Lipidoldékony antioxidáns vitaminstátus a plazma lipidfrakcióiban hiperlipidémiában és 1. típusú cukorbetegségben 118 6.1. E-vitamin koncentráció hiperlipidémiában és 1. típusú cukorbetegségben 118 6.2. A-vitamin koncentráció hiperlipidémiában és 1. típusú cukorbetegségben 118 7. A glikált hemoglobin szintek csökkenése hosszú távú, nagy dózisú aszkorbinsav pótlás hatására egészségesekben és cukorbetegekben 119 Köszönetnyilvánítás 121 Irodalomjegyzék 122 V

Rövidítés-magyarázat jegyzék AA aszkorbinsav AI aterogén index ATP adenozin-trifoszfát BB Bio Breeding CAT kataláz CEA carcinoembrionális antigén cgmp ciklikus guanozin-monofoszfát DHAA dehidroaszkorbinsav DNS dezoxiribonukleinsav EDRF endothelsejtből nyert relaxációs faktor FAD flavin-adenin-dinukleotid FAM flavin-mononukleotid Gpx glutation peroxidáz Gred glutation reduktáz GR glutation reduktáz GSH redukált glutation GSSG oxidált glutation HDL high density lipoprotein Hp. Helicobacter pylori IDDM inzulin dependens diabetes mellitus LDL low density lipoproteein MDA malondialdehid NADH nikotinamid-adenin-dinukleotid NADPH nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát NANC nonadrenerg, nonkolinerg NIDDM nem inzulin dependens diabetes mellitus NO nitrogén-oxid NOS nitrogén-oxid szintáz ONOO - peroxinitrit SH szulfhidril SSA szuperoxid gyökfogó aktivitás SOD szuperoxid dizmutáz STZ streptozotocin TAS teljes antioxidáns státusz TBARS tiobarbitursav reaktív anyagok VIP vazoaktív intestinalis polypeptid VLDL very low density lipoprotein 2

Bevezetés Évtizedek óta ismert és vizsgált a természetben és az emberi szervezetben előforduló párosítatlan elektronokkal rendelkező, nagy reakcióképességű molekulák, az ún. szabad gyökök szerepe. Számos vizsgálat kutatta és kutatja ma is, hogy részt vesznek-e az egyes betegségek patogenezisében, vagy felszaporodásuk csak következményként kíséri-e a kórképeket. Munkánk során a szabadgyökös reakciók egyes résztvevőinek vizsgálatát tűztük ki célul a populáció jelentős hányadát érintő két betegségcsoportban. Kiváncsiak voltunk, vajon a szabad gyökök felszaporodását kísérő oxidatív stressz, valamint az azt egyensúlyban tartó antioxidáns védelem hogyan alakul olyan gasztroenterológiai betegségekben, mint a peptikus fekély, a colitis ulcerosa és különösen a vastagbélrák, és milyen eltéréseket találunk 1. és 2. típusú cukorbetegség fennállása esetén. A klasszikus peptikus fekélybetegség a gyomor, elsősorban az antrum-nyálkahártya krónikus gyulladásával társuló folyamat. A peptikus fekélybetegséget a kiújulási hajlam jellemzi. Mind a gyulladásos folyamatok, mind a kiújulási hajlam vonatkozásában a Helicobacter pylori infekciónak tulajdonítanak szerepet. Bár a kórkép előfordulása a fejlett országokban csökkenő tendenciát mutat, megalapozott epidemiológiai adatok szerint még ma is a populáció 10%-a válik fekélyhordozóvá élete során (1). A colitis ulcerosa ismeretlen etiológiájú idült gyulladásos bélbetegség. A gyulladásos reakció mélységében csak a nyálkahártyára lokalizálódik, kiterjedés szerint folytonos. Lefolyása során aktív és inaktív periódusok váltakoznak egymással. Előfordulása a fejlett országokban 1-10/100.000 lakos/év. Patomechanizmusában, a gyulladás kóros mértékű felerősödésében, immunológiai történéseknek tulajdonítanak szerepet (2). A nitrogén-oxid és a reaktív oxigén metabolitok szerepét az utóbbi években vizsgálják (3). A colorectalis carcinoma a nyugati országokban a leggyakoribb malignus betegség, és a rosszindulatú folyamatok között a második vezető halálok (4). Oka ismeretlen, egyes adatok szerint kialakulásáért az esetek közel 35%-ban az étkezési szokások tehetők felelőssé (5). Zsírban és húsban gazdag, valamint rostban szegény 3

étrend jelentősen megemeli a székletben a hidroxilgyökök keletkezésének lehetőségét, ami ugyanakkor hozzájárulhat a colorectalis rák rizikójának emelkedéséhez (6). A gyulladásos vastagbélbetegségek és a vastagbélrák közötti összefüggés ismert. A diabetes mellitus szindróma komplex anyagcserezavar: elsődleges a szénhidrát-reguláció felborulása, melyet azonban a zsír-, a fehérje- és a nukleinsav-anyagcsere zavara is kísér. A szindróma oka az abszolút vagy relatív inzulinhiány. Bár a hiperglikémia a diabetes mellitus minden megjelenési formájában megtalálható, mégis különféle eredetű, eltérő genetikai és patofiziológiai vonatkozásokkal rendelkező, exogén és endogén kóroki tényezőkre visszavezethető szindrómát takar (7). Az elsődleges cukorbetegségnek két alapvetően különböző formáját, az 1. típusú vagy inzulin-dependens és a 2. típusú vagy nem inzulin-dependens diabetes mellitust különböztetik meg. Az aerob anyagcsere velejárója a reaktív oxigéngyökök képződése, ezért az ezen életformát folytató élőlények mind rendelkeznek valamilyen formájú antioxidáns védelemel (8). A szervezetben keletkező oxidáns - más néven prooxidáns - tényezők mennyiségét és minőségét egyrészt magában a szervezetben játszódó anyagcsere folyamatok, másrészt külső hatások - pl. sugárzás, táplálék - határozzák meg (9). A prooxidáns és antioxidáns tényezők közötti egyensúlyi állapot felborulását tehát az anyagcsere folyamatok megváltozása vagy környezeti hatások okozhatják. Számos betegség patofiziológiájában feltételezik a szabadgyökök és az általuk okozott oxidatív stressz szerepét (10), azonban e folyamatoknak pontosabb megismerése, annak eldöntése, hogy az oxidatív stressz oka vagy következménye az egyes betegségeknek, még ma is a kutatás tárgya (11). Ezekben betegségekben a természetes antioxidáns védekezés csökkenését mutatták ki. A kutatók felvetették, hogy a természetes antioxidáns anyagok pótlásával esetleg az oxidatív károsodás csökkenthető, és ezzel betegségek progressziója késleltethető (12). A prooxidáns tényezőkkel szembeni egyensúlyt a szervezet antioxidáns védelmi rendszere biztosítja (13, 14); intracellularisan elsősorban enzimek, mint a kataláz, a glutation peroxidáz és a szuperoxid dizmutáz. Az enzimatikus antioxidánsok mellett számos nem 4

enzim molekula vesz részt az oxidáció elleni védelemben. A plazmában található komponensek közül - gyökfogó kapacitásuk és relatíve magas koncentrációjuk miatt - az albumin, a húgysav és a bilirubin tartható fontos antioxidánsnak. Annak ellenére, hogy ezeknek az anyagoknak a fő feladata nem a gyökök közömbösítése, a plazma teljes antioxidáns kapacitásának 50-80%-t adják (15). További fontos antioxidánsok a - plazmában sokkal kisebb koncentrációban jelenlévő - zsíroldékony E- vitamin és béta-karotin, valamint a vízoldékony C vitamin (16, 17). A plazma antioxidáns kapacitásának kisebb hányadát teszik ki, mégis szerepük az oxidáció elleni védelemben jobban ismert, és valószínűleg élettanilag fontosabb (18, 19). A nitrogén-oxid és a peroxinitrit A nitrogén-központú szabadgyökök alapmolekulája a nitrogén-oxid (NO), mely az endothelsejtekben és a neuronokban a konstitutív nitrogén-oxid szintáz által kis mennyiségben termelődve, sejtvédő, sejtreguláló (vazodilatáció, neuro-transzmisszió), míg az indukálható nitrogén-oxid szintáz által nagy koncentrációban termelődve, citotoxikus (a mitokondriális enzimek és a légzési lánc bénítása révén) hatású (I). A közvetlen toxicitásért azonban nem az NO, hanem az NO oxigénnel és szuperoxiddal való reakciója során keletkező nitrovegyületei (nitrogén-dioxid, nitrogén-trioxid, peroxinitrit, nitrózaminok) a felelősek. A szervezetben képződő nitrózó vegyületeknek és nitritszármazékoknak mutagén szerepet tulajdonítanak a humán rákok etiológiájában (20). A nitrózó vegyületek a nitrogén-oxid és a makrofágok és neutrofilek által termelt szuperoxid gyökök interakciójából keletkeznek. A fagociták valószínűleg a nitrózó vegyületeket a daganatsejtek elpusztítására felhasználhatják, azonban e vegyületek képesek a reaktív oxigén intermedierekhez hasonlóan strukturális DNS változásokat indukálni. A peroxinitrit és a belőle származó termékek, deamináló, nitráló és nitrolizáló anyagoként szerepelhetnek. E nitrovegyületek közül ma a figyelem az endogén úton fiziológiásan is termelődő, a hidroxilgyök reakcióképességével rendelkező peroxinitrit felé fordult (21). A peroxinitrit szuperoxidból és nitrogén-oxidból keletkezik, aktív biológiai oxidáns, mely számos molekulával reagál, tiolokat oxidál, lipidperoxidációt 5

iniciál, ioncsatornákat inaktivál, károsítja a DNS-t. A peroxinitritet a monocyták eredetileg a baktériumok elpusztítására termelik, de kóros körülmények között, mint pl. krónikus gyulladásban, képes a saját sejtek DNS szintézisének károsítására is. A folyamatos sejtregenáció során ezáltal mutációk sora jöhet létre, s ez bizonyos esetekben malignus sejttranszformációhoz, tumor keletkezéséhez vezethet. A nitrotirozin in vivo a tirozin és a peroxinitrit reakciója során keletkezik. A nitrotirozin specifikus és stabil "footprint"-je a peroxinitrit és fenol gyűrűk, beleértve a fehérje asszociált tirozin maradékok in vivo reakciójának. Habár a nitrálás és a peroxinitrit szerepét feltételezik a rák etiológiájában, eddig nem igazolták nitrotirozin keletkezését humán colorectalis daganatban. Az oxidatív stressz és a daganatok kialakulása Az oxidatív stressz során keletkező oxigén-, és nitrogénközpontú szabad gyökök egyaránt fontos szerepet játszhatnak a daganatok kialakulásában (22, 23, 24). A reaktív oxigén és nitrogén vegyületek - mint a karcinogének általában - 1) képesek a DNS struktúrát véglegesen megváltoztatni, pl. bázispár mutációkat, átrendeződéseket, deléciókat, inzerciókat és szekvencia amplifikációkat létrehozva, 2) megváltoztathatják a sejtszintű jelátvitelt, 3) aktiválhatják a citoplazmatikus és a sejtmagban lévő szignál-transzdukciós utakat pl. a tirozin nitrálása a tirozin foszfatázok és kinázok működését gátolhatja (25), 4) és olyan stresszproteinek és gének aktivitását befolyásolhatják, melyek a növekedés, a differenciáció és a sejthalál szabályozásában résztvevő effektor génekhez tartoznak (26, 27, 28, 29). Az oxidatív stressz és a diabetes mellitus A cukorbetegség fő tünete a kórosan magas szérum glükóz koncentráció. A hiperglikémia oxidatív stresszt okoz a szövetekben és az oxidált anyagok koncentrációjának emelkedését eredményezi a szervezetben. A fehérjék nem-enzimatikus glikozilációjának - más szóval glikációjának - mértéke a glükóz koncentrációtól függ, és a jelenség a fehérjék strukturális és funkcionális megváltozásához vezet. A glükóz intracellularis elhelyezkedése a relatíve hosszú élettartamú vörösvértestekben, és az erytrocyta membrán átjárhatósága 6

a glükóz számára a hemoglobint a megelőző 6-8 hét glükóz értékeinek jó becslőjévé teszi. A hemoglobin fiziológiás glükóz koncentráció jelenlétében is glikálódik, de jóval nagyobb mértékben hiperglikémiás egyénekben. A plazmában található fehérjék, így az albumin is, glikálódnak, de ez egy rövidebb időszak glükóz fluktuációját tükrözi. A glikációt a glükóz autooxidációja fokozza, és reaktív oxigén intermedierek termelődése kíséri, így antioxidáns anyagokkal befolyásolható lehet. Az érfal strukturális proteinjeinek glikációját olyan reakciók követik, melyek a fehérjék visszafordíthatatlan megváltozásához vezetnek. Ezeket a nem-enzimatikus glikozilációs folyamatokat feltehetően a fehérjék oxidatív modifikációja kíséri. Ezt a folyamatot glikoxidációnak is szokták nevezni (30). Glikoxidált anyagok az öregedés alatt normálisan keletkeznek, de cukorbetegségben a folyamat felgyorsul, mely egyik oka lehet az erek felgyorsult öregedésének. A cukorbetegség - biokémiai szempontból - a felgyorsult kollagén öregedést is jelentheti. A glikoxidáció károsíthatja a sejtek DNS-ét, így szerepet játszhat a diabeteses szövődmények és a béta-sejt destrukció kialakulásában. A cukorbetegség nem megfelelő kontrollja hiperglikémiát okoz, ami az antioxidáns enzimek glikoxidációjához vezet, molekuláris biológiai szintű változásokat okoz, és kimeríti az antioxidáns kapacitást. Tehát a diabeteses szövődmények kialakulásában egy másik fontos tényező az antioxidáns rendszer gyengülése lehet. A kóros szénhidrát-anyagcsere elősegíti a diabetes késői szövődményeinek kialakulását, melyek a cukorbetegség mindkét típusában feltehetőleg azonos patogenetikai alapokon nyugszanak (9). A glükózmolekula és a társuló egyéb rizikó faktorok (dohányzás, hypertonia) szabad gyökök indukálására képesek. Toxikus szerepük azonban csak akkor valószínűsíthető, ha az antioxidáns rendszer károsodása kimutatható. A cukorbetegséget a prooxidáns és antioxidáns tényezők közti egyensúly felbomlása kíséri, és ez az oxidativ stressz szerepet játszhat a cukorbetegség szövődményeinek kialakulásában (9, 30, 31). A metabolikus folyamatok megváltozása cukorbetegség során az enzimatikus antioxidáns védelmet is befolyásolja, és ezek a változások szintén kapcsolatban lehetnek a diabetes késői szövődményeivel. A cukorbetegséggel és az oxidatív stressz-szel kapcsolatos megfigyeléseket többnyire jelentős hiperglikémiával, és a relatív inzulinhiányt szükségszerűen kísérő valamennyi metabolikus változással rendelkező újonnan diagnosztizált vagy rosszul kontrollált cukorbetegek esetében tették. A cukorbetegséget a lipidperoxidok 7

felszaporodása (32), az LDL fokozott oxidációs képessége (33), az oxidált LDL elleni antitestek titerének emelkedése (34) kíséri, miközben az antioxidáns enzimek, mint a szuperoxid dizmutáz (35), a glutation peroxidáz aktivitása gyengülhet (36, 37). Az antioxidáns vitaminok hozzáférhetősége is csökkenhet (38). Cukorbetegségben az ateroszklerózis kialakulásának rizikója fokozott, patomechanizmusában szerepet játszik az oxidatív stressz (30, 31). A reaktív oxigén intermedierek hatásukat kifejthetik az LDL oxidálása, az endothel kárositása, a vazomotilitás, valamint a véralvadás befolyásolása révén. Az oxidált LDL-nek a foam sejtek kialakulásában tulajdonítanak szerepet, a szuperoxid anion/nitrogénoxid arány eltolódása az endothel függő vazomotilitás zavarát okozhatja, valamint a reaktiv oxigén intermedierek az érfalat közvetlenül károsíthatják. A szabadgyökös reakciók vizsgálatának lehetőségei A nitrogén- és oxigén-szabadgyökök rövid féléletideje (millisecundum), és a kémiai reakciók bonyolultsága miatt, e folyamatok és a betegségek összefüggésének vizsgálata még in vitro körülmények között is nehéz. Az in vivo folyamatoknál ezért többnyire e szabadgyökreakciók valamely többé-kevésbé specifikus végtermékének mérésére kell hagyatkoznunk. A nitrogén-oxid kis mennyiségben termelődő, nagyon reaktív vegyület, ezért in vivo termelődését nehéz mérni. A nitrogén-oxid szintáz jelenlétének vagy hiányának kimutatása immunfestéssel széles körben alkalmazott módszer a nitrogén-oxid termelődésének elemzésére, de human szövetmintára és különleges tárolásra van szükség. Éhező emberben, az endogén módon keletkezett NO és reakcióinak végterméke jól mérhető a plazma nitrát/nitrit szintjével (39). Korábbi méréseinkből ismert, hogy a fehérvérsejtek által termelt szuperoxid mennyisége fordítottan arányos a plazma ún. szuperoxid gyökfogó aktivitásával (40). A teljes szulfhidril csoportok mennyisége inverz összefüggést mutat a keletkező szuperoxid mennyiségével. A peroxinitrit, képződése helyén, gyorsan reakcióba lép az ott lévő aminosavakkal. A tirozin és a peroxinitrit reakciójából nitrotirozin keletkezik, mely specifikus, stabil, a többi aminosavtól eltérő abszorbciós spektrumú, és ezért jól mérhető molekula (41). 8

Célkitűzések Kutatásunk tárgya egyes gasztroenterológiai betegségeket (A), valamint a cukorbetegséget (B) jellemző prooxidáns-antioxidáns egyensúly tanulmányozása. Ezért klinikai vizsgálatainkban mértünk szabadgyökös paramétereket és az oxidatív stressz elleni védelemben szerepet játszó antioxidánsokat. (A) A prooxidáns oldal jellemzésére a nitrogén-központú szabad gyökök jelenlétét indirekt módon vizsgáltuk, mérve a nitrát/nitrit szinteket, valamint megkíséreltük a nitrotirozin, mint az in vivo peroxinitrit képződés bizonyítékának kimutatását. A védekező rendszer tagjai közül számos antioxidáns enzim és kis molekulasúlyú vegyület koncentrációját határoztuk meg. Elektronspin rezonanciával meghatároztuk a szuperoxid gyökfogó aktivitást és kemilumineszcenciás módszert alkalmaztunk az össz-scavenger kapacitás meghatározására. Különböző betegségekben mért értékeinket összevetettük az egészségesekével és az eltéresek betegség-specifikus voltát vizsgáltuk. (B) A cukorbetegség mindkét típusában és különböző súlyosságú anyagcsere-zavarban kerestük az antioxidáns rendszer egészségesektől eltérő jellegzetességeit. Egyaránt meghatároztuk az antioxidáns enzimek és a kis molekulasúlyú antioxidáns tulajdonságú vegyületek, valamint az A-, E-, C-vitamin koncentrációját a plazmában. A zsíroldékony vitaminok szintjét a lipidfrakciókban is megmértük. Új összefüggéseket is kerestünk a diabetes típusa, súlyossága, klinikai időtartama, kezelése és a mért paraméterek között. Megvizsgáltuk az aszkorbinsav kezelés hatását a szénhidrát-anyagcsere zavarának mértékét jelző HbA1c szintekre. A következő kérdésekre kerestünk választ: (A) 1. a) Emelkedett-e a nitrogén-oxid szintézist tükröző plazma nitrát/nitrit szint peptikus fekélybetegségben? b) Betegség specifikus-e a plazma nitrát/nitrit szint változása vagy más felső gasztrointesztinalis betegségben is észlelhető? c) Összefügg-e a nitrát/nitrit szint változása a Helicobacter pylori (H. pylori) infekcióval? d) Van-e hatása a H. pylori eradikációnak a plazma nitrát/nitrit szintekre (absztrakt: 7, 12). 9

2. a) Emelkedett-e a szöveti nitrogén és oxigén központú szabadgyökök szintje H. pylori pozitív peptikus fekélybetegségben? b) A fekély helyére specifikus, lokalizált-e ez a változás? c) Változtate a H. pylori eradikációja a mért értékeken? és d) Keletkezik-e peroxinitrit a fekélyszövetben (absztrakt: 20)? 3. A plazma nitrát/nitrit szintek meghatározása colorectalis carcinomában szenvedő betegekben (XII) 4. A plazma nitrát/nitrit koncentráció, a szuperoxid gyökfogó aktivitás és a teljes szulfhidril szint összehasonlítása colorectalis carcinomás betegekben, colitis ulcerosás betegekben és egészséges önkéntesekben (VIII, XIII, absztrakt: 15, 18). 5. Következő célunk annak megválaszolása volt, vajon változnak-e a szöveti oxigén szabadgyök-scavengerek és a nitrát/nitrit szint vastagbél adenocarcinomában (absztrakt: 21, 22). 6. Kerestük a nitrotirozint, mint az in vivo peroxinitrit képződés bizonyítékát, betegekből műtét során eltávolított daganatos szövetekben és colitis ulcerosában szenvedő betegekből származó colon biopsiás mintákban. Választ kerestünk arra a kérdésre is, amennyiben keletkezik nitrotirozin in vivo, vajon korrelál-e emelkedett szuperoxid és nitrogén-oxid termelődéssel colorectalis carcinomás betegekben? (VIII, XIII, absztrakt: 15, 17). 7. A szisztémás természetes antioxidáns védelem eltéréseit vizsgálatuk colorectalis carcinomában szenvedő betegekben, és kerestük, hogy a rendszer mely része tükrözi legjobban a betegség súlyosságát (absztrakt: 4, 8). (B) 1.1. Azzal a céllal, hogy az intenzifikált inzulinnal kezelt, jól kontrollált (HbA1c=6,06±0,48%, átlag±se) 1. típusú cukorbetegség antioxidáns státuszra gyakorolt hatását tanulmányozzuk, összehasonlítottuk 1. típusú cukorbetegekben és egészséges önkéntesekben a három fő antioxidáns enzim (szuperoxid dizmutáz, glutation peroxidáz, kataláz) aktivitását, a kis molekulasúlyú antioxidáns anyagok szintjét és a teljes antioxidáns státuszt a plazmában (IV, absztrakt: 11). 10

1.2. Következő vizsgálatunk célja is az antioxidáns védelem eltéréseinek tanulmányozása volt intenzifikált inzulin kezelésben részesülő 1. típusú cukorbetegekben. Ezúttal azt vizsgáltuk, hogy megfelelő glikémiás kontrollal rendelkező (HbA1c=7,89±2,53%, átlag±sd) 1. típusú cukorbetegekben találunk-e eltérést az antioxidáns enzimaktivitásokban vagy a plazma kis molekulasúlyú antioxidánsainak koncentrációjában (absztrakt: 24, 35). 2. A cukorbetegség klinikai fennállási idejének hatását vizsgáltuk az antioxidáns védelem különböző összetevőire, mint a vörösvértest szuperoxid dizmutáz és kataláz, a teljes vér glutation peroxidáz és a plazma teljes antioxidáns státusza, jól kontrollált cukorbetegek csoportjában (V, absztrakt: 10). 3. Az intravazális antioxidáns védelem eltéréseit vizsgáltuk inzulinnal kezelt - 1. és 2. típusú - cukorbetegekben (absztrakt: 3). 4. A plazma redukált C vitamin és glutation szintjét határoztuk meg elfogadható anyagcsere - egyensúlyú 2. típusú cukorbetegekben (absztrakt: 2). 5. 2. típusú diabetes mellitusban szenvedő betegekben és kontroll egyénekben vizsgáltuk a természetes antioxidáns rendszer tagjai közül a plazmában található zsírban és vízben oldódó antioxidáns vitaminokat és a jelentős koncentrációjú kis molekulasúlyú antioxidáns anyagokat, valamint kapcsolatukat a szérum lipid szintekkel és egymással (VII, absztrakt: 13, 19). 6. A plazma és a lipoprotein frakciók (LDL+VLDL, HDL) E és A vitamin koncentrációját tanulmányoztuk hiperlipémiában és intenzifikált inzulin kezelésben részesülő, 1. típusú cukorbetegekben (absztrakt: 23, 25, 26, 36, 37). 7. A hosszú távú, nagy dózisú aszkorbinsav pótlás hatását értékeltük a szénhidrát-anyagcserére, a hemoglobin glikációjának vizsgálatával (IX, absztrakt 1). 11

Irodalmi háttér 1. Szabad gyökök és antioxidánsok Szabad gyöknek nevezünk bármely atomot vagy molekulát, amely egy vagy több párosítatlan elektront tartalmaz. Ez a párosítatlan elektron megváltoztatja az atom vagy molekula kémiai reaktivitását. A szervezetben lévő molekulák túlnyomó többsége nem gyök, éppen ezért a képződő szabad gyökök nagy valószinűséggel nem gyök molekulákkal reagálnak. A reakció eredménye egy láncreakció, mely során újabb gyökök keletkeznek. Antioxidáns bármely anyag, amelynek jelenléte - az oxidálható szubsztráthoz képest kis koncentrációban - késlelteti vagy meggátolja a szubsztrát oxidációját. A szervezet védelmét a szabad gyökök káros hatásai ellen számos antioxidáns enzim és vegyület biztosítja: a gyökök közvetlen hatástalanításával, a láncreakciók megszakításával vagy a már károsodott molekulák javításával (8). Az intracelluláris antioxidáns védelmet elsősorban enzimek szolgáltatják - kataláz, szuperoxid dizmutáz, glutation peroxidáz -, mig az extracelluláris térben különböző kis molekulasúlyú vegyületek - húgysav, aszkorbinsav, bilirubin stb. - biztosítják a prooxidáns és antioxidáns tényezők közötti egyensúlyt. Oxidatív stresszről ennek az egyensúlynak a felborulásakor beszélünk. A reaktív szabadgyökök károsító hatását számos betegségben megfigyelték (42), azt azonban, hogy egy betegségben oki szerepet játszanak-e, illetve részt vesznek-e a betegség kialakulási folyamatában, óvatosan kell értékelnünk (11). 2. Az antioxidáns védelem Az aerob anyagcsere során keletkező reaktív oxidánsok elleni védelem több szinten szerveződik. Az antioxidáns rendszer az antioxidáns hatású vegyületek és enzimek megfelelő szintjének és lokalizációjának biztosítása révén védekezik a kóros szabadgyökös hatások ellen. E rendszer károsodása több betegségben is igazoltan szerepet játszik magának a betegségnek és/vagy következményeinek kialakításában. 12

2.1. Az antioxidáns enzimek Az antioxidáns védelmet a sejten belül főként enzimek biztosítják, melyek a keletkező reaktív oxigén termékek lebomlását katalizálják. A három fő antioxidáns enzim - a szuperoxid dizmutáz (SOD), glutation peroxidáz (Gpx), kataláz (CAT) - szerkezetileg, kofaktor igényükben és lokalizációjukban is eltérőek. Működésük során reaktív oxigén intermediereket használnak fel szubsztrátként, a következő egyenletek szerint: SOD O 2 -. + O 2 -. + 2H + ---> H 2 O 2 + O 2 Gpx ROH + 2GSH ---> ROH + H 2 O + GSSG CAT 2H 2 O 2 ---> O 2 + H 2 O GSH és GSSG: redukált és oxidált glutation Szuperoxid dizmutáz: a szuperoxid aniont alakítja hidrogénperoxiddá és oxigénné. A SOD aktivitást McCord és Fridovich 1969-ben fedezte fel, később bebizonyították, hogy az enzim szükséges az élet aerob körülmények között való fenntartásához (43). Több fajtája is ismeretes, és mindegyikben legalább egy átmeneti fém található a katalítikus centrumban. Emberben a mangán tartalmú mitokondriális MnSOD, valamint a rezet és cinket tartalmazó intra- és extracellulárisan található CuZnSOD-ok ismertek. Glutation peroxidáz: szelén függő enzim (szelenoprotein). A plazmában található formája egy glikoprotein; a citoszólban, illetve a mitokondriumban található enzim ettől eltérő antigénstruktúrával rendelkezik. Működéséhez redukált glutationra van szüksége, így közvetetten függ a flavoprotein glutation reduktáz, azáltal pedig a rendelkezésre álló redukált NAD(P)H mennyiségétől is. Az enzim katalítikus centrumában egy szelenocisztein található, mely a transzláció során épül a polipeptid láncba, a szelénhiány in vitro és in vivo is enzimdefektushoz vezet. A Gpx specifikus H donort, glutationt használ nem specifikus szubsztrátok (H 2 O 2, lipid és nemlipid hidroperoxidok) redukálásához. Az enzimaktivitáson túl szükséges lehet a rendelkezésre álló GSH és szelén mennyiségét is vizsgálni. Kataláz: ubikviter enzim, eukaryotákban a peroxiszómák tartalmazzák. Feltehetőleg a peroxiszómális oxidázok által termelt 13

hidrogén-peroxidot bontja vízzé és oxigénné, katalítikus centrumában hemet tartalmaz. Közvetett módon ezeken kívül számos más enzim is részt vesz az oxidatív károsodás megakadályozásában vagy helyreállításában (pl. glutation reduktáz, NADPH termelés enzimei, DNS repair enzimei). A különböző sejttípusok és a sejtek kompartmentjei eltérő mennyiségben tartalmaznak antioxidáns enzimeket. 2.2. A nem-enzimatikus antioxidáns védelem 2.2.1. Antioxidáns vegyületek Az enzimatikus antioxidáns védelem mellett, mely elsősorban intracelluláris védelmet biztosít, számos nem-enzim molekula is részt vesz a szervezet különböző komponenseinek az oxidációtól való megvédésében. A plazmában található molekulák közül gyökfogó tulajdonságai és magas koncentrációja miatt jelentős antioxidánsok az albumin, a húgysav és a bilirubin. Bár ezen vegyületeknek nem elsődleges funkciójuk a szabadgyökök semlegesítése, a plazma teljes antioxidáns kapacitását vizsgáló módszerek szerint annak 50-80%-át e vegyületek adják (15). Húgysav: Már több mint 100 éve ismert mint a purin anyagcsere végterméke a főemlősökben, szabadgyök-fogó képessége és ezáltal feltételezhető antioxidáns szerepe azonban csak a közelmúltban vált ismertté. A húgysav döntően a májban képződik a xantinoxidáz által katalizált reakció során, kimutatták azonban az enzim aktivitását szív- és vázizomzatban, a vesében és a lépben is. Plazmakoncentrációját befolyásolja a vesén keresztüli kiválasztás és az étrend is. Bilirubin: A bilirubin az ún. scavengelő (lánctörő) antioxidánsok közé tartozik. Az albuminhoz kötődött zsírsavakat védheti a peroxidációtól. Albumin: Az albumin szabad SH csoportjai és réz kötése miatt preventív antioxidáns (44). Magas koncentrációja és nagy a turnovere ellenére az oxidatív stressz hatások kiküszöbölésében játszott biológiai szerepe feltehetően csekély. Mivel a vas és réz ionok elősegítik a szabadgyökös károsodások kialakulását, az őket szállító és raktározó fehérjék fontos antioxidáns szerepet töltenek be: a ferritin intracellulárisan, a 14

transzferrin extracellulárisan köti a vasat, a cöruloplazmin a réz kötésével gátolja meg annak szabadgyökös reakciókban való részvételét. A hemopexin és haptoglobin a hem és hemfehérjék gyök katalizáló képességét gátolják. 2.2.2. Antioxidáns tulajdonságú vitaminok További - lényegesen kisebb koncentrációban jelenlévő - antioxidáns vegyületek a lipidoldékony E- és A-vitamin, valamint a vízoldékony C vitamin. Bár az említett antioxidáns kapacitásnak csak kisebb hányadát teszik ki, részvételük a membránok antioxidáns védelmében jobban ismert. Az antioxidáns vitaminok struktúrája és funkciója különböző. A zsírban oldódó vitaminok, az E- és A-vitamin plazmakoncentrációja vegyes táplálkozás mellett egészséges egyénekben szűk határok között mozog, míg a vízben oldódó C-vitamin koncentrációja nagymértékben függ az aktuális beviteltől. E*vitamin: Az E-vitamin összefoglaló elnevezése különböző vegyületeknek (45). A természetben nyolc izomert találtak, mely E- vitamin aktivitással rendelkezik. Négynek a tokoferol szerkezet a jellemzője, melyhez szaturált oldallánc csatlakozik, négynek a tokotrienol szerkezet, melyhez 3-3 kettőskötést tartalmazó oldallánc kapcsolódik. Emberben a legjelentősebb biológiai aktivitású az RRRalfa-tokoferol. Az alfa-tokoferol lipidperoxil gyökökkel reagálva egy viszonylag stabil lipid hidroperoxid gyököt hoz létre, miközben nem reaktív tokoferil gyökké oxidálódik, és ezzel megszakítja a gyökreakciókat. Az E-vitamin jelen van a lipidekben, legjelentősebben a sejtmembrán lipidjeiben és a keringő lipoproteinekben. A zsírszövet legfontosabb antioxidánsának tartják, elsődleges védelemet biztosít a lipidperoxidációval szemben. Jelentős szerepe van a szabadgyökök semlegesítésében a láncreakciók megszakításával és az oxidatív károsodás limitálásával. Az E-vitamin különleges fontossága a sejtmembránok károsítása elleni védelemben játszott kulcsszerepében rejlik. Segít megelőzni a DNS károsodásokat is, melyek mutációkhoz vezetnek, és védi a low-density lipoproteineket (LDL) és más lipidgazdag alkotórészeket az oxidációval szemben (46, 47). Az LDL molekula belsejében a foszfolipideket védi (48). Antioxidáns funkcióját azáltal tudja fenntartani, hogy az E-vitamin gyököt a vízoldékony aszkorbinsav, a C-vitamin regenerálja oxidált formájából a biológiai membránokban. Az E-vitamin hiány a vörösvérsejtek alakváltoztatási 15

képességét és élettartamát csökkenti, ugyanakkor fokozza az oxidálódás lehetőségét és a vörösvérsejtek adhezív képességét (49). A-vitamin: A karotinok hosszú izoprenoid molekulák, melyek konjugált kettőskötéseket tartalmazó láncrészből és telítetlen, szubsztituált ciklohexángyűrűkből épülnek fel. Az antioxidáns hatást a kiterjedt kettőskötés rendszer adja. Több mint 500-féle fordul elő a természetben, főként, mint növényi pigmentek, de csupán néhány található az emberi vérben és szövetekben értékelhető mennyiségben (alfa-karotin, béta-karotin, lutein, zeaxanthin, cryptoxanthin), a legjelentősebb a béta-karotin. Bizonyos karotinok az A-vitamin prekurzorai és a szervezetben A-vitaminná képesek alakulni. A β- karotinnak van a legmagasabb A-vitamin aktivitása. Egy béta-karotin molekulából két A-vitamin molekula keletkezik. A karotinok hatásos szinglett oxigén befogók. Lánctörő antioxidánsként is működnek, és a szabadgyök-támadás által okozott oxidatív károsodást limitálják. A karotinok a lipoproteinek belső magjában a koleszterin-észtereket védik. A béta-karotin a lipidperoxidáció kivédésében a tokoferollal szinergizmusban működik (50, 51). Fontos megemlíteni, hogy e vegyületek esetében az antioxidáns hatás csak másodlagos (52). A bétakarotin és más A-provitamin karotinok csak akkor alakulnak A- vitaminná, ha szükséges. A karotinok iránti igény és felhasználásuk különböző lehet az egyén oxidatív statuszától függően. C-vitamin: A legfontosabb epizód a C-vitamin történetében 1928- ban történt, mikor Szent-Györgyi Albert redukáló ágenst izolált tiszta formában a mellékvesékből, majd 1931-ben a paprikából (53). Az aszkorbinsav hat szénatomos ketonolakton, strukturálisan hasonlít a glükózhoz és más hexózokhoz. Az emberből, a majmokból, és a tengerimalacból hiányzik az a májenzim, mely az L-gulonolakton -> L- aszkorbinsavvá alakulásához szükséges. Ebből következik, hogy táplálékkal bevitt C-vitamint igényelnek a skorbut megelőzéséhez. Az aszkorbinsav reverzibilisen dehidroaszkobinsavvá oxidálódik a szervezetben. Mindkét formája aktív. Az aszkorbinsav a vékonybél felső szakaszán szívódik fel. A plazmakoncentráció a beviteltől függően változik. Megfelelő bevitel 28µM (0.5 mg/dl). Gyakran a vitamin fehérvérsejtekben mért koncentrációját használják a szöveti szint reprezentálásához. Egészséges felnőtt fehérvérsejtjeinek aszkorbinsav koncentrációja 27µg/10 8 sejt. A napi aszkorbinsav szükséglet 60 mg egészséges felnőtt férfi és nő számára, függetlenül az életkortól (54), de néhány újabb 16

vizsgálat azt sugallja, hogy a jelenlegi 60 mg-os ajánlott napi bevitelt (RDA) 200 mg-ra kellene növelni, mely gyümölcsökkel és zöldségekkel fedezhető. A C vitamin biztonságos dózisa kevesebb, mint napi 1000 mg, és 400 mg-os napi adagoknak nincs bizonyított értéke (55). Az aszkorbinsav oxidációs-redukciós folyamatokban és hidrogénion szállításban vesz részt. Erős redukáló anyag, antioxidáns, különösen a lipid és vitamin anyagcserében, fontos szerepe van a tetrahidrofolát oxidáció elleni védelemben. Ugyancsak nélkülözhetetlen számos sejtfunkcióhoz. Az aszkorbinsav fokozza a nem-hem vas felszívódását a vékonybélben. C vitamin szükséges a kollagén anyagcserében, a kollagén bioszintézis zavarai felelősek a skorbut tüneteiért. Az aszkorbinsav részt vesz a karnitin bioszintézisben, a tirozin metabolizmusban, a sebgyógyulásban, immunfunkciókban és tagja a gyógyszer metabolizáló enzimrendszereknek. A C-vitamin első vonalbéli antioxidáns a plazmában (56, 57, 58). Legfontosabb feladata a plazmalipidek védelme a peroxidativ károsodás ellen, melyet peroxilgyökök okoznak. A C-vitamin vizes oldatokban a szuperoxid anion, a peroxilgyökök valamint a szinglett oxigén scavengere. Scavengeli a hipoklór savat és szubsztrátja a mieloperoxidáz enzimnek. Szintén scavengeli a nitroxid és hidroxil gyököket. Megakadályozhatja nitrózaminok keletkezését, melyek nitrózáló anyagokból és aminokból alakulnak ki. Szinergisztikus kapcsolatban van az E-vitaminnal: regenerálja az alfa-tokoferolt az alfa-tokoferil gyökből. Oxidatív stressz hatására mennyisége csökken - dehidroaszkorbinsavvá redukálódik. Ebből a formájából intracellulárisan a glutation regenerálja. Egészséges szövetekben a dehidroaszkorbinsav általában azonnal visszaalakul aszkorbinsavvá. A magas aszkorbinsav / dehidroaszkorbinsav arány fenntartása az adott szövetben az egészséges állapot jelzője lehet (59). 3. A nitrogén-oxid A Science folyóirat felmérése alapján, a nitrogén-oxid (NO) az 1992-es év molekulája volt (60). Ez a kis, instabil, potenciálisan mérgező, a sejtmembránon szabadon diffundáló gáz a sejtben L- argininből az NO szintáz hatására képződik. Az NO eltérő élettani és kórélettani hatásai magyarázhatók képződésének és lebomlásának sokféleségével. Az NO szintáznak például emlősökben legalább három 17

izoenzime (neuronális, endotheliális és indukálható) ismert. Maga az NO eltérő hatást fejt ki savas, neutrális és lúgos közegben, kis koncentrációban termelődve sejtvédő, míg magas koncentráció esetén toxikus hatású. Mind a fokozott, mind a csökkent NO képződésnek lehetnek káros hatásai. Mint neurotranszmitter, az NO fontos lehet az ingerképzésben és a tanulásban. Az endothelsejtekben állandóan termelődő NO erős értágító, a stimulált fagocyta sejtekből felszabadulva fontos szerepet játszik a mikroorganizmusok elpusztításában. Kóros esetben az NO-nak szerep juthat a krónikus gyulladás, az immunfolyamatok és a daganatképződés mechanizmusában. Jelen ismereteink szerint az NO terápiásan felhasználható a pulmonális hipertenzió, az agyi keringészavar, a simaizom záróizmok relaxációjának elmaradásával járó betegségek kezelésében, az NO szintézis gátlása pedig segíthet a szeptikus sokk, a hipotónia, illetve a gyulladásos folyamatok esetén. Régóta ismert, hogy a cigarettafüst és a szerves, ill. petróleum alapú anyagok lebontása során keletkező égéstermékek (autókipufogógáz, ipari füst) nagy koncentrációban tartalmaznak nitrogénoxidokat (1. táblázat). Még egy évtizeddel ezelőtt is a nitrogénoxidot csupán egy kicsiny, egyszerű, instabil mérgező molekulának tartották, mely szerepet játszhat pl. a savas esők pusztító hatásában és az ózonréteg károsításában. 1. táblázat A nitrogén oxidált termékei szimbólum név megjegyzés NO nitrogén-oxid szabad gyök NO + nitrozónium kation nitrolizáló szer, enzimműködést szabályozó NO - nitroxil anion N 2 O-dá alakul NO 2 nitrogén-dioxid szabad gyök, erős nitráló szer N 2 O nitrogén-oxidul altatószer N 2 O 3 dinitrogén-trioxid erős nitráló szer N 2 O 4 dinitrogén-tetraoxid NO 2 dimér, erős nitráló szer - NO 2 - NO 3 nitrit savi ph-n NO képződik belőle nitrát stabil anion 18

Az azóta eltelt időszakban az NO-ról alkotott kép gyökeresen megváltozott (61). 1981 óta tudjuk, hogy az emberben is endogén úton keletkeznek nitrátok (62), s az 1987-ben tett felfedezés, mely szerint az endothelsejtek L-argininből NO-t szintetizálnak, s ez azonos a korábban ismert relaxációs faktorral (EDRF), új fejezetet nyitott az NO történetében (63). Azóta kutatások sora bizonyította, hogy az NO fontos neurotranszmitter (64), résztvesz az értónus szabályozásában, a szervezet védekező folyamataiban, s szerepe van a tanulásban (65, 66). 3.1. A nitrogén-oxid biokémiája Az NO instabil, potenciálisan mérgező, gázállapotú szabad gyök, mely szabadon diffundál a sejtmembránokon keresztül (67). Féléletideje 3-5 másodperc, labilitása annak köszönhető, hogy oxigén jelenlétében gyorsan nitráttá és nitritté alakul (68). 2NO + O 2 ---> 2NO 2 2NO 2 ---> N 2 O 4 H 2 O > NO 2 - + NO 3 - NO 2 + N 2 O 4 H 2 O > NO + 2NO 3 - NO + NO 2 ---> N 2 O 3 H 2 O > 2NO 2 - A vegyületek midegyike erős nitrolizáló (X-NO), ill. nitráló (X-NO 2 ), s aminosavakkal való reakciójuk során potenciálisan karcinogén nitrózaminok képződnek; R 2 -NH + X-NO ---> R 2 N-N=O Vizes oldatban az NO és a szuperoxid (O - 2 ) a diffúziós konstans sebességével reagál egymással és peroxinitrit (ONOO - ) keletkezik. A peroxinitrit fiziológiás ph-n igen instabil, gyorsan hidroxilgyökre (OH ) és nitrogén-dioxidra (NO 2 ) bomlik le. A peroxinitrit erős oxidáló ágens, s direkt szövetkárosító hatású. O 2 - + NO ---> ONOO - ONOOH ---> NO 2 + OH 19

Az NO reaktivitása és tulajdonsága redox állapotától függ (69, 70) (1. táblázat). Az nitrogén-oxid (NO ) könnyen képez komplexeket hem metalloproteinekkel, mint pl. a hemoglobin, és reagálni tud az elektrontranszport lánc enzimeivel is. A nitrozónium kation (NO + ) nukleofil vegyületekkel reagál, mint pl. az elektron gazdag bázisok és aromás vegyületek. A metallonitrozil vegyületek fiziológiás válaszokat (pl. vazodilatáció) közvetítenek vagy kóros válaszokat indukálnak (például karcinogenezis). A nitroxil anion (NO - ) élettani szerepe nem ismert (70). 3.2. Az nitrogén-oxid bioszintézise Az NO az L-arginin guanidin csoportjának terminális nitrogénjéből keletkezik (71, 72). A reakciót a nitrogén-oxid szintáz (NOS) katalizálja, melynek eddig három izoenzimjét azonosították (73, 74) (2. táblázat). 20

2. táblázat A nitrogén-oxid szintáz (NOS) izoenzimei közötti különbség (75) Állandó NO szintáz Indukálható NO szintáz Eredet endothelsejtek egyes neuronok mastocyták thrombocyták mellékvesevelő makrofágok májsejtek daganatsejtek endothelsejtek mezangiális sejtek vese macula densa Ca ++ -calmodulin függő független NO termelés átmeneti (percek) kis mennyiség (pikomol) késleltetett (órák) nagy mennyiség (nanomol) Aktivátorok excitatorikus aminosavak acetilkolin ATP,ADP lipopoliszaharidok néhány interleukin tumor nekrózis faktor thrombin bradikinin, histamin leukotriének Gátlószerek nem ismert glükokortikoidok Emberben az izoenzim I (idegsejtekben és epithelsejtekben), II (makrofágokban) és III (endothelsejtekben) három különböző gén által kódolt a 12-es, 17-es és 7-es kromoszómán (76). A három izoenzim aminosav-szekvenciája kevesebb, mint 59%-os egyezést mutat. Mindegyik izoforma L-arginint és molekuláris oxigént használ szubsztrátként és NADPH-t, tetrahidrobiopterint, FAD-ot és FAM-ot igényel kofaktorként. Mindegyik köt calmodulint és tartalmaz hemet (77). Az I izoform állandóan jelen van a központi és perifériás idegsejtekben és bizonyos epithelsejtekben. Aktivitását Ca ++ és calmodulin szabályozza. Funkciója a szinaptikus transzmisszió hosszú távú regulálása a központi idegrendszerben, a vérnyomás központi szabályozása, simaizom relaxáció és vazodilatáció a perifériás idegeken keresztül. Az NO szintáz II izoform expresszióját lipopoliszacharidok és citokinek indukálják számos sejtben. Jelenleg egyfajta indukálható izoenzim szekvencia ismert. Az NO szintáz II független a Ca ++ koncentrációtól és nagy 21

mennyiségű NO-t termel, melynek citosztatikus hatása van a parazita célsejtekre azzal, hogy gátolja vas tartalmú enzimjeiket és DNS fragmentációt okoz. Az indukált NO szintáznak szerepe van az autoimmun betegeségek és a szeptikus shock patofiziológiájában. Az izoform III főleg az endothelsejtekben található. Expressziója állandó, de fokozható például az érben fellépő nyíróerővel. Aktivitását Ca ++ és calmodulin szabályozza. Az endothel sejtekből felszabaduló NO tartja az ereket dilatált állapotban, gátolja a thrombocyta és fehérvérsejt adhéziót, valamint feltételezhetően a vaszkuláris simaizomsejt proliferációt (78). Működését tekintve a három izoenzim alapjában két csoportra osztható, az állandóan kis mennyiségű NO-t termelő és az indukálható (nagy mennyiségben NO-t termelő) izoenzimekre (75) (2. táblázat). 3.3. A nitrogén-oxid molekuláris hatásai - A guanilát cikláz aktiválása A vaszkuláris endothelsejtekben keletkező NO gyorsan a simaizomsejtek membránjába diffundál és a szolubilis guanilát cikláz hem alegységéhez kötődik. Ez a c-gmp szint emelkedéséhez vezet, miközben az intercelluláris kálcium koncentráció csökken az ér simaizomszövetben. A NO a Na + -K + pumpát is aktiválja, ami az ér simaizomsejt membrán átmeneti hiperpolarizációjához vezet. Az NO citotoxikus hatásai különböző mechanizmusokkal magyarázhatóak. A makrofágok tumorsejtekre kifejtett toxicitása NO felszabadulással függ össze, mely gátolja a tumorsejt mitokondriális enzimeit, pl. a cisz-akonitázt és a NADH-szukcinát oxidoreduktázt. Az Fe-S proteineket tartalmazó mikrobiális enzimekkel való interakció is felelős az antimikróbás hatásért. A nukleinsavak nitrolizálása, mely a DNS láncok törését okozza, citotoxicitást okoz. Szövetkárosodást a peroxinitrit anion is okozhat. 3.4. A nitrogén-oxid fiziológiás és toxikus hatásai Az NO fiziológiás és toxikus hatásait a 3. táblázat foglalja össze. 22

3. táblázat. Az NO fiziológiás és toxikus hatásai Fiziológiás hatás Toxikus hatás Felszabadulás gyors, átmeneti (pikomol) lassú, késleltetett (nanomol) Kiváltás ingere emelkedett ciklikus GMP szint massziv ciklikus GMP emelkedés NO tartalmú szerek (tionitrátok) (RS-NO) nitrozil-vas komplexek Biológiai hatás vazodilatáció thrombocyta adhézió és aggregáció gátlás neurotranszmisszió GMP: guanozin monofoszfát (Fe(NO) 2 (RS) 2 lassú vazodilatáció enzimekkel való interakció (pl. mitokondriális enzimek, légzési lánc bénítása) citotoxicitás megváltozott immunválasz 3.5. A citosztatikus és citotoxikus nitrogén-oxid Az aktivált makrofágok NO-t szintetizálnak, melyből spontán nitrit és nitrát keletkezik (79, 80). Ez a folyamat, mely L-arginin függő és bizonyos L-arginin analógokkal gátolható, felelős ezeknek a sejteknek a tumorsejt és baktérium ellenes aktivitásáért. Az NO okozta citotoxicitás biokémiai alapja az NO reakciója a respiratorikus folyamat és a DNS szintézis vastartalmú kulcsenzimeivel (81, 82). Indirekt bizonyítékok állnak rendelkezésre NO képződésére L- argininből human makrofágokban, alveoláris makrofágokban és perifériás vérben lévő monocytákban (83). NO termelés folyik a human neutrophil sejtekben is. Az NO szuperoxiddal történő reakciója során toxikus peroxinitrit képződik (ONOO - ). Ez a sejtmembránon szabadon diffundálva citotoxikus szerepet játszhat a programozott sejthalálban is. 23