Problémák és megoldások a bioinformatikában Válogatott fejezetek a bioinformatikából Gyimesi Gergely, 2008. február 25.
Mik a fontos, megoldatlan biológiai problémák? Milyen módszereket, megoldási lehetıségeket ad a bioinformatika ezekre? Mik ezeknek a korlátai?
Molekula Mik a felismerési kódok Racionális fehérje-{dns,rns,fehérje} inhibitortervezés kölcsönhatások esetén Pontos ab initio fehérjeszerkezet jóslás Sejt Mikor és hol fog transzkripció történni? Splicing mintázatok jóslása Jelátviteli hálózatok modellje: hogyan reagál egy sejt a külsı stimulusra? Evolúció Új fehérjefunkciók kialakulásának mechanisztikus megértése A speciáció molekuláris részleteinek mechanisztikus megértése Hatékony gén ontológiák továbbfejlesztése gének és fehérjék funkciójának szisztematikus leírására
Szekvenciaillesztés többszörös illesztés Fragmens összeállítás (fragment assembly) Fragmensek fizikai vetítése (physical mapping) Filogenetikus fák építése Genomátrendezıdések modellje Genomösszehasonlítás Génpredikció génkeresés Fehérjeszerkezet predikció Microarray kísérletek kiértékelése Fehérjeklasszifikáció (osztályozás) Vizualizációs programok, felületek
Páronkénti szekvenciaillesztés (pairwise sequence alignment) Mik az egymásnak (funkcionálisan vagy szerkezetileg) megfelelı egységek? Mekkora az evolúciós távolság közöttük? Dotplot a legegyszerőbb vizuális illesztés M ij 1, = δa i, b = j 0, a i a i = b j b rövid, egzakt illeszkedések könnyen felfedezhetıek j...gcctaggcatgcgatgcgt......cgggagccgtgtagttgacggcctg......catggggcatgcgagtgac......cctaggccgtgtagttgacgtgcgt... ismétlıdı elemek megtalálása közös domének megtalálása hosszú szekvenciák (> 1000 bp) összehasonlításánál hatékony
Páronkénti szekvenciaillesztés (pairwise sequence alignment) Optimális illesztés keresése hézagok (gap) beszúrásával Biológiai események: beszúrás gap, indel törlıdés szubsztitúció (csere) két szekvenciának sokféle lehetséges illesztése van, de az optimálisat keressük pontozás: a, b, M a, b S = i M a b i i : (aminosav/nukleotid) szubsztitúciós mátrix Egzakt megoldások dinamikus programozással: K-LYE CN---E-SK -Y---EC-NQC-G-K KLYECNESK YE-CNQCGK KLYECNE-SK --YECNQRGK Lokális illesztés: csak a legjobban illeszkedı részszekvenciák felhasználása Smith & Waterman, 1981. Globális illesztés: az összes karakter felhasználása Needleman & Wunsch, 1970. futási idı: Ο( nm)
Páronkénti szekvenciaillesztés (pairwise sequence alignment) Szubsztitúciós mátrixok PAM (Point Accepted Mutation, Percent Accepted Mutation) Margaret Dayhoff, 1970-es évek kézzel összerendezett közeli rokon szekvenciák alapján statisztika log-odds: 1 PAM evolúciós egység: 1 csere / 100 aminosav hatványozással PAM30, PAM70, PAM250 mátrixok BLOSUM (Block Substitution Matrix) Henikoff and Henikoff, 1992 távoli homológokat is felhasználtak nagyobb adatkészlet BLOSUM62 legfeljebb 62%-ban azonos szekvenciák alapján
Páronkénti szekvenciaillesztés (pairwise sequence alignment) Szubsztitúciós mátrixok PAM250 BLOSUM62
Páronkénti szekvenciaillesztés (pairwise sequence alignment) Homológia: hasonlóság, ami közös ıstıl való származásból ered szekvenciák esetén gyakran közelítik a magas százalékos egyezéssel (pl. >50%) Homológ szekvenciák keresése: gyors, heurisztikus módszerek FASTA egzakt (BLAST) vagy majdnem-egzakt (FASTA) gap nélküli rövid illeszkedéseket keres ezeket kiterjeszti lokálisan mindkét irányba, gapekkel az eredmények szignifikanciáját becsli pa = pg = pt = pc = 0.25 keresı szekvencia (Q) hossza: L hosszú egzakt egyezés esélye: ez elıfordulhat Q-ban m LQ L 1 D-ben n L L 1 D adatbázis (D) hossza: L 2L p = 0.25 = 2 = + különbözı helyen (effective length of query), = + különbözı helyen (effective length of database). véletlenszerő egyezés esélye (E-value): E = mn = mne λ 2 2 L R L D L Q
Többszörös szekvenciaillesztés (multiple sequence alignment, MSA) KLYECNE-SK --YECNQRGK KLYECNQRGK KVYECNEKG- n Dinamikus programozás alkalmazható: Ο( l ) kevés számú szekvencia (~5-10) esetén használható nagy adatkészletekre (~10, ~100 db) nem túl praktikus Heurisztikus módszerek Progresszív illesztés (progressive alignment) hierarchikus vagy fa-módszer (tree method) illesztések sorozatát végezzük el egy irányító fa mentén (guiding tree) elıször a két (evolúciósan) legközelebbi szekvenciát illesztjük utána ehhez az illesztéshez illesztjük a következı legközelebbit automatikusan egy filogenetikus fát is létrehoznak
Többszörös szekvenciaillesztés (multiple sequence alignment, MSA) ClustalW 1. páronkénti távolságok megállapítása (teljes dinamikus programozás vagy valamilyen gyors heurisztika) 2. klaszterezés (pl. neighbor-joining) 3. progresszív illesztés Korlátok: erıs függés a kezdeti rokonságkereséstıl és a kezdeti illesztés minıségétıl romlik a teljesítmény, ha távoli klaszterek mind távoliak súlyozással csökkenteni lehet a kezdeti illesztés hatását
Többszörös szekvenciaillesztés (multiple sequence alignment, MSA) T-Coffee más információt (pl. szerkezeti illesztésbıl származót) is fel tud használni PSAlign részlegesen progresszív (semi-progressive) módszer, nem használ heurisztikát és polinomiális idejő T : fa i, j : szekvenciák P i,j : illesztés Megadható olyan többszörös illesztés, amely mindegyik Pi,j páronkénti illesztést megtartja i T adott szekvenciákból készítsünk egy teljes gráfot, élhosszak az evolúciós távolság keressük meg a minimális feszítıfát P i, j j
Többszörös szekvenciaillesztés (multiple sequence alignment, MSA) Iteratív módszerek Progresszív módszerek legnagyobb hiányossága: egyszer összeillesztett szekvenciák már úgy maradnak PRRN/PRRP CHAOS/DIALIGN MUSCLE Rejtett Markov modellek (HMM) POA, SAM Genetikus algoritmusok, szimulált hıkezelés SAGA, MSASA
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Cél: létrehozni egy olyan fát, amely leginkább jellemzi az adott gének, fajok, stb. leszármazását. gyökértelen gyökeres ultrametrikus
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Távolság alapú módszerek (distance based methods) távolságmátrixot hoznak létre a szekvenciákból (gyakran egy többszörös illesztés alapján) egzakt megoldás csak akkor van, ha a távolságmátrix additív: létrehoznak egy fát, ami a leginkább illeszkedik a távolság adatokhoz UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) módszer a legegyszerőbb faépítési módszer, mindig a legközelebbi szomszédot összevonjuk új távolságok: d A, C + d B, C Neighbor-joining (NJ) módszer d AB, C = feltételezi, hogy az evolúció sebessége minden ágon egyforma volt (molekuláris óra hipotézis) az új klaszter távolságát másképp számolja megenged különbözı evolúciós sebességeket (ez a reális) Gyors, polinomiális idejő módszerek (ClustalW, PHYLIP) 2 D Pi, j ij = e P i, j w( e) az út i-bıl j-be
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Fitch-Margoliash módszer egy adott fatopológiához az élhosszakat legkisebb négyzetek értelemben illeszti a távolságmátrixhoz a fa-térben való keresés miatt NP-nehéz Távolság alapú módszerek: gyorsak, hatékonyak nagy mennyiségő adat esetén is általában reális fákat adnak bármilyen távolság adat felhasználható (pl. DNS-DNS hibridizációs kísérletek) node density effect: a fa rosszul mintavételezett részein (kevés faj) inkább alulbecsültek lesznek a távolságok a távolságok nem függetlenek, ezért a hibák az egész fát érintik
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Karakter alapú módszerek karakter = diszkrét állapotokat felvevı tulajdonság Maximum parszimónia módszerek (maximum parsimony) olyan fát keres, amivel a legkevesebb mutációval leírható a filogenetika Kis parszimónia probléma (small parsimony problem) adott fának mennyi a parszimónia-pontszáma? (minimális változások) polinomiális idıben megoldható Nagy parszimónia probléma (large parsimony problem) melyik fatopológia az optimális? NP-nehéz
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) alkalmazott módszerek: branch and bound egzakt megoldás teljes enumerációhoz hasonló, de a keresıfa bizonyos részeit levágja
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) heurisztikus módszerek nearest neighbor interchange (NNI) A e C A D B D C B egy él négy al-fára osztja a fát, ezeket cserélgetjük A D C B
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Subtree pruning and regrafting (SPR)
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Tree bisection-reconnection (TBR)
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Problémák a parszimónia módszerekkel Long branch attraction: gyorsan evolválódó fajok egymáshoz közelinek lesznek jósolva A C emiatt nem statisztikusan konzisztens B D Parametrikus statisztikus modellek explicit szubsztitúciós modellt használnak az egyes ágakon más-más lehet az evolúció sebessége többszörös mutációkat is figyelembe tudja venni az egyes fákhoz valószínőségi értékeket rendelnek
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Szubsztitúciós modellek sztochasztikus Markov folyamatok Átmeneti mátrixok (transition matrix) tranzíció (nagy nagy) transzverzió (nagy kicsi, kicsi nagy) Ráta mátrixok (rate matrix) egyensúlyi eloszlás: P( t + dt) = P( t) + QP( t) dt Q t P( t + t) = e P( t) reverzibilitás:
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Szubsztitúciós modellek JC69 (Jukes, Cantor, 1969) K80 (Kimura, 1980) tranzíció/transzverzió megkülönböztetve F81 (Felsenstein, 1981) HKY85 (Hasegawa, Kishino, Yano, 1985) Fehérjékre: PAM, BLOSUM mátrixok alapján
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Maximum likelihood módszer poszterior valószínőség P( D T ) P( T ) P( T D) = P( D) prior valószínőség az egyes pozíciók függetlenek: n ( i) ( ) ( ) P D T = P D T i= 1 az egyes ágakon az evolúció független = P D T P A C C C G x y z w T ( i) ( ) (,,,,,,,, ) x y z w P( A, C, C, C, G, x, y, z, w T ) = P( x) P( y x, t ) P( A y, t ) P( C y, t ) 6 1 2 P( z x, t ) P( C z, t ) 8 3 ( i) P( D T ) = P( x) P( y x, t6) P( A y, t1) P( C y, t2) x y P( z x, t8 ) P( C z, t3) P( w z, t7) P( C w, t4) P( G w, t5) z w P( w z, t ) P( C w, t ) P( G w, t ) 7 4 5
Filogenetikus fák (phylogenetic trees) Maximum likelihood módszer számításigényes távolabbi szekvenciák vizsgálatára is alkalmas a kapott fa szignifikanciáját nehéz megbecsülni Maximum a posteriori probability (MAP) módszerek az egyes fáknak prior valószínőséget adnak (pl. speciáció elágazás valószínősége) sztochasztikus módszerrel keresnek a fa-térben, pl: Markov chain Monte Carlo (MCMC) legvalószínőbb fák egy sokaságát adják
Fehérjeszerkezet predikció Homológia modellezés (homology modeling, comparative modeling) megfigyelés: a fehérjék harmadlagos szerkezete konzerváltabb, mint az aminosav szekvencia magas szekvenciaazonosság homológia szerkezeti hasonlóság a szerkezetépítéshez templátokat használ (hasonló fehérjéket) lépések: templát választás (általában 1 db) szekvenciaillesztés modellépítés modell értékelés fontos egy jó minıségő illesztés régiók, amelyekrıl a templát nem tartalmaz információt loopok
Fehérjeszerkezet predikció Homológia modellezés (homology modeling, comparative modeling) Modellépítési módszerek Fragmens összeállítás (fragment assembly) közeli fehérjékben egy mag (core) régió szerkezete erısen konzervált, elıször ezt építik fel a változó régiókat különbözı szerkezetekbıl veszik Szegmens illesztés (segment matching) a kérdéses szekvenciát felosztja szegmensekre, amelyekhez külön-külön keres templátot Távolságkényszerek alkalmazása a templát alapján geometriai kritériumokat állít fel, és ezeket próbálja kielégíteni
Fehérjeszerkezet predikció Homológia modellezés (homology modeling, comparative modeling) MODELLER az ötlet NMR spektroszkópiás szerkezetmeghatározási módszerekbıl ered kényszereket hoz létre: távolságokra és gerinc torziós szögekre az illesztés (templát) alapján kötéshossz, kötésszög preferenciákat a CHARMM-22 force field alapján oldalláncok torziós szögeire statisztikus preferenciákat (rotamer könyvtárak) nemkötı atomok távolságeloszlására a kényszereket valószínőség-sőrőségfüggvényekké alakítja konjugált gradiensek optimalizáció, szimulált hıkezelés elıször a gerinc felépítése, majd rögzített gerinc mellett az oldalláncok optimalizációja (itt nagyobb a hiba lehetısége)
Fehérjeszerkezet predikció Homológia modellezés Modell értékelés gyors módszerek, pl. WHAT_CHECK Ramachandran-térkép ellenırzése oldalláncok torziós szögei, rotamer állapotok hidrogénkötések optimalizálása, pl. Asn/Gln fejcsoportjának 180 elfordítása gerinc
Fehérjeszerkezet predikció Homológia modellezés Modell értékelés statisztikus potenciálokkal DOPE (Discrete Optimized Protein Energy) ismert szerkezetek alapján atomtípus-párok távolságeloszlása ennek alapján megbecsülhetı, hogy egy új szerkezet mennyire valószínő fizikai potenciálként is értelmezhetı: (potential of mean force, Boltzmann-statisztika) léteznek aminosav felbontású modellek (aminosav kontaktusok alapján) hatékonyabbak, mint a fizikai energiát számoló módszerek aminosavankénti pontszámok esetén azonosíthatók a gyenge minıségú régiók
Fehérjeszerkezet predikció Homológia modellezés Modell értékelés fizikai energia számolásával valamilyen molekulamechanikai force-field (pl. OPLS, CHARMM) alapján legfontosabb kölcsönhatások: van der Waals elektrosztatikus oldószer figyelembevétele (implicit szolvatációs modell) entropikus járulékok figyelembe vétele számításigényes!
Fehérjeszerkezet predikció Homológia modellek pontossága erısen függ a templát kiválasztásától és a szekvencia illesztés minıségétıl 50% azonosság felett: gerinc RMSD ~1 Å körüli közepes minıségő NMR szerkezeteknek felel meg hibák lehetnek az oldalláncok pakolásában, kisebb gerinc torzulások, nagyobb hibák lehetnek a loop régiókban 30-50% azonosság: jelentısebb hibák is elıfordulhatnak, fıleg a loop régiókban a gerinc 90%-a ~1.5 Å körüli 30% alatt ( twilight zone ) alapvetı hibák lehetnek, pl. rossz fold jelentısen megnövekszik az illesztési hibák száma nem túl jól használható olyan esetben, amikor pontos atomi felbontású szerkezetre van szükség (pl. racionális gyógyszertervezés, fehérje-fehérje kölcsönhatások jóslása) kvalitatív következtetések levonhatók, pl. egyes aminosavak szerkezeti szerepe, konzerváltságának oka, stb.
Fehérjeszerkezet predikció Paracelsus challenge (1994) alakítsunk át egy fehérjét teljesen más foldra, legalább 50% szekvenciaazonosság megtartásával megoldás 1997: Janus fehérje a szekvenciaazonosság nem feltétlenül jelent szerkezeti hasonlóságot
Fehérjeszerkezet predikció Protein threading a kérdéses szekvenciát ismert fehérjeszerkezetekre ráfőzzük (thread) becslést teszünk az illeszkedés jóságára elmélet: a természetben legfeljebb kb. 2000 különbözı szerkezeti család (fold) létezik, ebbıl kb. 1100 azonosított strukturális illesztés fold recognition Ab initio fehérjeszerkezet jóslás folding probléma nem használ fel elızetes szerkezeti információt a pontozófüggvénynek nem feltétlenül kell fizikai jelentést hordoznia http://en.wikipedia.org/wiki/protein_structure_prediction_software