SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI ÉS INFORMATIKAI KAR XII. VMTDK Élő természettudományok szekció Ionizáló sugárzás hatásának in vitro dinamikus elemzése Nokta-Mán Imola Hajnal MSc I. évfolyam Témavezető: Dr. Puskás László AVIDIN Kft. ügyvezető igazgatója MTA doktora, MTA Szegedi Biológiai Központ tudományos tanácsadója Belső konzulens: Dr. Hackler László Jr. AVIDIN Kft. tudományos főmunkatársa 1
Tartalomjegyzék Tartalmi összefoglaló... 3 Irodalmi háttér... 4 Anyagok és módszerek... 6 Sejtvonalak és tenyésztési feltételek... 6 Besugárzás... 6 Colony forming assay... 6 MTT/MTS assay... 6 Laktát dehidrogenáz assay (LDH)... 7 Sejtnövekedés és proliferáció vizsgálata xcelligence rendszerrel... 7 Statisztikai analízis... 7 Eredmények... 8 Colony forming assay... 8 MTT assay... 9 Az RTCA, MTS és LDH tesztek értékelése 4 féle sejtszám használatában... 9 GBM2 humán glioblasztóma sejtvonal... 9 A549 humán tüdő adenokarcinóma... 11 Következtetés... 13 Felhasznált irodalom... 14 2
Tartalmi összefoglaló A dolgozat ismertet egy hatékony valós idejű vizsgálati eljárást, amivel az ionizáló sugárzás sejtkultúrákra kifejtett hatását lehet vizsgálni. A sugárkezelés lokális, lokoregionális modalitás, melynek során irányított energiaátadás történik. Eddig kevés információ állt rendelkezésre, ami időben jellemezi a sejtek szaporodását és túlélését ionizáló sugárzást követően. Az xcelligence készülék egy olyan impedancia alapú technológia, amely időben folyamatos információt ad a sejtek letapadásáról, szaporodásáról és túléléséről. Célunk volt optimalizálni és validálni egy olyan módszert, amellyel valós időben követhető a sejtek sugárzásra adott válasza. Cobalt-ágyúval különböző tumoros sejtvonalakat (GBM2, A549) sugaraztunk be 0-5- 10 Gy dózisokkal, majd ezt követően a sejteket végpontmérésen alapuló technikákkal: kolónia-, MTT-, MTS- és LDH-assay, illetve az xcelligence rendszerrel is megvizsgáltuk. Az impedancia vizsgálat alapján mindkét sejtvonalon mérhető volt a sugárhatás. Az xcelligence rendszer alkalmasabbnak bizonyult dózisfüggő változások detektálására, mint az MTT és LDH assay-k, és jól korreláltak a kolónia assay eredményeivel. Az xcelligence készülék egy megbízható és gyors diagnosztikai eljárásnak bizonyult a sugárzás sejtekre való hatásának követésében, továbbá értékes adatokat adhat a sugárzásra adott válasz mechanizmusáról, az időfüggő sejtproliferációról és túlélésről. 3
Irodalmi háttér A sugárkezelés lokális, lokoregionális modalitás, melynek során irányított energiaátadás történik. A részecskék energiája az élő anyagban ionizáció révén fejti ki hatását. A részecske lehet β vagy elektronsugár, mely negatív töltésű részecske, γ vagy foton sugárzás, mely hullám és részecske természetű, töltéssel nem rendelkező. Az ionizáló sugárzás elnyelődése az anyagban függ a sugárzás minőségétől (részecske típusa), energiájától (mértékegysége az elektronvolt: ev) és az elnyelő anyagtól (annak atomi összetételétől). A sugárzás mennyiségi jellemzője a dózis, azaz az egységnyi tömegben elnyelt energia, mértékegysége Joule/kg=Gy (Gray). A sejtekre, szövetekre, az élő szervezetre gyakorolt hatás az ionizációt követő kémiai folyamatok következménye. A sugárhatás okozta kémiai reakciók védekező folyamatokat indukálnak, iniciálódik az inflammációs kaszkád, működésbe lépnek a repair mechanizmusok. Mindezen folyamatok eredőjeként sejtszinten vagy átmeneti, kijavítható zavar jön létre, vagy a sejt szaporodásképtelenné válik, illetve bekövetkezhet a sejt pusztulása (1-2). Olyan új in vitro modellekre van szükség, amelyek tükrözik az in vivo kondíciókat és megbízhatóan bevihetőek a klinikumba. Eddig kevés információnk van a sejtek citotoxicitással, illetve ionizáló sugárzással összefüggő időbeni túléléséről és szaporodásáról. Az újfajta valós-idejű sejt vizsgáló lehetővé teszi a sejttúlélés folyamatos megfigyelését a kezelést követően egy adott perióduson keresztül (3). A kolónia, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) és LDH (laktát dehidrogenáz) esszék jól ismert végpont mérésen alapuló tesztek, melyekkel értékelhető a sugárérzékenység és kombinált sugár és kemoterápiás vizsgálatok (4). A kolónia esszé általában a besugarazott sejtek proliferáló képességéről ad információt. Ha a sejtek képesek szaporodni, akkor kolóniákat képeznek. Több napig vagy akár két hétig is eltarthat, amíg láthatóvá válnak a kolóniák. A kvantifikálásuk festés után történik (5). Az MTT esszé jól ismert a humán tumor sejtvonalak kemoszenzitivitását vagy gyógyszer toxicitását vizsgáló tanulmányokból (6), és nemrég kezdték használni a besugárzást követő sejttúlélés megállapításában is. Ez a módszer azon alapszik, hogy az élő sejtek képesek az oldható sárga tetrazólium sót lila formazán kristályokká redukálni. A kristályok elméletileg a mitokondriális dehidrogenáz enzim által keletkeznek, feloldhatóak és az így keletkezett 4
oldat abszorbanciája által mérhetővé válnak. Az abszorbancia értéke összefügg az élő sejtek számával (7-8-9). Egy másik általános viabilitás esszé az MTS esszé. Ez a módszer hasonló elven működik mint az MTT esszé : itt is a mitokondriumban található dehidrogenáz enzimek lebontják az MTS-t egy sötét bordó, víz oldékony formazán eleggyé, amit mikroplate olvasóval kvantifikálni tudunk. Annyiban különbözik, hogy az MTS reagenshez (tetrazólium só) hozzáadunk egy elektronkötő reagenst is (phenazine methoszulfát, PMS). További módszer a citotoxikus hatások kimutatására, a membrán integritás megbecsülése az átjárhatósága alapján. A laktát dehidrogenáz felszabadítását a sejt lízissel megfelelően LDH esszével mérik. A valós idejű mikroelekromos érzékelést arra használják, hogy megállapítsák számos gyógyszer citoprotektív hatását valós időben (10), hogy tanulmányo zzák különböző ágensek toxikus hatását agyi endothél és epitéliális sejtekben (11) és, hogy dinamikusan monitorozhassák a biológiai barrier modellek sértetlenségét (12-13). Az xcelligence egy olyan rendszer, amely lehetővé teszi a sejtek valós idejű megfigyelését, ezt értjük a letapadás, morfológiai változások, proliferáció, túlélés és citotoxicitás változásokra, információt adva a sejt fiziológiás állapotáról. A rendszer négy összetevőből áll: az RTCA (Real Time Cell Analyzer) rendszer, RTCA SP/DP stáció, számítógép szoftverrel és az E-plate 96 és/vagy 16. Az E-plate alja arany elektródás tömbökből álló gyöngyfűzérszerű hálózattal van lefedve. A letapadt sejtek állapotáról az elektródák által mért impedancia ad információt (14-15). Minél több sejt található, nő az elektródon, annál nagyobb a mért impedancia. Ez sejtindexként jelenik meg a szoftverben és kvantitavív információt szolgál a sejtek számáról, túléléséről és morfológiájáról. Ebben a tanulmányban a 16-os E-plate-t használtuk, amely egyszerre 3 független plete-t tud mérni egyidőben. Ezúton két sugárdózist tudtunk figyelni a harmadik, nem besugarazott kontrollal együtt. Azt vizsgáltuk, hogy az xcelligence alkalmas-e megbízhatóan mérni a tumor sejtek ionizáló sugárzásra adott válaszait. 5
Anyagok és módszerek Sejtvonalak és tenyésztési feltételek GBM2 (humán glioblasztóma) és A549 (humán tüdő adenokarcinóma) sejtvonalakat vizsgáltunk. A sejteket a szokásos módon neveltük DMEM F12 (Dulbecco s modified Eagle s medium) tápoldatban 10% FBS-el (feta l bovine serum), 1% L-glutaminnal és 1% antibiotikum-antimikotikummal kiegészítve a tápoldatot, 37 C-on párás környezetben 5% CO 2 és 95% levegő mellett. Besugárzás Teragam K-01 Cobalt ágyút használtunk a sejtek besugárzásához, amiket előzőleg különböző platekbe szélesztettünk szét: 16-os E-plate, 96 lyukú és 6 lyukú normál sejttenyésztő plate. A plateket minden oldalról vízzel ekvivalens anyaggal vettük körül és két, egyenként 2 cm vastag plexi lemez közé helyeztük őket. Az isocentrum a platek geometriai középpontjában volt. A megfelelő dózisokat felezve adtuk le, egyik felét fentről ( gantry szög 0), a másik felét alulról (gantry szög 180 fok), hogy maximalizáljuk a mező homogenitását. A mezőméret mindkét esetben 20x20 cm-es négyzetnek felelt meg. A Cobalt bomlásának következtében fellépő aktivitás csökkenést folyamatosan korrigáltuk. Colony forming assay A kísérletekhez a sejteket 75 cm 2 -es flaskában tenyésztettük. Mikor elérték a 75%-os konfluenciát, tripszinezés után begyűjtöttük, Buerker kamrával leszámoltuk őket és egy megfelelő sejtszámot (1000 sejt/well) kiszélesztettünk 6 lyukú platekbe háromszoros ismétlésekkel. A besugárzás után minden második nap tápoldatot cseréltünk 8 napon keresztül. A 8-ik napon a platekről eltávolítottuk a médiumot, majd átmostuk a felszínt PBSel. Ezután fixáltuk a sejteket 4%-os paraformaldehiddel, majd megfestettük a kolóniákat 0.5%-os kristály ibolya oldattal 20 percig. Háromszoros normál vízzel való átmosás után hagytuk a plateket megszáradni és csak másnap számoltuk le a kolóniákat. MTT/MTS assay Mindkét sejtvonal túlélési görbéjét MTT és MTS esszével is meghatároztuk. A sejteket 96 lyukú platekbe szélesztettük szét különböző sejtszámokkal : 2000-8000 sejt/well. A besugárzás csak másnap történt meg. 72 órával a besugárzás után 20 µl MTT reagenst 6
adtunk a sejtekhez, majd 3 órás inkubációs idő elteltével eltávolítottuk a médiumot és a platek alján megmaradt kristályokat izopropanollal feloldottuk. Az optikai denzitásokat egy ELISA readerrel olvastuk le 540 nm hullámhosszon. Az MTS esszét az xcelligence kísérlet lejártával végeztük el 96 lyukú plateken: 20 µl MTS reagenst adtunk mindegyik wellhez, majd egy órás inkubáció után az optikai denzitásokat 490 nm hullámhosszon olvastuk le. A kísérleteket legalább háromszor megismételtük. Laktát dehidrogenáz assay (LDH) Ez az esszé a laktát dehidrogenáz aktivitást méri a felülúszóból, vagy a teljes LDH aktivitást sejt lízis után. Az előbbi korrelál az elpusztult sejtek számával, míg az utóbbi arányos az élő sejtek számával. A sejtek négy féle sejtszámban voltak kiszélesztve: 500-1000- 2000 és 4000 sejt/well. 72 órával a besugárzás után 70 µl felülúszót kivettünk és ugyanolyan elrendezésben egy üres plate-be pipettáztuk. A maradék médiumot eltávolítottuk a sejtekről. PBS-el átmostuk őket, majd hozzáadtunk 70 µl PBS-Triton X 100 szolúciót, hogy elérjük a teljes sejt lízist. 15 perc szobahőn történő inkubáció után hozzáadtunk 70 µl LDH reagenst mind a lizált sejtekhez, mind pedig a felülúszóhoz és 490 nm hullámhosszon 20 percig mértük 2 perces intervallumonként. Sejtnövekedés és proliferáció vizsgálata xcelligence rendszerrel A sejteket 100 mm-es Petri csészékben tenyésztettük, és mikor elérték a 90%-os konfluenciát, tripszinezés után begyűjtöttük és egy megfelelő sejtszámokat (500-1000-2000-4000 sejt/well) kiszélesztettük 100 µl médiumban a 16-os E-platekbe. A rendszer ezután 10 percenként mérte a proliferációját, letapadását és megnyúlását a sejteknek. Körülbelül 24 órával a leültetés után, amikor a sejtek a növekedés log fázisában voltak, 5 és 10 Gy dózissal történő besugárzásnak tettük ki őket, majd ezután az impedancia mérése folytatódott még 76 órán keresztül. A szoftver lehetővé teszi a következő paraméterek hozzáférését: átlag érték, maximum és minimum értékek, szórás, effektív maximális 50%-os hatékonyság ( EC50), 50%-os gátló hatás (IC50), sejtindex (CI). Statisztikai analízis A csoportok közötti különbségeket páros t-próbával határoztuk meg, a hibákat a StatView 4.53 szoftver szerint javítottuk. Szignifikánsnak mondtuk a különbségeket, mikor 7
p<0.05 (***p<0.001). Az adatokat átlagként tűntettük fel ± standard hiba, kivéve ahol másként van jelezve. Eredmények Mindkét sejtvonalon vizsgáltuk az ionizáló sugárzás hatását és minden esetben összehasonlítottuk a végpont-mérésen alapuló illetve valós idejű tesztek eredményeit. Colony forming assay A kolónia esszé referenciaként szolgált, hogy megállapíthassuk a sugárzás sejtnövekedésre kifejtett hatását. Szoros összefüggést találtunk a leadott dózisok és a kolóniaképzés között: szignifikáns különbséget találtunk (p<0.001) a kontroll csoportok és az 5 és 10 Gy dózisú sugárzásnak kitett csoportok között ( 1. ábra). A GBM2 sejtek proliferációja összehasonlítva az A549 sejtvonallal jóval lassúbbnak bizonyult: számottevően kevesebb kolóniát számoltunk az adott kísérleti időben. Mindenesetre a besugarazott sejtek növekedése jócskán különbözött a kontroll sejtekhez hasonlítva. 1. ábra Kolónia esszé A549 és GBM2 sejtvonalakra ionizáló sugárzást követően. Az esszét a fentiekben leírtak alapján végeztük el 1000 sejt/well optimalizált sejtszámmal. A besugárzáshoz 5 és 10 Gy dózisokat használtunk. Az ábrán az átlagértékeket tüntettük fel ± SEM. 8
MTT assay A túlélési adatokat a 2.-es ábra szemlélteti. Mindkét sejtvonal esetében szignifikáns különbségeket találtunk a kontroll csoportok és a besugarazott csoportok között. A különbségek dózisfüggőek voltak. Viszont a sugárzás hatása kevésbé fejeződött ki, mint a kolónia esszénél, ez a tény a az MTT assay rövidebb lefutási idejének köszönhető (3 nap ellentétben a 7 napos periódussal). 2. ábra Az A549 és GBM2 sejtvonalak viabilitás tesztje 5 és 10 Gy sugárdózissal való kezelés után. Szélesztési sűrűség 2000-4000 sejt/well. A kapott eredmények átlagértékekként vannak ábrázolva ± SEM. Az RTCA, MTS és LDH tesztek értékelése 4 féle sejtszám használatában GBM2 humán glioblasztóma sejtvonal A besugárzás hatásai mind a négy sejtszámnál detektálható volt a label free technikának köszönhetően már 24 órával a besugárzást követően (3. ábra). A 4000 sejt/well sejt denzitásnál mind a kontroll, mind a besugarazott csoportoknál a sejtek túlnőttek a wellben, ez már 50 óra eltelte után látható volt. 12 órával a besugárzás után már hatást észleltünk a rendszer segítségével: az 5 Gy dózis esetében egy kis plató jelent meg, míg 16 és 22 órával a besugárzás után a 10 Gy dózis lokális maximumot és minimumot idézett elő. Ez a hullám mindegyik sejtszámnál megfigyelhető volt a besugarazott csoportoknál. Mikor a görbéket normalizáltuk (a sejt index értékeket a szoftver automatikusan 1-es értékre állítja) a legerőteljesebb hatás a két alacsony sejtszámnál (500 és 1000) volt megfigyelhető. Az 5 Gy 9
dózisnál egy szignifikáns emelkedést találtunk a proliferációban, míg a 10 Gy dózisnál láthatóan megállt a sejtnövekedés 60 órával a besugárzást követően. Összehasonlítva az xcelligence és a végpont esszék eredményeit, megjelenik, hogy az MTS és LDH teszteknél is egy dózisfüggő sejtszám növekedés lelhető fel az 500, 1000 és 2000 sejt/well sejtszámoknál 72 órával a besugárzás után, alacsonyabb szignifikáns arányban mint ami az xcelligence-nél mérhető volt. Mindhárom mérésnél a kezelés hatása csökkent a szélesztett sejtszámok növelésével. 10
3. ábra A, B, C, D: Az adhézió és proliferáció dinamikus vizsgálata xcelligence rendszerrel. Az Y tengely a normalizált sejt indexet mutatja. E: MTS assay 72 órával a besugarazás után. F: LDH assay 72 órával a besugarazás után. G: Sejt index értékek százalékos átkonvertálása 72 órára a besugárzást követően. A 0 Gy welleket tekintettük 100%-nak. A549 humán tüdő adenokarcinóma A besugárzás hatásai mind a négy sejtszámnál detektálható volt (4. ábra). A 2000 és 4000 sejt/well sejtszámok túlnövést eredményeztek a három napos időkeretben. Ellenben az 500 és 1000 sejt/well sejtszámok megfelelőnek bizonyultak reprodukálható görbékkel. 11
Dózisfüggő értelemben a proliferációs ráta drámaian csökkent a besugárzást követően. Hasonlóan a GBM2 sejtvonalhoz itt is a kezelés hatása csökkent a sejtszánok növelésével. A legkiemelkedőbb változások szintén az xcelligence-nél jelentek meg. 4. ábra A, B, C, D: Az adhézió és proliferáció dinamikus vizsgálata xcelligence rendszerrel. Az Y tengely a normalizált sejt indexet mutatja. E: MTS assay 72 órával a besugarazás után. F: LDH assay 72 órával a besugarazás után. G: Sejt index értékek százalékos átkonvertálása 72 órára a besugárzást követően. A 0 Gy welleket tekintettük 100%-nak. 12
Következtetés A sugárzás okozta sejttúlélést általában kolónia esszével mérik és ez valószínűleg a legmegbízhatóbb eljárás. A hátránya viszont az idő, ami szükség a kolóniáknak, hogy felnőjenek és azon sejtek túlélésének megállapítása, amelyek nem képeznek kolóniát. Az MTT és MTS esszék mennyiségileg meg tudják állapítani az élős ejtek számát az alapján, hogy redukálják az MTT/MTS reagenst vagy sem. Tanulmányunkban alkalmaztunk egy további eljárást, amivel validálni tudjuk a besugárzás után életben maradt sejteket. Az alacsony sejtszámnál használt LDH teszt nem gondoskodott használható eredményekről. Ezzel ellentétben a teljes LDH teszt teljességében jól korrelált az MTT és MTS eredményekkel. A végpont-mérésen alapuló technikákkal szemben, az xcelligence előnye a sejtválasz dinamikus megfigyelésének lehetősége. Általában a sejtszám optimalizálását már a kísérlet előtt megállapítják. A mi esetünkben a sejtszámok direkt hatását az impedancia mérésekkel detektáltuk. A használt sejtek száma nagyban befolyásolta az alkalmazhatóságot és a legtöbb sejtvonalnál az impedancia alapú vizsgálatok eredményeit. A vizsgált sejtszámok közül legalább egy minden esetben megfelelőnek bizonyult. Magasabb sejtszámoknál az esszé hossza korlátozva volt vagy a médiumból hiányzó tápanyagok miatt vagy pedig a sejtek túlnövése miatt a wellben. Ezt a sejt index értékek platója jelezte. Az xcelligence rendszer egy jóval kifejezőbb hatást mutatott mint a végpont esszék, ami azt bizonyítja, hogy ez egy jóval érzékenyebb eljárás a válaszok detektálására mint az LDH vagy MTS esszé. Összességében a sugárzás után detektált végpont esszék eredményei korreláltak a sejtindex értékekkel. A végpont esszék a sejtek redukciós kapacitásán alapulnak, nem pedig a sejt adhézióban, formában, alakban bekövetkezett változásain. Összefoglalásként az xcelligence rendszer az ionizáló sugárzásra adott sejtválasznak, elfogadható módszere, amely valós idejű információt ad annak hatásairól. 13
Felhasznált irodalom 1 Bittoni A, Faloppi L, Giampieri R, Cascinu S. (2012) Selecting the best treatment for an individual patient. Recent Results Cancer Res. 196:307-18 2 Fietkau R. (2012) Concurrent radiochemotherapy for the treatment of solid tumors. Strahlenther Onkol. 188 Suppl 3:263-71 3 Smout MJ, Kotze AC, McCarthy JS, Loukas A. (2010) A novel high throughput assay for anthelmintic drug screening and resistance diagnosis by real-time monitoring of parasite motility. PLoS Negl Trop Dis. 16;4(11):e885. doi: 10.1371/journal.pntd.0000885 4 Mishra J, Mittra B, Mittra A. (2002) Effect of whole body gamma radiation on hepatic LDH activity, lactate, pyruvate concentration and rate of oxygen consumption in Bufo melanostictus. Indian J Exp Biol. 40(11):1310-3 5 Buch K, Peters T, Nawroth T, Sänger M, Schmidberger H, Langguth P (2012) Determination of cell survival after irradiation via clonogenic assay versus multiple MTT Assay A comparative study. Radiation Oncology, doi: 10.1186/1748-717X-7-1 6 Twice P, Mcmillan TJ (1990) Use of Tetrazolium Assay in Measuring the Response of Human Tumor Cells to Ionizing Radiation. Cancer Research 50:1392-1396 7 Caltová K, Červinka M (2012) Antiproliferative Effects Of Selected Chemoterapeutics In Human Ovarian Cancer. Acta medica 3 55(3):116-24 8 Atienza JM, Yu N, Kirstein SL, Xi B, Wang X, et al. (2006) Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol 4: 597 607. doi:10.1089/adt.2006.4.597 9 Brubel R, Boronkai A, Reglodi D, Racz B, Nemeth J, Kiss P, Lubics A, Toth G, Horvath G, Varga T, Szogyi D, Fonagy E, Farkas J, Barakonyi A, Bellyei Sz, Szereday L, Koppan M, Tamas A (2010) Changes in the Expression of Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide int he Human Placenta during Pregnancy and Its Effects on the Survival of JAR Choriocarcinoma Cells. Neuroscience 42:450-458 10 Ozsvári B, Puskás LG, Nagy LI, Kanizsai I, Gyuris M, Madácsi R, Fehér LZ, Gerö D, Szabó C (2010) A cell-microelectronic sensing technique for the screening of cytoprotective compounds. Int J Mol Med. 25(4):525-30 11 Kiss L, Walter FR, Bocsik A, Veszelka S, Ozsvári B, Puskás LG, Szabó-Révész P, Deli MA (2013) Kinetic analysis of the toxicity of pharmaceutical excipients Cremophor EL and RH40 on endothelial and epithelial cells. J Pharm Sci. 102(4):1173-81 12 Kürti L, Veszelka S, Bocsik A, Ozsvári B, Puskás LG, Kittel A, Szabó-Révész P, Deli MA (2013) Retinoic acid and hydrocortisone strengthen the barrier function of human RPMI 2650 cells, a model for nasal epithelial permeability. Cytotechnology. 65(3):395-406 13 Kürti L, Veszelka S, Bocsik A, Dung NT, Ozsvári B, Puskás LG, Kittel A, Szabó-Révész P, Deli MA (2012) The effect of sucrose esters on a culture model of the nasal barrier. Toxicol In Vitro. 26(3):445-54 14 Diemert S, Dolga AM, Tobaben S, Grohm J, Pfeifer S, Oexler E, Culmsee C (2012) Impedance measurement for real time detection of neuronal cell death. Journal Neurosciens Methods. 203(1):69-77 15 Erskine CL, Henle AM, Knutson KL (2012) Determining optimal cytotoxic activity of human Her2neu specific CD8 T cells by comparing the Cr51 release assay to the xcelligence system. J Vis Exp. (66):e3683 14