NANORENDSZEREK ÁLTALÁNOS TULAJDONSÁGAI ÉS ORVOSI ALKALMAZÁSAI

NANORENDSZEREK ÁLTALÁNOS TULAJDONSÁGAI ÉS ORVOSI ALKALMAZÁSAI (Bóta Attila, MTA TTK Molekuláris Farmakológiai Intézet, Biológiai Nanokémia Osztály) Berényi Szilvia, Deák Róbert, Holló Gábor, Kiss Teréz, Kremmer Tibor, Kristyán Sándor, Lőrincz András, Mihály Judith, Nagyné Naszályi Lívia, Németh Csaba, Pálmai Marcell, Söptei Balázs, Szigyártó Imola, Varga Zoltán, Wacha András TOX Konferencia, 2013. október 16 18. Velence, Magyar Toxikológusok Társasága

definíció Azok az anyagok, amelyek mérete legalább két dimenzióban az 1 és 100 nm közötti mérettartományba esik. a különbség óriási! Megkülönböztetjük a nanorészecskéket (körülhatárolt) a nanorendszereket (makroszkopikus, de van karakterisztikus méret az 1 és 100 nm közötti mérettartományban

példák Nanorészecskék Kettétört egyrétegű vezikula D= 80 nm Nanorendszerek Stöber szilika 2 µm 2 µm D= 12 μm tenzid víz rendszer 100 µm 100 µm 0,2 mm aktívszén Sokrétegű vezikula/liposzóma

nanorészecskék mint kolloid alakzatok Diszperziós kolloidok (termodinamikailag instabil, szol:szilárd/folyadék (paszta) Makromolekulák, polimerek vizes rendszerei Asszociatív kolloidok fizikai kémiai tulajdonságok interdiszciplináris terület Fizikaikémiai alaptulajdonságok: Részecskeméret és alak Felületi (elektromos) tulajdonságok Részecskerészecske kölcsönhatások Részecske közeg kölcsönhatások

az előállítás meghatározó szerepe (szol készítés) egyedi részecske aggregátum elektrosztatikus kölcsönhatás sztérikus kölcsönhatás védőbevonat létrehozása

nanorészecskék, amelyek az érdeklődés középpontjában állnak a: organikus nanorészecskék (liposzómák, dendrimerek és szén nanocsövek b: anorganikus nanorészecskék (kvantum dotok/pontok, mágneses nanorészecskék, arany nanorészecskék)

Munkacsoportunkban előállított nanorészecskék 1 nm 4 5 nm

az előállítás meghatározó szerepe (szol készítés) ULV és MLV felhasználása nanoreaktorként 200 500 nm a prekurzor tartalmú domének a nanoreaktorokban 2 µm FendlerJ.H. Chem. Rev. 87 (1987) pp. 877. Tricot, Y.M., FendlerJ.H. J.Phys. Chem. 90 (1986) pp. 3369. Korgel,B., Monbouquette H. Langmuir 16 (2000) pp. 3588. J. Phys. Chem, 111 (2007) 1911., J. Appl. Cryst, 40 (2007) 259. Res. Highlights, DESY/HASYLAB, 2007.

méret, alak Módszerek: TEM (FTTEM, CryoTEM) (direkt) fényszórás (DLS) (indirekt) neutron és röntgenszórás (indirekt) gázadszorpció (indirekt) Speciális esetek (spektroszkópia) (indirekt) TEM DLS

méret (speciális eset) Mezopórusos szilika ezüst NR (Szegedi Ágnes, MTATTK) Nanopórusok (mikro és mezopórusok) jellemző méretének meghatározása: Adszorpciós mérések (gáz (gőz) adszorpciós izoterma meghatározása és analízise mikropórusok mezopórusok makropórusok n, mol/g p/p 0

méret, méreteloszlás : neutron és röntgenszórás nagyszögű diffrakció kisszögű szórás 2θ < ~ 10 sugárforrás résrendszer minta nyalábfogó beeső, áthaladt sugárnyaláb

Szerkezetmeghatározás röntgen vagy neutron szórással/diffrakcióval d(nm) 2Θ ( ) 0,1 100,4 1,0 8,8 10,0 0,88 100,0 0,088 (1000,0 0,0088 10000,0 0,0008) nagyszögű diffrakció kisszögű szórás 2θ < ~ 10 sugárforrás résrendszer minta nyalábfogó beeső, áthaladt sugárnyaláb

Intensity [a.u.] I [a.e.] Egyrétegű, többrétegű vezikulák szórási képe sugárforrás minta x beeső sugár Tipikus mintadetektor távolság: 0.21 (SAXS) 20 m (SANS) detektor q Szórási változó: q 4 sin 25000 20000 Radial averaging 15000 10000 5000 0 Bragg törvény: n 2d sin( ) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 q [nm 1 ] 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 h [1/A] A röntgennyaláb az elektronokon, míg a neutronok a magokon szóródnak A q r e i qr d 3 * ( ) ( ) r I( q) A( q) A( q)

Intenzitás (1/cm) méret, méreteloszlás: röntgen szórás elmélet: számolt görbe gyakorlat: szilika részecskék 0,01 0,1 1,0 q (1/nm) 100 Mérési pontok Illesztés (SAXS) (TEM) SAXS: N(R)*R 3 TEM: N(R)*R 3 10 1 0,1 0,01 0,1 1 q [1/nm) 5 10 15 részecske sugár, R(nm)

Pórusos szilika röntgenszórása a részecskék egésze pórusok

méret (speciális esetek): röntgen szórás A nanorészecskék halmazának makroszkópikusan irányított (anizotrop) elrendeződése A nanorészecskék halmazának makroszkópikusan nem irányított (izotrop) elrendeződése

méret, méreteloszlás in situ meghatározása a mátrixban, anomális röntgenszórás pure DPPC/water system DPPC/water system with Cd(NO 3 ) 2 DPPC/water system with CdS nanoparticles

méret, méreteloszlás in situ meghatározása a mátrixban, anomális röntgenszórás, E 1, E 2, E 3 Anomális kisszögű szórásgörbék E1 E2 E 1 E 2 E 3 Különbség a szórásgörbék között Különbségek különbsége E3 Méreteloszlás TEM

Abszorbancia Arany nanorészecskék 0,4 600 0,3 idő 550 abs (nm) 0,2 500 0,1 0,0 350 400 450 500 550 600 650 (nm) 450 4,0 4,5 5,0 részecske particle sugár size (nm) nm

Abszorbancia fehérje/peptid stabilizált arany klaszterek nanorészecskékre jellemző: felületi töltéssűrűség hullámok kialakulása DE: a subnano klaszterekre nem jellemző! 0,9 0,6 nanorészecskék jellemző elnyelése 0,3 0,0 300 600 900 1200 hullámhossz (nm) 13 23 aranyatomból áll

felületi töltés, Zéta potenciál zeta potential [mv] stability behavior of the colloid from 0 to ±5, rapid coagulation or flocculation from ±10 to ±30 incipient instability from ±30 to ±40 moderate stability from ±40 to ±60 good stability more than ±61 excellent stability a részecskével mozgó réteg határa a zétapotenciál részecske felületétől számított távolság potenciál [mv]

a részecskével mozgó réteg határa a zétapotenciál részecske felületétől számított távolság potenciál [mv] Natív és aminopropilszilika nanorészecskék zéta potenciáljának phfüggése stabil stabil

a határréteg befolyása a felületi töltésre

Sók hatása Kozmotrop: kisméretű, nagy töltéssűrűségű ionok szulfát, foszfát, Mg 2, Li, Zn 2, Al 3 Kaotrop: nagyméretű, kis töltéssűrűségű ionok bromid, jodid, K, Cs pl: Al 2 (SO 4 ) 3 megakadályozza a fehérjék aggregációját Hofmeistereffektus

asszociatív kolloidok/nanorendszerek, nanorészecskék DPPC foszfolipid kettősréteg vezikula liposzóma biomembrán

Ionok elhelyezkedése a kétfázisú rendszerben laterális inhomogenitás

Lipidomika Klasszikus definíció: Lipidomika Membránalkotó lipidek PC, PE, SM, Chol Raktározó lipidek TG CE Szignál lipidek Metabolitok (Szabad zsírsavak, DG, MG...) Specifikus/marker lipidek Bis(monoacylglycero)phosphate (BMP), CL, PIPn Balogh Gábor, Péter Mária, Török Zsolt, Gombos Imre, Glatz Attila, Burcin Güngör, Tim Crul, Horváth Ibolya és Vígh László MTA SZBK

a lipidek sokfélesége Szerkezeti komplexitás Zsírsav Lipidfajta lipidek száma Zsírsavak 40 Foszfolipidek/osztály 1,600 Trigliceridek 64,000 Gangliozidok > 1,000,000 Gangliozid Polaritás Trigliceridek Glicerofoszfolipidek (PC, PE, PS, PI) Gangliozidok hexán Kloroform/metanol víz MTA SZBK

Atomi szintű közelítés Durvaszemcsés leírás

Ab initio számítások: Kvantumkémia: HartreeFock, Sűrűség funkcionál elmélet (DFT) Felhasználás: Atomi szintű modellek paramétereinek meghatározása Alapállapoti konformáció meghatározása, elektron ill. proton átmenet leírása Példa 1: PC fejcsoportok konformációja, kölcsönhatása egy vízmolekulával Példa 2: PE fejcsoport kölcsönhatása egy vízmolekulával (Ab initio MD)

Atomi szinten: ab initio, vagy molekuladinamikai számítások, durva szemcsés leírás, dinamika

a lipidek alakja, töltése

Fázisátalakulás: DSC FÁZISÁTALAKULÁSOK vizsgálata DSC módszerrel Leolvasható információk a DSC görbe csúcsa alapján: Mire következetünk ezekből az adatokból? Milyen kapcsolat van a termikus jellemzők és a stabilitás között? Endoterm irány A kettősréteg régiói Hol történik változás a fázisátalakulás során?

vendég molekulák hatására a fázisátalakulás jellege megváltozik első rendű > gyengén első rendű > folytonos (másodrendű) Fázis 2 G(T) (p=állandó) Fázis 1 Fázisátmeneti pont: T1 H(T) (p=állandó) ΔH H(T) (p=állandó) δh hőmérséklet hőmérséklet hőmérséklet

előátmenet fő átmenet hőmérséklet, C 35 41 gél fázis ~ 1/ 7 ΔH hullámosgél fázis ΔH Folyadékkristályos fázis

Halogénezett fenol /idegen molekula hatása DPPC/2,4diklórfenol/víz (2,4diklórfenol/DPPC mólarányt változtatva) DSC mérés előátmenet fő átmenet tiszta 4/1000 4/100

Rel. Int. Rel. Int. Rel. Int. Az előátmenet eltűnik ( DCP/DPPC=2. 10 2 ) DSC SAXS 32 C 0.011 0.013 0.015 0.017 0.019 s (1/Å) Fagyasztvatörés 30 C mért szórási görbe Lorenz1Lorenz2. Lorenz1. Lorenz2. 0.011 0.013 0.015 0.017 0.019 s (1/A) 28 C Gél fázis és hullámos gél fázis együttes jelenléte (29 C) 0.011 0.013 0.015 0.017 0.019

Rel. Int. Rel. Int. Rel. Int. A gyengén elsőrendű (közel folytonos) jellegű fázisátalakulásnak drámai következményei vannak: A korrelációs távolság megnő (határesetben: végtelen) A legkisebb kölcsönhatások SAXS is hatással vannak a rendszer egészére > 32 C a rendszer flusztrált állapotba jut Interdigitated (=egymásba 0.011 0.013 0.015 0.017 0.019 s (1/Å) tolt) fázis kialakulása 30 C 28 C mért szórási görbe Lorenz1Lorenz2. Lorenz1. Lorenz2. 0.011 0.013 0.015 0.017 0.019 s (1/A) 0.011 0.013 0.015 0.017 0.019 s (1/A)

A PEGmodell és a korábbi elméleti megfontolások alapján (de Gennes) létrehozott szerkezetek Kis koncentrációk esetén: gomba ( mushroom ) szerkezet Nagy koncentrációk esetén: kefe ( brush ) szerkezet Biophysical Journal (1998) 74 13711379

Szórási intenzitás (tetszőleges egység) Scattered intensity [a.u.] Az SSL kettősréteg szerkezete, a PEG réteget figyelembe véve Az egy és sokrétegű liposzómák szórásának formái: DPPC/water, 20 wt% MLV DPPC/DSPEPEG2000 extruded ULV DSC, ultrahang, denzitometria, abszorpció mérések(tirosh et al. Biophys. J. 74(3), 1371 1379,1998 ) Zetapotenciál mérések (Sadzuka et al. Int. J. Pharm. 238,171 180, 2002.) NMR (GarciaFuentes et al., Langmuir, 20, 8839 8845, 2004) x5 0 1 2 3 4 5 6 q [nm 1 ] A lamellaritás jellemzése

Intenzitás, 1/cm Intensity [cm 1 ] Electron density [a.u.] Elektronsűrűség Az SSL kettősrétegének szerkezete 0 1 2 3 Belső réteg Külső réteg 0,08 0,06 0,04 A SSL Fit (asymmetric) 0,02 0,00 0,08 0,06 0,04 B SSL2 Fit (asymmetric) 1 0 0,02 0,00 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 C SSL0.5 Fit (symmetric) 1 0,1 10 5 0 5 10 SSL SSL2 SSL0.5 SSLPEG1k 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 D SSLPEG1k Fit (symmetric) 0,0 10 5 0 5 10 Distance from the bilayer center [nm] Távolság a kettősréteg centrumától, nm 0 1 2 3 q [nm 1 ]

liposzóma kölcsönhatása kettősréteggel

polialmasav hatása a vezikula morfológiájára, szerkezetére 2 μm 200nm extrudálás előtt extrudálás után

Intenzitás (relatív egység) Intenzitás (1/cm) polialmasavat tartalmazó extrudált vezikulák kisszögű röntgenszórása A Vezikula belső szerkezete: a kettősréteg B E F Vezikula egésze D C 10 ³ 10 ² 10 ¹ 10⁰ 10¹ q (1/nm) 10 ² 10 ¹ 10⁰ 10 ² 10 ¹ 10⁰ 10 ² 10 ¹ 10⁰ q (1/nm)

polialmasavat tartalmazó vezikulák szerkezeti jellemzése kisszögű röntgenszórással q max = 2,8 (1/nm) q (1/nm) 80 nm, az extrúder pórusainak átmérője

Intenzitás, 1/cm Intensity [cm 1 ] Intenzitás, 1/cm Intensity [cm 1 ] Az SSLiposzómák közötti kölcsönhatás koncentráció hatás van: korrelációs csúcs jelenik meg só hatás nincs 1000 100 1000 100 10 10 1 0,1 100:5, 1% 100:5, 0.5% 100:5, 0.25% 1 0,1 NaCl, 100:5, 1% NaCl, 100:5, 0.5% NaCl, 100:5, 0.25% 1E3 0,01 0,1 q [Å 1 ] 1E3 0,01 0,1 q [Å 1 ] USAXS, VSAXS USANS, VSANS

Köszönöm a figyelmet! Köszönetnyilvánítás OTKA BESSY Berlin