Szerológiai vizsgálatok APPvel kapcsolatban

Szerológiai vizsgálatok APPvel kapcsolatban Kiss István Tudományos Támogató Igazgatóság Ceva-Phylaxia

Tudományos támogató igazgatóság Termék támogatás Diagnosztika Módszer átadás

Vázlat APX toxinok Szerológiai módszerek Irodalmi adatok Saját tapasztalatok Anti-APX2 MDA védettség Anti-APX4 MDA - védettség Ellenanyag válaszok különféle vakcinákra Telepi adatok Konklúzió(k)

Az A. pleuropneumoniae virulencia faktorai, többek között, az exotoxinok RTX toxin család: nonapeptid Repeat-in-ToXin fehérje család, elterjedt a Gram- baktériumok körében, >1000 ismert R. Benz / Biochimica et Biophysica Acta 1858 (2016) 526 537 ApxI: erősen hemolizál, citotoxikus, 13 nonapeptid (np) ApxII: gyengén hemolizál, mérsékelten citotoxikus, 8 np ApxIII: nem hemolizál, erősen citotoxikus, 13 np ApxIV: gyengén hemolizál - csak természetes fertőzést követően termelődik (vakcinák nem tartalmazzák újabb adatok: Clinical and Vaccine Immunology, 2014, 21, p. 85 95) RTX toxinok

RTX toxinok Csoportosítás toxin termelés alapján: 1. 1,5,9,11: erősen patogén, járványtani jelentőség, ApxI, ApxII 2. 2,4,6,8: kevésbé patogén, járványtani jelentőség, ApxII, ApxIII 3. 3: legkevésbé patogén, ApxIII 4. 7,12: ApxII 5. 10: ApxI Frey et al., 1993 Idexx

RTX toxinok

APP szerológiai vizsgálatok Az állomány fertőzöttségi státuszának monitorozására APP-re utaló tüdőelváltozások hátterének tisztázása Védettség megállapítása

Szerológiai módszerek Passzív hemagglutináció (HA), koagglutináció, indirekt HA, precipitáció, immundiffúzió (keresztreakciók tanulmányozása) A komplement-fixáláson alapuló teszt volt a golden standard nem elég érzékeny komplex a kivitelezése Napjainkban különféle ELISA-kat használnak LC-LPS ELISA(k): szerotípus specifikusak: 1-9-11, 2, 3-6-8-15, 4-7, 5,10, 12, 13 APXIV ELISA: faj-specifikus APXI, II, III ELISA: saját fejlesztésű, részben termék felszabadításhoz fejlesztve APX I, II, III, IV Luminex

Szerológiai módszerek Luminex: fluorescensen jelölt gyöngyök, antigén köthető hozzájuk, áramlási citométer alapon működő kimutatás Előnyei: egyidejűleg sokféle ellenanyag vizsgálható velük (>100), multiplexelhető Széles mennyiségi tartományban használható Érzékeny

Módszer Előnyök Hátrányok PCR Érzékeny Vizsgálató módszerek Laborok jellemzői eredményei eltérhetnek Baktérium izolálás (szelektív hatékonyabb) Költséghatékony Nem túl érzékeny Gyakorlatot igényel hozzáférhetőség korlátozott Szerotipzálás Megadja a szerotípust Korlátozott elérhetőség LC-LPS ELISA APX-IV ELISA APX-I-III ELISA-k Luminex Szerotípus specifikus Kereskedelmi forgalomban van Gyakorlati tapasztalatok Alacsony költség, screening célokra Bármely szerotípus okozta fertőzést kimutat Kereskedelmi forgalomban van Potenciális eszköz vakcinázás optimalizálásához? Multiplex kapacitás, érzékenység, széles mennyiségi tartomány Költséges a szerotípus panelek miatt Érzékenység? Viszonylag kevés gyakorlati tapasztalat Érzékenység, specificitás?? Kevés adat Nincs sertésre validált! Kevés adat

Irodalmi adatok Luminex-szel ismert A.p. státuszú állományban

A.p.5 és 8. ráfertőzés utáni vizsgálatok 12 hetes malacok ráfertőzése után ráfertőzés

A.p. 8 ráfertőzés utáni vizsgálatok 12 hetes malacok ráfertőzése után ráfertőzés

A.p.5 & 8 ráfertőzés utáni Ea kinetika: ráfertőzés utáni titer csúcsok APX2 APX3 APX4 A.p.5 14 - Ø A.p.8 21 21 Ø

Anti-Apx2 MDA és LLS korrelációja, Ea kinetika Apx2 elleni Ea titerek alapján 3 csoportba osztottunk 6 hetes malacokat (~1.6; ~2.1, and ~2.4 log titerek) 6 hét múlva ráfertőzés (A.p.2, 10 8 CFU/állat) Anti-APX2 szerológia, vágás utáni tüdő-elváltozás pontozás Csoport (malac #) 6hét (D0) 9 hét (D21) 12 hét (D42) 13 hét (D50 Elhullás% 1. Alacsony MDA (10) 2. Közepes MDA (10) 3. Magas MDA (10) App2 ráfertőzés Vágás, tüdő/mellhártya pontozás 70 40 20

APX2 elleni ellenanyagok kinetikája ráfertőzés 70 40 20 6hét 9hét 12hét 13hét

APX3 elleni ellenanyagok kinetikája ráfertőzés 40 20 70 6hét 9hét 12hét 13hét

APX4 elleni ellenanyagok kinetikája 20 40 70

Anti-Apx titerek változása ráfertőzés után 70 40 20

D0 Apx2 elleni ellenanyagok és LLS, lineáris regresszió, egyedi adatok

D42 APX2 elleni ellenanyagok és LLS, lineáris regresszió, egyedi adatok

Anti-Apx2 MDA, ráfertőzés előtti APX elleni titerek, és LLS Konklúziók: A ráfertőzésre az APX2 elleni Ea szintek emelkedtek számottevően, és az MDA függvényében. A D0 APX2 értékek mutattak egy tendenciát a magasabb ellenanyagszint alacsonyabb LLS összefüggés irányába, de nem volt szoros korreláció a D0 (6 hetes kor) ás D42 (12 hetes kor, ráfertőzés előtt) időpontban gyűjtött savók APX ellenanyag titerei és a ráfertőzés okozta tüdőelváltozások között. A ráfertőzés kimenetele szempontjából a 6 hetes kor körül végzett szerológiai vizsgálat informatívabb volt, mint a 12 hetes korban végzett.

Anti-APX4 MDA és LLS 3 hetes malacok, 3 csoport a szérum APX4 Ea titerek alapján D42 ráfertőzés A.p.2-vel, aeroszollal (10 8 CFU A.p./állat) 1 hét megfigyelés, tüdőelváltozások pontozása Szerológiai vizsgálatok 30% elhullás, enyhe ráfertőzés Csoportok (malac #), életkor, hét 6 (D0) 9 (D21) 12 (D42) 13 D49) 1. Alacsony MDA (12) 2. Közepes MDA (12) Ráfertőzés Vágás, tüdő pontozás 3. Magas MDA (12)

Anti-APX4 MDA, APX4 Ea kinetika 20 10 30

Anti-APX4 MDA, APX2 Ea kinetika 30 20 10

Anti-APX4 MDA, APX2 Ea kinetika

Anti-APX4 MDA D0 anti-apx2 titer, és LLS

Anti-APX4 MDA ráfertőzés előtti anti-apx2 titer, és LLS

Anti-APX4 MDA D0 anti-apx4 titer, és LLS

Anti-APX4 MDA ráfertőzés előtti anti-apx4 titer, és LLS

Anti-APX4 MDA és LLS Konklúziók Nem volt összefüggés a 6 hetes korban mért APX4 elleni MDA, a 12 hetes korban mért ellenanyag szintek, és az ugyanakkor végzett A.p. ráfertőzés kimenetele között - viszonylag enyhe ráfertőzés esetén.

Kísérletes eredmények, különböző vakcinák priming booster ráfertőzés A.p.9 (10 6 CFU/állat) vágás D0 D21 D35 D42 6. hét 9. hét 11. hét 12. hét

Kísérletes eredmények, különböző vakcinák priming booster ráfertőzés A.p.9 (10 6 CFU/állat) vágás D0 D21 D35 D42 6. hét 9. hét 11. hét 12. hét >50% elhullás a pozitív kontrolok között, 20% a vakcinázottak között = közepes ráfertőzés

Különféle APP vakcinákkal oltott malacok Apx2 elleni Ea titerei, prime-boost vakcinázás után, 2 héttel a második oltás után ráfertőzve A.p. 9 szerotípussal D0 Priming D21 booster D35 ráfertőzés 2 bc Kísérletes eredmények, különböző vakcinák bc b ab d c d d a bc d d 1.6 log10 Apx2 1.2 0.8 0.4 0 V1 V2 V3 C V1 V2 V3 C V1 V2 V3 C

Kísérletes eredmények, különböző vakcinák Különféle APP vakcinákkal oltott malacok Apx4 elleni Ea titerei, prime-boost vakcinázás után, 2 héttel a második oltás után ráfertőzve A.p. 9 szerotípussal D0 Priming D21 booster D35 ráfertőzés 170 ab ab b a c cd cde c de de e cde 140 110 S/P% 80 50 20-10 V1 V2 V3 C V1 V2 V3 C V1 V2 V3 C

Különböző vakcinák, ráfertőzés előtti APX2 titer és LLS - lineáris regresszió

Különböző vakcinák, ráfertőzés előtti APX4 titer és LLS- lineáris regresszió

Különböző vakcinák, konklúzió Az A.p. 9-es szerotípussal végzett, közepesen erős ráfertőzés a után nem volt korreláció a ráfertőzés előtti APX2 elleni Ea titerek, és gyenge korreláció volt az Apx4 S/P arányok és a súlyozott tüdő pontszámok között. Valószínűsíthető, hogy erős ráfertőzésnél, peracut lefolyásnál, a ráfertőzés előtti Ea szint nem sokat befolyásol.

ARM A hetes hetes 0 hetes 4 hetes 8 hetes 2 hetes ID APP 1,9,11 APP 2 APP 3,6,8 APP 4,7 APP 5a5b APP 10 APP 12 APX 4 A/1 - - - - - - - + A/2 - - - - - - - + A/3 - - - - - - - + A/4 - - - - - - - + A/5 - - - - - - - - A/6 - - - - - - - - A/7 - - - - - - - + A/8 - - - - - - - + A/9 - - - - - - - + A/10 - - - - - - - + A/11 - - - - - - - - A/12 - - - - - - - - A/13 - - - - - - - + A/14 - - - - - - - + A/15 - - - - - - - + A/16 - - - - - - - - A/17 - - - - - - - - A/18 - - - - - - - - A/19 - - - - - - - + A/20 - - - - - - - - A/21 - - - - - - - - A/22 - - - - - - - - A/23 - - - - - - - - A/24 - - - - - - - - A/25 - - - - - - - - A/26 - - - - - - - - A/27 - - - - - - - - A/28 - - - - - - - - A/29 - - - - - - - - A/30 - - - - - - - - Telepi adatok

FARM B 4 hetes 7 hetes 10 hetes 14 hetes 18 hetes 22 hetes ID APP 1,9,11 APP 2 APP 3,6,8 APP 4,7 APP 5a5b APP 10 APP 12 APX 4 B/1 + - - - - - - - B/2 - - - - - - - + B/3 - - - - - - - - B/4 - - - - - - - - B/5 - - - - - - - + B/6 - - - - - - - + B/7 - - - - - - - - B/8 - - - - - - - + B/9 - - - - - - - - B/10 - - - - - - - - B/11 - - - - - - - + B/12 - - - - - - - - B/13 - - - - - - - + B/14 +? - - - - - - B/15 - - - - - - - - B/16?? - - - - - + B/17 - - - - - - - - B/18 + + - - - - - - B/19 - - - - - - - - B/20 - - - + - - - - B/21 - - - + - - - - B/22 - - - + - - - - B/23 - - - + - - - - B/24 - - - + - - - - B/25 - - - + - - - - B/26 - - - - - - - - B/27 - - - - - - - - B/28 - - - - - - - - B/29 - - - - - - - - B/30 - - - - - - - - B/31 - - - - - - - - B/32 - - - - - - - - B/33 - - - - - - - - B/34 - - - - - - - - B/35 - - - - - - - - B/36 - - - - - - - - B/37 - - - - - - - - Telepi adatok

FARM C 4 hetes 7 hetes 10 hetes 14 hetes 18 hetes 22 hetes ID APP 1,9,11 APP 2 APP 3,6,8 APP 4,7 APP 5a5b APP 10 APP 12 APX 4 C /1 - - - - - - - + C /2 - - - - - - - + C /3 - - - - - - - + C /4 - - - - - - - + C /5 - - - - - - - + C /6 - - - - - - - + C /7 - - - - - - - + C /8 - - - - - - - + C /9 - - - - - - - - C /10 - - - - - - - + C /11 - - - + - - - - C /12? - - - - - - + C /13 - - - - - - - + C /14 - - - - - - - + C /15 - - - - - - - - C /16 + - - - - - - - C /17 + - - - - - - - C /18 + - -? - - - + C /19 +? -? - - - - C /20 - - - - - - - - C /21 - - - - - - - - C /22 + - - - - - - - C /23 - - - - -? - - C /24 - - - - - - - - C /25 - - - - - - - + C /26 - - - - - - - - C /27 - - - - - - - - C /28 - - - - - - - - C /29 - - - - - - - - C /30 - - - - - - - - Telepi adatok

A jövő?

APP szerológiai vizsgálatok: konklúziók MDA - későbbi ráfertőzés kimenetele között nincs szoros összefüggés APX4-et és APX2-t illetően ugyanakkor az APX2 jobb paraméternek mutatkozik ebből a szempontból. APX4-re nincs hatással a vakcinázás, és a ráfertőzés előtti titerek nem (A.p.2) vagy gyengén (A.p9) korrelálnak a védettséggel Mind a vakcinázásra mind a ráfertőzésre adott immunválaszt érzékenyebben mutattuk ki az APX2 ELISA-val, és a 6 hetes korban mért titerek informatívak voltak a későbbi LLS-t illetően Kis létszámú csoportokon végzett kísérletek!

APP szerológiai vizsgálatok: összefoglalás Leginkább az állományok A.p. fertőzöttségéről adnak felvilágosítást APX4: minden szerotípus által okozott fertőzésről érzékenység? LPS ELISAk: szerotípus specifikusak, de több ELISA-t kell használni - érzékenység? Az APX(2) profil segíthet a A.p státusz felderítésében Keresztreakciók! Többféle tesztet is igénybe kell venni a helyzet tisztázáshoz (mind szerológiai, mind bakteriológiai, vagy PCR vizsgálatokat), részben a járványtani helyzet, részben fals pozitivitás, ill. keresztreakciók miatt érzékenységbeli különbségek befolyásolhatják a kiértékelést.

Telepi adatok APX2 ELISA 2.5 Korcsoportonkénti Apx2 titerek, 10 malac/csoport, 11 hetes korban vakcinázást folytatnak a b c d VAKCINÁZÁS bc 2 logapx2 1.5 1 0.5 5 7 9 11 14 életkor, hetekben

Telepi adatok APX2 ELISA 2.5 Korcsoportonkénti Apx2 titerek, 10 malac/csoport, 11 hetes korban vakcinázást folytatnak a b c d VAKCINÁZÁS bc 2 logapx2 1.5 1 Köszönöm a figyelmet! 0.5 5 7 9 11 14 életkor, hetekben