SVETOZAR MARKOVIĆ GIMNÁZIUM SZABADKA ÉRETTSÉGI HÁZIDOLGOZAT KÉMIÁBÓL A VÉR BIOKÉMIAI ANALÍZISE Mentor: prof. Nikolić Ibolya Tanuló: Márton Kinga (aláírás) 2009. május, Szabadka 1
Minden sóhajtásnak előzménye van, a sejtek, a vér, az izmok, a könnyek, a verejték mind a lélek szolgálatában állnak. /Schäffer Erzsébet/ 2
TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék... 1. Bevezető... 2. A vér... 3. Na +, K + és Cl - szerepe és mennyiségének meghatározása... 4. Nátrium... 4. Kálium... 4. Klór... 5. Aktív transzport... 5. Na + és K + szintjének meghatározása... 6. Cl - szintjének meghatározása... 8. A glükóz vagy vércukor szerepe és mennyiségének meghatározása... 8. A szénhidrátok anyagcseréje... 8. Glikolízis... 9. Citrátkör... 11. Terminális oxidáció... 13. A vércukorszint meghatározása... 13. Koleszterin szerepe és mennyiségének meghatározása... 15. Koleszterin a vérben... 16. A koleszterinszint meghatározása... 17. Hemoglobin szerepe és mennyiségének meghatározása... 18. A hém... 19. Oxi- és deoxi-hemoglobin... 20. A hemoglobinszint meghatározása... 20. Miért is fontosak ezek a mérések? Milyen betegségek előzhetőek meg, ismerhetőek fel időben a vizsgálatokkal?... 21. Felhasznált irodalom... 23. 3
Bevezető Fontosnak tartom, hogy az emberek ismerjék szervezetüket. Így éltető szövetünk, a vér összetételét is. Legjobban szerettem volna bemutatni a vér teljes összetevőit, de beláttam, hogy nem lenne hozzá sem elegendő időm, sem pedig elegendő tudásom. Ezért kiválasztottam néhány fontosabb anyagot, mely vérünkben található. Ezek kimutatási módszereit, eljárásait és a hozzájuk fűzűdő betegségeket fogom bemutatni ebben a munkában. A kiválasztása a vizsgált anyagoknak főként véletlen volt, de szerepet játszott kiválasztásukban az is, hogy mennyire fontosak a szervezetben, illetve, hogy mennyire ismert jelenlétük a vérben az átlagemberek számára. Hiszen néhány anyag koncentrációjának a változása komoly betegségekre utalhat. Ezzel a munkával szeretném felhívni a figyelmet a vérvizsgálat fontosságára. Segítségemre voltak munkámban a Szabadkai Kórház klinikaikémiai laboratóriumának biokémikusai, akik bevezettek a laboratórium munkájába és beavattak a biokémiai analizátorok működésébe, hiszen ma már leginkább gépek végzik az analíziseket. Egy gépet én magam is kipróbálhattam, elvégezhettem a nátrium és kálium koncentrációjának lángfotometriás meghatározását. Mivel a legtöbb géphez komoly szaktudás szükséges, azoknak a működését elmondták és megfigyelhettem, hogyan végzik rajtuk a szakemberek a különféle analíziseket. 4
A vér Folyékony sejtközötti állományú kötőszövet. A vértérfogat jelentős részét a víz és a fehérjék alkotják. Térfogata megközelítőleg 5 liter egy felnőtt embernél. Alakos elemei a vörösvértestek, a fehérvérsejtek és a vérlemezkék. Az alakos elemek térfogata közel fele a vértérfogatnak. A vörösvértestek vagy eritrociták tartalmazzák a hemoglobint, a vörös vérfestéket. A hemoglobin egy szállító protein, ami az O 2 szállítását végzi a tüdőtől a sejtekig, illetve CO 2 szállítását a sejtektől a tüdőig. A fehérvérsejteknek vagy leukocitáknak védő szerepük van. A vérlemezkék vagy trombociták apró testecskék, melyek résztvesznek a véralvadás folyamatában. A sejtközötti állomány a vérplazma. 1. ábra: A vér összetevői A vérplazma a vér 55-56%-át adja. Ennek 90%-a víz, 2%-át különféle ionok (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Cl -, HCO - 3,...) alkotják. A mardék 8%-a pedig fehérjékből áll (albuminok, globulinok, fibrinogén, stb.). Lehetnek egyéb anyagok is a vérben, mint például glükóz, szabad zsírsavak, aminosavak, szteroidok, húgysav, karbamid, stb. A vérplazma csak akkor vizsgálható, ha specifikus anyagokkal a véralvadást magakadályozzuk. Ha a plazmát (vagy a teljes vért) hagyjuk megalvadni, és csak ezután centrifugáljuk, akkor kapjuk a szérumot, amely a plazmától csak annyiban különbözik, hogy a fibrinogént már nem tartalmazza. 5
Na +, K + és Cl - szerepe és mennyiségének meghatározása Nártium Az élővilág, így az ember számára is létfontosságú másodlagos elem a nátrium. Naponta a táplálékkal nagyjából 100-250 mmol nátriumot viszünk be a szervezetünkbe nátrium-klorid formájában. Ez teljesen fedi a napi szükségleteinket. A nátrium-klorid szinte teljes mértékben felszívódik az emésztés során, mindössze csak 2% távozik a széklettel. Szabad kationként van jelen a sejtekben, a vérplazmában és az extracelluláris térben, ahol a káliumionnal együtt nagyon jelentős szerepük van. Az extracelluláris tér fő kationja. Részt vesz az ideg- és izomsejtek ingerületvezetési folyamataiban, a negatív töltésű fehérjemolekulák töltésének kompenzálásában. Fontos szerepe van az extracelluláris tér ozmolalitásának fenntartásában és a volumen regulációjában. A nátrium kiválasztása legnagyobbrészt vizelet útján történik, de a könny, a verejték és a széklet is tartalmaz nátriumot. A glomerulusokban naponta körülbelül 1000 g (kb. 17 mol) nátrium választódik ki az elsődleges vizeletbe. Ennek legnagyob része, 80-85 %-a visszaszívódik a közelebbi tubulusokon, és valamennyi a távolabbi tubulusokon. A másodlagos vizeletbe mindössze csak 1% kerül. A nátrium visszaszívódását egy hormon szabályozza, az aldoszteron. Kálium Szintén minden élőlény számára fontos másodlagos biogén elem. Az állati és emberi szövetek egyik legfontosabb kationja. Naponta átlagban 50-100 mmol káliumot viszünk be a szervezetünkbe a táplálékkal. Ez a mennyiség kielégíti napi szükségletünket. A vékonybélben szívódik fel. Kiválasztása 90%-ban a vizelettel, míg 10%-a a széklettel történik. Fő kation az intracelluláris térben. Fontos szerepe van a az ideg- és izomsejtek ingerületvezetési folyamataiban, illetve a negatív fehérjemolekulák semlegesítésében. Hatással van a szívizom aktivitására. A vörösvértestekben nagyjából hússzor több kálium van, mint a szérumban, ezért vérvételkor vigyázni kel, hogy a vörösvértestek ne sérüljenek (ne kerüljön sor hemolízisre, a vörösvértestek feloldódására). Ugyanis a kiáramló intracelluláris kálium emeli a szérum kálium szintjét. Valamint a szérumot minnél hamarabb el kell választani az alakos elemektől, mert a vér állásával, különösen hűtés esetén, a kálium diffundál a sejtekből a szérumba, a nátrium pedig a szérumból a sejtekbe. 6
Amikor a vérrel együtt a kálium áthalad a veséken, akkor az kiválasztódik az elsődleges vizeletbe, de onnan a közelebbi tubulusokban 90% fölszívódik. A távolabbi tubulusokban részben újra kiválasztódik, azaz átcserélődik nátriumionra. A kálium kiválasztását a mineralkortikoszteroidok (aldoszteron) szabályozzák, de csak közvetett úton. Klór Szintén másodlagos biogén elem, mely az emberi szervezetben jelentős. A gerincesek szervezetében az egyik legfontosabb sejten belüli és sejten kívüli anion. Naponta a táplálékkal 140-260 mmol klórt viszünk be konyhasó formájában, ami kielégíti szervezetünk napi szükségletét. Teljes mértékben felszívódik a vékonybélben. Kiválasztása a főként vizelet útján történik, illetve kisebb mértékben verejtékezéssel. Szabad anionként van jelen, főként az extracelluláris térben. Az intracelluláris térben csak nagyon kis mennyiségben van jelen, csupán 1 mmol/l. A vörösvértestek tartalmazzák nagyobb mennyiségben, nagyjából 50-54 mmol/l. De még ez is alacsonyabb, mint a szérumbeli szintje. A gyomorsav egyik összetevője, szabályozza a vörösvértestek szén-dioxidtranszportfolyamatait, valamint fontos szerepe van az ingerlési folyamatokban. A nátriumhoz hasonlóan a klór is kiválasztódik az elsődleges vizeletbe, ám a közelebbi tubulusokban passzívan visszaszívódik. Aktív transzport (Na + K + -pumpa) Az aktív transzport a sejtek membránján keresztül megvalósuló transzport folyamat. Ez fehérjékből álló rendszerek segítségével valósulhat meg, ám a szállítómolekula mozgása és a szállított molekula leadása a sejtben energiafelhasználással jár a sejt részéről. A folyamat során a szállítófehérjék vagy carrierek az energiaszükségletüket az ATP-moleklák hidrolíziséből nyerik. A szállítófehérjék a transzportot végző enzimek, melyek segítségével mindig egy irányba, akár magasabb koncentráció felé is szállítódhatnak molekulák. Különböző anyagok szállítódhatnak ilyen módon, például a vékonybélben a glükóz felszívása vagy az ideg- és izomsejtek ingerlési folyamataiban a nátrium- és a káliumionok. A Na + -K + -pumpa az ingerelhető sejtek memránjában található. Ilyenek az ideg- és izomsejtek. Ezek membránján kívül, az extracelluláris térben magas a nátriumionok koncentrációja, míg az inracelluláris térben a káliumionok koncentrációja magasabb. A membrán a káliumionnal szemben permeabilis, vagyis átjárható, míg a nátriumionnal szemben szinte teljesen inpermeabilis, vagyis átjárhatatlan. Tudjuk, hogy a nátriumion tömege kisebb, mint a káliumioné, de hidratált állapotban van a nátriumion, ezért jelentősen megnövekszik nagysága 7
és lényegesen nehezebben tud átjutni a membránon. Mégsem ez a magyarázat a koncentráció egyenlőtlen eloszlására, mivel ha a sejt elhal, elveszíti káliumion tartalmát és a nártiumionok koncentrációja is kiegyenlítődik az extra- és az intracelluláris térben. Ezért kell, hogy legyen egy mechanizmus, mely létrehozza ezt a koncentráció különbséget és szabályozza is azt. Ezt a mechanizmust nevezzük Na + -K + -pumpának. Ez egy időben távolítja el az élő sejt belsejéből a nátriumionokat és vesz fel a környezetéből káliumionokat. A intracelluláris folyadékban az effektív káliumion-koncentráció 35-ször magasabb, a nátriumion-koncentrációja pedig 20- szor kisebb, mint az extracelluláris részben. A szállítófehérje itt a Na + -K + -ATPáz. Mivel ez a folyamat energia igényes, ezért a táplálékkal felvett energia nagyrésze, amit az ATP tárol, itt használódik fel (kb. 20-30%-a az aktív transzport folyamatokra használódik). Ez a folyamat primér aktív transzport, mivel az ATPáz energiája közvetlenül a transzport mechanizmusra használódik fel. 2. ábra: Na + -K + -pumpa mechanizmusa A Na + és K + szintjének meghatározása A nátrium- és káliumionok kétféle módszerrel mutathatóak ki a szérumban: 1. Emissziós lángfotometriás eljárással: Ennél a módszernél azt használjuk ki, hogy ezek az alkálifémek megfestik a színtelen lángot. A nátrium sárgára, a kálium pedig lilára. A mintát propán és levegő keverékének lángjába porlasztjuk. A gerjesztett ionok által kibocsátott fény áthalad a megfelelő filtereken, és 8
elektromos energiává alakul a fotocellában. A keletkezett elektromos áramot egy galvanométer méri. A kisugárzott fényerősség függ a ionok koncentrációjától a vizsgált mintában. Az adott feltételek mellett történik az ismert (standard) koncentrációjú nátrium és kálium oldatok mérése. A kapott értékek szükségesek a minta nátrium és kálium koncentrációjának kiszámításához. 1. kép: Lángfotométer IL 463 2. Ionszelektív elektródákkal: Ma az elektrolitok szintjét, így a nátriumét és a káliumét is potenciometriás eljárásokkal mérik. Meghatározható az elektrokémiai potenciál különbség az üvegmembrános elektródák és a referenciális elektródák között, amely változik a ionok koncentrációjától függően a szérumban. Ezen az elven működik több berendezés is, melyek a nátrium- és káliumionok meghatározására szolgálnak. Az ilyen analizátoroknál pontosan be kell tartani a gyártó által adott utasításokat, hogy a mérések pontosak legyenek. 2. kép: Olympus AU400 biokémiai analizátor 9
A Cl - szintjének meghatározása A modern biokémiai analizátorokban a klór meghatározása ionszelektív elektródákkal történik. Az eljárás ugyanúgy zajlik, mint a nátrium- és a káliumionoknál. Azzal a különbséggel, hogy itt negatív ionról beszélünk. A mérés az elektródák közötti potenciál különbségen alapszik, melyből következtetni lehet a szérum kloridion koncentrációjára. A glükóz vagy vércukor szerepe és mennyiségének meghatározása A glükóz egy monoszacharid. Egészen pontosan egy aldohexóz. A glükóz egy biológiailag nagyon fontos vegyület az élőlények számára. Az élő szervezetek energiaforrásként hasznosítják. Mint a szénhidrátok mindegyikének, a glükóznak is van nyílt és zárt szénláncú alakja. A gyűrűs formában legstabilabb a hattagú szék konformációjú piranózgyűrűs alakja. Ilyenkor a molekulát glükopiranóznak nevezzük. Ezzel a belső reakcióval félacetálok képződnek. Az 1- es szénatomhoz kapcsolódó hidroxid csoport kétféle helyzetet vehet fel a gyűrűhöz viszonyítva. Ezzel kétféle anomer keletkezhet. Így megkülönböztetünk α- és β-glükopiranózt. 3. ábra: α- és β-glükopiranóz A szénhidrátok anyagcseréje Az összetett szénhidrátok (poli- és diszacharidok) az emésztés folyamán glükózra bomlanak le, és így szívódnak fel az emésztőcsatornából a vérbe, mely a sejtekhez szállítja a felszívott a glükózt. A glükóz lebontása a citoplazmában játszódik le. Első szakasza a glikolízis. Ez még anaerob, majd a biológiai oxidáció következtében belép a folyamatba az oxigén és a keletkezett termék enzim segítségével a Krebs-ciklusba kerül, ahol szén-dioxidra és hidrogénre bomlik. Majd a hidrogén a terminális oxidációban vízzé oxidálódik. A tüdőbe visszakerülve, a szén-dioxid és a víz kilélegzésre kerül. Az a nagy mennyiségű energia, ami felszabadul és beépül az ATP-be, az az életfolyamatok fenntarására használódik majd el. 10
A fel nem használt glükózt a szervezetünk tárolni is tudja glikogén formájában. Ez hasonlít a keményítőhöz és a funkciója is ugyanaz, tartalék szénhidrát csak épp az állati és az emberi szervezetben. Emiatt állati keményítőnek is szokták nevezni. Főként az izmokban illetve a májban tárolódik. A glükóznak glikogénné való átalakítását a szervezetben glikogenezisnek nevezzük. Ezt a tartalék tápanyagot hasonlóan bontja le szervezetünk, mint a glükózt. A glikogénnek először le kell bomlania glükóz molekulákra ahhoz, hogy beléphessen a glükóz lebontási folyamatába. A glükóz molekulák egyesével válnak le a láncról, és ez nem igényel energiát, mert azonnal felvesznek egy foszfátcsoportot. Így glükóz-1-foszfát keletkezik, ami enzim hatására glükóz-6-foszfáttá alakul. Ez már képes belépni a lebontási folyamataba. Glikolízis A glikolízist Louis Pasteur, francia vegyész vizsgálta először. Később több kutatócsoport is foglalkozott ezzel a témaval. Az 1940-es évekre már teljesen letisztázták ezt a folyamatot. A folyamat során egy molekula glükózból két molekula piroszőlősav keletkezik oxidáció során. Négy hidrogénatom válik ki, melyek közvetlenül a hidrogénszállító koenzimre kerülnek, a NAD + -ra, mely NADH-vá redukálódik. Oxigén jelenlétében a piroszőlősav tovább oxidálódik, és acetil-koenzim-a keletkezik a folyamat végén. Az oxidáció során leválasztott hidrogének ismét a NAD + -ra kerülnek. A szénatom pedig szén-dioxid formájában kilép a folyamatból. A folyamat kémiai lépései: 1. a glükóz egy molekula ATP felhasználásával glükóz-6-foszáttá alakul (hexokináz) 2. a glükóz-6-foszfátból fruktóz-6-foszfát keletkezik (glükóz-fruktóz-izomeráz) 3. a fruktóz-6-foszfát egy molekula ATP felhasználásával fruktóz-1,6-difoszfáttá alakul (fruktóz-foszfát-kináz) 4. a fruktóz-1,6-difoszfát felbomlik dihidroxi-aceton-foszfátra és glicerinaldehid-3- foszfátra (aldoláz) 5. a dihidroxi-aceton-foszfát glicerin-aldehid-foszfáttá alakul (trióz-foszfát-izomeráz) 11
4.1. ábra: A glikolízis folyamata I. 6. a glicerin-aldehid-foszfát foszforsav felvétele és NAD + redukciója közben glicerinsav-1,3-difoszfáttá oxidálódik és NADH keletkezik (glicerinaldehid-3- dehidrogenáz) 7. a glicerinsav-1,3-difoszfát lead egy foszfát csoportot és ATP és glicerinsav-3-foszfát keletkezik (foszfo-glicerát-kináz) 8. a glicerinsav-3-foszfát foszfátcsoportja áthelyeződik és glicerinsav-2-foszfát keletkezik (foszfo-glicerát-mutáz) 9. a glicerinsav-2-foszfát veszít egy molekula vizet és foszfo-enol-piroszőlősavvá alakul (enoláz) 10. a foszfo-enol-piroszőlősav leadja foszfát csoportját és piroszőlősav és ATP keletkezik (piruvát-kináz) Ezt követi a piroszőlősav oxidációja oxigén jelenlétében: piruvátdehidrogenáz piroszőlősav + NAD + + KoA acetil-koa + NADH + H + + CO 2 12
4.2. ábra: A glikolízis folyamata II. Citrátkör A citrátkört többen is kutatták. Szent-Györgyi Albert magyar biokémikus 1937-ben a biológiai oxidáció mechanizmusának kutatásáért és elért eredményeiért orvosi Nobel-díjat kapott. Valamint Hans Albert Krebs német származású angol biokémikus az intermedier anyagcsere-kutatásaiért 1953-ban Nobel-díjat kapott. Ezért tiszteletükre Szent-Györgyi- Krebs-ciklus néven is nevezik. A glikolízis folyamán keletkezett piroszőlősavat a koenzim-a szállítja acetil-koa-ként a citrátkörbe. Az acetilcsoport leválik a koenzim-a-molekuláról és egy oxálecetsav molekulához kapcsolódik. Így citromsav jön létre. A citromsav több lépésen keresztül részlegesen oxidálódik. A leváló hidrogénatomok a NAD + illetve FAD molekulákhoz kapcsolódnak, a két szénatom pedig szén-dioxid formájában távozik a folyamatból. A keletkezett négy szénatomos vegyület újra oxálecetsavvá alakul, és indul a folyamat elölről. A folyamat biokémiai lépései: 1. az acetil-koenzim-a oxálecetsavval reagál és citromsav keletkezik 2. a citromsav a cisz-akonitsavon keresztül izocitromsavvá alakul 13
3. az izocitromsav két hidrogén leadásával először oxálborostyánkősavvá, majd egy molekula szén-dioxid kilépésével α-ketoglutársavvá alakul 4. az α-ketoglutársav szukcinil-koenzim-a-vá alakul és szén-dioxid szabadul fel 5. a szukcinil-koenzim-a borostyánkősavvá alakul 6. a borostyánkősav fumársavvá alakul át, dehidratálódik 7. a fumársav vízfelvétellel almasavvá alakul 8. az almasav oxálecetsavvá alakul, oxidálódik A folyamat lényege: acetil-koa + 3NAD + + FAD + H 3 PO 4 + 2H 2 O 2CO 2 + 3NADH + FADH 2 + GTP + KoA 5. ábra: A citrátkörben lezaljó reakciók 14
Terminális oxidáció A XX. században fő szerepet játszott a biológiai oxidáció folyamatainak tanulmányozása a biokémiai kutatásaban. 1910-ben Heinrich Otto Wieland feltételezte, hogy a biológiai oxidáció a hidrogénatomok dehidrogenáz enzimek által történő aktiválása. Az ATP központi szerepét a 30-as években fedezték fel. 1948-ban rájöttek, hogy a terminális oxidáció és a hozzá kapcsolódó ATP-szintézis a mitokondriumokban játszódik le. A redukált koenzimek, mint szubsztrátok oxidálását egy soklépcsős reakciósor végzi. A dehidrogenáz enzimek a szubsztráttól hidrogént vesznek el és redukálódnak, az oxidáz enzimek pedig a redukálódott dehidrogenázok hidrogénjeit a légköri oxigénnel vízzé alakítják, miközben visszaoxidálódnak. A folyamatok a mitokondriumok belső nagyfelületű membránján játszódnak, és egységes rendszert alkotnak. Fontos szerepe van még az elektronszállító citokróm enzimláncnak is, melyek a dehidrogenázok és az oxidázok között találhatóak. A vércukorszint meghatározása Ma háromféle enzimatikus eljárással tudjuk meghatározni a vér cukorszintjét. Ebből kettőt említek, melyeket ma is alkalmaznak: 1. Glükóz-oxidáz enzimmel: Ez az eljárás azon alapul, hogy a glükóz-oxidáz oxidálja a glükózt glükonsavvá és közben hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) keletkezik: GOD D-glükóz + O 2 + H 2 O D-glükonsav + H 2 O 2 A keletkezett hidrogén-peroxid a peroxidáz mellett valamely elekrton akceptorral oxidálja a színtelen kromogént egy színes vegyületté. A keletkezett színintemzitást fotometriásan mérik ismert koncentrációjú glükóz oldathoz viszonyítva 550 nm-es hollámhosszon. Ebben az eljárásban a glükóz oxidációja specifikus, de a kromogén oxidációja már nem. Interferálhat az aszkorbinsavval, húgysavval, adrenalinnal, stb., melyek a kromogén helyett oxidálódnak, és az eredményünk alacsonyabb lesz. A vérben ez az interferencia kevésbé kifejezett. Viszont vannak más olyan oxidáló szerek, mint a hipoklorit, melyek képesek oxidálni a kromogént, és sokkal magasabb eredményt előidézni. 15
Ezen a fotometriás eljáráson kívül figyelemmel követhetjük a glükóz oxidációját még az oxidációhoz elhasznált oxigén mérésével specifikus oxigén-elektródák segítségével. A keletkezett hidrogén-peroxidot el kell távolítani a keverékből. Ezt kataláz és etanol, majd molibdát és jodid hozzáadásával tudjuk elérni: H 2 O 2 + C 2 H 5 OH kataláz CH 3 CHO + 2H 2 O H 2 O 2 + 2H + + 2I - molibdát I 2 + 2H 2 O 2. Hexokináz enzimmel: Ez egy kétlépcsős módszer. A fő vagy primáris reakcióban a glükóz foszforilálódik ATP segítségével. Az indikátor reakcióban a glükóz-6-foszfát enzim (hexokináz) segítségével oxidálódik, miközben az NAD koenzim redukálódik. A 340 nm-es hollámhosszon abszorbció változás történik, melynek mértéke arányos a glükóz koncentrációjával. hexokináz D-glükóz + ATP D-glükóz-6-foszfát + ADP G-6-P DH glükóz-6-foszfát + NAD 6-foszfoglükonát + NADH Ez az eljárás erősen specifikus, mert a reakció a hexokinázzal és a foszforiláció is lejátszódhat más hexózzal is, ám a glükóz-6-foszfát-dehidtogenáz csak a glükóz-6-foszfátot képes oxidálni. Ezért ezt az eljárást veszik referenciális eljárásnak a glükóz koncentrációjának meghatározására. Ez emellett nagyon érzékeny eljárás. Viszont pontos, gyors, és nagyon széles skálán mérhető a koncentráció, a nagyon alacsonytól a nagyon magasig. Némely gyógyszerek, mint a Baralgin, nincsenek kihatással az eredményekre, míg a glükóz-oxidázzal történő reakciókat befolyásolják. 3. kép: Arhitect C8000 biokémiai analizátor 16
Koleszterin szerepe és mennyiségének meghatározása A koleszterin a szterán vázas vegyületek csoportjába tartozik. Az egyszerű lipidekhez sorolható, pontosabban a szteroidokhoz. A szteroidokon belül pedig a szterolok csoportjába tartozik. A szterán vázat négy gyűrű alkotja, melyeket A, B, C és D betűkkel jelölünk. Tartalmaz még egy nyolc szénatomból álló oldalláncot is. Összesen huszonhét szénatomból áll. 6. ábra: A koleszterin szerkezete Az ember a koleszterint állati eredetű táplálék útján viszi be a szervezetébe, mert a növények nem tartalmazzák. Ám ezen kívül az ember szervezetén belül is képes szintetizálni a koleszterint acetátból. A bioszintézis főként a májban történik (napi 1,5 g), de kisebb mennyiségben (napi 0,5 g) történhet például a bőrben, a bélfalban, az aorta falában, stb. Az enzimek, melyek részt vesznek a szintézisben, vízben oldódó citoplazmatikus és mikroszomális enzimek. Szervezetünk számára nagyon jelentős szerves molekula. A sejtfal és a sejtszervecskék membránjának szerkezeti eleme. Nagyon fontos az új sejtek keletkezéséhez, majd az elhalt sejtek pótlásához. Ezen kívül a szervezetünkben hormonok, szteroid hormonok is képződnek a koleszterinből. Ilyen hormonok például az ösztrogének, az androgének, a kortizol és az aldoszteron. A hormonokon kívül a D 3 -vitamin valamin és az epesavak keletkezésének kiinduló molekulája. 17
7. ábra: A koleszterinből képződő vegyületek szervezetünkben Koleszterin a vérben A keringésben nagyjából 60-80% koleszrein van észter formájában. A vérben a koleszterin kapcsolódik a lipoproteinekhez, legtöbbször a β-lipoproteinekhez. Koncentrációja a szérumbn több tényezőtől is függ. Az ösztrogén hormonok felerősítik a koleszterin szintézisét, de ugyanakkor elősegíti a kiválasztását, így csökkenti a koleszterin koncentrációját a szérumban. Ez az oka annak, hogy a nőknél átlagban alacsonyabb a koleszterin szint a menopauzáig. A tiroxin az általános hatásával a metabolizmusra csökkenti a koleszterin szintjét. Ezért a tiroxin és a koleszterin koncentrációja fordított arányban van. Megkülönböztetünk kétféle koleszterint a szervezetben. Úgymond rossz koleszterin az LDL-koleszterin, a jó koleszterin pedig a HDL-koleszterin. Míg az LDL-koleszterin káros a szervezetre, mert érszűkületet okoz lerakódva az erek falára, addig a HDL-koleszterin épp az ellenkezője. Védi az erek falát a lerakódó zsírrétegtől megszabadítja, és visszajuttatja a májba. Ezért fontos, hogy a HDL-szint magas legyen és az LDL-szint minnél alacsonyabb. A szérumban lévő koleszterinből nagyjából 20% a HDL-koleszterin. 18
8. ábra: Az LDL- és HDL-koleszterin jó aránya és munkája A koleszterinszint mehatározása A koleszterinszint meghatározására enzimes eljrást alkalmaznak, mely első ízben 1972-ben adott pontos képet a koleszterinszint mérésének problémájában. Először a koleszterin észterei hidrolizálnak és a koleszterin oxidálódik koleszterin-oxidáz vagy dehidrogenáz enzim segítségével. Később az eljárás az koleszterin észter hidrolízisén alapszik, melyben szabad koleszterin és zsírsav keletkezik. Így az összes koleszterin szabad állaptba kerül. A koleszterin tovább reagál oxigénnel egy enzimatikus reakcióban, melyet a koleszterol-oxidáz katalizál és Δ-4-koleszterén-3-on és hidrogén-peroxid keletkezik: O R-CO koleszterin észter koleszterin zsírsav HO koleszterinészteráz + H 2 O + R-CCOH koleszterinoxidáz +O 2 +H 2 O 2 HO O koleszterin Δ-4-koleszterén-3-on 19
A fent leírt reakciók minden enzimatikus eljárásnál azonosak, a különbség az egyes eljárásoknál csak a keletkezett termékek fotometriás mérési módjában van. Többféleképp mérhetjük a keletkezett anyagok koncentrációját, és következtethetünk a koleszterin koncentrációjára. A leginkább alkalmazott eljárásban peroxidáz enzimet használnak, hogy a hidrogén-peroxid oxidálja a 4-aminofenazont a fenollal, és 4-fenazon kelezkezik: OH peroxidáz H 2 O 2 + + + 3H 2 O H 3 C N N O H 3 C N N O H 3 C NH 2 H 3 C N 4-aminofenazon fenol 4-fenazon O A inkubáció 15 percig tart és a reakció lineáris egészen 13 mmol/l koleszterin koncentrációig. Az abszorbciót 500-550 nm között mérik. Hasonlóan, mint a glükóznál az aszkorbinsav zavarja a reakciót, és csökkenti a koncentráció értékét. Hemoglobin szerepe és mennyiségének meghatározása A hemoglobin a gerincesek vérében található vas tartalmú metalloprotein. Az embernél a hemoglobin négy alegységből áll. Mind a négyet egy globuláris fehérjerész és egy nemfehérjerész, a vastartalmú hem alkotja. Ez a molekula szállítja az oxigént tüdőnktől a sejtekig, illetve a szén-dioxidot a sejtektől a tüdőnkig. Attól függően, hogy oxigén vagy szén-dioxid kapcsolódik hozzá, megkülönböztetünk oxi- és deoxi-hemoglobint. A hemoglobin az eritrocitákban található elraktározva. A vörösvértestek szárazanyagtartalmának körülbelül 97%-át teszi ki. Az emberi szervezetben legelterjedtebb a hemoglobina. Ez két α és két β alegységet tartalmaz. Az alegységek 141 és 146 aminosavból épülnek fel. Összetétele α 2 β 2. A láncokat ionos kötések, hidrogénhidak és hidrofób kölcsönhatások tartják össze. A láncok molekulatömege külön külön 17000 dalton körüli. A tetramer össz molekulatömege pedig 68000 dalton körüli. 20
9. ábra: A hemoglobin a vörösvértestekben; Felépítése A hem A hem a hemoglobin festékanyaga. A kétértékű vasionoktól kapja jellegzetes piros színét. A hem molekulát négy pirolgyűrű alkotja, amelyek metenil-hidakkal kapcsolódnak egymáshoz. Így alakul ki a porfirin váz. Ezért nevezzük még a hemet ferro-protoporfirinnek is. A pirolgyűrűk nitrogénatomjaihoz kapcsolódik a kétértékű vas. Kettővel kovalens kötést alakít ki. Ha globin kapcsolódik hozzá, akkor létrehozzák a hemoglobint. A hem szintézisére képes minden sejt, ám nagy mennyiségben a vöröscsontvelő és a máj állítja elő. A szintézis a sejt mitokondriumában kezdődik a szukcinil-koenzim-a és a glicin kondenzációjával. Így δ-aminolevulinsav keletkezik. Ez a vegyület továbbalakul porfobilinogénné. Innentől a szintézis már a citoplazmában folytatódik. Négy molekula porfobilinogénből lineáris tetrapirrol jön létre. Enzimek segítségével záródik a molekula, és oxidációkkal protoporfirin keletkezik. Ebbe enzim építi be a kétértékű vasiont. Ez a zárólépés ismét a mitokondriumokban játszódik le. 21
10. ábra: A hem szerkezete Oxi- és deoxi-hemoglobin A vérben kétféle hemoglobint különböztethetünk meg. Azt amelyik oxigént szállít és amelyik már leadta a sejteknek oxigénjét. Az oxigént szállító hemoglobin élénkpiros színű, és az artériákban található. A tüdőben veszi fel az oxigént és ott adja le, ahol a sejteknek szükségük van rá. Ekkor deoxi-hemoglobinné válik. Ez sötét vörös színű, és a vénákban található. Újra a tüdőbe jutva, felveszi az oxigént és oxi-hemoglobinná alakul. 11. ábra: Oxigén felhasználás; Az oxi-hemoglobin szerkezete A hemoglobinszint meghatározása A hemoglobin koncentrációjának kimutatására ciánmethemoglobinos eljárást alkalmaznak. A módszer alapelve, hogy a kálium-ferricianid oxidálja a hemoglobint hemiglobinné, ami a kálium-cianiddal hemiglobin-cianidot alkot. A keletkezett szín intenzitását fotometriásan mérik 546 nm-es hullámhosszon. Ezt az értéket hasonlítják egy ismert koncentrációjú standardhoz viszonyítva. 22
Ma a hemoglobin koncentráció meghatározása automata sejtszámlálókban történik. Először a gép elvégzi a hemolízist a megfelelő reagenssel, amely feoldja a vörösvértesteket. Így felszabadul a hemoglobin, melynek mérése ciánmethemoglobinos eljárással történik a fent leírt módon. 4. kép: Sejtszámláló berendezés CELL DYN 1700 Miért is fontosak ezek a mérések? Milyen betegségek előzhetőek meg, és ismerhetőek fel időben a vizsgálatokkal? A vér vizsgálatának fontossága sokak számára még nem eléggé jelentős. Sok ember hiszi azt, hogy csak a különféle bakteriális és vírusos fertőzések, a koleszterin, a vércukor és a vérszegénység kimutatására alkalmas. Pedig ezekkel az anlízesekkel több betegség megelőzhető, idejében felismerhető, diagnosztizálható és az alkalmazott terápia hatékonysága is követhető. Nemcsak az káros szervezetünkre, ha egyes anyagok szintje túl magas, hanem az is, ha túl alacsony. A következő táblázatban bemutatom, hogy az általam mért paraméterek alacsony vagy magas szintje mely betegségekre utal. Illetve mellékletként csatolok egy-egy vizsgálati eredményt a referencia tertományban, az alatt és az felett minden általam vizsgált paraméternél. 23
Vizsgált anyagok, vegyületek Nátrium Kálium Klór Glükóz Koleszterin Hemoglobin Csökkent szint hyponartaemia: acidosis, Addison-kór, hypothermia, pneumonia, májcyrrosis, stb. hypokalaemia: bélelzáródás, Cushingsyndroma, ACTH-adagolás, hyperthyreosis, stb. hypochloraemia: hányás, izzadás sóbevitel nélkül, diabeteses ketosis, hypothermia, pneumonia, stb. hypoglykaemia: szigetsejttumorok, insulin túladagolás, Dumpingsyndroma, Addison-kór, stb. hypocholesterinaemia: máj-cyrrhosis, máj-necrosis, súlyos sepsis, Kwashior-kór, anaemiák, stb. polyglobulia, polycythaemia, hypophysis hyperfunctio, stb. Referencia tartomány(mmol/l) 135-147 3,5-5,2 98-108 3,9-6,1 3,33-5,20 8,7-11,2 (ffi) 7,5-10,0 (nő)* Emelkedett szint hypernatraemia: dehidratáció, cardinális v. renalis oedema,, stb. hyperkalaemia: haemolysis, anuria, Crush-syndroma, Addison-kór, diabeteses ketosis, stb. hyperchloraemia: dehidratáció, hypothalamus sérülés, hypochloraemiás acidosis, stb. hyperglykaemia: Cushingsyndroma, gigantizmus, acromegalia, pancreatitis, B 1 - vitamin hiány, shock, égések, stb. hypercholesterinaemia: hepatitisek, epeút elzáródás, nephritis, pancreatitis után, insulin hiány, stb. az anaemiák minden fajtája *A hemoglobint általában g/l-ben szokás feltüntetni. A táblázatban mmol/l-ben van. A mellékelt eredmények viszont g/l-ben. A referencia tartománya tehát: 130-170 g/l (ffi), 120-160 g/l (nő). 24
Felhasznált irodalom: 1. Božidar Štraus: Medicinska biokemija, JUMENA, Zagreb, 1988. 2. P. Karlson: Biokémia, Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1972. 3. Elődi Pál: Biokémia, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1981. 4. Goreneczky László-Sós József: Klinikai kémiai-laboratóriumi zsebkönyv, Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1976. 5. Dr. Györe Ágnes: Biokémia, Magyar Testnevelési Egyetem, Budapest, 1992. 6. Dr. Hiller-Kolarov Valéria-Wéber Zita: Biokémia II., Atlantis, Újvidék, 2000. 7. Fazekas György-Szerényi Tibor: Biológia I. molekulák, élőlények, életműködések, SCOLAR Kiadó, Budapest, 2002. 8. Gál Béla: Biológia 11. A sejt és az ember bilógiája, MOZAIK Kiadó, Szeged, 2004. 9. Vojislav Petrović-Mira Pašić-Ljubinka Ćulafić-Gordana Cvijić: Biológia a gimnáziumok III. osztálya számára, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Belgrád, 1998. 25