A nikotinos acetilkolin és a kannabinoid receptorok szerepe a neurotranszmitter-felszabadulás szabályozásában a központi idegrendszerben

A nikotinos acetilkolin és a kannabinoid receptorok szerepe a neurotranszmitter-felszabadulás szabályozásában a központi idegrendszerben Ph.D. értekezés tézisei Kõfalvi Attila Témavezeto: Dr. Sperlágh Beáta Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Molekuláris Farmakológiai Laboratórium és Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 2003 Budapest 1

BEVEZETÉS A nikotin és a? 9 -THC a legszélesebb körben használt drogok. Segítségükkel fedeztünk fel két alapveto szignalizációs családot: a nikotinerg és a kannabinerg rendszert. A kannabinoid rendszer osi és alapveto fontosságú szabályozó rendszert alkot a biokémiai, genetikai, élettani, és kórélettani folyamatokban. A kannabinoidoknak három megklónozott receptora van: a gátló metabotróp CB 1 és a CB 2 kannabinoid receptor, illetve a serkento ionotróp VR 1 vanilloid receptor. Eme receptorok közül csak a CB 1 expressziója bizonyított az idegsejteken. Mások farmakológiai vizsgálatai feltárták azonban, hogy két további perifériás receptor is létezik (az ún abnormális-kannabidiol és a CB 2 -szeru receptor), és lehet, számolnunk kell az agyban egy új centrális receptorral, a CB 3 -mal is. A CB 1 receptor denzitása az agyban néhol eléri az ionotróp glutamát receptorokét. A receptorok endogén agonistái (az ún endokannabinoidok) telítetlen zsírsavak, vagy azok éter, észter és amid származékai, és általában arachidonsav-származékok. Ilyen például az anandamid, a 2-arachidonoil-glicerol vagy a noladinéter sok más mellett. A kannabinoidokkal szemben a nikotinos acetilkolin (nach) receptorok gyors, serkento ionáramokkal operálnak. A nyolcféle a (2-7, 9, 10) illetve háromféle ß (2-4) alegységbol számos kombinációban állhat össze funkcionális homo- és heteropentamer. Mindegyik fajtának endogén ligandja az acetilkolin, némelyiknek az az Alzheimer-kórban kulcsszerepet játszó toxikus protein, az Aß 42 is, illetve az a7 homopentamer számára a kolin is. A rágcsálók központi idegrendszerében a legnagyobb mennyiségben kimutatható alegység az a7, ami után a ß2, az a4 és az a3 következik. Számos agonista és antagonista használatával lehet egy nikotinos receptort farmakológiailag megbízhatóan azonosítani. Azonban ha a kolin és a nikotin is teljes agonistaként, emellett nanomoláris a-bungarotoxin (a-btx) és metilakonitin (MLA) antagonistaként viselkedik, a7 homopentamerként azonosítjuk a receptort. Sajnos, a centrális nach receptorok szerepe tisztázatlan a normál fiziológiás muködésben, csak a Renshaw-szinapszisokban és a hippokampusz egyes területein bizonyították a nikotinerg szinaptikus áramok létét. A hippokampusz idegsejtjei rendkívül érzékenyek a nach receptorok agonistáira. Az eddig bizonyított nach típusok, melyek depolarizálhatják a GABA-erg interneuronokat és részt vesznek a szinaptikus plaszticitás szabályozásában az a7 és az a4ß2. A glutamáterg sejtek a dús kolinerg beidegzés ellenére ritkán válaszolnak a nikotinra is. Érdekes, hogy az a7 és NMDA receptorok koaktivációja anandamid szintézist is elindít a sejtben, míg az anandamid direkt endogén antagonistaként gátolja az a7 nach receptort. A dohányzással bevitt nikotin az Alzheimer-kór egyik bunös faktorával, az Aß 42 -vel verseng az a7-es receptorért. Az endokannabinoidok (anandamid, noladinéter) gátolják az amiloid-ß 42 peptid neurotoxikus hatását. Úgy tunik tehát, hogy a kannabinoid rendszer nem csak a fiziológiás folyamatokban vesz részt. Szerepe van a neurodegeneratív betegségek (Alzheimer-kór, Parkinson-kór, Huntington-kór, szklerózis multiplex, epilepszia) kialakulásában, illetve a fájdalomérzésben is. Neuroprotekív hatásuk egy újabb ok, amiért az érdeklodés középpontjába kerültek. Valószínu, hogy a különféle drogaddikciók (beleértve a nikotint és az etanolt) foként a ventrális 2

tegmentális áreában (VTA) és a nucleus accumbens GABA-erg, kolinerg, dopaminerg, kannabinerg, glutamáterg rendszerén konvergálnak. A kokain, a nikotin és az etanol akutan jelentos változást okoz eme agyterületek endokannabinoid szintjében, és a CB 1 génkiütött egérben nem váltható ki etanoladdikció, nem alakul ki a nikotinra pszichológiai dependencia, a nikotin jutalmazó hatása. A CB 1 receptor antagonista SR141716A dózisfüggoen gátolja a nikotinfüggést. Az exogén kannabinoidok fogyasztása szembetuno motoros és kognitív zavarokat okoz, azaz a striátum és a hippokampusz muködését is befolyásolják e molekulá k. Az is látszik, hogy a hippokampuszt és a striátumot éro akut és krónikus, sejtelhalással járó betegségekben a kannabinoidoknak komoly neuroprotektív, restoratív szerep juthat. Viszont munkáink kezdetén hiányzott egy részletes, minden kétséget eloszlató, komplex morfológiai-funkcionális vizsgálat, ami megismertet bennünket az eddig megklónozott egyetlen centrális kannabinoid receptor expressziójával, szerepével. Azt is tisztázni kívántuk, hogy vajon minden centrális kannabinoid hatásért a CB 1 receptor a felelos-e, avagy vannak-e ez alól kivételek is. E célból a striátum vizsgálatát is tervbe vettük, hogy tisztázzuk a szakirodalomban található inkoherens adatokat. A nikotin centrális támadáspontja közül a hippokampusz az egyik legjelentosebb terület. Elégséges mennyiségu, részletes morfológiai adat gyult össze az? 7 és az? 4?2 receptor eloszlásáról az elmúlt évtizedben, és kimutatták, hogy funkcionálnak, áramot lehet rajtuk kiváltani. Viszont egy olyan integrált rendszerben, mint a hippokampusz szelet, közvetlenül a GABA kiáramlásának mérésén keresztül nem volt kimutatható az? 7 receptor muködése. Tekintve, hogy az Alzheimer-kórban az nach receptorokat érinto jelenségek már nem csak e betegség kialakulásának és progressziójának okozatai, hanem részben okai is, érdemes lenne látni, vajon milyen szerep hárul rájuk a hippokampusz GABA-erg sejtjeinek szabályozásában. 3

CÉLKITUZÉSEK A kannabinoid receptorokkal kapcsolatos kérdések: 1. Célul tuztük ki a CB 1 -es kannabinoid receptor eloszlásának, expressziós mintázatának vizsgálatát a rágcsálók és az ember hippokampuszában, s hogy az eltéro fajokban mennyire homológ a receptor kifejezodése. 2. Az expresszió függvényében kíváncsiak voltunk arra, hogy milyen hatással bírnak a kannabinoid agonisták azon traszmitter(ek) felszabadulására, amelyeket a CB 1 receptort szintetizáló sejtek szabadítanak fel. Kíváncsiak voltunk arra is, mennyire extrapolálhatóak a patkányban kapott eredmények az emberben tapasztaltakra. 3. Választ kerestünk arra a kérdésre, hogy a kannabinoidok gátolják-e a glutamát felszabadulást, és ha igen, hogyan, ha a receptorok nem detektálhatók a glutamáterg terminálisokon. 4. Tisztázni kívántuk, hogy in vitro milyen irányban modulálják a kannabinoidok a dopamin, a GABA és a glutamát felszabadulását a patkány striátumában. A nikotinos receptorral kapcsolatos kérdések: 5. Tisztázni kívántuk, hogy a hippokampusz szeletben a nikotin hogyan befolyásolja a GABA felszabadulását. 6. A hatásban résztvevo receptor(ok) karakterizálását is célul tuztük ki. 7. Emellett a receptorok aktivációjától a GABA felszabadulásig vezeto mechanizmus feltárását is tervbe vettük. 4

MÓDSZEREK Valamennyi állati és emberi szövetet felhasználó kísérlet megfelelt a Kísérleti Orvostudományi Intézet és a Semmelweis Egyetem kísérleti etikai szabályzatainak. Anatómiai kísérletek Anatómiai kísérleteinket hím Wistar patkány és humán hippokampuszon végezték Prof. Freund Tamás munkacsoportjából Dr. Katona István és kollégái. A CB 1 receptor celluláris és szubcelluláris eloszlásának feltárásához egyszeres preembedding és preembedding kettos immunfestést peroxidáz reakcióval, kombinált immunarany-immunperoxidáz kettos immunfestést, és fluoreszcens kettos immunfestést alkalmaztak. Farmakológiai kísérletek A szeleten végzett [ 3 H]GABA és [ 3 H]dopamin ([ 3 H]DA) felszabadulásos kísérleteinkben 400 µm vastag hippokampusz és striátum szeleteket használtunk. A [ 3 H]glutamát méréséhez megfelelobbnek találtuk a szinaptoszóma preparátumot, ahol Ca 2+ -függo [ 3 H]glutamát-felszabadulást tudtunk beállítani, ami mentes volt a glia befolyásától, és a poliszinaptikus folyamatoktól. A szeleteket egy órán át inkubáltuk 37 ºC-on [ 3 H]GABÁ-val és ¾ órán át [ 3 H]DA-nal, ami által a tríciált transzmitter felvevodött a szinaptikus végkészülékekbe. Ennek végén a szeletek szuperfúziós kamrákba kerültek, majd 1 órán keresztül szuperfúziós rendszerben mostuk a oket 0,7 ml/perc perfúziós sebességgel. Ezek után került sor a mintavételi periódusra: 19 darab 3 perces mintát gyujtöttünk az elfolyó perfuzátumból. A 3. és a 13. mintavétel elején elektromos ingerlést alkalmaztunk a kamrában. A vizsgálandó vegyületeket vagy azok oldószereit vagy az elso (S 1 ) vagy a második elektromos ingerlés (S 2 ) elott 15 perccel adtuk a perfúziós folyadékhoz. Általában ha csak egy vegyületet adtunk S 2 elott, akkor annak a vegyületnek a transzmitter-felszabadulásra kifejtett hatását vizsgáltuk. Ez kétféle módon értékeltük: a vegyület hatása a nyugalmi és a stimulált transzmitter felszabadulásra aránypárokban kifejezve. Az antagonistákat általában S 1 elott adtuk 15 perccel (tehát már a mosási periódus 51. percétol), míg az agonistákat S 2 elott. Ezzel kivédtük azt, hogy az antagonista esetleges saját hatása keveredjen az agonista hatásával. Ennek megfeleloen antagonista kontrollokat is mértünk, amikhez statisztikailag viszonyítani lehetett az agonista hatását az antagonista jelenlétében. A nikotinos vizsgálatok során egy elektromos ingerlést választottunk (a mintavétel 36. percétol). Ezekben a kísérletekben 15 mintát gyujtöttünk. A kísérlet kiértékelése során az egyes perfuzátum minták radioaktivitás-tartalmát fejeztük ki a mintavétel idopontjában ka lkulált szöveti tartalom százalékában. Azaz egy lépcsozetes transzmitter felszabadulási görbéhez, ún. fractional release százalék diagramhoz jutottunk (FR%). A patkány és egér szinaptoszóma preparálása során egy ml tisztított P 2 szinaptoszóma frakció eloállításához 4 hím Wistar patkány hippokampuszait és striátumait, illetve 8 CD-1 egér hippokampuszait használtuk. A CD-1 egérbol generált CB 1 receptor génkiütött egeret Dr. Catherine 5

Ledent, a Brüsszeli Egyetem professzora biztosította számunkra. Az egér genotípusát konvencionális PCR technikával rendszeresen ellenoriztük. A kész preparátumot [ 3 H]glutamáttal inkubáltuk 5 percig, majd a szokásos módon a perfúziós kamrába kerültek egy-egy Whatman GF/C üvegszálas szuro közé, és 33 perc eloperfúzió után háromperces mintákat gyujtöttünk a perfuzátumból. A felszabadult és a szöveti radioaktivitás megoszlását Baranyi Mária kollégánk analizálta HPLC technikával. A felszabadult trícium túlnyomó része az adot ttranszmitterhez kötodött. Az ingerléssel kiváltott többlet transzmitter felszabadulást a görbe alatti területek számolásával határoztuk meg, így jutottunk az FRS 1 és FRS 2 százalékos értékekhez. Az adatok n? 4 identikus megfigyelés átlag ± szórás adatait tartalmazzák. Az EC 50 adatokat Prism 3.01 (Graph Pad, San Diego, CA) program segítségével kalkuláltuk. A statisztikai kiértékelést Student t-teszttel vagy ANOVÁ-val végeztük, ez utóbbi mellé a Dunnett illetve a Bonferroni poszt-tesztet alkalmaztunk szelektált csoportokra. A p < 0,05 értéket fogadtuk el szignifikánsnak. A nikotinos vizsgálatsorozatban a hippokampális interneuronokon a nikotin hatását intracelluláris kalcium méréssel vizualizálta osztályunkról Dr. Zelles Tibor. A 250?M vastag koroná lis metszeteket fura-2 acetoximetil-észterrel töltöttük fel. Egy óra állás után, mikor már megtörtént a festék deészterifikálódása, kísérleti kamrába kerültek a szeletek, és 340 ± 5 illetve 380 ± 5 nm-en történt a megvilágításuk. A szeletek által kibocsájtott fényt (510 ± 20 nm) hutött charged-coupled kamerával detektáltuk, majd megfelelo szoftverrel kiértékeltük az adatokat. 6

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS A kannabinoidok és a hippokampusz A morfológiai vizsgálatok kimutatták, hogy mind a patkány, mind az ember hippokampuszában a CB 1 receptor preszinaptikusan, a piramissejtek bemenetét szabályozó CCK-pozitív GABA-erg interneuronok axonterminálisain fejezodik, és nem kollokalizál a glutamáterg sejtekkel, vagy azok axonterminálisaival. Ezenfelül a CB 1 receptor génkiütött egerekben az antitest nem festett. Miután a morfológiai adatok erosen sugalmazták, hogy a CB 1 receptor aktiváció a GABA-erg terminálisokon okozhat gátlást, megvizsgáltuk ezt a kérdést az osztályunkon nagy hagyományokkal bíró szuperfúziós elrendezésu in vitro radioizotópos transzmitter felszabadulás méréssel. Az egyik legszélesebb körben alkalmazott kannabinoid receptor agonista, a WIN55212-2 hatását teszteltük. A patkány hippokampuszában a WIN55212-2 koncentráció-függoen (0,01 1 µm) váltott ki csökkenést az elektromos téringerléssel kiváltott [ 3 H]GABA-felszabadulásban. A legnagyobb csökkenés ~48% volt, amit 1 µm-os koncentrációjú agonista jelenlétében tapasztaltunk. A WIN55212-2 hatásának EC 50 értéke 41 nm-nak bizonyult. Felmerült a kérdés, hogy vajon a kannabinoid receptor aktivációjával kiváltott válasz közvetlen-e, vagy esetleg részben avagy egészében egy másik transzmitter közvetíti-e. Az AMPA/kainát és az NMDA típusú glutamát receptorok antagonistái, a CNQX és az AP-5 jelenlétében is ~46%-kal csökkent a WIN55212-2 hatására a GABA felszabadulás, tehát nem az excitátoros bemenetek WIN55212-2 által okozott esetleges csökkenése befolyásolta a GABA felszabadulását. Szóba jöhetett, hogy a kannabinoid agonista nem a felszabaduló transzmitter mennyiségét csökkenti, hanem elektromos téringerlés alatt esetleg a transzporter rendszer serkentésén keresztül elomozdítja a [ 3 H]GABA visszavételét, és következményesen csökkenti a nettó trícium-kiáramlást. Egy további vizsgálatban viszont kimutattuk, hogy a WIN55212-2 nem befolyásolja 1?M-os koncentrációban a [ 3 H]GABA visszavételét. A CB 1 receptorra szelektív antagonista SR141716A (1?M) felfüggesztette a WIN55212-2 hatását, tovább bizonyítva, hogy a CB 1 receptor aktiváció preszinaptikusan csökkenti a GABA felszabadulását a hippokampuszban. A WIN55212-2 a humán hippokampuszban a patkányban tapasztaltakkal megegyezoen ~49%-os gátlást váltott ki az elektromos ingerléssel kiváltott GABA felszabadulásban. Az AMPA/kainát és az NMDA típusú glutamát receptorok antagonistái, a CNQX és az AP-5 jelenlétében is ~46%-kal csökkent a WIN55212-2 hatására a GABA felszabadulás, tehát nem az excitátoros bemenetek WIN55212-2 által okozott esetleges csökkenése befolyásolta a GABA felszabadulását a humán hippokampuszban sem. 7

A CB 1 receptorra szelektív antagonista SR141716A (1?M) felfüggesztette a WIN55212-2 hatását. Mindezen eredmények arra utalnak, hogy mind expressziós mintázatában, mind funkciójában rendkívül konzervatív a CB 1 receptor még távoli rokonságú fajok közt is. Érdekes módon azonban a patkány hippokampuszából készített szinaptoszóma preparátumban négy gyakran használt agonista is szignifikánsan csökkentette a nyugalmi és a 25 mm K + -mal kiváltott [ 3 H]glutamát felszabadulást. Az agonisták hatáserosség-sorrendje a következo volt: CP55940 (EC 50 = 0,84 µm) > WIN55212-2 (3,47 µm) > ACEA (17,8 µm) R-metanandamid (19,8 µm), míg a hatékonyságuk sorrendje: WIN55212-2 (72%-os maximális gátlás) > CP55940 (40%) ACEA R- metanandamid. A kannabinoid agonisták hatását azonban két szelektív és potens CB 1 receptor antagonista alkalmazása sem védte ki. Az egyik a már említett SR141716A volt, a másik pedig az AM251. Az SR141716A-t (1-5?M) 1, 3 és 20?M WIN55212-2-vel illetve 10?M CP55940-nel szemben is alkalmaztuk, míg az AM251-et (1?M) 3 és 20?M WIN55212-2-vel szemben. A VR 1 receptor antagonista kapszazepin (10-30?M) sem függesztette fel a WIN55212-2 (3 és 20?M) hatását. Mindez arra utal, hogy CB 1 és VR 1 receptortól független hatásokkal állunk szemben, mikor a kannabinoidok glutamáterg terminálisokra kifejtett hatását értékeljük. Hogy ezt egy további lépéssel alátámasszuk, CB 1 receptor génkiütött vagy a már meghonosodott angol kifejezéssel élve homozigóta CB 1 knockout egértörzsön, illetve annak vad típusán folytattuk a vizsgálatokat. A CB 1 receptor agonista WIN55212-2 (20 µm) mindkét egértípusban egyforma mértékben csökkentette a stimulált (~54% gátlás a vad típusban, ~55% a génkiütött egérben) és a nyugalmi [ 3 H]glutamát felszabadulást. A kannabinoidok és a striátum Eredményeink tanúsága szerint a WIN55212-2 (0,3-10 µm) és a CP55940 (0,3-10 µm) sem a nyugalmi, sem az elektromos ingerléssel kiváltott [ 3 H]DA-felszabadulást nem befolyásolta szignifikánsan a patkány striátum szeletekben. Egy régebbi tanulmányban kimutatták, hogy a dopamin D 2 és a CB 1 receptorok kollokalizálnak, és funkcionális egységet alkotnak a striátumban. Ha csupán dopaminerg vagy kannabinerg agonista aktiválja a receptort, a camp termelodés csökkenése az eredmény. Viszont ha mindkét receptor agonistái egyszerre vannak jelen, a camp szint emelkedésnek indul. Úgy gondoltuk tehát, hogy ez a folyamat elmaszkírozhat egy esetleges CB 1 receptor aktivációt. Ám a D 2 antagonista sulpiride (1 µm) jelenlétében sem befolyásolta a WIN55212-2 a [ 3 H]DA-felszabadulást. Ezen túlmenoen az ionotróp GABA és glutamát receptorok gátlószereinek jelenlétében is teszteltük a WIN55212-2-t, hogy kiszurjük a poliszinaptikus folyamatok esetleges változásának hatását, de ez esetben sem láttunk választ a kannabinoid agonista jelenlétében. Kipróbáltuk a WIN55212-2-t (1 µm) más ingerlési paramétereken és más oldószerekkel, de továbbra sem kaptunk választ az agonistára. Jelen helyzetben tehát nem tudjuk alátámasztani azt, hogy a 8

kannabinoidok közvetlenül befolyásolnák a striatális dopamin felszabadulást. A dopaminnal ellentétben a WIN55212-2 (1 µm) ~32%-os csökkenést okozott az elektromos téringerléssel kiváltott [ 3 H]GABA-felszabadulásban. Az AM251 (1 µm), a CB 1 receptor szelektív antagonistája kivédte a WIN55212-2 hatását, azaz a folyamat feltehetoleg CB 1 receptorok aktiválásán keresztül zajlott. Az AMPA/kainát és az NMDA típusú glutamát receptorok antagonistáinak gátlása ellenére is ~32%- kal csökkentette a stimulált [ 3 H]GABA-felszabadulást a WIN55212-2 (1 µm). Azaz a CB 1 receptor aktivációja feltehetoleg preszinaptikusan érintette a GABA felszabadulását. A fentiek után már nem meglepo, hogy a patkány striátumából készített szinaptoszóma preparátumban a gyakran használt kannabinoid agonisták közül a CP55940 (EC 50 = 0,58 µm) és a WIN55212-2 (3,38 µm) is szignifikánsan csökkentette a 25 mm K + -mal kiváltott [ 3 H]glutamát felszabadulást. Az agonisták hatékonysága és hatáserossége hasonló volt a hippokampuszban tapasztaltakhoz, bár a WIN55212-2 a maximális hatást már 6?M-ban kiváltotta. A nikotinos acetilkolin receptorok és a hippokampusz interneuronjai A nikotinnak (illetve a többi agonistának) a mintavétel hatodik percében alkalmazott perfúziója nem váltott ki extra [ 3 H]GABA-felszabadulást, feltehetõleg mert a receptor nem preszinaptikus, hanem szomatodendritikus elhelyezkedésû. Ugyanakkor a nikotin perfúziója és kimosása után az elektromos ingerlésben jelentõs emelkedés volt tapasztalható a nikotin koncentrációjától, és a nikotinos illetve az elektromos ingerlés közt eltelt idõtõl függõen. Az elektromos ingerlést az agonistás stimuláció után 15 perccel hajtottuk végre a továbbiakban. A nikotin (EC 50 = 4,1 µm, maximális serkentés: 440%) és a többi vizsgált nachr agonista, azaz az acetilkolin (EC 50 = 147 µm), és a kolin (EC 50 = 352 µm) koncentráció-függoen serkentette az ingerléssel kiváltott GABA felszabadulást. A DMPP-nek nem volt hatása. Ennek megfeleloen az agonisták hatáserosség-sorrendje a következo: nikotin > acetilkolin > kolin, míg a hatékonyságuk sorrendje: nikotin = kolin = acetilkolin >> DMPP. A nikotin (100 µm) hatásának idofüggését lineáris összefüggésként leírva 31,5 percnek adódott a folyamat féléletideje. A nach receptorok néhány antagonistájának jelenlétében is kipróbáltuk a nikotin (100 µm) hatását. A hippokampuszban az a7 receptort gátló metilakonitin (MLA, 10 nm) és az a-bungarotoxin (a-btx, 100 nm) is kivédte a nikotinos stimulációt, de a másik gyakori receptor, az a4ß2 sze lektív antagonistája, a DHßE nanomoláris tartományban nem gátolta a nikotin hatását. Mindezen eredmények meggyozoek abból a szempontból, hogy az a7 alegységet tartalmazó nach receptorok aktivációja vezetett el az elektromos ingerléssel kiváltott [ 3 H]GABA-felszabadulás fokozódásához. Az extracelluláris Ca 2+ -mentes környezetben történo nikotinos stimuláció nem volt hatással a 9

késobbi, normál perfúziós oldatban történo elektromos ingerlésre. Ez azt jelzi, hogy külso Ca 2+ - beáramlás szükséges a nikotin hatásának megjelenéséhez az elso lépésben, ahogy az elvárható egy nach receptor aktivációjakor. A Ca 2+ -függés további vizsgálatához intracelluláris Ca 2+ -szint méréshez folyamodtunk. A stratum radiatum és a stratum lacunosum moleculare alrégiókban az interneuronok 35%-a reagált nikotinra (100?M). Az á7-szeletív antagonista MLA (10 nm) jelenlétében viszont 13 vizsgált sejtbõl csak kettõ reagált a nikotinra. A feszültségfüggo Na + -csatornák gátlószere, a tetrodotoxin (TTX, 1 µm) jelenlétében történt nikotinos stimuláció hatása elmaradt. Ha a TTX-et csak az elektromos ingerlés alatt adtuk, akkor is elmaradt a nikotinos elokezelés hatása. Ez nem jelenthet mást, minthogy 1) az a7 receptor aktivációja a terminálisba terjedo akciós potenciált váltott ki; és 2) a feszültségfüggo Na + -csatornák aktivációja, azaz Na + -beáramlás is kellett ahhoz a folyamathoz, ami a többlet [ 3 H]GABA felszabadulást reprezentálta az elektromos ingerlés alatt, nikotinos kezelés után. Ez utóbbi megfigyelés azért fontos, mert az elektromos ingerlés alatti Na + -beáramlás a GABA transzporter megfordulását is eredményezheti. A transzporteren keresztüli [ 3 H]GABA felszabadulás differenciált gátlására vagy modulálására számos lehetoség ismert. Ezen lehetoségek közül mind a szerfürdo homérsékletének 12-17 o C-ra való csökkentése, mind a GAT-1 transzportgátló (-)- nipekotinsav (1 mm) kivédte a nikotinos elokezelés hatását. MEGBESZÉLÉS A kannabinoid receptorokkal kapcsolatos válaszok: 1. A CB 1 kannabinoid receptor konzervatív módon fejezodik ki mind a rágcsálók, mind az ember hippokampuszában. A receptor minden esetben preszinaptikusan, a CCK-pozitív interneuronok axonterminálisain volt megtalálható. 2. A kannabinoid agonisták koncentráció-függo módon a patkányban és a humán hippokampuszban is azonos mértékben csökkentették stimulált GABA felszabadulást. A gátlást preszinaptikus CB 1 kannabinoid receptorok közvetítik, és a kannabinoid hatás fennmaradt a glutamát receptorok antagonistáinak jelenlétében is. 3. A hippokampuszban a nagy koncentrációjú kannabinoid ligandok csökkentik a nyugalmi és stimulált glutamát felszabadulást, amit a szelektív CB 1 receptor antagonisták nem védenek ki. A hatás fennáll CB 1 receptor-génkiütött egérben is. Tehát a kannabinoidok gátló hatása a glutamát felszabadulásra nem a CB 1 receptorok aktiválásán nyugszik. 4. A kannabinoid agonisták csökkentik az ingerléssel kiváltott GABA felszabadulást CB 1 kannabinoid receptorok közvetítésével a patkány striátum szelet preparátumában, ugyanakkor nem befolyásolják a 10

dopamin kiáramlását. Csökkentik a nyugalmi és stimulált glutamát felszabadulást is, ez azonban szintén nem a CB 1 receptorok aktiválásán nyugszik, ahogy a hippokampuszban sem. Azaz, a kannabinoidok által okozott motoros diszfunkciók elsosorban a GABA és glutamát modulálásán nyugszanak, és nem a dopamin szintjének szabályozásán. A nikotinos receptorokkal kapcsolatos válaszok : 5. A nikotin és más nach receptor agonisták nem váltanak ki GABA felszabadulást a hippokampusz szeletbol, de koncentráció-függo módon, hosszantartóan fokozzák a stimulált GABA felszabadulást. Tudomásunk szerint ez az elso olyan megfigyelés, ami egy ionotróp nach receptor aktiválásához hosszú ideju intracelluláris transzformációt társít. 6. A folyamatban részt vevo legvalószínubb nach receptor az? 7-es homopentamer. 7. A mechanizmus Ca 2+ -beáramlást igényel, amit a feszültségfüggo Na + -csatornák aktivációja követ. Az elektromos ingerlés során többlet GABA-kiáramlás a transzporterek megfordulása révén zajlik. Azaz, a nikotinos elokezelés a késobbiekben esetleg aktiválódó interneuron számára a fokozott posztszinaptikus gátlás lehetoségét hordozza a transzporterek érzékenyítése által. 11

ÖSSZEFOGLALÁS A hippokampusz az ot alkotó sejtek sokféleségével egy sérülékeny és rendkívül összetett rendszert alkot. Az interneuronok kontrollálják a bemeneti és kimeneti rendszerét, a viselkedésfüggo elektromos aktivitást, részt vesznek a szinaptikus plaszticitásban, és elengedhetetlen a szerepük a rövidtávú memória kialakulásában. Sérülékenységébol adódóan azonban számos alattomos betegség támadáspontja. A CB 1 kannabinoid és az a7 nikotinos acetilkolin receptorok két eltéro receptor nagycsaládba tartoznak. Aktivációja ellentétes intracelluláris hatást eredményez. Talán ezért van az, hogy a marihuana illetve a nikotin miért ellentétes hatású a kognitív funkciókra. Ráadásul a saját és mások morfológiai tanulmányait összevetve úgy tunik, hogy e két receptor expressziója átfedést mutat, a CCK-pozitív interneuronokra jellemzoek a hippokampuszban. A fentiekbol az is kiderül, hogy a két receptor a neurodegeneratív betegségek kialakulásában is részt vesz. Emellett egy közös jellemzojük az aktivációjukkal járó neuroprotektív hatás, melynek hátterében bizonyíthatóan a CB 1 és az a7 nach receptorok állnak, bár más receptorok (CB 3?) szerepe is gyanítható. Eredményeink tükrében a CB 1 receptorok is, és a glutamáterg terminálisokat szabályozó kannabinoid receptorok is konzervatívan viselkednek, de nem egyeznek meg egymással. 12

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A hagyományokhoz híven itt szeretném hálámat kifejezni témavezetomnek és tanítómesteremnek, Sperlágh Beátának, aki türelemmel és szakértelemmel vezetett át a tudomány útvesztojén, hogy elkerüljem a kínálkozó csapdákat. Köszönöm figyelmét, tanácsait, támogatását, ami elengedhetetlen volt a felelosségteljes munkában történo helytálláshoz. Vizi E. Szilveszter akadémikus, Elnök Úr iskolát teremtett, ahol a fiatalok nem csupán megszeretik a tudományt, de értoi lesznek annak. Köszönettel tartozom Vizi E. Szilveszternek a bizalmáért, támogatásáért, a lehetoségért, hogy részt vehettem az intézet nagy hagyományokkal bíró farmakológiai osztályának munkályában. Köszönet illeti laborunk munkatársainak, névsorrendben Baranyi Marinak, Kittel Áginak, Korössy Zsuzsinak, Papp Lillának és Szénássy Évinek társaságát, segítségét, szeretetét, támogatását, ami nélkülözhetetlen volt a munkám létrejöttében. Nem feledkezem meg az osztályon dolgozó többi kollégáimmal eltöltött kellemes pillanatokról sem. Zsilla Gabinak köszönöm a szinaptoszómás kísérletekhez nyújtott önzetlen segítségét. Zelles Tibornak és Sántha Ernonek köszönöm a közös munkát. Köszönettel tartozom intézetünk igazgatójának, Freund Tamás akadémikusnak, illetve munkatársainak: Hájos Norbertnek és Katona Istvánnak az önzetlen, konstruktív segítségéért. Az o szaktudásuk kiszélesítette a látóköröm a kutatásaim területén. S végül, de nem utolsó sorban hálával tartozom szeretteimnek, akik megértették, hogy nem munkába járok a KOKI-ba, hanem ez egy hivatás, életpálya, s ennek megfelelo környezetet biztosítottak számomra. 13

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁVAL ÖSSZEFÜGGO KÖZLEMÉNYEK 1. Katona I, Sperlágh B, Sík A, Köfalvi A, Vizi ES, Mackie K, Freund TF (1999) Presynaptically Located CB 1 Cannabinoid Receptors Regulate GABA Release from Axon Terminals of Specific Hippocampal Interneurons. J Neurosci 19:4544-4558 2. Katona I, Sperlágh B, Maglóczky Z, Sántha E, Köfalvi A, Czirják S, Mackie K, Vizi ES, Freund TF (2000) GABAergic interneurons are the targets of cannabinoid actions in the human hippocampus. Neuroscience 100:797-804 3. Köfalvi A, Sperlágh B, Zelles T, Vizi ES (2000) Long-lasting facilitation of 4-amino-n-[2,3-3 H]butyric acid ([ 3 H]GABA) release from rat hippocampal slices by nicotinic receptor activation. J Pharm Exp Ther 295:453-462 4. Köfalvi A, Vizi ES, Ledent C, Sperlágh B (2003) Cannabinoids inhibit the release of [ 3 H]glutamate from rodent hippocampal synaptosomes via a novel CB 1 receptor-independent action. Eur J Neurosci 18:1973-1978 AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK 5. Sumiya Y, Torigoe K, Gerevich Z, Köfalvi A, Vizi ES (2001) Excessive release of [ 3 H]noradrenaline by veratridine in spinal cord. Neurochem Int 39:59-63 6. Sperlágh B, Illés P, Gerevich Z, Köfalvi A (2001) Distinct Mechanisms Underlying a1- Adrenoceptor and P2x Purinoceptor Operated ATP Release and Contraction in the Guinea-Pig Vas Deferens. Neurochem Res 26:951-957 7. Sperlágh B, Köfalvi A, Deuchars J, Atkinson L, Milligan C, Buckley NJ, Vizi ES (2002) Involvement of P2X 7 receptors in the regulation of neurotransmitter release in the rat hippocampus. J Neurochem 81:1196-1211 8. Papp L, Balázsa T, Köfalvi A, Erdélyi F, Szabó G, Vizi ES, Sperlágh B (2004) P2X receptormediated modulation of noradrenaline release from rat hippocampal slices J Pharm Exp Ther (közlésre benyújtva) *Az értekezés témájával összefüggo közlemények 14