Tudományos Diákköri Dolgozat PRIBRANSKÁ KINGA Tuberkulózis elleni hatóanyag és hatóanyag-konjugátum nanokapszulázása Témavezető: Dr. Kiss Éva ELTE Kémiai Intézet, Fizikai Kémiai Tanszék Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriuma Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2010
Köszönetnyilvánítás Dolgozatomat az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriumában készítettem. Elsőként Dr. Gilányi Tibor tanár úrnak szeretnék köszönetet mondani, hogy munkámat lehetővé tette a laboratóriumban, hogy megismertetett a fényszórás méréssel, és segítette az eredmények értelmezését. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Kiss Évának áldozatos munkájáért, hogy bármikor fordulhattam hozzá kérdéseimmel, és tanácsaival fáradhatatlanul segítette munkámat. Köszönöm továbbá az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratórium dolgozóinak, Pénzes Csanád Botondnak az AFM méréseket, és Hórvölgyi Zoltánné Pető Idának a sok segítséget, amit munkám során nyújtott. Köszönöm az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport tagjainak a munkámhoz nyújtott segítséget, különösen Dr. Bősze Szilviának és Dr. Horváti Katának, hogy az új hatóanyag konjugátumot rendelkezésemre bocsátották. Köszönöm Bendő Zsoltnak az elektronmikroszkópos felvételeket, melyek az ELTE Földtudományi Központ SEM Laboratóriumában készültek. - 2 -
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés... 4 2. Irodalmi áttekintés... 6 3. Célkitűzés.....10 4. Kísérleti rész... 11 4.1. Felhasznált anyagok... 11 4.2. A hatóanyag polaritása... 12 4.3. Mintakészítés... 13 4.4. Vizsgálati módszerek... 16 4.4.1. Dinamikus fényszóródás mérés... 16 4.4.2. Pásztázó elektronmikroszkópia... 17 4.4.3. Atomi erő mikroszkópia... 17 4.4.4. Stabilitásvizsgálat és rediszpergálhatóság... 19 4.4.5. Hatóanyagtartalom és kapszulázási hatékonyság... 19 5. Eredmények és értékelésük... 20 5.1. Fényszóródás mérés, részecskeméret-meghatározás... 20 5.2. Pásztázó elektronmikroszkópia... 21 5.3. Atomi erő mikroszkópia... 22 5.4. Stabilitásvizsgálat és rediszpergálhatóság... 23 5.5. Hatóanyagtartalom és kapszulázási hatékonyság... 24 6. Összefoglalás... 27 7. Irodalomjegyzék... 29-3 -
1. Bevezetés A hagyományos gyógyszerek alkalmazásánál felmerülő leggyakoribb probléma, hogy a hatóanyagok nem a rendeltetési helyükön fejtik ki hatásukat. A mai napig a legtöbb gyógyszer irányított célba juttatása nem megoldott, így azokat a kívánatosnál jóval nagyobb mennyiségben kell adagolni, hogy a testben szétterülve a célszervben is a megfelelő koncentrációban legyenek jelen. Szükségessé vált ezért, a gyógyszerkutatásban új irányzatok megjelenése, mert a hagyományos gyógyszerek több kórkép, elsősorban daganatos megbetegedések esetében alkalmatlannak bizonyultak, és rengeteg toxikus mellékhatással jártak [1]. Az utóbbi időkben ezért, az új hatóanyagok kifejlesztése mellett egyre több kutatás irányul a szövetbarát, biokompatibilis, ellenőrzött hatóanyag-leadási rendszerek kifejlesztésére [2]. Többek között a nanotechnológia fejlődése is lehetővé tette az új anyagok megjelenését a gyógyszerszállításban. Ezek a hordozók kolloid részecskék, nagyságuk a nanométeres mérettartományba esik, szerkezetileg makromolekulákból, szervetlen anyagokból és a bennük vagy a felületükön adszorbeált hatóanyagból állnak [3]. A leggyakrabban használt makromolekulák a biológiailag könnyen lebomló polimerek [3]. Ezek közül is a politejsav (PLA), a glikolsav (PGA) és a tejsav/glikolsav kopolimer (PLGA) került a figyelem középpontjába, mivel sok előnyös tulajdonságuk van: nem mérgezőek, biokompatibilisek [4], valamint bomlásuk során tejsav és glikolsav képződik, melyek a szervezetben is megtalálható, nem toxikus anyagok. Sikeresen felhasználhatóak gyulladásgátló hatóanyagok, peptidek, hormonok szállítására [4]. Alkalmazásuk esetén a hatóanyag nagyobb koncentrációban juthat el a célsejtekhez, így ezen anyagok használata csökkenti a szabad hatóanyaggal történő kezeléseknél tapasztalt mellékhatásokat [1]. Az e fajta kolloidális polimer gyógyszerhordozók előállítása többféleképpen történhet, a legelterjedtebbek az emulziós eljárások, de egyre szélesebb körben használnak más, újfajta technikákat, mint a nanoprecipitációs (nanolecsapási), kisózásos vagy permetszárításos módszerek. Dolgozatom témája a nanoprecipitációs eljárás bemutatása, és az így készült gyógyszerhordozó vizsgálata. A nanoprecipitáció egy könnyen kivitelezhető és jól reprodukálható módszer politejsav alapú nanorészecskék előállítására. A technikával elkerülhető a toxikus oldószerek - 4 -
alkalmazása, lehetséges nagyon pontos részecskeméret elérése, és nem igényel nagyobb, külső energiabefektetést [4]. A keletkező nanorészecskékhez megfelelő polaritású hatóanyag adszorbeáltatható, más szóval nanokapszuláztatható, ennek mértékéről az előállított kolloidális gyógyszerhordozó hatóanyagtartalma és a kapszulázási hatékonysága szolgál információval. - 5 -
1. Irodalmi áttekintés A tuberkolózis a Mycobacterium tuberculosis okozta fertőzés eredményeképp kialakuló kórkép, amely évente 1,9 millió halálos áldozatot követel az egész világon [5]. A betegséget általában négy különböző antibakteriális hatóanyaggal kezelik, közülük a leghatásosabbnak az izoniazid (izonikotinsav-hidrazid, INH) bizonyult. A legfőbb probléma a betegség kezelésénél az elhúzódó terápia (6-9 hónap) során kialakuló mellékhatások. Figyelembe véve, hogy a M. Tuberculosis képes életben maradni a vendég fagocitákban, eltávolítása sokkal hatékonyabb, ha a hatóanyag irányítottan jut a célsejtekhez. Másrészről, a hatóanyagnak különböző membránokon kell áthatolnia a megfelelő sejt eléréséig, ezért a kölcsönhatás a membránok és a hatóanyag között szintén nagyon fontos. A kolloidális hatóanyag-szállító rendszereket, mint a liposzómákat, nanorészecskéket, micellákat és konjugátumaikat széleskörűen alkalmazták az elmúlt évtizedben, mert használatukkal csökkenthetők a sejt ellenreakciói, és aktív gyógyászati ágensek juttathatók a célszövetekhez, ezzel pedig nagyobb hatásfokkal érvényesülhet a hatóanyag [6]. Ezen rendszerek alkalmazásánál fontos, hogy rendelkezzünk a megfelelő és pontos ismeretekkel a hordozó méretét, hatóanyag-tartalmát, stabilitását és felületi tulajdonságait illetően. A biodegradábilis polimerek, mint gyógyszerhordozók már régóta az szabályozott hatóanyag-leadási technológiák részét képezik [7], azon rendkívül előnyös tulajdonságuk miatt, hogy bomlásuk során a szervezetben is megtalálható, nem toxikus anyagok keletkeznek. A bejuttatott biodegradábilis és biokompatibilis polimer részecskékkel (mikrokapszulák, nanokapszulák, nanogömböcskék) megvalósítható az időben ellenőrzött hatóanyag-leadás [8,9]. A leggyakrabban használt és vizsgált biodegradábilis polimerek a politejsav (PLA), és a tejsav/glikolsav kopolimer (PLGA), melyek alkalmazását az Amerikai Élelmiszer és Gyógyszerhivatal is engedélyezte. [10]. A PLGA-alapú részecskék számos fontos előnnyel rendelkeznek a többi ellenőrzött hatóanyag-leadási rendszerrel szemben, ami a szerkezetükből és felépítésükből adódik. Biokompatibilisek, könnyen adagolhatók, valamint pontosan kontrollálható hatóanyag-leadási sebességgel rendelkeznek, ami néhány naptól akár hónapokig tartó időszakot is jelenthet [11]. - 6 -
1. ábra PLGA szerkezeti képlete A tuftsin egy természetes fagocitózis stimuláló peptid [12,13]. Az előző évtizedben az oligopeptid hordozók egy új csoportja jelent meg, melyek diszkrét molekulatömeggel és meghatározott szekvenciával rendelkeznek. A tuftsin származékok egy pentapeptid egységből állnak, melyek aminosav sorrendje: TKPKG [14,15]. Ezek az összetevők nem mérgezőek, nem váltanak ki immunreakciót, és tuftsin-szerű biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, mint például a receptorhoz való kötődés. Dolgozatomban egy tuftsin-származék INH-val alkotott konjugátumát használtam. A konjugálás célja az volt, hogy a hatóanyag jobban tudjon kötődni a membránokhoz, és a sejt a számára könnyebbé váljon a hatóanyag-felvétel [16]. 2. Ábra Az INH-konjugátum (pal-t 5 -(INH) 2 ) szerkezeti képlete A konjugátum tervezése és szintézise az MTA Peptidkémiai Kutatócsoport munkája. A molekula egy tuftsin-receptor specifikus peptid és zsírsav származékának INH konjugátuma. Az izoniaziddal először glioxilsavval származékot képeztek, majd karboxil csoportján keresztül konjugálták a peptidszármazékhoz amidkötés kialakítása mellett [16]. Az izoniazid egyike a legfontosabb tuberkulózis elleni gyógyszereknek, mind a megelőzés, mind a kezelés tekintetében. Az izoniazid hidrofil jellege miatt nehezen kapszulázható. A hidrofób jelleg növelésében sokat segít a konjugálás, vagyis a molekula kémiai kapcsolása specifikus molekulákkal, esetünkben peptidekkel és zsírsavakkal. A konjugálás célja kettős, a peptid kapcsolásával a specifikus sejtbe jutás segíthető, míg a zsírsav várhatóan a hatóanyag sejtmembránhoz való affinitását növeli. Ezzel együtt várható, hogy a hidrofób természetű PLGA gyógyszerhordozóhoz jobban tud kötődni a hatóanyagkonjugátum, ezzel együtt pedig nagyobb kapszulázási hatékonyság és hatóanyag-tartalom érhető el, mint az INH esetében. - 7 -
Számos kísérlet számol be arról, hogy a PLA és PLGA nanorészecskék jól hasznosíthatók az irányított hatóanyagleadási alkalmazásokban [17]. Az intravénásan adagolt PLA nanorészecskéket, melyek mérete 200 nm-nél kisebb, először a mononukleáris fagocita rendszer veszi fel, így gyorsan kiürülnek a véráramból, és a májban, a lépben valamint a csontvelőben koncentrálódnak. A részecskeméreten túl, a gyógyszerhordozó szervezetbeni sorsának szempontjából, a felületi tulajdonságok is meghatározóak. A poli(etilén-oxid) (PEO vagy PEG) által sztérikusan stabilizált nanorészecskék csökkentik a fehérjeadszorpciót és a májban való koncentrálódást, így a specifikus hatóanyag-szállítás jobban tud megvalósulni [18]. A hidrofil és nemionos természetű PEG felületi réteg által csökkentett fehérjeadszorpció miatt a retikulo-endotelális rendszer nem tudja eltávolítani a gyógyszerhordozót, így növekedhet a vérben való tartózkodási ideje. A PEG stabilizálószerként való alkalmazásának más fontos előnye is van: a nanoszuszpenzió előállításának és rediszpergálásának stabilizálásában is komoly szerepet játszik. Ezek a nemionos tenzidek a kereskedelemben a Pluronic márkanéven kaphatók [19,20]. HO H 2 C O C H 2 n H 2 H C C O CH 3 m H 2 C C H 2 O n H PEO PPO PEO 3. ábra A Pluronic -ok általános szerkezeti képlete Nanoprecipitációval könnyen és gyorsan lehet nanorészecskéket előállítani [21]. Az eljárás során két közeg érintkezik: egy vizes, és egy vízzel elegyedő szerves fázis, ami a polimert és a hatóanyagot tartalmazza [4]. Az eljárás oldószercsere történik, a polimer eredeti közegét elrontjuk, így lecsapással tudjuk elérni a hatóanyagot adszorbeált nanorészecskék létrejöttét. A szerves fázis elpárologtatással távolítható el. Az egyesítés után egy polimer részecskéket tartalmazó diszperziót kapunk 100-250 nm közötti részecskeátmérővel [22,23,24]. 4. ábra Nanoprecipitációval előállított PLGA nanogömböcskék [25] - 8 -
3. Célkitűzés Az izoniazid egyike a legfontosabb és legjobban elismert tuberkulózis elleni gyógyszereknek. A kezelés azonban sok mellékhatással jár, mivel nagy mennyiségben kell a hatóanyagot alkalmazni, hogy a célszervben is a megfelelő koncentrációban legyen jelen [1]. Szükséges ezért olyan gyógyszerhordozó alkalmazása, amely irányítottan, a célszervhez juttatva képes a hatóanyagot szállítani. Ezek a polimer gyógyszerhordozók erősen hidrofób jellegűek, az izoniazid viszont hidrofil természetű, ezért nélkülözhetetlen az INH konjugálása olyan molekulával, amellyel jobban tud adszorbeálódni a polimerhez. A konjugátum egy receptorhoz kötődő peptid szakaszt és egy zsírsavláncot tartalmazó molekula, amely eleget tesz ezeknek a kritériumoknak. A zsírsav-szakasz a membránokon való könnyebb átjutást is segíti. Dolgozatom egyik célja annak igazolása, hogy az izoniazid konjugálásával lehetővé válik nanokapszulázása, vagyis adszorpciója egy kolloidális gyógyszerhordozóhoz. Ezt, a polimer gyógyszerhordozók két jellemzőjével, a hatóanyagtartalommal és a kapszulázási hatékonysággal szeretném alátámasztani. A hatóanyagot tartalmazó nanorészecskéket nanoprecipitációs eljárással állítottam elő. Kutatómunkám további célja magának a nanoprecipitációnak, mint módszernek, és a lépéseinek bemutatása felhasználva az irodalomban megtalálható leírásokat, külön kiemelve a technika előnyeit és könnyű reprodukálhatóságát a többi eljáráshoz képest. Az előállított gyógyszerhordozó méretét és méreteloszlását dinamikus fényszóródás méréssel, pásztázó elektronmikrószkópos és atomi erő mikroszkópos képekkel jellemzem. Megvizsgálom a nanorészecskék rediszpergálhatóságát és stabilitásukat az idő függvényében, a hatóanyagtartalmat és a kapszulázási hatékonyságot UV-abszorpciós mérésekkel állapítom meg. - 9 -
4. Kísérleti rész 4.1. Felhasznált anyagok PLGA50/50, tejsav/glikolsav kopolimer, tejsav-glikolsav arány 1:1, M = 50 000-75 000 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Izoniazid > 99,0% tisztaságú, M = 137,14 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország pal-t 5 -(INH) 2, palmitinsav-treonin-lizin-prolin-lizin-glicin, mindkét lizinhez kapcsolódik egyegy INH molekula, M = 1120,7 g/mol, a konjugátum tervezése és szintézise az MTA Peptidkémiai Kutatócsoport munkája Pluronic 12700, M w = 12200 g/mol, poli(etilén-oxid)-poli(propilén-oxid)-poli(etilén-oxid) (PEO-PPO-PEO) blokk-kopolimer, BASF Hungaria Kft. Aceton alt., M = 58,08 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország NaOH, p.a., M = 40,00 g/mol, Chemolab Kft. Magyarország NaCl, 99,8% tisztaságú p.a., M = 58,44 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország 1-Oktanol, > 99,5% tisztaságú UV spektroszkópiához, M = 130,23 g/mol Dializáló csövek, Cellulóz észter membrán, M = 20 000 g/mol, Float-A-Lyzer, Spectra/Por Kétszer desztillált víz, γ > 71,5 mn/m - 10 -
4.2. A hatóanyag polaritása A gyógyszerek szervezetbeni sorsát (felszívódását, eloszlását, raktározódását, stb.) alapvetően meghatározó lipofilitás számszerű jellemzésére a gyógyszerkémiában az oktanol/víz rendszerre vonatkozó megoszlási hányados logaritmusa (logp) használatos. Ez az oldószer rendszer a biológiai megoszlás (extracelluláris tér/membrán vagy membrán/citoplazma) jó prediktorának bizonyult, mert a szerves fázisként szolgáló oktanol (C 8 H 17 OH) amfifil jellegénél fogva valamelyest modellezni képes a gyógyszer és a membrán lipid kettős rétegével és fehérjéivel létrejövő kölcsönhatásokat [26]. A logp érték kísérletes meghatározásának standard módszere a hagyományos vagy rázótölcséres technika. A módszer lényege, hogy két egymással nem elegyedő oldószer között, intenzív fázisérintkeztetés útján és termosztált körülmények között, a vizsgálandó anyagot megosztjuk. A megoszlási egyensúly beállta után a fázisokat szétválasztjuk és azokban a megoszlott anyag koncentrációját alkalmas kvantitatív analitikai módszerrel meghatározzuk. A fázisok érintkeztetésére különféle technikai megoldásokat dolgoztak ki. Történhet alkalmasan megtervezett, megfelelő térfogatú, csiszolt dugóval záródó üvegedényekben, amelyeket változtatható rázási amplitúdójú rázógépbe helyezünk, vagy keverőedényes eljárással, ahol a fázisérintkeztetést megfelelő sebességű felső keverő biztosítja [26]. Vizsgálatunk célja, hogy számszerű adattal rendelkezzünk arról, hogy a pal-t 5 -(INH) 2 valóban hidrofóbabb-e, mint az INH, és milyen mértékben. Az eljárás első lépése a két fázis telítése volt. Ehhez csavaros üvegedényekbe öntöttünk azonos mennyiségű desztillált vizet és oktanolt, majd meghatározott ideig rázattuk őket. A telítés után szétválasztottuk a fázisokat. Ezután a vizes fázisban feloldottunk 0,1 g/dm 3 pal-t 5 -(INH) 2 -t, újraegyesítettük a fázisokat, és egy órán keresztül rázattuk őket. Az egy óra letelte után szétválasztottuk a fázisokat, és spektrofotometriásan megmértük a vizes fázis pal-t 5 -(INH) 2 koncentrációját. Három párhuzamos mérést végeztünk. Az irodalom szerint a logp megállapításához elegendő csak a vizes fázisban feloldani a hatóanyagot, a mérés pontossága miatt azonban végeztünk olyan mérést is, ahol a telítés után az oktanolban oldottuk fel a pal-t 5 -(INH) 2 -t, és rázatás után megmértük ennek a fázisnak is a koncentrációját. Szintén három párhuzamos mérést végeztünk. A 1. táblázat tartalmazza a mért értékeket. - 11 -
logp (INH) -1,12 [27] logp (pal-t 5 -(INH) 2 ) -0,198 1. táblázat logp értékek INH-ra és INH-konjugátumra Az INH és a pal-t 5 -(INH) 2 megoszlási hányadosa között egy nagyságrend a különbség, a hidrofóbicitás növekedett, az oktanol/víz megoszlási hányados kb. nyolcszor lett nagyobb a konjugálás következtében. A növekedés miatt a pal-t 5 -(INH) 2 nanokapszulázása előreláthatólag nagyobb hatásfokkal valósulhat meg. 4.3. Mintakészítés Nanolecsapás során két közeg érintkezik egymással, egy vizes és egy szerves fázis. A vizes fázisban kerül feloldásra a felületaktív anyag, a szerves fázisban pedig a polimer és a hatóanyag. Felületaktív anyagként a már említett Pluronic 12700-at használtuk, ezt oldottuk fel desztillált vízben (2. táblázat). Vizes fázis c (Pluronic 12700) / g/dm 3 V (deszt.víz) 1 10 ml 2 16 ml 2. táblázat Pluronic 12700 koncentrációi a vizes fázisban A szerves fázisban oldottuk fel a polimert és a hatóanyagot, ami minden esetben a PLGA50/50 és a pal-t 5 -(INH) 2 volt. A kísérletek kezdetén több oldószert, oldószerelegyet is kipróbáltunk, és a kapott gyógyszerhordozó mérete alapján az acetont találtuk ideális közegnek. A szerves fázis térfogata a kezdeti, kis hatóanyag-beméréses kísérleteknél 5 ml volt, később azonban csökkentettük a szerves fázis térfogatát, mivel megfigyeltük, hogy a vizes/szerves fázisarány növelésével nagyobb kapszulázási értékeket érhetünk el. - 12 -
m (PLGA50/50) m (pal-t -(INH) ) Szerves fázis V(aceton) c (PLGA50/50)/ g/dm 3 5 2 5 ml 10 50 mg 2,06 mg 3,5 ml 10 35 mg 2,11 mg 3,5 ml 10 35 mg 3,95 mg 3,5 ml 10 35 mg 7,57 mg 3,5 ml 10 35 mg 12,44 mg 3,5 ml 10 35 mg 24,92 mg 3. táblázat Az INH-konjugátum és a PLGA50/50 koncentrációi a szerves fázisban A táblázat utolsó öt adata egy olyan sorozat részét képezi, amelyekben fokozatosan növeltük a hatóanyag tömegét. Ezzel arra szerettünk volna választ kapni, hogy a különböző pal-t 5 -(INH) 2 bemérésekkel mennyiben tudjuk befolyásolni a kapszulázás mértékét. Miután mindkét fázisban megtörtént a feloldódás, a két közeget egyesítettük. A Pluronic 12700-at tartalmazó vizes fázist 50 ml-es Erlenmeyer lombikba öntöttük, majd folyamatos keverés mellett fecskendővel cseppenként adagoltuk hozzá a hatóanyagot és a PLGA50/50-et tartalmazó acetonos fázist. A csepegtetés befejezése után még további 30 percig kevertettük az elegyet. 5. ábra A nanolecsapás sematikus rajza [28] A fél órás kevertetés után a mintákat 6000 fordulat/perc sebességgel centrifugában ülepítettük 20 percig. A kiülepedett részt elválasztottuk, a kolloid oldatot a továbbiakban dialízissel tisztítottuk. A dialízis során a féligáteresztő hártyából készült csövekbe öntöttük a szuszpenziót, majd a csöveket dializáló folyadékot (kétszer desztillált víz) tartalmazó edénybe tettük, és UV-abszorpciós mérésekkel folyamatosan figyeltük a kioldódás mértékét. A - 13 -
dializáló folyadékból vett minták UV-mérése során nem mértünk elnyelést, vagyis a folyadék nem tartalmazott mérhető mennyiségben izoniazidot, a dialízist abbahagytuk, mivel arra következtettünk, hogy a nanogömböcskék közegében már nem található hatóanyag. A mintákat a további mérésekig 3-5 C-on állni hagytuk. Szerves fázis Vizes fázis c (PLGA50/50) / V m (pal-t 5 -(INH) 2 ) c (Pluronic 12700) / V (deszt.víz) g/dm 3 (aceton) g/dm 3 10 5 ml 2,06 mg 1 10 ml 10 3,5 ml 2,11 mg 2 16 ml 10 3,5 ml 3,95 mg 2 16 ml 10 3,5 ml 7,57 mg 2 16 ml 10 3,5 ml 12,44 mg 2 16 ml 10 3,5 ml 24,92 mg 2 16 ml 4. táblázat Az egyesítés előtti szerves és vizes fázis összetétele és mennyisége pal-t 5 -(INH) 2 alkalmazása esetén - 14 -
4.4. Vizsgálati módszerek 4.4.1. Dinamikus fényszóródás mérés A mérésekhez Brookhaven dinamikus fényszóródás mérő berendezést használtam, amely mind statikus- mind dinamikus fényszóródás mérésre lehetőséget nyújt [29]. Ha a részecske mozdulatlan, akkor a róla szóródó fény frekvenciája megegyezik a besugárzó fény frekvenciájával. Abban az esetben viszont, ha a részecske mozgásban van, akkor a Doppler-effektus miatt a besugárzó fény frekvenciája eltolódik. A frekvencia eltolódás következménye az lesz, hogy a különböző részecskékről szóródott fény interferenciájának mértéke állandóan változik, ezért a szórt fény intenzitásának fluktuációját tapasztaljuk. Az intenzitás fluktuációja tehát a részecskék mozgása miatt tapasztalható. Ez utóbbi analízisét a térerő autokorrelációs függvény segítségével végezzük el: g(τ ) = Aexp( Γτ ) ahol 1/Γ a relaxációs idő, τ pedig a korrelációs idő. Γ = Dq 2, ahol D a kollektív diffúzió állandó, q pedig a szórási vektor: q = 4πn / λ sin(θ/2) melyben n a közeg törésmutatója, λ a lézer fényforrás hullámhossza, θ a szórási szög. A részecskék méretét az Einstein-Stokes egyenlet alapján számíthatjuk, ha a részecskék gömb alakúak és a fény intenzitásának fluktuációja kizárólag transzlációs diffúzió következménye: D 0 = kt / 3πηd ahol k a Boltzmann-állandó, T a hőmérséklet, η a közeg viszkozitása, d a részecske átmérője [29]. - 15 -
6. ábra A fényszóródásmérő berendezés elvi vázlata [29] 4.4.2. Pásztázó eleltronmikroszkópia (SEM) Egy kiválasztott minta részecskeméretét és méreteloszlását pásztázó elektronmikroszkóppal (AMRAY 1830, Amray Inc., Bedford, MA) 20-30 kv gyorsító feszültség mellett is meghatároztuk. A vizsgálathoz a mintát megfelelő üvegfelületre vittük fel, megszárítottuk, majd vákuumpárologtatóval vékony szén- és aranyréteget párologtattunk a felületükre. A méreteloszlást a SEM-képek alapján több mint 300 nanorészecske méretének meghatározásával állapítottuk meg. 4.4.3. Atomi erő mikroszkópia (AFM) Az atomi erő mikroszkópia (AFM) felhasználható különböző felületek szerkezetének, morfológiájának vizsgálatára. Az AFM érzékelője egy ismert erőállandóval rendelkező kis laprugóra rögzített apró, hegyes tű (görbületi sugara <10 nm), mellyel a minta felületét végigpásztázzák. A tű és a felület között a távolság függvényében vonzó, vagy taszító erők lépnek fel, melynek hatására a rugó elhajlik. A rugó mozgásának követésére egy lézer dióda fényét a rugó hátoldalára fókuszálják, és a visszavert fénynyalábot egy négy részre osztott detektorba vezetik. A készülék fontos egysége a piezoelektromos mozgató rendszer. A minta - 16 -
mozgatása x, y irányban történik, míg a tű ettől függetlenül z irányban mozoghat. A műszerrel a felületek nm-es felbontású, 3 dimenziós leképezése valósítható meg (7. ábra). 7. ábra Az AFM készülék sematikus rajza A liofilizált, szén- és aranyréteggel bevont részecskéket tartalmazó minta felületét PSIA Inc. XE-100 készülékkel vizsgáltuk. A minta jellegéből adódóan szobahőmérsékleten, szilárd/levegő határfelületen, nem-kontakt módban mértünk. A méréshez NSC15 (MikroMasch) típusú, Si 3 N 4 anyagú, hátoldalán alumíniumreflektáló felülettel borított, átlagosan 40 N/m rugóállandójú, pásztázó tűt használtunk. A mérések 3-4 véletlenszerű módon kiválasztott helyen történtek. A mintákról 4,5 µm x 4,5 µm-es felvételek készültek. A mérési eredményeket a XEI 1.6 (PSIA Inc., Dél-Korea) programmal értékeltük ki. 4.4.5 Stabilitásvizsgálat és rediszpergálhatóság A stabilitásvizsgálat során arról szerettünk volna információt kapni, hogy az előállított hatóanyaghordozó nanogömböcske mérete mennyire változik az idő előrehaladtával, történik e jelentős aggregáció a nanoszuszpenzióban. Ezért egy kiválasztott minta részecskeméretét meghatározott időközönként megmértük. Vizsgálatunkhoz a c(plga) = 10 g/dm 3, m(pal-t 5 -(INH) 2 = 2,011 mg és a c(pluronic 12700) = 2 g/dm 3 koncentrációjú rendszert választottuk. - 17 -
A rediszpergálhatósági vizsgálathoz a nanoszuszpenziókat liofilizálással kezeltük. A liofilizálás vagy fagyasztva szárítás, tartósításra szolgáló víztelenítés. Az eljárás során először megfagyasztják a víztelenítendő anyagot, majd vákuumot idéznek elő, így szakítják ki a vízmolekulákat a mintából. A vízmolekulák eltávolítása hővesztéssel jár, ezért hőt közölnek a rendszerrel. A víz közvetlenül a szilárd fázisból a gáz fázisba szublimál. A vizsgálattal arra szerettünk volna választ kapni, hogy a nanorészecskék milyen mértékben diszpergálhatók abban a közegben, amelyben az előállítás során keletkeztek. Ezért a liofilizálás után visszakapott szilárd anyagra annyi desztillált vizet öntöttünk, amennyi az adott mintakészítés során alkalmazott térfogat volt. 4.3.6. Hatóanyag-tartalom és kapszulázási hatékonyság A hatóanyag-tartalom és kapszulázási hatékonyság meghatározásához a dializált és liofilizált minták mért mennyiségét lúgban (0,05 M NaOH) feloldottuk, és előzőleg meghatározott kalibrációs görbe alapján a hatóanyag-koncentrációt fotometriásan mértük. - 18 -
5. Eredmények és értékelésük 5.1. Fényszóródás mérés, részecskeméret-meghatározás A nanoprecipitáció során készült minták részecskeméretét igyekeztünk minél rövidebb időn belül meghatározni. A vizsgálódás dinamikus fényszóródás méréssel történt. Az 5. táblázat tartalmazza a mért értékeket, a d a hidrodinamikai átmérőt jelenti. d / nm Polidiszperzitás c (PLGA) / g/dm 3 m (pal-t 5 -(INH) 2 ) c (Plur. 12700)/ g/dm 3 10 2,06 mg 1 194 0,145 10 2,11 mg 2 223 0,101 10 3,95 mg 2 230 0,128 10 7,57 mg 2 253 0,192 10 12,44 mg 2 244 0,139 10 24,92 mg 2 205 0,136 5. táblázat A pal-t 5 -(INH) 2 -val készült szuszpenziók részecskemérete A 5. táblázat értékei rendkívül jónak számítanak, ezt az irodalmi adatok is alátámasztják, amelyek egy kolloidális gyógyszerhordozó részecskeméretének a közvetlen tüdőbeli bevitel szempontjából a 100-250 nm közötti nagyságot tekintik megfelelőnek. Az adatok összehasonlítása végett, megmértük a csak INH-val készült minták részecskeméretét is, mely 150 nm körüli értéknek adódott. A mintakészítés eredményei alapján azonban azt is tudjuk, hogy az INH hidrofil jellege miatt nem beszélhetünk nanokapszulázódásról, ezért a 150 nm körüli értékek lényegében a hatóanyag nélküli polimer nanorészecskék méretét jelentik. A pal-t 5 -(INH) 2 -vel készült minták részecskeméretei nagyobbak lettek, de még az ideális tartományon belül mozognak. A növekedés várható volt, mivel a mintakészítés eredményeiből már tudjuk, hogy a nanogömböcskék átlagosan 70%-ban tartalmazzák a hatóanyagot. A két gyógyszerhordozó részecskeméretében megfigyelhető eltérés megfelel ennek a méretnövekedésnek. A minták polidiszperzitása átlagosan 0,15 körül változott, ez az érték közel áll a monodiszperz rendszereket jellemző értékhez, ami 0,10 körüli érték. - 19 -
5.2. Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) A SEM képek alapján a nanorészecskék gömb alakúak, nagyságuk a nanométeres mérettartományba esik, és nincsenek köztük nagyobb méretű aggregátumok. Az INH-val készült minták méreteloszlása (8.ábra a,c) szűk tartományba esik, ami nem meglepő, mivel ezek a nanorészecskék minimális mennyiségű (<1%) izoniazidot tartalmaznak. A pal-t5(inh)2-vel készült minták (8.ábra b,d) méreteloszlása már szélesebb tartományban mozog. Kis részük 200 nm körüli nagysággal rendelkezik, míg nagyobb részük 300-400 nm-es mérettel rendelkezik, ami összhangban van ezen nanorészecskék különböző mennyiségű hatóanyagtartalmával. a. b. 10 µm 10µm c. d. 1 µm 1 µm 8. ábra INH-val (a,c) és pal-t5-(inh)2-vel (b,d) készült SEM képek - 20 -
5.3. Atomi erő mikroszkópia (AFM) Az AFM képek egy pal-t 5 -(INH) 2 -vel készült mintáról készültek (9. ábra). A képeken jól látszik a nanorészecskék magassága, ami teljesen összhangban van a dinamikus fényszóródásmérővel mért értékekkel (200-250 nm). A részecskék szélessége azonban eltér ettől, viszont ezeket az értékeket nem kell figyelembe venni, mivel abból adódtak, hogy a kúp alakú AFM-tű nyílásszöge túl nagy, emiatt nem tudja kellően letapogatni a nanorészecskéket. A 3D-s képekből jól látszik, hogy hasonlóan a SEM képekhez, a nanorészecskék közel gömb alakúak. a. b. c. d. 9. ábra Pal-T 5 -(INH) 2 -vel készült minta AFM képei - 21 -
5.4. Stabilitásvizsgálat és rediszpergálhatóság Az időbeli stabilitás vizsgálatához az átlagos részecskeméretet fényszórásméréssel követtük. A nanoszuszpenzió részecskemérete nőtt az idő előrehaladtával, de ez a növekedés nagyon kismértékű volt. Több mint egy hónap elteltével a részecskék mérete 22 nm-rel lett nagyobb (6. táblázat), ami olyan kis érték, hogy gyakorlatilag elhanyagolhatónak tekinthető. Az előállítás óta eltelt idő 1 h 34 h 72 h 1 hét 2 hét 4 hét d / nm 194 195 195 197 199 201 6. táblázat A nanorészecske méretének időfüggése Az időfüggés vizsgálatát azért tartottuk fontosnak, mert szerettünk volna választ kapni arra, hogy a nanorészecskék aggregálódása milyen ütemben zajlik. Bár a vizsgálat nem modellezte pontosan az élő rendszereket, de azt meg lehetett belőle állapítani, hogy az idő előrehaladtával nem várható gyors és nagymértékű aggregálódás a nanogömböcskék között, ami bíztató eredménynek számít. 300 250 200 d / nm 150 100 0 100 200 300 400 500 600 700 t / h 10. ábra A részecskeméret időfüggése - 22 -
Rediszpergálhatósági vizsgálatot már korábban is végeztünk, olyan minták esetében, amelyeknél a Pluronic 12700 koncentrációja 1 g/dm 3 volt. Ezeknél a mintáknál nem tapasztaltunk teljes diszpergálódást, a minta egy része megmaradt szilárd állapotban. A továbbiakban megnöveltük a stabilizálószer koncentrációját 2 g/dm 3 -re, és ezzel sokkal jobb rediszpelgálódási eredményt értünk el, gyorsabban és nagyobb mértékben diszpergálódott a minta. Sőt, azokban az esetekben is jó volt a rediszpergálódás, amikor a liofilizált mintákra csak több napi tárolás után öntöttünk vizet. 5.5. A hatóanyag-tartalom és a kapszulázási hatékonyság A hatóanyag-tartalom és kapszulázási hatékonyság meghatározásához az előállított szuszpenziókat, hasonlóan a rediszpergálhatósági vizsgálathoz, dialízis után liofilizálással szárítottuk. A szilárd anyagra az irodalmi eljárásokat figyelembe véve 0,05 M NaOH-oldatot öntöttünk, majd a teljes feloldódás után spektrofotometriásan megmértük az elnyelésüket. A méréseket λ = 260 nm-en végeztük, mivel az INH abszorpciója ezen a hullámhosszon maximumot ér el. A kezdeti, tájékozódó jellegű eredmények után kalibráló oldatokat készítettünk a pal-t 5 -(INH) 2 -vel, majd a kalibráló egyenes segítségével határoztuk meg a minták INH-koncentrációját. A hatóanyagtartalmat és a kapszulázási hatékonyságot az alábbi képletek alapján számoltuk: m(hatóanyag nanorészecskében) ( hatóanyag tartalom) = m(plga nanorészecske) m(hatóanyag nanorészecskében) ( kapszulázá si hatékonyság) = m(összes bevitt hatóanyag) - 23 -
0,7 0,6 0,5 abs 0,4 0,3 0,2 0,1 abs = -0,011 + 5,638c r = 0,996 0,0 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 c / g/dm 3 11. ábra pal-t 5 -(INH) 2 kalibrációs egyenes Az eredmények (7.táblázat), különösen az INH kapszulázásához hasonlítva, jónak számítanak, a kapszulázási hatékonyság egy kivételével 70-100% között változott. Megfigyelhető, hogy annál a mintánál kaptunk 27%-os kapszulázási hatékonyságot, amelynél a kisebb koncentrációjú tenzidet használtuk, valamint ebben az esetben a vizes/szerves fázis aránya is kisebb volt, mint az összes többi esetben. Ezek alapján megállapítható, hogy a vizes/szerves fázis arányának növelésével jobb kapszulázási eredményeket lehet elérni. A magyarázat az lehet, hogy az aceton-víz elegy annál erősebb kicsapószer, minél nagyobb a víztartalma. A kisebb szerves fázis térfogatú bemérések esetén növeltük a kicsapószer erősségét, vagyis több pal-t 5 -(INH) 2 tudott kötődni a polimerhez. c (PLGA50/50)/ g/dm 3 m (pal-t 5 -(INH) 2 ) c (Pluronic 12700)/ g/dm 3 Hatóanyagtartalom Kapszulázási hatékonyság 10 2,06 mg 1 3% 27% 10 2,11 mg 2 5% 90% 10 3,95 mg 2 9% 90% 10 7,57 mg 2 18% 100% 10 12,44 mg 2 20% 75% 10 24,92 mg 2 30% 70% 7. táblázat Hatóanyag-tartalom és kapszulázási hatékonyság pal-t 5 -(INH) 2 alkalmazása esetén - 24 -
A 8. táblázat a hatóanyagtartalom és a kapszulázási hatékonyság összehasonlításaként szolgál INH és pal-t 5 -(INH) 2 alkalmazása esetén. Az eredmények alapján kijelenthető, hogy nanoprecipitációs módszerrel a két hatóanyag közül a pal-t 5 -(INH) 2 esetében valósítható meg nanokapszulázás, az izoniazid esetében nem kaptunk használható eredményeket. A kapott adatok összehasonlításából megállapítható, hogy az INH konjugálása mennyire fontos és szükségszerű a molekula, mint kolloidális gyógyszerforma felhasználásának céljából. Hatóanyagtartalom Kapszulázási hatékonyság INH pal-t 5 -(INH) 2 INH pal-t 5 -(INH) 2 0,2% 0,9% 3% 30% 0,4% 16,5% 27% 100% 8. táblázat Hatóanyagtartalom és kapszulázási hatékonyság összehasonlítása INH és pal-t 5 -(INH) 2 esetében - 25 -
6. Összefoglalás Az utóbbi időkben a nanotechnológia fejlődése lehetővé tette új, biokompatibilis nanorészecskék megjelenését a gyógyszerszállításban. A leggyakrabban alkalmazott gyógyszerhordozó család a poli(tejsav) (PLA), a poli(glikolsav) (PGA), és a tejsav/glikolsav blokk kopolimerek (PLGA). Ezek az anyagok nem mérgezőek, mert bomlásuk során tejsav és glikolsav képződik, melyek a szervezetben is megtalálható, nem toxikus anyagok [4]. A nanogömböcskék előállítása többféleképpen történhet, mi a nanoprecipitációs módszert választottuk. Az eljárás során egy vizes és egy vízzel elegyedő, szerves fázis érintkezik, melyben a polimer és a hatóanyag van feloldva. A szerves fázisban oldott polimer a vízzel érintkezve nanorészecskék formájában kicsapódik. Hatóanyagnak egy tipikusan vízoldható molekulát, az izoniazidot választottuk, azonban a kísérletekből kiderült, hogy hidrofilitása miatt nem tud adszorbeálódni az erősen hidrofób polimerhez. A továbbiakban ezért, az izoniazid egy tuftsin jellegű molekulával alkotott konjugátumát (pal-t 5 -(INH) 2 ) használtuk. A pal-t 5 -(INH) 2 hidrofób jellegéről megoszlási hányados mérésekkel győzödtünk meg, amelynek értéke nyolcszorosa volt az izoniazidéhoz képest. A molekula egy peptidszakaszt valamint palmitinsavat tartalmaz, és a MTA-ELTE Peptidkémiai kutatócsoport munkája. A konjugált hatóanyag alkalmazása jelentős növekedést eredményezett a nanorészecskébe jutatott hatóanyag mennyiségében és kapszulázási hatékonyságban is. A hatóanyag-tartalom 3% 30%, a kapszulázási hatékonyság 20% 100% között változott. A kapott nanorészecskék méretét dinamikus fényszóródás méréssel, SEM és AFM képekkel jellemeztük. Az INH alkalmazásakor 150 nm körüli átmérők adódtak, viszont ez az érték lényegében a PLGA méretét jelenti, mivel az izoniaziddal készült nanorészecskék esetén gyakorlatilag nem beszélhetünk nanokapszulázódásról, mivel 1%-nál kisebb hatóanyagtartalmú részecskék keletkeztek. A pal-t 5 -(INH) 2 -re átlagosan 200-250 nm körüli értékeket mértünk, ami kiváló eredmény, mivel ebben az esetben a hatóanyag-tartalom is jelentős volt. A stabilitásvizsgálatnál meggyőződhettünk arról, hogy az előállított nanorészecske mérete állandó marad hosszabb időn keresztül is, a rediszpergálhatósági vizsgálat során azt tapasztaltuk, hogy a nagyobb koncentrációjú tenziddel készült, liofilizált pal-t 5 -(INH) 2 minták tudtak jól rediszpergálódni. - 26 -
A mérési eredmények azt mutatják, hogy a nanoprecipitációs módszerrel előállított nanorészecskék megfelelnek mind stabilitásukban, mind méretükben a kolloidális gyógyszerhordozókkal szemben állított követelményeknek. Az eljárás során jó eredményekkel tudtuk a pal-t 5 -(INH) 2 -t kapszulázni, a továbbiakban a gyógyszerhordozó szerkezetéről szeretnénk többet megtudni, hogy pontosan hol helyezkedik el benne a hatóanyag, és tervezünk hatóanyag-leadási kinetikát vizsgálni. - 27 -
7. Irodalomjegyzék [1] Hudecz Ferenc: Polimer terapeutikumok, http://www.kfki.hu/chemonet/hun/olvaso/kemia/polimer.html [2] I. Bertóti, Gy. Marosi, A. Tóth, Műszaki felülettudomány és orvosbiológiai alkalmazásai, B+V (medical&technical) Lap- és Könyvkiadó Kft, Budapest, 11-12 (2003) [3] M. Muthu, Asian J Pharm, 3, 266-267 (2009) [4] Verónica Lasalle, María Luján Ferreira, Macromolecular Journals, 7, 767-769 (2007) [5] K. Horváti, Mycobacterium tuberculosis immundomináns fehérjéiből származtatható mesterséges peptidantigének, valamint antituberkulotikum konjugátumok szintézise és in vitro aktivitásuk vizsgálata, Doktori értekezés, ELTE Kémia Doktori Iskola, Budapest (2009) [6] Derakhshandeh, K., Soheili, M., Darashzadeh, S., Saghiri, R., Int. J. Nanomedicine, 5, 463-471 (2010) [7] Barichello, J. M., Morishata, M., Takayama, K., Nagai, T., Drug Development Ind. Pharm., 25, 471-476 (1999) [8] Lewis D. H., In Biodegradable polymers as drug delivery systems, edited by M. Chasin, R. Langer; New York: Marcel Dekker; 1-41 (1990) [9] Jain, R. A., Biomaterials, 21, 2475-2490 (2000) [10] Peltonen, L., Aitta, J., Hyvönen, S., Karjalainen, M., Hirvonen, J., AAPS Pharm. Sci. Techn., 5, 1-6 (2004) [11] Yeh M-K, Davis S. S, Coombes A. G. A., Pharm Res.,13 (11), 1693-1698 (1996) [12] Siemion, I. Z., Kluczyk, A., Peptides, 20 (5), 645-674 (1999) [13] Najjar, V. A., Ann N Y Acad Sci., 419: 1-11 (1983) [14] Mező, G., Kalászi, A., Reményi, J., Majer, Z., Hilbert, A., Láng, O., Kőhidai, L., Barna, K., Gaál, D., Hudecz, F., Biopolymers, 73 (6), 645-656 (2004) [15] Bai, K. B., Láng, O., Orbán, E, Szabó, R., Kőhidai, L., Hudecz, F., Mező, G., Bioconjug Chem., 19 (11), 2260-2269 (2008) [16] Horváti, K., Mező, G., Szabó, N., Hudecz, F., Bősze, S., J. Pept. Sci., 15 (5), 385-391 (2009) [17] Brannon-Peppas, L., Int. J. Pharm., 116, 1-9 (1995) - 28 -
[18] Scholas, P.D., Coombes, A.G.G., Ilium, L., Davis, S.S., Vert,M. and Davies, M.C., J. Contr. Release, 25, 145-153 (1993) [19] P. Bouillot, A. Petit, E. Dellacherie, J App Polymer Sci, 68, 1695 (1998) [20] K. Cai, K. Yao, Y. Cui, Z. Yang, X. Li, H. Xie, T. Qing, L. Gao, Biomaterials, 23, 1603-1611 (2002) [21] Bilati, U., Allémann, E., Doelker, E., Eur. J. Pharm. Sci., 24, 67 75 (2005) [22] Stainmesse, S., Orecchioni, A.-M., Nakache, E., Puisieux, F., Fessi, H., Coll. Polym. Sci., 273, 505-511 (1995) [23] Govender, T., Stolnik, S., Garnett, M. C., Illum, L., Davis, S. S., J. Controlled Release, 57, 171-185 (1999) [24] Lamprecht, A., Ubrich, N., Yamamoto, H., Schafer, U., Takeuchi, H., Lehr, C-M., Maincent, P., Kawashima, Y., J. Contr. Release, 71, 297-306 (2001) [25] http://lifekills.files.wordpress.com/2009/02/nanoparticles.jpg [26] K. N. Takácsné, Gyógyszerész kémia gyakorlatok, Semmelweis Kiadó, Budapest, 276-277 (2005) [27] S. K. Mehta, G. Kaur, K.K. Bhasin, Pharm Res, 25, 227-236 (2008) [28] http://www.rsc.org/ejga/jm/2009/b906556n-ga.gif [29] A. Borsos, Elektromosan töltött polimer nanogél részecskék vizsgálata, Tudományos Diákköri Dolgozat, ELTE Fizikai Kémiai Tanszék, Budapest (2007) - 29 -