Egy hexamer acilpeptid-hidroláz szerkezete, a méretszelektivitás újszerű módja

Tudományos Diákköri Dolgozat TICHY-RÁCS ÉVA ILONA Egy hexamer acilpeptid-hidroláz szerkezete, a méretszelektivitás újszerű módja Témavezető: Harmat Veronika, Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2009

Tartalomjegyzék Bevezetés... 3 1. Irodalmi áttekintés... 4 1.1. Az enzimek felosztása... 4 1.2. A szerin-proteázok katalitikus mechanizmusa... 4 1.3. A Prolil-oligopeptidáz család... 5 1.4. Az acilpeptid-hidroláz alcsalád... 6 1.5. Az acilpeptid hidroláz szerkezete... 7 Célkitűzések...8 2. Módszerek... 9 2.1. Fehérjekrisztallográfia... 9 2.1.1. Kristályosítás, adatgyűjtés... 9 2.1.2. Modellépítés, finomítás... 10 2.2 A szerkezet elemzése... 13 3. A PhAAP fehérje szerkezete... 14 3.1. A monomer felépítése... 14 3.1.1. A β-propeller domén... 14 3.1.2. A hidroláz domén szerkezete, stabilitása... 15 3.2. A PhAAP komplex felépítése... 16 3.2.1. A monomerek közötti kölcsönhatások... 16 3.2.2. A hexamer dinamikája... 17 3.3. Az aktív hely... 18 4. PhAAP fehérje összehasonlítása más enzimekkel... 19 4.1. A propeller domén... 19 4.2. A hidroláz domén stabilitása... 19 Összefoglalás... 21 Köszönetnyilvánítás... 21 Rövidítések... 22 Irodalomjegyzék... 22 2

Bevezetés A fehérjék az élő szervezetek megfelelő működésében létfontosságú szerepet töltenek be. Az élő szervezetben lezajló folyamatok túlnyomó része energetikai okok miatt csak katalizátorok segítségével mehet végbe. Ilyen katalizátor szerepet töltenek be az enzimek, melyek speciális funkciójú fehérjék. Az enzimek tanulmányozása fontos az emberi test és más szervezetek működésének legjobb megismeréséhez, és segítségünkre lehet az esetleges problémák orvoslásához. A szerkezet-meghatározás nagyon sokat segíthet a reakciómechanizmusok felderítésében, hiszen a 3D szerkezet, a fehérje konformációja determinálja, hogy az enzim milyen biológiai funkciót tud ellátni. Az elmúlt évtizedben hihetetlen mértékben fejlődtek a makromolekulák térszerkezetének meghatározásához alkalmazott módszerek, és meredeken nő az ismert szerkezetek száma, mely segítségünkre lehet a mai tudomány számos területén. E dolgozat témája is egy ilyen fontos, néhány éve felfedezett fehérje, az acilaminoacilpeptidáz (AAP) szerkezetének meghatározása és elemzése. Az AAP fehérje a szerinpeptidázokon belül a prolil-oligopeptidáz (POP) családba tartozik. Biológiai szerepe és jelentősége az, hogy katalizálja bizonyos oligopeptidek N-terminálisán lévő acilezett aminosav lehasítását, így részt vesz a peptidhormonok és a neuropeptidek szintjének szabályozásában. Ezenkívül kapcsolatba hozható egyes rákfajtákkal, valamint egyik célpontja a memórianövelő gyógyszerek kutatásának is. A Pyrococcus horikoshii nevű, termofil ősbaktériumból származó AAP fehérjét (PhAAP) E. coli baktériumban fejezték ki a, majd tisztítás után került az ELTE fehérjekrisztallográfiai laboratóriumába. Kristályosítás után a hamburgi szinkrotronban végezték a röntgendiffrakciós méréseket b, melyeknek a kiértékelésében vettem részt. Ez alapján vizsgáltam a fehérje egyedi, eddig ismert szerkezeteknél nem tapasztalt felépítését, ami a méretszelektivitást újszerű módon befolyásolja. Ezen kívül vizsgáltam a PhAAP fehérje egyéb sajátosságait a POP enzimcsaládon belül, illetve ennek a családnak az α/β hidroláz klánon belüli hasonlóságait és eltéréseit. a Polgár László professzor csoportja, MTA Enzimológiai Intézet b Harmat Veronika, ELTE Fehérjekrisztallográfiai Laboratórium 3

1. Irodalmi áttekintés 1.1. Az enzimek felosztása Az enzimeket hat nagy csoportra osztják az általuk katalizált reakciók alapján [1]. Az oxidoreduktázok egyik biomolekula redukálása közben egy másikat oxidálnak. Azokat az enzimeket, amelyek funkciós csoportokat visznek át egyik molekuláról a másikra, transzferázoknak nevezzük. A hidrolázok észter-, éter- vagy amidkötést bontanak el hidrolízissel. Ezek közé tartoznak az általunk tanulmányozott enzimcsalád tagjai is. A liázok vagy szintázok szubsztrátjaikon kettőskötéseket alakítanak ki. A testben lévő molekulák belső szerkezeti átalakulását (izomerizációját) az izomerázok segítik elő. A ligázok vagy szintetázok nagyenergiájú szintéziseket hajtanak végre. Egy-egy családot aszerint oszthatunk fel újabb csoportokra, hogy milyen szubsztrátok vesznek részt a reakcióban. E szempont szerint a hidrolázokat négy csoport alkotja: az észterspecifikus lipázok, a glikozidos kapcsolatokat hasító amilázok, a nukleinsavak foszfodiészterkötéseit hidrolizáló nukleázok és az amidkötéseket bontó proteázok. A proteázok fehérjéket, polipeptideket vagy módosult aminosav-származékokat hidrolizálnak kisebb molekulákká. A proteázokat reaktív csoportjukat alkotó aminosavak szerint négy családra választjuk szét: a szerin-proteázokra, a cisztein-proteázokra, illetve a metallo- és az aszparaginsav-proteázokra. Ez utóbbi kettőből egyelőre kevésnek határozták meg a szerkezetét, a legnagyobb irodalma a szerinnel katalizáló enzimcsaládnak van. A fenti fő csoportok másféle felosztása a szerkezet/feltekeredés szerint tesz különbséget. Az általunk vizsgált POP enzimek hidroláz doménje amint arról még szó esik egy központi β-redőből és a körülötte elhelyezkedő α-hélixekből áll, így az α/β hidroláz feltekeredés (α/β hidrolase fold) névre hallgató klán tagja [2]. Ez a klán 58 tagot számlál, melyek között különböző hidrolázok szerepelnek lipázok, észterázok, proteázok. A proliloligopeptidáz család tehát egyrészt a szerin-proteázok, másrészt az α/β hidroláz klán tagja. 1.2. A szerin-proteázok katalitikus mechanizmusa A mechanizmus [1] kezdő lépése az, hogy a szubsztrát beköt az enzim megfelelő szubsztrátkötő helyére, melyet a katalitikus triád (Asp, His, Ser) határoz meg. A hasadó kötéstől számítva a peptid N-terminálisa felé az aminosavak a P1, P2 jelölést kapják, amelyek rendre az S1, S2, S3, kötőzsebekbe kötődnek. A hasadó kötéstől a peptid C-terminálisa felé haladva a P1', P2' stb. aminosavak az S1', S2' helyekre kötnek. A szubsztrát optimális 4

pozícióban való stabilizálása a katalízis szempontjából rendkívül fontos, ezért az S1 zseb határozza meg az enzim elsődleges specificitását (1. ábra). 1. ábra: Aktív hely és szubsztrátkötő hely a szerin-proteázokban A katalitikus triád a névadó szerin, valamint az aszparaginsav és a hisztidin. A bekötés után a szerin hidroxil-csoportja nukleofil támadást intéz a peptid karbonil-csoportja ellen, ezáltal kovalens kötés jön létre a szubsztrát és a szerin között, létrehozva ezzel egy negatív töltésű, átmeneti, a volt karbonil szén körül tetraéderes konfigurációjú oxianiont. A hidroxiloldallánc disszociáló hidrogénjét a hisztidin köti meg. Az aszparaginsav polarizáló hatása segíti elő ezt a folyamatot. Az oxianion komplexet a volt karbonil oxigénjén keresztül két főláncbeli amid-hidrogén hidrogénkötésekkel stabilizál. A hidrogéndonor aminosavak alkotta szerkezeti elrendeződés az oxianion-kötő zseb. Az átmenet állapot felbomlásával kialakul az acil-enzim komplex, amelyben a P1 aminosav a szerinhez észterkötéssel kapcsolódik. Ennek a felbomlását és az enzim regenerálódását hasonló módon egy vízmolekula nukleofil támadása indítja el. 1.3. A Prolil-oligopeptidáz család A családot 1991-ben azonosították, amikor a prolil oligopeptidáz, a dipeptidil-peptidáz IV és az aminoacil-peptidáz aminosavsorrendjét összehasonlították [3]. Még ez évben Kanatani és munkatársai által proteáz II néven leírt oligopeptidáz B [4] lett az alapító fehérjék negyedik tagja. A csoportot több hasonló fehérjével együtt S9 családnak nevezték el [5], amely szerkezeti jellemzői alapján a szerin-proteázok SC klánjába tartoznak, azaz karboxipeptidázok, és a katalitikus triádot a szerin, a hisztidin és az aszparaginsav alkotja. A 5

katalitikus domén vizsgálatakor kiderült, hogy ez a család más jellegű fehérjékkel együtt például egyes lipázokkal, harmadlagos szerkezetét (feltekeredését) tekintve az α/βhidrolázokhoz tartozik [6]. A prolil-oligopeptidáz család tagjai a szerin-peptidáz csoport más családjaitól több ponton lényegesen eltérnek. A szerin-proteázok általános 25-30 kda-os molekulatömegéhez képest a prolil-oligopeptidázoké ennek három-négyszerese, azaz 80-120 kda, továbbá szintézisük során nem előenzim, hanem rögtön az aktív alak keletkezik [7]. A méretbeli anomáliánál is fontosabb újszerű szerkezetük. A monomer enzim két fő részből tevődik össze, a hidroláz és a β-propeller doménből. A harmadik megkülönböztető jegy az, hogy az enzimcsalád tagjai nem tudnak harminc aminosavnál hosszabb láncokat lebontani [7,8]. Ennek fontos következményei vannak: a méret-korlát megakadályozza a fehérjék esetleges lebontását, ezáltal az önemésztést is. 1.4. Az acilpeptid-hidroláz alcsalád A prolil-oligopeptidázok családjának negyedik ágát az acilpeptid hidrolázok, vagy más néven acilaminoacil peptidázok (AAP) alkotják, amelyek az N-terminusról acilezett aminosavakat hasítanak le [8], miáltal egy rövidebb, de szabad végű polipeptid keletkezik. Az eltávolított acilező csoport lehet szerves formil, acetil, kloroacetil, vagy éppen szervetlen, például foszfát [9]. Számos eukarióta élőlényben találtak AAP fehérjéket. A patkányból a sertésből és az emberből nyert tetramer enzimek teljes szekvenciáját meghatározták [10, 11, 12]. Mindegyik 732 aminosav hosszú, szerkezetük kilencven százalékban azonos és a katalitikus aminosavak helyei is megegyeznek [6, 7]. Miután kiderült, hogy az emberben is előforduló egyes foszfátészter típusú ingerületátvivő anyagok a fehérje specifikus szubsztrátjai [13], feltételezhetjük, hogy az enzim hasonló szerepet játszik a tudat kémiai folyamataiban, mint az acetilkolinészteráz [14]. Az acilpeptid hidroláz alcsalád képes a β-endorfin és más biológiailag aktív peptidek bontásával részt vesz azok testbéli koncentrációjának szabályozásában [15]. Az AAP termelésének csökkenése sok esetben együtt jár a tüdőben és vesében lévő, kissejtes rosszindulatú daganatok kialakulásával [16]. Mindezen funkciói miatt szerkezetének és működési mechanizmusának megismerése gyógyászati jelentőségű lehet. 6

1.5. Az acilpeptid hidroláz szerkezete Az AAP fehérjék közül eddig egynek ismert a szerkezete, mely az Aeropyrum Pernix nevű termofil ősbaktériumból származik (ApAAP). A monomeren belül két domén található. Egyik a β-propeller domén, amely hét darab, egyenként négy antiparallel β-szálat tartalmazó lapátból áll. Ez a szerkezet sokféle funkciójú fehérjében előfordul. A POP család fehérjéiben az első és az utolsó lapát között nincs kovalens kapcsolat. A propellerben és a két domén között dinamikus mozgásra van lehetőség. Általában ez biztosítja az enzim belsejébe jutó peptidek méret szerinti szelektivitását. Másik a hidroláz domén, amelyben a központi nyolc β- szál körül α-hélixek helyezkednek el. Ezen belül a szélső β-szál után helyezkedik el a katalitikus triád (ApAAP: Ser445, Asp524, His556) hisztidinje. Az aktív hely a monomer belsejében van, így ebben a formában nem hozzáférhető, hanem a két doménnek oldatban szét kell nyílnia, hogy a szubsztrát be tudjon jutni. Az ApAAP enzim szimmetrikus homodimer, amelyben a két hidroláz domén úgy kapcsolódik, hogy a két β-élnél illeszkedve folytonos β-redőt képeznek (2. ábra). a) b) 2. ábra: Az ApAAP enzim szerkezete. a) A két monomer hidroláz doménje úgy illeszkedik, hogy folytonos β-redő jön létre. b) A szubsztrát (magenta színnel) csak a két domén szétnyílásával juthat be a katalitikus helyhez (metszeti kép). 7

Célkitűzések Az acilaminoacil peptidázok a POP családon belül nem túl rég lettek önálló csoportként elkülönítve. Az eddigi egyetlen meghatározott szerkezetű Aeropyrum Pernix ősbaktériumból származó enzim két monomerből áll, míg az általunk vizsgált Pyrococcus Horikoshii eredetű fehérje az első ismert hexamer szerkezetű. Emlősfehérjéből egyelőre még nem sikerült jól szóró AAP kristályt készíteni. Ezeknek a szekvenciája a hidroláz doméneket összevetve mintegy 25%-ban hasonlít az ősbaktériumokból származó enzimekéhez ez makromolekulás meghatározásnál elég nagy egyezésnek számít. Szerkezetükről annyi ismert, hogy tetramereket alkotnak. Ha sikerül megismernünk rokon fehérjék szerkezetét és működési mechanizmusát, akkor közelebb kerülhetünk az orvosi szempontból legfontosabbnak számító, ám közvetlenül nem vizsgálható emlősfehérje leírásához. 8

2. Módszerek 2.1. Fehérjekrisztallográfia 2.1.1. Kristályosítás, adatgyűjtés A molekulák szerkezetéről, atomjaik pontos térbeli helyzetéről röntgendiffrakciós módszerrel nyerhetünk információt. A diffrakció jelenségének alapja a sugárzás rugalmas kölcsönhatása az anyaggal. Jelen esetben a röntgensugár szóródik az atomok elektronfelhőjén, ezt detektáljuk a diffrakciós képen, melyből a tárgy képét Fourier-transzformációval számítjuk, számítógép segítségével. Ennek eredményeként a molekulák elektronsűrűségi függvényét kapjuk. 3. ábra: A függőcsepp módszer A cseppben lévő kicsapószer koncentráció hígabb mint a kristályosító oldatban. A két oldat gőznyomása kiegyenlítődik, miközben a csepp fehérjére nézve lassan töményedik. A Pyrococcus horikoshii ősbaktériumból származó fehérjét E. Coli baktériumban fejezték ki, és tisztítás után került az ELTE fehérjekrisztallográfiai laboratóriumába. A kristályosítást a CrystalScreen II (Hampton Research) 39. számú elegyéből kiindulva függőcsepp módszerrel végezték (0. ábra). Ez a körülmény úgy áll össze, hogy 60-70 µl 1M MgCl 2, 50 µl 1M Tris[hidroximetil]aminometán], 280-300 µl 5M 1,6-hexándiol kerül 500 µl végtérfogatú kristályosító elegybe. Ebből a körülményből 2 µl-t 3 µl fehérjeoldattal elegyítve készült a csepp. A kristályokat UO 2 (OAc) 2, KI ill. K 2 PtCl 4 oldatokba áztatták. A nagy rendszámú atomok beépülése a kristályba a szórási mintázat megváltozását eredményezi, ami felhasználható a kezdeti fázisok kiszámításához. Ezt nevezzük izomorf helyettesítéses módszernek [17,18]. Később vált ismertté egy rokon enzimből származó β-propeller domén szerkezete, amelyet esetleg fel lehetett volna használni a fázisprobléma molekuláris 9

helyettesítéssel való megoldására [19]. Ez utóbbi módszer használatának az a feltétele, hogy a két fehérje aminosavsorrendje legalább 25-30%-ban megegyezzen. [20] Az adatgyűjtést 100 K-en végezték egy natív és három nehézatommal (U, Pt, I) származékolt egykristály felhasználásával. Sugárforrások: ESRF szinkrotron sugárforrás BM14-U nyaláb, a DESY EMBL X11 nyaláb és az ELTE Fehérjekrisztallográfiai Laboratóriumban található diffraktométere (réz Kα sugárzás, Rigaku RU-H2R forgó anódos generátor, Rigaku R-AXIS IIC image plate detektor). Az adatfeldolgozást az XDS programmal [21] illetve a CCP4 programcsomaggal (a MLPHARE és a DM programokkal [22, 23]) végezték. A fázisproblémát a MIRAS módszerrel oldották meg a SHELX csomag segítségével [24]. 2.1.2. Modellépítés, finomítás A kezdeti fáziskészletből számolt elektronsűrűségi térkép alapján úgy építjük fel a molekulaszerkezetet, hogy a nagy elektronsűrűségű régiókba illesztjük az atomokat. A kezdeti modellmolekulát a szekvencia elektronsűrűségi hálóba történő automatizált illesztésével kapjuk, ezek után igazítjuk a térképhez, a hozzáigazított modellből új fázisokat számítunk, ami alapján új térképet kapunk. A töredezett és a szekvenciában bizonytalan helyzetű fehérjeláncokat tartalmazó kezdeti modell felülvizsgálata, és a további modellépítési lépések manuálisan történnek. A modell lokális tökéletesítése a teljes elektronsűrűségi térkép javulását eredményezi, ezért modellépítési-finomítási ciklusok sorozatát végezzük. Ahogy egyre jobb lesz a modell, úgy csökken a térképek zajszintje (4. ábra). 4. ábra: modellépítés-finomítási ciklusok egymásutánja. A Coot programmal [26] megjelenített elektronsűrűségi térkép. Kiindulási modellt az ARP/wARP [25] segítségével építették fel. Ezután a modellépítési lépéseket a COOT programmal [26] végeztem. Ezzel a programmal építettem be 10

a szerkezetbe a vízmolekulákat, a kristályosítási körülményből származó 1,6-hexándiolokat, és a Mg 2+ -ionokat is. A program automatikusan csak vizet tud elhelyezni az elektronsűrűségi hálóban, ezért a többit manuálisan kell megkeresni, és kicserélni a térképen elhelyezett vízmolekulákkal. A Mg 2+ -ionokat a hatos koordinációs szféra, és az abban található negatív töltésú aminosav oldalláncok alapján azonosítottam (5. ábra). 5. ábra: Mg 2+ -ion koordinációja. Az első koordinációs szférában négy vízmolekula, és két aszparaginsav van. A finomítást az CCP4 (Collaborative Computing Project 4) programcsomag REFMAC5 programjával készítettem [27]. A felbontás (esetünkben 1,9 Å) meghatározza a mért adatok és atomok számának arányán keresztül az alkalmazandó finomítási stratégiát: A molekulákra geometriai kényszereket alkalmaztam. A fehérje atomokra individuális izotróp B-faktor finomítást alkalmaztam. Hogy modellezzem a fehérjemolekulák doménjeinek hőmozgási anizotrópiáját is, ún. TLS finomítást alkalmaztam [28]. Mivel a hidrogén atomok az elektronsűrűségi térképen nem látszanak ilyen felbontás esetén, kémiai ismeretek alapján generáltam őket, és rögzített geometriával, a kapcsolódó nemhidrogén atomon lovagolva finomítottam őket ( riding model ). A szerkezet validálását a CCP4 programcsomaggal végeztem. Ennek során vizsgáltam a szerkezet krisztallográfiai és fizikai-kémiai (pl. geometriai jellemzők, nemkötő kölcsönhatások) jóságát. Az adatgyűjtési (1. Táblázat) és szerkezetfinomítási (2. Táblázat) eredmények alább láthatók. 11

1. Táblázat: az adatgyűjtés eredményei. Adatgyűjtés Natív UO 2 (OAc) 2 KI K 2 PtCl 4 Tércsoport R32 R32 R32 R32 R32 Cellaparaméterek (a, c; Å) (Hexagonális tengelyválasztás) 183,0 144,63 182,95 143,94 182,82 144,44 184,80 145,73 184,68 145,48 Hullámhossz (Å) 1,5418 1,5418 1,5418 0,8162 1,0715 Felbontás 20,0-1,9 20,0-2,5 20,0-2,2 20,0-2,0 20,0-2,5 Független reflexiók száma 69738 61659 85004 124693 63959 I/σ(I) 12,79 10,94 9,65 15,35 31,14 R meas 0,158 0,141 0,137 0,112 0,071 Teljesség (%) 95,7 99,2 92,7 99,4 99,6 Nehézatomhelyek száma - 1 13 2 Fázismeghatározó erősség (acentrikus/centrikus reflexiók) - 0,74/0,48 1,01/0,69 2,01/1,25 1,77/1,07 2. Táblázat: a finomítás eredménye, Finomítás Felbontási tartomány 19,78-1,91 Reflexiók száma 64802 R 0,184 R free c Atomok száma: 0,212 fehérje 5090 1,6-hexándiol molekula 6 Mg 2+ -ion 3 vízmolekula 361 c Az R free számítására a reflexiók 5%-a lett véletlenszerűen kiválasztva. Átlagos négyzetes eltérés az ideális geometriától Kötéshossz (Å) 0,010 Kötésszög (º) 1,247 Trigonális / általános síkok (Å) 0,004 Átlagos B-faktor (Å 2 ) 17,79 Átlagos koordinátahiba (Å) d 0,122 Ramachandran térkép ϕ / ψ a legkedvezőbb régióban 462 ϕ / ψ a megengedett régióban 66 ϕ / ψ bővített megengedett és 4 / 2 tiltott régióban d R free alapján számolva 12

2.2 A szerkezet elemzése A fehérje szerkezete a PyMOL [29] programmal praktikusan megjeleníthető. Nem csak az atomok, aminosavak közti kötéseket, hanem a másodlagos szerkezeti elemeket, a feltekeredést is ábrázolja. Továbbá a fehérje szimmetriamásolatait is generálja, ezáltal az egész komplex szerkezetet is megjeleníthetjük vele. Amelyik ábránál külön nem jelzem, ott a molekulaszerkezet képét ezzel a programmal készítettem. Molekuladinamikai számításokat is végeztem, hogy kiderüljön, milyen mozgásokat végezhet az enzim oldatban. Az ElNémo [30] szerver makromolekulák mozgását a felhasználó által beküldött.pdb fájl (ami a kristályban lévő atomok koordinátáit tartalmazza) alapján normál módus analízissel végzi. A normál módus elemzés ún. elasztikus hálózat modellen alapul: több aminosavat tartalmazó nagyobb egységek elasztikus hálózatával modellezve a fehérjét a legalacsonyabb frekvenciájú normál módusok ugyanazok maradnak, így lehetővé válik nagy molekulák normál módus elemzése. Ezek a legalacsonyabb frekvenciájú normál módusok a domének közti és a fehérje multimeren belüli hajlékonyság jellemzésére használhatók. A számított eredményeket grafikusan, három irányból mutatva animált formátumban is megjeleníti (6. ábra). a) b) c) 6. ábra: Az ElNémo szerver által megjelenített irányok. a) x0, b) x90, c) y90.

3. A PhAAP fehérje szerkezete 3.1. A monomer felépítése A PhAAP enzim 622 aminosavból áll, amelyek két domént alkotnak. Ezek a komplexben egymáshoz képest félig nyitott helyzetben vannak rögzítve, szemben a POP család többi tagjával, ahol a domének szétnyílhatnak. Míg általában ennek a dinamikus mozgásnak a határai szabják meg, hogy mekkora oligopeptid fér a hidroláz domén katalitikus triádjának közelébe, addig itt a méretszelekció másféle, eddig egyedülálló módon valósul meg. 3.1.1. A β-propeller domén Sok, különböző funkciójú fehérjében megtalálható ez a jellegzetes doménszerkezet. 4-8 lapát építi fel, amik egyenként négy antiparallel β-szálból állnak (7. ábra). A proliloligopeptidáz családban 7 vagy 8 lapát építi fel ezt a domént. Az első és az utolsó lapát között nincs kovalens kapcsolat, vagy más extra stabilizáló kölcsönhatás, így a propelleren belül a dinamikus mozgást semmi nem gátolja, a közepén levő pórus átmérője változhat [31]. 7. ábra: A lapátok szerkezete, és a PhAAP a β-propeller doménjének felépítése. Az N-terminálistól (kék) számított 3. lapát 2. és 3. szála közé beékelődött hurok. A PhAAP fehérje propeller doménjének sajátossága az a hurok, ami a 3. lapát 2. és 3. β-szálja közé ékelődött be. Ez az inzerció szerepet játszik a fehérjekomplex struktúrájának rögzítésében, valamint a hidroláz doménnek is nagyfokú stabilitást biztosít. 14

3.1.2. A hidroláz domén szerkezete, stabilitása Az enzim másik eleme, a hidroláz domén, amely tulajdonképpen a peptidek bontását végzi. Ebben a központi nyolc β-szál körül α-hélixek helyezkednek el. Ezek közül a szélső β- szál után helyezkedik el a katalitikus triád (Ser466, Asp546, His578) hisztidinje (8. ábra). 8. ábra: A PhAAP monomer szerkezete A fehérje aktivitását feltehetően nagymértékben befolyásolja ennek a szélső β-szálnak a stabilitása, ezért külön vizsgáltuk ennek a kölcsönhatásait a hexameren belüli szomszédos AAP molekulákkal. Azt találtuk, hogy nem csak a monomer és az egymással érintkező hidroláz domének α-hélixei rögzítik, hanem a szomszédos fehérje β-propeller doménjének inzerciója is, mivel ez a hidroláz domén központi β-redőjének folytatásaként helyezkedik el. Ez az elhelyezkedés szimmetrikus, vagyis a hidroláz doménnel érintkező molekulák kölcsönösen rögzítik egymás β-élét. Vizsgáltam POP család többi tagjánál fellelhető β-él stabilizációs megoldásokat is. Azt találtam, hogy a prolil-oligopeptidázok közül mindegyikben nagyfokú stabilitás jellemzi a szélső β-szálat. Mint azt már láttuk, az ApAAP és a PhAAP fehérjéknél is folytatólagos a β- redő, az ApAAP-nél a két hidroláz domén kapcsolódása, míg a PhAAP-nél a szomszédos fehérje inzerciója következtében. 15

3.2. A PhAAP komplex felépítése 3.2.1. A monomerek közötti kölcsönhatások A negyedleges szerkezet döntően befolyásolja egy enzim működési mechanizmusát. A teljes PhAAP enzim hat monomerből áll, melyek szimmetrikus hexamert alkotnak (11. ábra). Elegendő tehát egyetlen monomer szerkezetének a meghatározása, a többit az R32 krisztallográfiai szimmetria szerint képezzük. A monomerek közötti kölcsönhatások érintik mindkét domént. 3-3 fehérje β-propeller doménje érintkezik úgy, hogy a háromból páronként az egyik első lapátja a másik második lapátjához illeszkedik (10. ábra). A hidroláz domének közül 2-2 szorosan érintkezik, de nem alkot folytonos β-redőt. Ennek a párnak a kapcsolatát a fent említett inzerció következtében létrejövő propeller-hidroláz kölcsönhatás is erősíti (9. ábra). 10. ábra: A β-propellerek közötti kapcsolatok. 9. ábra: A hidroláz-propeller kölcsönhatás. Az 1. lapátok a 2. lapátokkal illeszkednek. A propeller inzerciója a hidroláz β-redőjének folytatása. Az ApAAP fehérje felépítésében a dimer két tagja között csak hidroláz-hidroláz kölcsönhatás van, ezért az ApAAP enzimben domének szét tudnak nyílni, és szét is nyílnak a szubsztrát bejutásához és az elbontott fragmensek kijutásához. Ezzel szemben a PhAAP komplex oldalán kb. 10X30 Å méretű rések vannak (11. ábra), az oligopeptidek ezeken át juthatnak el a szubsztrátkötő zsebig, ami, ellentétben az ApAAP-vel, a fehérjemolekula oldalról nyitott üregében helyezkedik el (8. ábra). Így a méretszelektivitás a POP család többi tagjától eltérően nem azáltal valósul meg, hogy a két domén dinamikusan szét tud nyílni, tehát az PhAAP fehérje esetében új működési mechanizmust ismerhetünk meg. 11. ábra: a hexamer oldalán található 10X30 Å méretű 16

3.2.2. A hexamer dinamikája Arra is kíváncsi voltam, hogy ezek a nyílások az oldatban, működés közben is nyitva maradnak-e, vagy be tudnak csukódni? Ennek felderítésére molekuladinamikai számításokra volt szükségem, amit az ElNémo szerveren keresztül végeztem. Ez a kiszolgáló kiszámolta a legalacsonyabb frekvenciájú normál módusokat (szám szerint ötöt) a PhAAP hexamer mozgására, amit animált formátumban is megjelenített, mindhárom tengely irányából. A dinamikus mozgásokat az x-tengely felől nézve az alábbi módon ábrázolom (12. ábra): a hat monomert a hat megfelelő szín jelöli, a rövid nyilak a monomerek mozgását, a hosszúak a dimerekét (ha a két monomer együtt mozog, csak az egyikük színével jelzem). A szaggatott vonalak az elmozdulás utáni helyzetüket mutatják, ahol szaggatott vonal/nyíl nem szerepel, abban a módusban az adott monomer/dimer mozdulatlan. Ezeken az látszik, hogy az oldalsó nyílások mérete és alakja hogyan változik. Az derült ki mindebből, hogy a pórusok ugyan lélegeznek, vagyis méretük változik a mozgás során, ám sosem záródnak be teljesen. Emellett a három pórus a hexamer oldalán sohasem szűkül egyszerre, tehát a szubsztrát bejutása és a termékek távozása mindig biztosított a hexamer mozgása során. 12. ábra: A pórusméret változása, a hexamer mozgása során az ElNémo szerver számításai szerint. 17

3.3. Az aktív hely A félig szétnyílt domének miatt az oldalsó nyílásokon belépő oligopeptidek mind a hat aktív helyet meg tudják közelíteni (13. ábra a)). Az aktív helyen a katalitikus triád (Ser466, His578, Asp546) és az oxianion hely konformációja hasonló az ApAAP szerkezetben találthoz, és aktí enzimkonformációnak felel meg. A szubsztrátkötő hely összehasonlítása azért érdekes, mert az ApAAP esetén kiderült, hogy az emlős enzimekkel ellentétben nemcsak egy láncvégi védett aminosavat tud eltávolítani az oligopeptidről, hanem láncközben is képes hasítani (endopeptidáz) [32]. Ez a PhAAP esetén is beigazolódott [33]. A PhAAP szubsztrátkötő régiójának molekuláris felszínét megvizsgálva (13. ábra c) részén bekeretezve) kiderül, hogy ennek az az oka, hogy az S2-S4 régió nyitott: sem térbeli, sem elektrosztatikus akadálya nincs hosszabb peptidlánc megkötésének. Az enzim S1 zsebének alján ellentétben az ApAAP-vel savas oldallánc is található (13. ábra b)), ami magyarázza a szubsztrát-specificitásbeli eltérést a két enzim között: mindkettő elsődlegesen fenilalanin után hasítja el a peptidláncot, de a PhAAP kisebb mértékben arginin után is. A B C 13. ábra: A PhAAP aktiv helye a) A komplex oldalán bejutó szubsztrát bármelyik aktív helyhez eljuthat. b) A molekuláris felszín a szubsztrátkötő helyen (propeller domén: barna, hidroláz domén: narancssárga). c) A katalitikus triád (zölddel aláhúzva) és az S1 zseb aminosavjai. PhAAP szerkezet: narancssárga C atomok, a zsebben található 1,6 hexándiol molekula magenta. ApAAP szerkezet: drapp C atomok, a zsebben kötött acetil-fenilalanin világoskék. d) Az S1 zseb kötrnyezetének molekuláris felszíne elektrosztatikus potenciál szerint színezve (kék: pozitív, piros: negatív) 18

4. PhAAP fehérje összehasonlítása más enzimekkel 4.1. A propeller domén Mint azt már említettem, az adatgyűjtés után publikálták egy β-propeller domén szerkezetet [19], ami nagymértékben hasonlít a PhAAP β-propeller doménjére. Ez rokon fajból, a Pyrococcus furiosus származó ún. háromlebenyű fehérje (TLP). Különbség csak a hidroláz doménnel érintkező hurokrégióknál, illetve a szomszédos fehérjemolekulákkal érintkező részen van (14. ábra). 14. ábra: A TLP és a PhAAP propellerjének egymásra illesztése. A bal oldali kép felülről jobb oldali alulnézetből, a hidroláz domén felől készült. A TLP molekula szürke, a PhAAP cián színnel van ábrázolva narancssárgával jelezve azokat a részeket, amik a molekulán belül a hidroláz doménnel, és magentával, amik a szomszédos fehérjével érintkeznek. 4.2. A hidroláz domén stabilitása A fent leírt sajátos megoldás a hexamer szerkezetének rögzítésére felvetette, hogy meg kellene vizsgálni, más enzimeknél is szerepel-e hidroláz domén β-redőjének kibővítése vagy a szélső β-szál valami egyéb módon stabilizálva van-e. Ugyanis az ez utáni hurkon helyezkedik el a katalitikus hisztidin, ezért a β-él destabilizációja az aktivitás rovására mehet. Első lépésben a POP enzimcsalád tagjait vizsgáltam meg (14. ábra), és azt találtam, hogy minden esetben található valamiféle erős kölcsönhatás a β-él és az enzimnek a fehérjemolekula hidroláz doménjén kívüli része között. Az acil-aminoacil peptidázoknál a hidroláz domén β-redője folytatódik, az ApAAP dimernél a két hidroláz kapcsolódásával, a PhAAP esetén pedig a szomszédos molekula inzerciójával. A prolil-oligopeptidáznál (POP) a 19

szélső β-szál a fehérje N-terminálisán levő α-hélix-szel van kölcsönhatásban. A dipeptidilpeptidáz IV (DPP4) dimerje esetén a két hidroláz domén úgy érintkezik a két szélső β-szálnál, hogy nem alkotnak folytonos β-redőt, hanem a két β-él egymást keresztezi (15. ábra). 15. ábra: A POP enzimcsaládban előforduló β-él stabilizáló megoldások Hidroláz domén: világoskék, propeller domén: sötétkék. A β-él széle és a katalitikus hisztidint tartalmazó hurok magenta. A második, kölcsönható fehérjemolekula megfelelő színei: sárga, zöldessárga, vörös. A katalitikus hisztidint térkitöltő ábrázolással jelenítettem meg. Az α/β hidroláz klánban megnéztem a POP családdal közvetlen rokonságban álló enzimcsaládokat is. Nem minden esetben, de találtam példákat hasonló β-él stabilizáló szerkezetekre. Az S10 peptidáz családban úgy valósul ez meg, hogy a molekula plusz egy vagy kettő - két β-szálat tartalmazó - inzerció beépülésével a központi β-redőt még kettő vagy négy β-szállal bővíti (16. ábra). 16. ábra: Az S10 család hidroláz domén Az 1ac5 jelű fehérje esetén négy, az 1whs jelűnél két β-szállal bővül a központi β-redő. 20

Összefoglalás Munkám során elsőként sikerült meghatározni a PhAAP enzim monomerjének és komplexének szerkezetét. Normál módus elemzést végeztem az enzim lehetséges mozgásának leírására. Ezek alapján elmondható, hogy az általam vizsgált fehérjénél újszerű módon valósul meg a méretszelektivitás. A szubsztrátmolekulák nem a domének szétnyílásával, hanem a komplex oldalán levő nyíláson keresztül jutnak el az aktív helyhez. Összehasonlítottam különböző enzimek hidroláz doménjében szélső β-szálak kölcsönhatásait, és azt tapasztaltam, hogy a POP család minden tagját nagyfokú β-él stabilizáció jellemzi. További tervek: Kutatási eredményeim publikálása folyamatban van. Köszönetnyilvánítás Mindenek előtt köszönet illeti témavezetőmet, Harmat Veronikát, aki munkámat irányította, hasznos tanácsokkal látott el és mindvégig biztatott. Szeretnék továbbá köszönetet mondani az Enzimológiai Intézetben dolgozó Polgár László csoportjának, köztük Kiss Andrásnak, akik a fehérjét előállították, és az oldatbeli vizsgálatokat végezték. Köszönettel tartozom az ELTE Fehérjekrisztallográfiai Laboratórium vezetőjének Náray-Szabó Gábornak, és Perczel Andrásnak, hogy lehetőséget adtak a csoportban a diákköri munka végzésére. S köszönet illeti még a csoport tagjait, Rádi Krisztinát és Hornung Balázst, akik a fehérjét kristályosították. 21

Rövidítések AAP: acil-aminoacil peptidáz, az acilpeptid hidroláz ennek a szinonimája ApAAP: Aeropyrum pernix AAP DPP4: dipeptidil-peptidáz IV PhAAP: Pyrococcus horikoshii AAP POP: prolil oligopeptid peptidáz TLP: Pyrococcus furiosus háromlebenyű proteáz (trilobed protease) Irodalomjegyzék [1] Boross László Sajgó Mihály A biokémia alapjai pp. 143. Mezőgazda, (2003) [2] Nardini, M. and Dijkstra, B. W.: α/β Hydrolase fold enzymes: the family keeps growing. [3] Rawlings N. D., Polgár, L. and Barrett, A. J. J. Biochem. 279; 724 729 (1991). [4] Kanatani, A., Masuda, T., Shimoda, T., Misoka, F., Lin, X. S., Yoshimoto, T. et al. J. Biochem. 110; 315-320 (1991). [5] Rawlings, N. D. and Barrett, A. J. Methods Enzymol. 244; 19-61, (1994). [6] Polgár, L. FEBS Lett. 311; 281-281 (1992). [7] Polgár, L. Cell. Mol. Life Sci. 59; 349-362 (2002). [8] Jones, W. M., Manning, L. R. and Manning J. M. Biochem. Biophys. Res. Comm. 139; 227-231 (1986) [9] Tsunawa, S., Narita, K. and Ogata, K. J. Biochem (Tokyo) 77; 89-102 (1975) [10] Scaloni, A., Jones, W.M., Pospischil, M., Scheewind, O., Popowicz, A., Bossa, F. et al. J. Lab Chin. Med. 120; 546-552 (1992) [11] Mitta, M., Asada, k., Uchimura, Y., Kimizuka, F., Kato, I., Sakiyama, F. et al. J. Biochem. 106; 548-551 (1989) [12] Kobayashi, K., Lin, L., Yeadon, J., Klickstein, L. and Smith, J. J. Biol. Chem. 264; 8892-8899 (1989) [13] Richards, P. G., Johnson, M. K. and Ray, D. E. Mol. Pharmacol. 58; 557-583 (2000) [14] Duysen, E. G., Li, B., Xie, W., Schopfer, L. M., Anderson, R. S., Broomfield, C. A. and Lockbridge, J. Pharmacol. Exp. Ther. 299; 528-535 (2001) [15] Jones, W. M. and Manning, J. M. Biochim. Biophys. Acta 953; 357-360 (1988) [16] Erlandsson, R., Boldog, F., Persson, B. et al Oncogene 6; 1293-1295 (1991) 22

[17] Blundell, T.L. & Johnson, L.N. Protein Crystallography, Academic Press, London, (1976) [18] Robertson, J.M. J. Chem. Soc., 615-25 (1935) [19] Bosch, J. et al. Acta Crystallographica D63, 179-182 (2007) [20] Sanderson, M.R., Skelly, J.V.S. Macromolecular Crystallography conventional and high-throughput methods Oxford University Press (2007) [21] Kabsch, W. J. Appl. Cryst. 26, 795-800 (1993) [22] Collaborative Computational Project, Number 4. (1994) Acta Cryst. D50, 760. [23] K. Cowtan, Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein Crystallography, 31, p34-38. (1994) [24]Sheldrick, G.M., Acta Cryst. A64 112-122. (2008) [25] Langer, G., et al. Nature Protocols. 3 1171-1179. (2008) [26] "Coot: model-building tools for molecular graphics" Emsley P, Cowtan K Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 60: 2126-2132. [27] Vagin, A.A. and Dodson, E.J. "Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method" G.N. Murshudov, Acta Cryst. D53, 240-255. (1997) [28] Winn, M., Isupov, M. & Murshudov, G.N. Use of TLS parameters to model anisotropic displacements in macromolecular refinement. Acta Cryst D57: 122-133. (2001) [29] DeLano, W.L. (2002) http://pymol.sourceforge.net [30]Suhre, K. & Sanejouand, Y.H. ElNemo: a normal mode web-server for protein movement analysis and the generation of templates for molecular replacement. Nucleic Acids Research, 32, W610-W614, (2004) [31] V. Fülöp, D.T. Jones, Cur. Opin. Struct.Biol. 9, 715-721 (1999) [32] Kiss, A.L., Hornung, B., Radi, K., Gengeliczki, Z., Sztaray, B., Juhasz, T., Szeltner, Z., Harmat, V., Polgar, L., J. Mol. Biol. 368, 509 520. (2007) [33] Szeltner, Z., Kiss, A.L., Domokos, K., Harmat, V., Náray-Szabó, G. & Polgár, L. Biochim Biophys Acta 1794: 1204-1210 (2009) 23