Preeclampsia-asszociált extracelluláris vezikulák hatása(i) a monocita sejt működésére Kovács Árpád Ferenc 1, Láng Orsolya 1, Kőhidai László 1, Rigó János 2, Turiák Lilla 3, Fekete Nóra 1, Buzás Edit 1, Pállinger Éva 1 1 Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Semmelweis Egyetem; 2 1-es számú Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, Semmelweis Egyetem 3 Szerves Kémiai Intézet, Természettudományi Kutatóközpont, MTA
135 millió újszülött 10 millió újszülött 2
Preeclampsia kialakulása kezdetét veszi Preeclampsia tüneteinek megjelenése Preeclampsia okozta koraszülés Hatékony szűrőmódszer Magas rizikó kezelés és szoros monitorozás Alacsony rizikó várandósság követése Egészséges újszülött és édesanya 3
Trophoblast a várandósság karmestere Deciduális stroma sejtek Immunsejtek Táplálkozás Epigenetikai mechanizmusok Trophoblast invázió Oxidatív stressz Hormonális tényező Imprintált gének Transzporterek Citoarchitektúra Méhlepény növekedése, fejlődése és működése Genetikai tényezők Habituális vetélés Preeclampsia IUGR Koraszülés Környezeti tényezők 4
Extracelluláris vezikulák (EV) 5
EV szerepe a várandósságban Keringő extracelluláris vezikulák Spirális artéria remodelling 6
Célkitűzés Keringő preeclampsia-asszociált extracelluláris vezikulák hatásának a vizsgálata monocita sejteken 7
Módszer (1) K3 - EV Protein tartalom - MS DNS sejtciklus analízis- FACS P- EV mrns relatív expresszió - qpcr Migráció Neuropore assay Motilitás és migráció- Holomikroszkópia Fagocitózis - FACS MV- THP-1 kötődés - FACS Sejtfelszíni fehérje expressziós-facs THP-1 8
Módszer (2) Thp1 sejt Letapadt Thp1 sejt MV Vizsgálati csoportok: Egészséges 3. trimeszteres Preeclampsiás 3. trimeszteres 9
M V 1 m ik ro lite r p la z m á b a n Eredmények (1) Keringő EV mintázat 1 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 K 3 P 6 0 0 0 0 4 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 H L A -G C D 6 2 C D 4 1 A n n e x in V Preeclampsia: alacsonyabb CD41, AnnexinV + expresszió az EV-kon 10
Apoptótikus test PI festődés Eredmények (2) EV jellemzés (1) 5400 5300 * 5200 5100 5000 4900 4800 4700 4600 4500 4400 4300 K3 P Preeclampsia: emelkedett PI apoptótikus test szám 11
Eredmények (3) EV THP-1 kötődés 12
Eredmények (4) EV THP-1 fagocitózis Keringő MV-k fagocitózisa a THP-1 sejtek által K3 P Preeclampsia: csökkent fagocitózis 13
Keringő Evk exofaciális foszfatidilszerin expressziója E x o f a c i a l p h o s p h a t id y ls e r in e e x p r e s s io n o f c ir c u la t in g E V s Keringő AnnexinV + EVk Eredmények (5) EV jellemzés (2) 5 0 * * * 4 0 3 0 2 0 1 0 0 C O N T R P K3 P K3 P Don t eat me?! Preeclampsia: alacsonyabb foszfatidilszerin expresszió az EV-kon 14
Exofaciális CD47 a HLA-G+ trophoblast eredetű MV-kon (MFI) Eredmények (6) EV jellemzés (3) K3 P Preeclampsia: alacsonyabb CD47 + expresszió a HLA-G + EV-kon 15
S e jt-in d e x Eredmények (10) THP-1 adhézió mérés 0.0 7 5 0.0 7 0 0.0 6 5 0.0 6 0 0.0 5 5 0.0 5 0 0.0 4 5 T H P 1 + K 3 M V T H P 1 + P M V T H P -1 K3 P T H P 1 + K 3 M V T H P 1 + P M V T H P -1 Preeclampsia: fokozott kinetikájú kitapadás 16
Eredmények (6) Sejtfelszíni adhéziós fehérjemintázat (1) CD44+ (24h) Integrin α2+ (24h) Integrin β1+ (24h) 1 5 0 4 0 3 5 0 1 0 0 3 0 3 0 0 5 0 2 0 1 0 2 5 0 2 0 0 0 0 1 5 0 K 3 M V k e z e lt P M V k e z e lt T h p 1 K 3 M V k e z e lt P M V k e z e lt T h p 1 K 3 M V k e z e lt P M V k e z e lt Preeclampsia: csökkent Integrin α2 és emelkedett integrin β1 T h p 1 17
Eredmények (7) Sejtfelszíni adhéziós fehérjemintázat (2) Integrin α2+ (72h) Integrin β1+ (72h) 4 0 3 5 0 3 0 3 0 0 2 0 2 5 0 1 0 2 0 0 0 1 5 0 K 3 M V k e z e lt P M V k e z e lt T h p 1 K 3 M V k e z e lt P M V k e z e lt T h p 1 Preeclampsia: csökkent Integrin α2 és emelkedett integrin β1 18
C h e m o ta x is a c t [% ] C h e m o ta x is a c t [% ] THP-1 sejtek kemotaxisa 1 0 0 0 8 0 0 P K 3 Eredmények (9) 6 0 0 2 5 0 2 0 0 1 0 0 0 1 5 0 1 0 0 9 0 0 M V 1 x E x o 1 x E V fr e e 1 x M é d iu m 8 0 0 7 0 0 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 P K 3 M V 1 x E x o 1 x Preeclampsia: csökkent kemotaxis indukció 19
Átlagos migráció (µm) Átlagos motilitás (µm) Eredmények (11) THP-1 migráció és motilitás Motilitás (megtett út hossza) Migráció (végpontok közti távolság) 150 1100 140 1000 130 900 120 800 110 100 90 700 600 80 500 70 60 50 40 THP-1 K3 + THP-1 P + THP-1 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 400 300 200 100 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 THP-1 K3 + THP-1 P + THP-1 Idõ (egység = 20 sec) Idõ (egység = 20 sec) Preeclampsia: csökkent motilitás 20
% Sejtciklusvizsgálat Eredmények (8) 6 0 4 0 2 0 0 S u b G 1 fá z is G 0 /G 1 fá z is S fá z is M fá z is T H P -1 + K 3 M V T H P -1 + P M V T H P -1 21
r e la tív m R N S e x p r e s s z ió r e la tív m R N S e x p r e s s z ió Eredmények (14) Gyulladásos citokin génexpresszió 1 0 TNF-α 0.0 1 0 IL-6 K 3 M V 8 0.0 0 8 P M V 6 0.0 0 6 K 3 e x o P e x o 4 0.0 0 4 T H P -1 2 0.0 0 2 0 0.0 0 0 2 h 2 4 h 2 h 2 4 h Preeclampsia: elhúzódó gyulladásos hatás 22
Eredmények (7) Proteomikai jellemzés MV-ben azonosított fehérje 424 protein 375 protein 15 (21,4%) 39 (55,7%) 16 (22,9%) (n=6) K3 54 protein P 55 protein (n=6) 23
Eredmények (12) Proteomika (1) Protein Elhelyezkedés Fő hely Placenta PBMC Endometrium ACTN1 FLNA PFN1 TLN1 intracelluláris intracelluláris intracelluláris, szecernált intracelluláris plazma membrán, fokális adhézió plazma membrán, citoplazma, citoszkeleton +++ N/A +++ +++ +++ +++ citoplazma ++ +++ ++ plazmamembrán, MTOC +++ +++ ++ URP2 intracelluláris N/A + (RNS) N/A minimális (RNS) VINC intracelluláris fokális adhézió ++ +++ ++ http://proteinatlas.org + alacsony; ++ közepes; +++ magas expressziós szint 24
Eredmények (13) Migrációval kapcsolatba hozható fehérjék ACTN1 FLNA PFN1 TLN1 http://pantherdb.org URP2 VINC 25
Eredmények (15) Gyulladással kapcsolatba hozható fehérjék A1AG1 AACT http://pantherdb.org 26
Megbeszélés Keringő MV mintázat eltérő a K3 és P csoportban A K3-MV, illetve a P-MV eltérő mértékben befolyásolja a monociták mükődését Keringő MV fehérjeösszetétele eltérő a K3 és P csoportban 27
Továbblépés 1. K3-MV és P-MV hatásának vizsgálata egészséges donorból származó monocitákra 2. Vizsgálati csoportokból származó monociták funkcionalitásának jellemzése, standardizált stimulusok hatására (pl. E.coli fagocitózis, fmlp indukálta kemotaxis) 28
Köszönetnyilvánitás Témavezető: Dr. Pállinger Éva Prof. Dr. Buzás Edit Prof. Dr. Rigó János Dr. Kőhidai László Dr. Láng Orsolya Dr. Turiák Lilla EV munkacsoport tagjainak Kemotaxis munkacsoport tagjainak Fekete Nóra Orbán Andrea "A tudomány izgalmas kaland. Ajtókat nyitogatunk, keressük az igazságot, s egyszerre ott van előttünk, mint mesebeli kincs, a maga kézzelfogható, tündöklő valóságában." (Kosztolányi Dezső) 29