PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR hematológia - vér frakcionálása Példa: teljes vérkép www.aok.pte.hu SZÉTVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK: SZEDIMENTÁCIÓ ELEKTROFORÉZIS vérplazma (55 %) BIOFIZIKA 2. 2015. március 10. Dr. Bugyi Beáta Biofizikai Intézet 1000 g, 5-10 min fehérvérsejtek vérlemezke(< 1%) vörösvérsejt (45 %) vérszérum elektroforézise Példa: egészséges (A, C) és mielómamultiplex (plazmasejtes mielóma, Kahler betegség, plazmasejt rák)-ben szenvedő páciens (B, D) elektroforetogrammja Szedimentáció, elektroforézis Biofizikai aspektus RÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBEN SZEDIMENTÁCIÓ részecskék mozgása centrifugális erõtérben ELEKTROFORÉZIS részecskék mozgása elektromos erõtérben Forrás: http://bestpractice.bmj.com/best-practice/monograph/179/diagnosis/step-by-step.html 1
Folyamatábra vizsgált objektum: részecske szuszpenzió (vér-, vizelet, csontvelõminta, sejt, sejtalkotók, fehérjék, nuklein savak ) mûszer: laboratóriumi centrifuga/elektroforézis készülék mért mennyiségek: optikai jel (abszorpció, fényszórás, fluoreszcencia emisszió) információ/eredmény: fizikai, kémiai, biológiai jellemzõk (méret, molekulatömeg, alak, sûrûség, izoelektromos pont, nukleotid szekvencia) Szedimentáció SZEDIMENTÁCIÓ részecskék mozgása centrifugális erõtérben ANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁS részecskék tömegének és méretének meghatározása SZEDIMENTÁCIÓS SEBESSÉGI MÓDSZER SZEDIMENTÁCIÓS EGYENSÚLYI MÓDSZER PREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁS részecskék elválasztása DIFFERENCIÁLCENTRIFUGÁLÁS» méret és molekulatömeg alapján GRADIENS CENTRIFUGÁLÁS» sûrûség alapján Részecskék mozgása a Föld gravitációs erõterében úóá óő éé :sűrűség közeg < : sűrűség részecske 9.81 6 ó úóá éé éé úóá ó A TEST RÉSZECSKE ÜLEPEDÉSI (SZEDIMENTÁCIÓS) SEBESSÉGE gyorsulás gravitációs sűrűség erőtér tömeg 1 alak Részecskék mozgása a Föld gravitációs erõterében Becsüljük meg, hogy a fenti körülmények között mennyi ideig tart, míg egy fehérje a Föld gravitációs terében 1 cm-t ülepszik? ~10, ~10, A) néhány nap 1.38 10, 273, B) hónapok C) több száz év ~10 ~300 é MIÉRT? GRAVITÁCIÓS TÉRERŐ < DIFFÚZIÓ! HOGYAN? GYORSÍTHATÓ A RÉSZECSKE ÜLEPEDÉSE? TÉRERŐ > DIFFÚZIÓ 9.81, 10 1 nem a részecskére jellemző, hanem az erőtérre 2
Mûszer laboratóriumi centrifuga Egy kis kitekintés 20 G centrifuga (NASA Ames Research Center, Kalifornia) Részecskék mozgása a centrifuga erõterében helyett úóá á óő 2π körfrekvencia :sűrűség közeg < : sűrűség részecske ~ 6 forgó mozgás forgástengely ó úóá á á úóá ó A RÉSZECSKE ÜLEPEDÉSI (SZEDIMENTÁCIÓS) SEBESSÉGE gyorsulás sűrűség centrifugális erőtér tömeg 1 alak A részecske sebessége a forgástengelyhez közeledve csökken. Részecskék mozgása a centrifuga erõterében helyett RELATÍV GYORSULÁS á 0.011 10 GRAVITÁCIÓS GYORSULÁS: g = 10 m/s 2 sebesség változás: 36 km/h másodpercenként Az emberek átlagosan 3-5*g-t tolerálnak. ALACSONY FORDULATSZÁM N ~ 1000 rpm *g visszatérve a fehérjére ~10 ~3 é MAGAS FORDULATSZÁM N ~ 100.000 rpm (100x)..*g (10.000x!! = 100 2 ) visszatérve a fehérjére ~10 ~ 3 ó 3
Szedimentációs mobilitás á é őé SZEDIMENTÁCIÓS MOBILITÁS (S: Svedberg, Theodore Svedberg) 1 ~ 6 Svedberg: a részecskék ülepedését jellemző fizikai mennyiség szedimentációs sebesség egységnyi erőre [Svedberg] = 1S = 10-13 s (SIegység) Szedimentációs mobilitás részecske szedimentációsmobilitás (S, 10-13 s, 20 o C) molekulatömeg (Dalton) O2 0.12 32 glükóz 0.18 180 inzulin monomer 1.5 6000 ribonukleáz 1.75 13.683 lizozim 2.03 17.200 inzulin 1.84 24.430 szérum albumin 4.3 68.460 kataláz 10.7 250.000 dohánymozaik vírus 175 31.340.000 175175 10 s 10 175 10 s 10. Analitikai ultracentrifugálás szedimentációs sebességi módszer N magas ülepedés koncentráció (c) ~abszorpció ~ fluoreszcencia idő, forgástengelytől mért távolság (r) a részecskék koncentrációjának időbeli eloszlása a forgástengely mentén:, 1 2 tömeg, ~ 1 diffúziós együttható (mérni kell!) Boltzmann állandó hőmérséklet A tömeg meghatározása diffúziós mérésekkel! ~ centrifugálás sebessége Analitikai ultracentrifugálás szedimentációs egyensúlyi módszer N alacsony koncentráció ~abszorpció ~ fluoreszcencia diffúzió ülepedés forgástengelytől mért távolság (r) ülepedési sebesség = 0 egyensúly a diffúzió és az ülepedés között a részecskék egyensúlyikoncentráció eloszlása a forgástengely mentén (Boltzmann eloszlás): tömeg Boltzmann állandó hőmérséklet 1 2 ~ centrifugálás sebessége 1 ~ A tömeg meghatározása! 4
Preparatív ultracentrifugálás differenciálcentrifugálás Preparatív ultracentrifugálás gradiens centrifugálás SZÖVETALKOTÓK SZÉTVÁLASZTÁSA ÜLEPEDÉSI SAJÁTSÁGAIK ALAPJÁN szövet homogenizátum sejt, sejtmag, citoszkeleton, membrán ALKOTÓK SZÉTVÁLASZTÁSA SŰRŰSÉGÜK ALAPJÁN SŰRŰSÉG GRADIENS minta mitokondrium, lizozómák, perixóma mikroszóma (ER, kis vezikulák) riboszómák, makromolekulák Elektroforézis Mûszer elektroforézis készülék ELEKTROFORÉZIS részecskék mozgása elektromos erõtérben SZABAD ELEKTROFORÉZIS GÉLELEKTROFORÉZIS POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS fehérjék NATÍV GÉLELEKTROFORÉZIS» részecskék szétválasztása méret, alak és töltés alapján DENATURÁLÓ GÉLELEKTROFORÉZIS» részecskék szétválasztása méret alapján IZOELEKTROMOS FÓKUSZÁLÁS» részecskék szétválasztása izoelektromos pont alapján 2D ELEKTROFORÉZIS» részecskék szétválasztása méret és izoelektromos pont alapján AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS nuklein savak» részecskék szétválasztása méret alapján 5
Részecskék mozgása elektromos erõtérben Elektroforetikus mobilitás potenciálkülönbség pozitív részecskék kationok negatív részecskék anionok Negatív elektróda úóá Pozitív elektróda úóá úóá A RÉSZECSKE ELEKTROFORETIKUS SEBESSÉGE töltés alak elektromos térerősség á é éő ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS u: a részecske elektroforetikus mobilitását jellemzi a részecske elektroforetikus sebesség egységnyi erőre [u] = m 2 *V -1 *s -1 Gélelektroforézis mátrix, gél Natív és denaturáló gélelektroforézis akrilamid koncentráció (%) lineáris szétválasztási tartomány (kda) poliakrilamid (PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis), agaróz alapú térhálós polimer térháló pórusméret makromolekulák méret szerinti szétválasztása agaróz koncentráció (%) DNS méret (bázispár) 5 57-212 0.2 5000-40000 7.5 36-94 0.4 5000-30000 10 16-68 0.6 3000-10000 15 12-43 0.8 1000-7000 koncentráció pórusméret méreartomány 1 500-5000 2 200-1500 3 100-1000 NATÍV NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ KÖRNYEZET natív állapotú fehérje szétválasztás: MÉRET SZERINT ALAK SZERINT TÖLTÉS SZERINT DENATURÁLÓ (SDSPAGE) REDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZET SDS (nátriumdodecilszulfát, anionos detergens) negatív töltés β MEA(β-merkaptoethanol) diszulfid hidak felbomlása hőkezelés denaturáció szétválasztás: MÉRET SZERINT független a részecske natív töltésétől független a részecske natív alakjától 6
Izoelektromos fókuszálás 2D elektroforézis KEZDETBEN: inhomogén eloszlás 1D: ph gradiens izoelektromos fókuszálás ph gradiens negatív töltésű pozitív töltésű EREDMÉNY: izoelektromos pont szerinti eloszlás 1D: SDSPAGE méret szerinti szétválasztás ph gradiens szétválasztás: IZOELEKTROMOS PONT SZERINT 2D elektroforézis Gélek színezése méret izoelektromos pont Coomassie blue fehérje ezüst festés fehérje fluoreszcens festés fehérje ethidium bromide DNS/RNS méret (bázispár) érzékenység 5-25 ng 0.25-1 ng 0.25 8 ng 0.5-5.0 ng mechanizmus megjelenés Coomassie blue kötődése a bázikus és hidrofób aminosavakhoz abszorpció kék ezüst ionok kötődnek a karboxilsav, imidazol, szulfhidril, amino csoportokhoz abszorpció sötétbarna fluoreszcencia emisszió DNS interkalátor fluoreszcencia emisszió Egér agyából származó minta 2D elektroforézise, forrás: www.bio-rad.com 7
kvantitaív és kvalitatív elemzés kvantitatív elemzés, szétválasztás: MÉRET SZERINT (MOLEKULATÖMEG, BÁZISPÁR) TÖLTÉS SZERINT ALAK SZERINT IZOELEKTROMOS PONT SZERINT kvalitatív elemzés: MÉRET (MOLEKULATÖMEG, BÁZISPÁR) MEGHATÁROZÁS MENNYISÉG MEGHATÁROZÁS IZOELEKTROMOS PONT MEGHATÁROZÁS kvalitatív elemzés molekulatömeg meghatározás 1. ismeret molekulatömegű fehérjék (standard) 2. ismeretlen molekulatömegű fehérje http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/notes/protein_properties/protein_purification.htm vérszérum elektroforézise ELEKTROFORETOGRAMM mennyiség elektroforetikus mobilitás protein normál érték Albumin 55.8-65% α1 globulin 2.2-4.6 % α2 globulin 8.2-12.5 % β(1+2) globulin 7.2-14.2 % γ globulin 11.5-18.8 % Szedimentáció, elektroforézis kulcsfogalmak Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos) Analitikai és preparatív ultracentrifugálási módszerek Szabad-,, és gél-elektroforézis Natív, denaturáló gélelektroforézis,, izoelektromos fókuszálás, 2D gélektroforézis Minõségi és mennyiségi elemzés Korábban ismertetett fogalmak: hidrosztatika - felhajtóerõ, abszorpció, fluoreszcencia, fényszórás www.aok.pte.hu 8