Az (N)MR(I) módszer elve

A biomolekuláris szerkezet és dinamika vizsgáló módszerei Az (N)MR(I) módszer elve Dr.Fidy Judit 215 május 5 Biomolekuláris szerkezet? (összefoglalás az eddig tanultak alapján) Nagyságrendek - sejtek, sejtorganellumok ~ 1-1 μm - makromolekulák és komplexeik ~.1-1 nm Aktin filamentumok Mikrotubulusok Sejtmag Ion-transzport fehérje és membrán-lipidek atomjai a H-ek nélkül, környezetben víz és ionok Két doménből álló fehérje polipeptid lánca és másodlagos szerkezeti elemei A szerkezetmeghatározás módszerei 1. Sejtek, sejtorganellumok 2. Makromolekulák és komplexeik Mérettartomány módszer ~μm Konfokális mikroszkóp Multifoton gerjesztés Fluoreszcens jelzés Központi idegrendszer kék Mikrotubulusok - zöld Fénymikroszkópia? Abbe elve: Drosophila melanogaster embrio Felbontóképesség: 1/δ δ =.61 λ λ 2nm nsinα 2 Mikroszkópi technikák felbontása TIRFM, szuperrezolúciós mikroszkóp (+fluoreszcens jelzés) < 2 nm DNS-re feltekeredett fehérje-filamentum AFM, elektron mikroszkópia ~ 1, 1 nm EM-képe UV-VIS abszorpciós és fluoreszcencia spektroszkópia IR és CD spektroszkópia 3. Makromolekulák molekulák szerkezete atomi részletességgel Röntgen-diffrakció (makromolekulák kristályain!) NMR spektroszkópia (kisebb tartományok szerkezete, nagy koncentráció!) (Tömegspektrometria) A tormaperoxidáz enzim atomi részletességű szerkezete

A szerkezet dinamikájának jellemzése Új anyag: Szerkezeti Dinamika ~ belső atomi mozgások összessége (másodlagos kötések felszakadása visszaépülése) Jellemzése: fizikai jelek időbeli változása pl. 1. fluoreszcencia élettartam v. lecsengési idő mennyire van lehetőség egy energia-átvevő molekulával való ütközésre Az atommag mágneses rezonancia jelensége, és alkalmazása: - NMR spektroszkópia - MR képalkotó diagnosztikai módszer (MRI) 2. mágneses momentumok orientációjának relaxációs sebessége az orientáló hatás megszűnte után l. később:nmr paraméterek Ábrák: Kastler-Patay: MRI orvosoknak, Folia Neuroradiologica, 1993 1. Történelmi háttér jelenség és alkalmazások NMR -spektroszkópia Bloch, Purcell, 1946 1952: Nobel-díj I. A mag mágneses rezonancia jelensége MRI: első élő felvétel 1973 első rétegvizsgálat 1977 első emberi agyvizsgálat 198 Felix Bloch 1912-1977 Edward Mills Purcell 196-1983 EPR Electron Paramagnetic Resonance elektron spektroszkópiai módszer magyarul: ESR Elektron-Spin Rezonancia-spektroszkópia

2. Az atommagok spin-állapottal rendelkeznek, hasonlóság az elektronnal 3. A spin-állapot (saját impulzusmomentum/perdület) kvantált viselkedése Az atommagok alkotói: protonok és neutronok P N Rendelkeznek saját impulzusmomentummal: spinnel S N =S P =1/2 kvantumszám azonos mint az elektron! Modell: elektron r A saját impulzusmomentum viselkedése azonos az elektron-pályákhoz tartozó impulzusmomentum kvantált viselkedésével: Nagysága kvantált: Planck állandó L h = L = l l 2π L r S ( + 1) r r r L = mv L r A spin-állapot eredete a nukleonok kvark-szerkezete: N és P egyenként 3-3 de különböző kvarkból állnak kvarkok: ½ spin-kvantumszámú, tömeggel és elektromos töltéssel bíró alkotók l=,1,2,..n-1 mellékkvantumszám Modell: pályáján körbe forgó elektron (m tömeg, v sebesség, r pályasugár) mozgásához tartozó impulzusmomentum vektor Iránya nagysága: L = mvr L iránya is kvantált: iránykvantálás A spin-momentum hasonlóan kvantált viselkedése H(z) L Pl. l= 2 5-féle irány L x és L y nem meghatározott Egy kitűntetett irány pl. H (z) mágn. térhez viszonyítva csak meghatározott irányok L cos Θ = L = h 2π z m l (m l =,+/-1, +/-l) Mágneses kvantumszám 2l +1 -féle Nagysága : r S = S = h S( S + 1) 2π Iránya kvantált: S cos Θ = S = h 2π z m S H r (z) m S : spinhez rendelt mágneses kvantumszám 2S+1-féle értéket vehet fel 2-féle beállás m S = +1/2 és -1/2 S r

4. Impulzusmomentummal rendelkező elektromos töltéssel bíró részecskék mágneses dipólus-momentummal is rendelkeznek A spin-mágneses momentum iránykvantáltsága Impulzusmomentum~körmozgás töltés körmozgása=köráram mágneses dipólus μ l = e 2 m r L Mágneses momentum vektor elektron töltése elektron tömege Iránya párhuzamos az impulzusmomentummal, iránykvantálás irányítottsága ellentétes A spin-momentumhoz is tartozik mágneses momentum! e r μ S = 2 S 2 m = e r μ 2 = e 2 h S S s ( s + 1 ) 2 m 2 m 2 π r, = e r μs z 2S 2m m = ± 1 S 2 z = e 2 h m 2m 2π S = e h m 2m π 2 irány z-irányú vetület nagysága azonos S H r (z) Az elektron spin állapotához tartozó saját mágneses momentum z irányú vetületének nagysága: Bohr magneton μ B az xy-síkra vett vetülete nem meghatározott! eh 4π m elektron töltése elektron tömege 5. Az atommagok spin-állapotához tartozó mágneses momentum N P Irányitottságuk ellentétes, és μ N < μ P μ μ μ e, z N, z P, z μ g = = 2 s μ B = 2 s = 2 s eh 4πm n = μ B ( 1.91 ) ( 2.79 ) Giromágneses konstans μ g μ g m P ~184m e!! μ g << μ B A nukleonok mágneses momentuma jóval kisebb, mint az elektroné Több nukleonból álló atommagok spin-mágneses momentuma több nukleon, párosával energiaszinteken, ellentétes spinnel 3 1 = H kétnneutron μn egyn proton μmag = μp = = 2.79 μg A páros számu nukleonok ellentétes momentumai közömbösítik egymást 3 μg 2 μ N μ P 3 A mag momentuma =, ha a protonok v. neutronok száma ptl. szám

A H-atommag (proton) - momentum jelentősége: μ P kiemelkedően nagy Az élő szervezet atomjainak mágneses momentuma M ag n p 2 1 H 3 1 H 3 2 He 4 2 He 6 3 Li 7 3 Li 9 4 Be 1 5 B I h-ban 1/2 1/2 1 1/2 1/2 1 3/2 3/2 3 μ μ g - ben M ag -1,91 12 6 C +2,79 13 6 C -,86 14 7 N +3 15 7 N -2,1 16 8 O 17 8 O +,8 36 17 Cl -3,2 115 49 In -1,2 28 82 Pb -1,8 29 83 Bi I h-ban 1/2 1 1/2 5/2 2 9/2 9/2 μ μ g -ben +,7 +,4 -,28-1,9 +1,3 +5,5 +4 h = h 2π Milyen atommagoknak lesz jele mágneses kölcsönhatásban? Diagnosztika a szervezetben előforduló atommagok? páratlan atomszámúak? 1 H 13 C 19 F 23 Na 31 P I impulzusmomentum h -ban van megadva Az anyagokban igen sok H van eredő momentum nagy Atomok 2/3-a H! Nagy mágneses momentum! Sok legyen belőle! Proton-MRI 6. A protonok mágneses momentuma mágneses térben iránykvantálást mutat energetikailag is különböző állapotok Klasszikus viselkedésű mágneses momentum energiája mágneses térben E = H r ~ B r E B μ cosφ = E Bμ z φ μ r Zeeman effektus Zeeman felhasadás Kvantumos viselkedésű spin-mágneses momentumok mágneses térben kétféle orientációt vesznek fel, ezek energiában különböző állapotok, és az energiakülönbség lineárisan nő a mágneses tér nagyságával E E 2 antiparallel Az energia mágneses tér nélkül E csökken, ha cos φ nő a mágneses tér orientálja a momentumot parallel irányba E ΔE =2μ B Z Kvantumos viselkedésű mágneses momentum kétféle orientáció parallel és antiparallel orientációk energia-különbség ( E E ) ( E E ) ΔE = E 2 E1 = o mágn.2 = μb cos φ + μb cos φ = 2 μ B Z mágn.1 Zeeman féle energiafelhasadás = mágneses tér nélkül: E energia 1T 2T B E 1 parallel T:Tesla 1 Tesla= 1 Gauss Föld mágneses tere ~.5 Gauss

A proton-spin mágnesek orientációja precessziós mozgással történik A precesszió frekvenciáját a Zeeman felhasadás nagysága (μ és B ) határozza meg. parallel orientáció Mint az elektron! energetikailag kedvezőbb E 1 állapot ΔE = 2μB = hf precesszió frekvenciája Larmor frekvencia Proton-momentum antiparallel orientáció E 1 < E 2 E 2 állapot Egy fontos kérdés és érdekes válasz: - Milyen frekvenciával gerjeszthető az E1 E2 átmenet? - Válasz: ΔE = 2μB = hf A gerjesztő fotonenergia frekvenciája azonos a Larmor-frekvenciával! 7. A mágneses térrel parallel és antiparallel orientált momentum vektorok eredője? Mag-mágneses momentumokra alapozott mérésekben igen kis effektus várható Az ellentétes irányú vektorok eredője =! Melyikből van több? N1 és N2 Boltzmann eloszlás: az alacsonyabb energiájú nívó populációja nagyobb N1>N2 N N 2 1 = e ΔE kt Pl. proton μ, B=.5T ΔE =2μB 1-7 ev kt (31 K) =.27eV Nagyon kis szám! ~ e =1! Az antiparallel orientációk száma alig kisebb, mint a parallel orientációké A mágneses momentumok csaknem teljesen közömbösítik egymást Az eredő vektor parallel a mágneses térrel és igen kicsi N N N 1 8 1 2 Hogyan növelhetnénk meg az effektust? Jelölés: protonok eredő momentuma M μi = M De: a gazdag információtartalom miatt mégis érdemes mérést tervezni A populáció-különbség ΔE-től függ. Nagyobb ΔE nagyobb eredő vektor ΔE = 2μB ΔE a mágneses tér nagyságával növelhető nagyobb vektor nagyobb effektus!

Proton- momentumok mágneses térben - összefoglalás A mag (spin) mágneses rezonancia jelensége A protonok mágneses momentumai mágneses térben B r - -vel parallel és anti-parallel állásúak lehetnek - a parallel orientációnak kisebb az energiája és nagyobb a populációja - mindkét orientációban precesszálnak f = 1 2 μb frekvenciával h - a két orientáció energiakülönbsége lineárisan nő B-vel -az eredő mágneses momentum vektor parallel a mágneses tér irányával - és nagysága B r -vel növelhető Spin-mágneses momentum hf = E2 E1 = ΔE = 2μB A minta mágneses térben van E 2 E 1 Mag-spin-mágneses momentum A mágneses térbe tett mintát besugározzuk olyan fotonenergiájú elektromágneses sugárzással, amely gerjeszti az E1 E2 energiaátmenetet Az energiaátmenet rezonanciában van a sugárzás fotonenergiájával II. Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy A mag mágneses rezonancia alkalmazásai II. NMR spektroszkópia A kiválasztott mag (pl. H) lokális környezete egy kémiai kötésben megváltoztatja az általa érzett mágneses teret a külső mágneses tér (B ) hatása helyett egy módosított mágneses tér hatása érvényesül kémiai eltolódás a gerjesztési fotonenergiában hf ' ( ) = 2μ B 1 ± σ Többféle kötés jelenléte többféle gerjesztési energia kémiai molekulaszerkezet Proton-NMR-spektrum (abszorpciós spektrum) hf ' hf hf ( ppm ) Az effektus igen kicsi 1 H, 13 C, 15 N, 31 P -re alapozott mérések In vivo alkalmazások is Referencia-szerkezet : tetrametilszilán Gerjesztési energiája hf

A mag mágneses rezonancia alkalmazásai III. Diagnosztikai képalkotó módszer: MR(I) A diagnosztikai kép alapjául szolgáló adatokat - a gerjesztő sugárzás kikapcsolása után mérik - mialatt a gerjesztett (antiparallel orientált) momentumok visszatérnek az alacsonyabb energiájú, parallel orientációjú állapotba 2. A mágneses tér hatása a betegben levő 1. A diagnosztikai mérés jellemzői protonokra M:kompenzálatlan momentumok Szupravezető elektromágnes tekercs Erős mágnes ΔE nagyobb Kompenzálatlan momentumok száma nő Z tengely M z nagy eredője, parallel orientáció B-vel 2μB=hf Mágneses tér hatása: -orientáció -azonos frekveciáju precesszió A B mágneses tér iránya II Z Lineárisan nő Z mentén B o +B(Z) B B O 1 Gauss.5 G földi tér Különleges rendszabályok óvatosság -De: a precesszió fázisa összehangolatlan Z Fémek, implantok, pacemaker. M xy =

3. Megfelelő gerjesztési frekvenciájú sugárzás bekapcsolása: proton-mágneses rezonancia A gerjesztés hatása: Δ E = 2μB( z) = hf A vizsgálandó testrészt rádiófrekvenciás sugárzásnak tesszük ki tekercs AC tere RF ~ 2 MHz ( ΔE) Z-től függ! vizsgálandó keresztmetszeti szelet kiválasztása a sugárzás frekvenciájával 1. Energiaátmenet E1 E2 egy adott testszeletben 2. Orientációváltás parallel antiparallel 3. A külső váltakozó feszültség-tér rákényszeríti fázisát a precessziós mozgásra a mágneses momentumok együtt forognak M xy A gerjesztés impulzus jellegű - időtartamának szerepe Az orientációváltás időt vesz igénybe! Az orientációváltás precesszálva történik (együttes precesszió) M xy Elnevezések az impulzus időtartama alapján pl.15 o Az együttes precesszió Következménye: 9 -os impulzus Merőlegesbe fordítás-ig tart A gerjesztő tekercs mágneses tere Precesszió B1 körül is hν 1 = 2μB 1 18 -os impulzus Teljes átfordítást végez Az X-Y síkban a gerjesztés alatt -Növekvő amplitudójú -Forgó mágneses momentum AC feszültség adó tekercs

A gerjesztés néhány fázisa 9 o Orientációváltás energia-képben 18 o 9 o -os impulzus 5%-os orientáció-váltás M z = Valódi mérésben : 9 és 18 fokos jelek kombinációja szekvenciák 4. Adatgyűjtés pl. 9 -os impulzus után Az MR-kép adatait a gerjesztő impulzus kikapcsolása utáni relaxáció alatt mérhető jelek jelentik Mz változik: max Mxy változik: körbeforogva csökken - orientációváltás - precesszió fázisa elhangolódik Változó mágneses tér az X-Y síkban elektromos feszültséget indukál Mz relaxációs ideje: spin-rács relaxációs idő -T1 Környező molekulák A momentum B irányú vetülete a 9 o -os impulzus után visszatér a z irányhoz M Z M Zo 1 e = τ t A ρ protonsűrüséggel arányos T1: 5 1 ms T1 A mért jel: Free Induction Decay FID --> Mz és Mxy relaxációs ideje

T1 értelmezése Milyen gyorsan sikerül ütközésekkel leadni a ΔE energiát a környezetnek? A ρ protonsűrüséggel arányos M Z M Zo 1 e = τ t Az energiaátadás feltétele, hogy az átvevő molekula vibrációs frekvenciája rezonanciában legyen a Larmor precesszióval f p ~ f mol (f viz >> f p ) T1: 5 1 ms Nagy molekulák lassú rezgései fehérjék, lipidek T1 kicsi t T1 rövid --- Mz(t) nagy --- fényes pixel --- zsírszövet világos Mxy relaxációs ideje: spin-spin relaxációs idő T2 T2 értelmezése M XY = M XY, e t τ A lokális mágneses terek miatt a koordinált precesszió elhangolódik ΔE = 2μB = hf M XY = M XY, e t τ T2 Környezet: mágneses inhomogenitás Nagy molekulák-> lassú mozgás ->inhomogenitás fennmarad -> gyors fázisvesztés -> T2 rövid T2 T2: 5 1 ms T2: 5 1 ms Nagy molekulák-> T2 rövid -> Mxy(t) kicsi -> pixel sötét Vizes közeg: inhomogenitások kiátlagolódnak -> fázisvesztés lassú -> T2 nagy -> fényes pixel

A képalkotásra használt paraméterek : ρ(protonsűrűség), T1 és T2 A T1 és a T2 szerinti fényesség-kódolás különböző szöveti tulajdonságokat emel ki: pl zsírszövet ellentétes Nagy molekulák (pl. lipidek) T1 rövid -- pixel világos T2 rövid -- pixel sötét 5. A kiválasztott testszeleten belüli felbontás 1. A rezonancia állapot gerjesztési frekvenciája kiválaszt egy testszeletet hf= 2μB(Z) f B Z T1 szerinti súlyozás Világos: fehér állomány T2 szerinti súlyozás Világos: szürke állomány 2. Képelemek feloldása az X irányban A relaxáció alatt X irányban lineárisan változó gradiens tér bekapcsolása precesszió (=> indukált feszültség) frekvenciája az X mentén változik hf= 2μ(B+B(X)) 3.Képelemek feloldása az Y irányban Y mentén lineárisan változó gradiens tér alkalmazása rövid ideig => Precesszió fázisának módosítása Y függvényében Egy szeleten belül a pixelek kijelölése gradiens-terekkel 4. A vevőtekerccsel mért jel felbontása A mért indukált feszültség sok frekvenciájú és fázisú jel szuperpoziciójának eredménye ω = 2πf Az egyes f és φ komponensek előállítása Fourier analízissel ρ, τ, τ minden képelemre i, j 1, i, j 2, i, j

Az MRI mint diagnosztikai módszer De: - a készülék és a mérés drága - 3D képhez hosszú adatgyűjtési idő pszichológiai problémák -non-invasive módszer (de: kontrasztanyagok toxicitása?) -Csont-szövet nem zavar: pl. gerincvelő vizsgálata UH, CT -Felbontás: ~5 mm vastag szelet, 1.5x1.5 mm képelem igen jó mint a CT, de a kontraszt élesebb Biztonsági szempontok erős mágneses tér, indukált áram melegítő hatása, hangjelenségek, periferiális idegvégződések stimulálása -3D rekonstrukció lehetősége -Lágy szövetek, elsősorban zsírszövetek agyszövet de széleskörű alkalmazás: nyak, mellkas, alhas (máj, lép, hasnyálmirigy, vese..) vázizomzat, izületek gerjesztő tér teljesítménye és db/dt limitek kontraindikáció: terhesség első trimer pacemaker ferromágneses és fém implantok (szembe kerűlt szilánkok) Olvasásra Speciális MRI technikák fejlődési irányok 1. Angiográfiai alkalmazások A mért térfogatba a szeletre merőlegesen ki vagy be-áramló vér a sebességprofiltól és az áramlási sebességtől függően jelszegény vagy jelgazdag tartományhoz vezet Olvasásra érszűkűlet értágulat Artéria cerebri média területén arterio-venosus malformáció -fáziselemzés alapján Gd jelzés Time of flight

Olvasásra 2. Kontrasztanyagok alkalmazása: T1 és T2-kontraszt T1 súlyozott kép meningeoma diagnosztizálásához Gadolinium kontraszt kiemeli a daganat helyét: világos képlet Olvasásra T2 tipusu kontrasztanyagok ferromágneses: ép szövetekben T2 csökken T2 kép sötét szuperparamágneses (Fe-oxid) nanorészecskék: T2-kép sötét pl. máj: normál szövetek dúsítják, tumor nem Víz: természetes kontrasztanyag De: Gd jelző toxicitása - veseelégtelenség Paramágneses atomok alkalmazása: T1 rövidül a kóros szövetekben Gd, Mn, Ba farmakonok (ahol a vér-agy gát átjárható) 3. Funkcionális MRI- fmri BOLD : Blood Oxygen Level Dependent signal Hemodinamikai válaszfüggvények rövid mérési idő: 1-2 perc alacsony felbontás, gyors szken 1/ 2-3 sec Ogawa, 199 Alapja: oxy hemoglobin : diamágneses, nincs mag mágneses momentuma deoxy hemoglobin: paramágneses, mágneses momentuma van => Hb állapota endogén kontraszt-ágens Alkalmazása agyi funkciók vizsgálatában: visual cortex, motor cortex, beszéd Neoron aktivitás véráramlás oxyhb T2 jelintenzitás

fmri sebészeti területek és funkcionálisan fontos tartományok elkülönítése