Szakdolgozat. SZABÓ JUDIT V. éves biológus. A humán 3-foszfoglicerát kináz aktív centrumának vizsgálata irányított mutagenezissel

Átírás

1 Szakdolgozat SZABÓ JUDIT V. éves biológus A humán 3-foszfoglicerát kináz aktív centrumának vizsgálata irányított mutagenezissel Témavezetők: Pollnerné Dr. Flachner Beáta Kazinczyné Dr. Vas Mária MTA SzBK Enzimológiai Intézet EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR Budapest, 2005.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETŐ 1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A 3-foszfoglicerát kináz (PGK) enzim szerepe az élő szervezetben A PGK molekula térbeli felépítése A szubsztrát kötőhelyek jellemzése A 3-PG kötőhely szerkezete A nukleotid kötőhely A doménzáródás mechanizmusa A PGK különleges enzimkinetikai viselkedése A PGK esetén elvégzett korábbi mutagenezis kísérletek 9 3. CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Anyagok Az enzim előállítása során használt anyagok és oldatok A kinetikai mérésekhez alkalmazott anyagok Agaróz gélelektroforézishez használt oldatok A redukáló gélelektroforézishez felhasznált anyagok és oldatok Módszerek PCR reakció Transzformálás Plazmid tisztítása Emésztés restrikciós endonukleáz enzimekkel és DNS elektroforézis DNS gélelektroforézis Fehérje termelése E. coli sejtekben A fehérje feltárása és tisztítása Fehérje vizsgálata SDS-gélelektroforézissel Fehérjekoncentráció meghatározása PGK enzimaktivitásának meghatározása A szubsztrátok koncentrációjának meghatározása Szubsztráttelítési kinetikai vizsgálatok 3-PG-vel és MgATP-vel Anion aktiválás-gátlás vizsgálatok Differenciál scanning (DSC) mikrokalorimetria Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK A humán PGK kifejezése és tisztítása Mutációk tervezése és kivitelezése A tisztított mutáns fehérjék biofizikai jellemzése 29

3 5.4 A vad típusú sertés és humán PGK kinetikai összehasonlítása Szubsztrátok feleslegének aktiváló hatása Anionaktiválás és gátlás együttes megnyilvánulása Aniongátlás kinetikai vizsgálata a vad típusú hpgk esetében A Lys215 mutáció hatása a PGK kinetikai viselkedésére A mutáns hpgk-k specifikus aktivitása Szubsztrátfelesleg aktiválás hiánya Anionaktiválás hiánya Aniongátlás kinetikai vizsgálata a mutáns enzimek esetében A kinetikai eredményekből levonható következtetések ÖSSZEFOGLALÁS ABSTRACT IRODALMI HIVATKOZÁSOK 45

4 Ábrák jegyzéke 1. ábra: A sertésizom PGK terner komplexének szerkezete a kötött szubsztrátokkal 3 2. ábra: A PGK doménmozgásai az enzim működése során 4 3. ábra: A sertésizom PGK 3-PG szubsztrát kölcsönhatásának részletei a biner 6 komplexben 4. ábra: A MgATP és nem-reaktív analógjainak kötődési módja a PGK-hoz ábra: SDS gélelektroforézis a hpgk gén indukciójának ellenőrzésére ábra: A hpgk kimutatása SDS-gélelektroforézissel a tisztítási lépések során ábra: Az CM-Sepharose oszlopkromatográfia ábra: Az CM-Sepharose oszlopkromatográfia frakcióinak SDS-gélelektroforézise ábra: A mutáció hatása a hpgk CD spektrumára ábra: A mutáció hatása a hpgk kalorimetriás hőstabilitására ábra: A vad típusú PGK-k aktivitásának függése a 3-PG koncentrációtól ábra: A vad típusú PGK-k aktivitásának függése a MgATP koncentrációtól ábra: Pirofoszfát anion hatása a vad típusú PGK-k aktivitására ábra: Pirofoszfát hatása a hpgk 3-PG telítési görbéjére lineáris (a) és reciprok 34 (b) ábrázolásban 15. ábra: Pirofoszfát hatása a hpgk MgATP telítési görbéjére lineáris (a) ill. 35 reciprok (b) ábrázolásban 16. ábra: A két gátló anionkötőhely elhelyezkedése a PGK aktív centrumában ábra: A mutáns hpgk-k aktivitásának függése a 3-PG koncentrációtól ábra: A mutáns hpgk-k aktivitásának függése a MgATP koncentrációtól ábra: Pirofoszfát anion hatása a mutáns PGK-k aktivitására ábra: A K215A (a) és K215R (b) mutáns pirofoszfát gátlása különböző 40 szubsztrát körülményeket alkalmazva

5 Táblázatok jegyzéke 1. táblázat: A 3-PG kötőhelyen elvégzett mutációk hatásának összehasonlítása táblázat: A hpgk génjében tervezett mutációk táblázat: A K215R és a K215A mutánshoz tervezett primerek táblázat: Kinetikai állandók összefoglalása táblázat: A mutáns enzimekre vonatkozó gátlási állandók összefoglalása 41

6 Rövidítések jegyzéke PGK 3-foszfoglicerát kináz hpgk humán eredetű 3-foszfoglicerát kináz GAPDH glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz 3-PG 3-foszfoglicerát 1,3-BPG 1,3-biszfoszfo-glicerát ATP adenozine triphosphate AMP-PCP β, γ-metilén-adenozin-5 -trifoszfát AMP-PNP β, γ-imido-adenozin-5 -trifoszfát EDTA Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid DTT ditiotreitol SDS Sodium Dodecyl Sulfate CD cirkuláris dikroizmus DSC Differential Scanning PCR Polymerase Chain Reaction PAGE poliakrilamid gélelektroforézis APS ammónium-perszulfát TEMED N, N, N, N -Tetrametil-etilén diamin IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside NADH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Hidrogeen E. coli Escherichia coli DpnI Diplococcus pneumoniae I NdeI Neisseria denitrificans BamHI Bacillus amyloliquefaciens H T. brucei Trypanosoma brucei

7 Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki témavezetőimnek Kazinczyné Vas Máriának, az MTA doktorának, hogy munkámat irányította és tudásával nélkülözhetetlen segítséget nyújtott dolgozatom elkészítésében, valamint Pollnerné Dr. Flachner Beátának a fehérje expresszió és termelés módszerének kidolgozásáért és a kísérleti munkák irányításáért. Köszönet illeti Matkovicsné Varga Andrea PhD hallgatót a munkában való aktív közreműködésért, tanácsaiért. Hálás vagyok az Intézet igazgatójának, Dr. Friedrich Péter akadémikusnak, hogy lehetőséget biztosított számomra, hogy kutatómunkámat a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjának Enzimológiai Intézetében végezhettem. Köszönöm Dr. Závodszky Péter akadémikusnak, hogy lehetővé tette laboratóriumában a DNS-szintű munkák kivitelezését és Hajdú István PhD hallgatónak e munkák során nyújtott sokoldalú segítségét. Külön köszönöm Szüleimnek, Családomnak, hogy minden körülmények között mellettem álltak és segítették munkámat szeretetükkel, türelmükkel.

8 1. BEVEZETŐ Az élő szervezeteket felépítő makromolekulák között kulcsfontosságú szereppel bírnak a fehérjék, melyek az összes életműködésünkben részt vesznek. Jelentőségük abban áll, hogy specifikus kölcsönhatásba lépve szubsztrátjaikkal, sokszorosára gyorsíthatják azokat a kémiai átalakulásokat, melyek nélkülük nem, vagy csak nagyon lassan mennének végbe. Az enzimeket mindennapi életünk során is számos helyen felhasználjuk, fontosságuk megkérdőjelezhetetlen. A molekuláris biológia utóbbi évtizedeiben bekövetkezett előretörése megteremtette annak a lehetőségét, hogy egy adott fehérje (enzim) szerkezetét genetikus úton módosítsuk és ezáltal annak funkcionális tulajdonságait befolyásoljuk. Ahhoz, hogy ilyen módosításokat előre megtervezett módon hajthassunk végre, a fehérjék (enzimek) szerkezetével, működésével kapcsolatban a jelenleginél pontosabb ismeretekre van szükségünk. Ennek eléréséhez jól használhatjuk a genetikus módosítás, az ún. irányított mutagenezis módszerét. A fehérje oldalláncok kémiai természetét így megváltoztatva megállapíthatjuk, hogy egy adott változás hogyan befolyásolja az adott fehérje működését. Ezáltal enzimreakció mechanizmusok, allosztérikus szabályozó mechanizmusok deríthetők fel. A vizsgálati objektumom a 3-foszfoglicerát kináz, mely egy tipikus kináz enzim. Egyetlen polipeptidláncból épül fel, azaz monomer szerkezetű, mely két doménre tagolódik. Ezt, a legtöbb élő szervezet sejtjében jelenlévő molekulát, nemcsak in vivo betöltött szerepe érdemesíti kutatásokra. Kináz enzimként, vizsgálatával olyan általános kérdésekre kaphatunk választ, mint a foszforiláció, defoszforiláció reakciójának mechanizmusa, a doménzáródás mikéntje vagy akár az univerzális energiatároló vegyület, a MgATP kötődésének módja. TDK munkám során a PGK feltételezett nukleotid-foszfát kötőhelyén irányított mutagenezis kísérleteket végeztem, hogy felderítsem a kötőhely szerepét az aktív enzim konformáció kialakításában. 1

9 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 A 3-foszfoglicerát kináz (PGK) enzim szerepe az élő szervezetben A 3-foszfoglicerát kináz az élő sejtek számára alapvető fontosságú enzim. Aerob szervezetekben a glikolízisben, anaerob élőlényekben a fermentációban játszik szerepet, a növények esetében pedig a glükoneogenezisben nélkülözhetetlen enzim. A glikolízisben a PGK az 1,3-biszfoszfo-glicerát (1,3-BPG) savanhidrid kötésben levő foszfo-csoportjának MgADP-re való átvitelét katalizálja, melynek során a 3-foszfoglicerát (3-PG) és ATP, azaz univerzális energiadonor képződik, kétszeres töltésű fémion (általában Mg 2+ ) jelenlétében (1. egyenlet). A növények glükoneogenezisében ennek a folyamatnak a fordítottja megy végbe. 1,3-BPG 3-PG 1. egyenlet: A PGK által katalizált reakció egyenlete a glikolízisben Az előzőekben említett, anyagcsere folyamatokban betöltött szerepén túl a PGK számos más biokémiai folyamatban szerepet játszik. Így a kation transzportban, a Na + transzportnál (1), ill. a Ca 2+ -pumpa működése során (2). Más glikolitikus enzimekkel együtt kapcsolatban áll a szarkoplazmatikus retikulummal, így szolgáltat ATP-t a pumpa működéséhez. Ez a működése kapcsolatban áll az emberi hemolitikus anémia betegséggel (3, 4), melyben a vörösvérsejtek károsodnak, súlyos esetben kipukkadnak. Ekkor ugyanis a sejtmembrán két oldala között eltűnhet a Na + - és K + -gradiens, melynek hátterében X kromoszómán bekövetkező mutáció áll. A PGK funkcionális károsodása ATP hiányt okoz, mely a K-Na-pumpa működését befolyásolja. Egyes vizsgálatok szerint a PGK szerepet játszik a sejtmagban a DNS szintézisénél, transzkripciójánál, valamint javításánál (5). A DNS replikációjánál a PRP (Primer Recognition Proteins) komponenseként azonosították a PGK-t. A PRP szükséges azon első lépésben, amikor az α-dns-polimeráz a kb nukleotid hosszúságú RNS-láncot szintetizálja meg a DNS-templát irányításával. 2

10 Újabb kutatások szerint az emberi eredetű PGK gátolja a tumor angiogenezisét (6, 7). Daganatsejtekben diszulfid reduktázként működve részt vesz a plazmin redukciójában, melynek során angiosztatin keletkezik, ennek hatására kerül gátlás alá az angiogenezis. A PGK tiol-reduktáz aktivitására még nem született ésszerű magyarázat. A legújabb eredmények alapján, a PGK aktív centrumának közelében levő két, szekvenciálisan szomszédos tiol-csoport ebben az aktivitásban nem vesz részt (7), bár ez várható volna. A mechanizmust a doménzáródás során létrejövő konformáció változással próbálják magyarázni (8). Jelentős szerepet kap a PGK a vírus-, és tumorellenes terápiákban. A HIV, a Hepatitis B vírus által okozott betegségek, valamint a rák gyógyítására használt L-dezoxinukleotid analógokat foszforilálja, és így a farmakológiailag aktív metabolitot állítja elő, valamint ezen anyagok sejtbeli koncentrációját szabályozza (9-11). 2.2 A PGK molekula térbeli felépítése A PGK 44,5 kda molekulatömegű, monomer szerkezetű, azaz egy polipeptidláncból felépülő enzim. 1. ábra: A sertésizom PGK terner komplexének szerkezete a kötött szubsztrátokkal. A másodlagos szerkezeti elemek közül piros színű hordók az α-hélixeket, sárga lemezek a β-redőket jelölik, míg a szubsztrátok gömb-pálcika modellel, szürke színnel láthatók. A terner komplex szerkezetben (12) 3-PG az N-, míg a nukleotid a C-doménen kötődik. Molekulája két doménből, a C-, és az N-terminálisból áll, melyek kb. azonos méretűek. Mindkét domén központjában 6 parallel β-redőből felépülő hidrofób mag található, melyet α-hélixek vesznek körül (13) (1. ábra). 3

11 Az aminosav-szekvencia a különböző fajok közt akár 50%-os eltérést is mutathat, azonban az emlős eredetű szekvenciák esetén ez már kb %-os azonosságot jelent (14). Az enzim harmadlagos szerkezete az aminosav-szekvenciában mutatkozó különbségek ellenére is meglehetősen konzervatív (15). A röntgenkrisztallográfiás adatok alapján ismert, hogy a PGK mint kétszubsztrátos enzim 3-PG szubsztrátja az N-terminális doménen (16), míg a nukleotid szubsztrát, MgADP, MgATP és analógjai, a C-terminális doménen kötődnek (17-20). A 3-PG kötőhelye az N-terminális domén Arg-ben gazdag bázikus foltja, míg a nukleotid kötőhely a C-doménen a belső hidrofób felszín (1. ábra). A PGK-nak ún. nyitott és zárt konformációjú szerkezetét különböztetjük meg (2. ábra). 2. ábra: A PGK doménmozgásai az enzim működése során A zárt szerkezet sokáig nem volt ismert. A korán meghatározott nyitott szerkezetben (13) viszont a két doménen megkötött szubsztrát egymástól nagyon távol, kb. 10 Å távolságra helyezkedik el, az ATP γ-foszfátja (P atom) és a 3-PG karboxil-csoportja (O atom) között mérve. A 10 Å-nyi távolság miatt a reakció a nyitott szerkezetben nem jöhetne létre, mivel a PGK által katalizált reakció közvetlen foszfotranszferrel játszódik 4

12 le (21). Ennek alapján már akkor feltételezték, hogy az enzimreakció lejátszódásához a két doménnek össze kell záródnia. Későbbiekben ezt a hipotézist különböző kísérletek tették valószínűvé, sőt sikerült a zárt konformáció kristályszerkezetét is meghatározni (22, 23). Tehát bebizonyosodott, hogy a szubsztrátok reaktív csoportjainak optimális térközelbe kerülése, a zárt konformáció kialakulásával, azaz a doménzáródással valósul meg. A domének merev testekként a csuklórégiók mentén fordulnak el, így kerülnek közel a szubsztrátok egymással reagáló molekularészei, ami elengedhetetlen a katalízis szempontjából. Nemcsak a kristályokkal történő röntgendiffrakciós vizsgálatok, hanem az oldott enzimmel végzett kisszögű röntgenszórási kísérletek is a doménzáródást igazolták, ahol a mindkét szubsztrátot kötő terner komplexben a girációs sugár csökkenését tapasztalták (24). 2.3 A szubsztrát kötőhelyek jellemzése A 3-PG kötőhely szerkezete A szubsztrát 3-PG az N-terminális domén belső felületén lévő bázikus oldalláncokhoz kötődik (1. ábra). A 3-PG kötődésének részleteit a 3. ábra mutatja. A krisztallográfiás adatok szerint a 3-PG negatív töltésű foszfátcsoportja a PGK (sertésizom enzim számozása szerinti) Arg170, Arg122 és Arg65 konzervatív oldalláncok guanidinocsoportjaihoz hidrogénhíd kötéssel és ionos kölcsönhatással kapcsolódik (16). Mindhárom Arg 2-2 kötést (H-híd kötés és ionos kölcsönhatás) formál a foszfát-csoport 3 oxigénatomjával. A negyedik észterkötésben levő oxigénatom a His62 imidazol gyűrűjével alakít ki hidrogénhíd kötést. Az Asn25 és az Asp23 a 3-PG hidroxilcsoportjával alakít ki hidrogénhíd kötést. Ez utóbbi oldalláncokkal való kölcsönhatás felelős a szubszrát sztereospecificitásáért A nukleotid kötőhely A nukleotid szubsztrát a C-terminális belső hidrofób helyén kötődik (1. ábra). A krisztallográfiás adatok szerint a MgADP ill. a MgATP szubsztrátok, valamint ennek analógjai különböző kapcsolatokat alakítanak ki a fehérje oldalláncaival (4. ábra) (12, 20). Míg mindkét nukleotid adenozin és cukor gyűrűje azonos pozíciót foglal el a hidrofób zsebben, addig a foszfát láncok különbözőképpen kapcsolódnak. Az adenozin gyűrű a βh, a βg ill. βj lemezek által alkotott zsebben kötődik, a ribóz gyűrű pedig a Pro338 pirrolidin gyűrűje fölött. A ribóz 2 - ill. 3 -hidroxil csoportjai pedig a Glu343 karboxilátjával létesítenek hidrogénkötést. 5

13 3. ábra: A sertésizom PGK 3-PG szubsztrát kölcsönhatásának részletei a biner komplexben (16) A szubsztrátot zöld színű gömb-pálcika modell jelöli, az enzim oldalláncai kék színű pálcika modellel láthatók. A távolságadatok Ǻ-ben értendők. A Lys219 ε-amino csoportjával mindegyik nukleotid α-foszfátja ionos kölcsönhatásban van. A többi foszfát-csoport kölcsönhatásában már a nukleotidok különbséget mutatnak. A MgADP β-foszfátját az Asn336, a Thr375 és az α13 hélix stabilizálja (17). Az α- és β-foszfát 1-1 negatívan töltött oxigénjével ionos kölcsönhatásban áll a Mg-ion, ami további ionos kötést létesít az Asp374 karboxil csoportjával. A MgATP kötődésének vizsgálatához először ezen szubsztrát analógjait használták. Ezek segítségével, a 3-PG és az enzim jelenlétében stabil, de működésképtelen terner komplexet lehet előállítani. Ilyen ATP analógok az AMP-PNP ill. az AMP-PCP. Míg az ATP esetén a β- és γ-foszfátot oxigén köti össze, addig az AMP-PNP-ben egy aminocsoport, míg az AMP-PCP-ben egy metilén-csoport helyettesíti az O atomot. A helyettesítés izosztérikus, ezért nem okoz lényeges különbséget a kötés jellegét tekintve és csak kevéssé változtatja meg a MgATP-re vonatkozó egyéb tulajdonságokat. 6

14 4. ábra: A MgATP és nemreaktív analógjainak kötődési módja a PGK-hoz. Az α8 és α13 hélixet szalagdiagram jelzi, míg a szubsztrát és analógjai gömb-pálcika modellel láthatók. Az AMP-PNP-vel (18), az AMP-PCP-vel (19) és az ATP-vel (20) meghatározott kristályszerkezeti adatokat a nukleotidok adenozin gyűrűje alapján illesztettük egymásra. Az AMP-PNP mindhárom foszfátja segítségével koordinálja a fémiont, míg az AMP- PCP csak a β-foszfátja által (18, 19, 23). Ezen kívül a fehérjéhez való kötődésük is különböző. Az AMP-PNP az ADP-hez hasonlóan kötődik, azaz a foszfátlánca az α13-as hélix N-terminálisa felé hajlik. Viszont az AMP-PCP β-és γ-foszfátja a 8-as hélix N- terminálisa felé hajlik. Itt kölcsönhatásba lép egyrészt a Lys215, másrészt a Mg 2+ -on keresztül az Asp218 oldallánccal. Feltételezhetően a nukleotid-foszfátnak lehetősége van alternatív módon elfoglalnia mind az α13-as hélix, mind pedig a 8-as hélixnél lévő kötőhelyet. A MgATP kötődését leíró újabb szerkezeti munka szerint (20) a nukleotid szubsztrát foszfát lánca viszont a két alternatív kötőhely között közti pozíciót foglal el. 7

15 2.4 A doménzáródás mechanizmusa A doménzáródás az a folyamat, melynek során a domének helyzetváltozásával a szubsztrátok optimális térközelbe kerülnek, lehetővé téve a foszfotranszfer végbemenetelét. A kristályszerkezetek szerint (22, 23) az enzim csak a mindkét szubsztrátot (esetleg analógot) kötő terner komplex esetében záródik. A záródás során a domének merev testekként fordulnak el egymáshoz képest, a folyamatban fontos szerepet játszik a molekulában feltérképezett néhány csukló régió (hinge). A szubsztrát 3-PG kötődése már önmagában az α7 hélix N-terminális régiójában idéz elő 8 o -os elfordulást (16). Ugyanezen hélix C-terminális régiójában a zárt és a nyitott szerkezetek közti nagy átlagos négyzetes eltérés (RMS) alapján, Bernstein és munkatársai bebizonyították a két domén egymáshoz képesti kb. 32 o -os elfordulását (22). A PGK legfontosabb csukló régiója az α13 és α14 hélixeket összekötő βl-redő, a doménzáródás mozgatója (12). A szubsztrátok valószínűleg közvetlenül ezt a régiót irányítják. Mivel az α13 hélix a C-domén része és az α14 az N-terminális doméné, így a két hélix elmozdulása a domének helyzetváltoztatását vonja maga után. A doménzáródáshoz az α7 hélixben található csuklórégiók elmozdulása is szükséges, enélkül a fehérjelánc széttörne. A doménzáródás során az α8 és az α13 hélixek egymáshoz viszonyított helyzete is jelentősen megváltozik, közelednek egymáshoz. Ez az elmozdulás feltehetően kapcsolatba hozható a nukleotid szubsztrát foszfát láncával való kölcsönhatással. A fent bemutatott szerkezeti ábra (4. ábra) ugyanis azt sugallja, hogy a MgATP foszfátjai (flexibilitásukból eredően) képesek az analógokkal azonosított két alternatív kötőhely között elmozdulni. Amennyiben ez megvalósul, úgy a MgATP aktívan közreműködik abban, hogy az α8 és az α13 közeledjen egymáshoz, ami a doménzáródást elősegíti. Ebben fontos szerepe lehet az α8 N-terminálisán elhelyezkedő Lys215-nek, amely abszolút konzervatív oldallánc és szerepe az enzimműködésben még nem tisztázott. 2.5 A PGK különleges enzimkinetikai viselkedése Az enzimekre általánosan jellemző Michalis-Menten kinetika a PGK esetében nem valósul meg. Jellemző tulajdonsága a szubsztrátfelesleg aktiválás (25, 26). A kettősreciprok Lineweaver-Burk ábrázolásban a szubsztráttelítési görbék nem adnak egyenest, hanem a kapott görbe két eltérő meredekségű görbével közelíthető. Ennek 8

16 magyarázatára korábban két aktív centrum létét feltételezték. Ma már azonban a röntgen diffrakciós kísérletek alapján tudjuk, hogy az enzimnek csak egyetlen aktív centruma van, és mindkét szubsztrátnak csak egyetlen kötőhelye. Jellegzetes további kinetikai tulajdonság, hogy a többértékű anionok alacsony koncentrációban aktiválják, magas koncentrációnál viszont gátolják az enzimet (27, 28). Az aktiválás molekuláris mechanizmusára a következő elméletet alkották meg (29): az anionok, hasonlóan a szubsztrátokhoz, hiszen azok is anionos jellegűek, az aktív centrumon kívüli aktiváló helyre kötődnek, mely a nyitott konformációjú enzimben csak részben létezik és a doménzáródás során alakul ki. Valószínűleg az N-és a C-terminális domén belső felszínén lévő bázikus aminosavak hozzák létre. Feltételezések szerint az anionok gyengíthetik a termék 1,3-biszfoszfo-glicerát (1,3-BPG) kötődését, közvetve pedig csökkenthetik a doménzáródás energiagátját. Feltételezések igazolására még egyéb független kísérletekre van szükség. Ezzel szemben a magas anionos koncentrációnál tapasztalt gátlási jelenség egyértelműen annak tulajdonítható, hogy az anionok kiszorítják a szintén anionos tulajdonságú szubsztrátokat az aktív centrumból. 2.6 A PGK esetén elvégzett korábbi mutagenezis kísérletek Már azelőtt is, hogy a PGK-ról részletes szerkezeti adatok álltak volna rendelkezésre, végeztek mutációs kísérleteket, melyeknek döntő többsége a 3-PG kötőhely kiderítésére irányult. Az elvégzett mutációk közül egyedül az Arg38 módosítása bizonyult fontosnak a katalízis szempontjából. Az R38A ill. R38Q mutációk (30, 31) az aktivitás teljes elvesztéséhez vezettek, ami az Arg38 kiemelkedő fontosságát mutatja. A mutációs kísérletekből nincs egyértelmű bizonyíték arra vonatkozóan, hogy van-e még ezen kívül más, az enzim katalízisében fontos oldallánc. A 3-PG kötőhelyre vizsgálatára irányuló más mutációk főként az anionaktiválás jelenségéről szolgáltattak információkat. Az egyik ilyen az Arg65 oldallánc Gln-ra való cserélése volt, mely az anion aktiváló viselkedés teljes elvesztéséhez vezetett. Ezen oldalláncnak valószínűsíthető, hogy szerepe van az anion aktiváció mechanizmusában (32). Az Arg65 viszont nem esszenciális oldallánc az enzim aktivitása szempontjából, mivel R65Q, R65S, R65A mutánsok specifikus aktivitása kb. ugyanakkorának adódott, mint a vad típusé (33). 9

17 Az Arg65, 120 és 169 oldalláncok irányított mutagenezisét is elvégezték (34). A 3-PG foszfátja kötést létesít ezen oldalláncok guanidíno-csoportjaival. Mindhárom oldalláncot Lys-re (ugyanolyan töltés) ill. Met-ra (nincs töltés) cserélték külön kísérletekben. 1. táblázat: A 3-PG kötőhelyen elvégzett mutációk hatásának összehasonlítása (34) Mutáció jellege R65K R65M R120K R120M R169K R169M K m (3-PG esetén) 40 mm szulfát jelenlétében 2,2-szeres növekedés 20,6-szoros növekedés 2-szeres növekedés 2,6-szoros növekedés 8,3-szoros növekedés K m (MgATP esetén) 40 mm szulfát jelenlétében Nincs hatása 4,9-szeres növekedés K d (3-PG) Szulfát hiányában 3,6-szoros növekedés k cat 1,5-szeres növekedés - 7-szeres csökkenés K cat /K m katalitikus hatékonyság Nincs szignifikáns hatás 45-szörös csökkenés Nincs hatás - 1,5-szeres csökkenés 3,5-szeres csökkenés 3-szoros 2,3-szoros - 5,5-szörös növekedés növekedés csökkenés 4-szeres növekedés 14-szeres növekedés - 34,6-szoros csökkenés Az elvégzett mutációk bizonyították ezen oldalláncok szerepét a 3-PG szubsztrát megkötésében. Az Arg65, az Arg120 és az Arg169 oldalláncok kicserélése bizonyította továbbá az N-terminális domén belső felszínén levő bázikus régió szerepét a 3-PG-n kívül más anionok kötésében is. Később sikerült laboratóriumunk közreműködésével a PGK 3-PG-vel alkotott biner komplexét kristályosítani és szerkezetét meghatározni (16), mely egyértelműen igazolta a fentieket. Az elvégzett mutációk alapján még eddig nem sikerült az anion aktiválás molekuláris mechanizmusát tisztázni, nincs pontos információ az aktiváló anionkötőhely elhelyezkedésére vonatkozóan. A nukleotid kötőhelyre vonatkozóan ismertek azok a kísérletek, melyekben a Glu343-at, a Lys219-et ill. Asn336-ot módosították (9). Az E343A mutáció esetén a ribonukleotid difoszfátokra vonatkozó k cat értékek szignifikánsan csökkentek. Ezen eredmények szerint a Glu343 karboxil-csoportja és a ribonukleotid difoszfát ribózának hidroxilcsoportja közt kialakuló H-kötésnek fontos szerepe van a szubsztrát optimális orientációja szempontjából, elősegíti a foszfotranszfer hatákonyságát. Mindeddig nem végeztek egyetlen mutációs kísérletet sem a Lys215 oldallánccal, melynek szerepét a nukleotid foszfátlánc kötésében, és ezáltal a doménzáródásban, a 10

18 fentiek alapján jogosan tételezhetjük fel (2.4 pont). A PGK számos ismert kristályszerkezete közül csak két olyan szerkezetet közöltek (23, 35), amelyekben a domének záródtak. A szerzők a szerkezeti adatokat modellezéssel kiegészítve valószínűsítették, hogy a Lys215 közvetlenül stabilizálhatja az enzimreakcióban átadódó foszfo-csoportot. Az egyik szerkezeti munka (23) felveti annak a lehetőségét is, hogy a zárt szerkezetben a Lys215 a 3-PG foszfát-csoportjával is kölcsönhat. Ez annál is inkább érdekes, mert a nyitott PGK szerkezetekben (16, 18) a Lys215 oldallánc NH 2 - csoportja kb. 15 Å távolságra helyezkedik el a 3-PG foszfátjának bármelyik O- atomjától. Ennek alapján feltételezhető, hogy a Lys215 fontos katalitikus oldallánc és pozitív töltése révén az anionaktiválásért is felelős lehet. 11

19 3. CÉLKITŰZÉSEK Célul tűztem ki, hogy a PGK Lys215 konzervatív oldalláncának az irodalmi áttekintésben felvetett fontos szerepét tisztázzam: az enzim működésében, a katalízisben, a MgATP foszfátlánca kötésében, a doménzáródásban, a szubsztrátfelesleg-és anionok általi aktiválásban. A kérdések megválaszolása érdekében a következőket terveztem: a humán PGK előállítását bakteriális expresszióval, azért, hogy mutációs kísérleteket végezhessek, a Lys215 oldallánc mutációval történő kicserélését neutrális alaninra (K215A) és hasonlóan pozitív töltésű, de eltérő természetű argininre (K215R), a mutáns fehérjék biofizikai jellemzését (DSC mikrokalorimetria és CD spektroszkópia), enzimkinetikai vizsgálatokat (3-PG és MgATP szubsztrátokat használva): i. egyrészt a vad típusú humán PGK és a korábban vizsgált sertésizom PGK összehasonlítására, ii. másrészt a kétféle mutáns humán PGK jellemzésére és a vad típusú enzimmel való összehasonlítására. 12

20 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1 Anyagok Az enzim előállítása során használt anyagok és oldatok Az élesztő kivonat, a bacto trypton, a NaCl, a NaH 2 PO 4, a Na 2 HPO 4 Reanal; az ampicillin, a kloramfenikol Sigma; az IPTG Fermentas, az (NH 4 ) 2 SO 4 pedig Merck gyártmány volt. LB tápoldat készítése: 10 g bacto trypton, 5 g élesztő kivonat 5 g NaCl ioncserélt vízzel 1 l-re töltöttem fel. (ph = 7,2 2 M NaOH-dal) Ampicillin törzsoldat: Klóramfenikol törzsoldat: LB lemezek készítése: 100 mg/ml (20 ml tápoldathoz 20 µl törzsoldat szükséges) 30 mg/ml etanolban (20 ml tápoldathoz 20 µl szükséges) 2,5 g NaCl 2,5 g élesztő kivonat 5 g bacto-tryptont ioncserélt vízzel 500 ml-re, ph=7,2 7,5 g bacto-agar Az így elkészített mennyiség 10 lemezre volt elegendő. Az ampicillin ill. klóramfenikol antibiotikum tartalmú lemezek készítéséhez az antibiotikumok törzsoldatából µl-re volt szükség 10 lemezhez. Oszlopkromatográfiához használt pufferek: NaP i puffer: 20 mm-os NaH 2 PO 4 1mM EDTA oldat ph=6,2-re 20 mm Na 2 HPO 4 1mM EDTA oldattal Eluáláshoz használt pufferek: A puffer: 20 mm NaP i ph=6.2 B puffer: 20 mm NaP i ph=6.2, 1 M NaCl Az irányított mutagenezist QuikChange mutagenezis kit (Stratagene) segítségével végeztem A kinetikai mérésekhez alkalmazott anyagok A 3-PG és az ATP Na-sója formájában Boehringer gyártmányú volt; a MgCl 2, a Tris, a pirofoszfát, az EDTA és a DTT a Sigma-tól származott, a merkaptoetanol, a NADH pedig a Reanal-tól. 13

21 A PGK enzim és a GADPH segédenzim A sertésizomból izolált PGK-t [EC ] és a GAPDH segédenzimet [EC ] laboratóriumunkban készítették, 3,4 M ammónium-szulfát oldatban kristályszuszpenzió formájában tárolták. Kísérleteimhez dializálva használtam fel Agaróz gélelektroforézishez használt oldatok STOP oldat: 0,1 % brómfenolkék 0,2 M EDTA 50 % glicerin TAE oldat: 50 mm Tris-CH 3 COOH 20 mm CH 3 COONa 2 mm EDTA ph=8, A redukáló gélelektroforézishez felhasznált anyagok és oldatok Az SDS Merk, akrilamid/bisz-akrilamid, mólsúlymarker (Phosphorylase b D, Bovin Serum Albumin D, Ovalbumin D, Carbonic Anhydrase D, Soybean Trypsin Inhibitor D, α-lactalbumin D) Bio-Rad; ammónium-perszulfát, N,N,N,N -Tetrametil etiléndiamin (TEMED) Serva gyártmány volt. Felhasznált oldatok: 10 (w/v%) SDS-oldat 1,5 M Tris-HCl, ph=8,8 (elválasztó puffer) 40 % akrilamid / bisz-akrilamid frissen készített 10 %-os ammónium-perszulfát oldat (APS) 0,5 M Tris-HCl, ph=6,8 (tömörítő puffer) Elválasztó gél: Tömörítő gél: Mintakoktél: 4,4 ml ioncserélt víz 0,1 ml 10 %-os SDS 2,5 ml 1,5M Tris-HCl ph=8,8 (elválasztó puffer ), 3,0 ml 40 % akrilamid / bisz-akrilamid öntés előtt 100 µl APS, 10 µl TEMED 6,425 ml ioncserélt víz, 0,1 ml 10 % SDS, 0,975 ml 40 % akrilamid/bisz-akrilamid öntés előtt 100 µl APS, 10 µl TEMED 3,55 ml ioncserélt víz, 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl ph=6,8, 2,5 ml glicerol, 2 ml 10 %-os(w/v) SDS, 0,2 ml 0,5%-os (w/v) brómfenol kék 14

22 Az így elkészített mintakoktél 640 µl-éhez 360 µl DTT-t adtam, mintáimhoz frissen készítettem ezt az oldatot. A futtatáshoz használt puffer(1 l-hez): 30,3 g Tris bázis 144 g glicin 10 g SDS Ebből a 10-szeres töménységű futtatóból 50 ml-t vettem ki és hígítottam a gélelektroforézishez 500 ml-re ioncserélt vízzel. A gélek festéséhez: Bio-Save Coomassie festéket (Bio-Rad) használtam. A nem említett egyéb vegyszerek is analitikai tisztaságúak voltak. 4.2 Módszerek PCR reakció Az irányított mutagenezis kivitelezésére PCR reakciót alkalmaztam, melyet Stratagene s QuikChange helyspecifikus mutagenezis kit segítségével kiviteleztem. Ez a kit alkalmas pontmutációk elvégzésére. A PCR reakcióban PfuTurbo DNS polimeráz, valamint az előállított megfelelő primerek segítségével lehetett létrehozni a mutáns gént tartalmazó plazmidot. A folyamatban a ciklusok felfűtési szakaszában a két lánc elválik egymástól, a primerek annellálnak és szintetizálják a DNS-t, hűtéskor a komplementer láncok újra összekapcsolódnak. Megfelelő számú ciklus ismétlésével, minden lépésben a duplájára növekedve, megsokszorozható a plazmid mennyisége. PCR elegy összetétele: 5 µl 10X reakció puffer 5-50 ng dsdna templát (hpgk gént tartalmazó plazmid) 125 ng primer#1 125 ng primer#2 2 µl dntp mix 1 µl Pfu Turbo DNS polimeráz (2,5U/µl) kiegészítettem 50 µl-re ddh 2 O-val A hpgk gént tartalmazó plazmidot Philip J. Hogg-tól (Centre for Vascular Research, University of New South Wales, and Department of Haematology, Prince of Wales Hospital, NSW 2052, Australia) kaptuk. T3 Thermocycler (Biometra) készülékkel 20 ciklust végeztettem. 95 o C-os felfűtés után kezdődtek el a ciklusok. Egy ciklus felépítése a következők szerint alakult: 97 o C-on 20 15

23 sec, 55 o C-on 60 sec, 68 o C-on 14 perc (templát hosszától függ, 2 perc/kb). A ciklusok után 68 o C-on 10 sec-ig tartotta a hőmérsékletet, majd 4 o C-ra hűlt. A reakciótermék mennyiségét 1%-os agaróz gélen ellenőriztem (összehasonlítottam a kiindulási DNS mennyiségével). Emésztés 1µl DpnI enzimet (10 U/µl) adtam a reakcióelegyhez és 37 o C-on 1 órán keresztül inkubáltam. Ekkor az enzim hatására a metilált (szülői, nem mutáns) dsdns lebomlik Transzformálás A PCR segítségével felszaporított mutációt tartalmazó plazmidot Epicurian Coli XL1- Blue szuperkompetens sejtekbe, fehérjetermelés céljából a felszaporított és kitisztított vektort pedig BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Strategene) kompetens sejtekbe transzformáltam. A -80 o C-on tartott kompetens sejteket jégen lassan felolvasztottam. 50 µl sejthez az 1 µl plazmidot adtam, majd jégen inkubáltam 30 percig. 90 másodpercig 42 o C-on (hősokk) indukáltam a rezisztencia gének kifejeződését, majd 2 percig jégen tartottam. Ezt követően 500 µl 42 o C-ra előmelegített 500 µl LB kondicionált médiummal rázattattam egy órán át 37 o C-on. Antibiotikum tartalmú lemezekre kentem ki, majd 16 órán át növesztettem 37 o C-on Plazmid tisztítása Viogene Mini-M plazmid DNS preparációs kit segítségével történt Emésztés restrikciós endonukleáz enzimekkel és DNS elektroforézis Annak ellenőrzésére, hogy a pet11c vektor valóban tartalmazza a megfelelő nagyságú hpgk génjét NdeI és BamHI restrikciós enzimek segítségével emésztettem a kitisztított plazmidot. A hasítóhelyek a hpgk génjének 5 ill. 3 végén találhatók. Ezt követően agaróz gélelekroforézist használtam az emésztett termék tisztaságának és mennyiségének ellenőrzésére. 16

24 4.2.5 DNS gélelektroforézis A DNS fragmensek elválasztására agaróz gélelektroforézist használtam. A fragmensek méretüknek megfelelően az elektromos térerősség hatására különböző sebességgel vándorolnak, ez szeparálást tesz lehetővé. Az elektroforézishez 1 %-os agaróz gélt készítettem, amit forralás után lehűtve öntöttem a tálcára a fésű megfelelő elhelyezését követően. Az agaróz gél megszilárdulását követően összeállítottam a berendezést és felvittem a mintákat. Az elektroforézist TAE oldatban 80 V feszültségen kb. 50 percig végeztem. A gél festéséhez etídium-bromidot alkalmaztam, mely 20 percig tartott. Ezt követően ioncserélt vízben mostam kétszer, 10 percig. UV fénnyel megvilágítva láthatóvá váltak a szeparálódott DNS sávok Fehérje termelése E. coli sejtekben A plazmidot tartalmazó BL21-C+(DE3)-RIL kinőtt telepek közül egyet 20 ml LB tápoldatba tettem, ami 20 µl ampicillint és 20 µl kloramfenikolt tartalmazott. Ezt a kezdő kultúrát egy éjszakán át növesztettem. A fehérje termelést 2 l-es Erlenmeyer lombikokban végeztem, lombikonként 500 ml LB-táptalajjal, melyhez 5 ml kezdő kultúrát, 500 µl ampicillint, és 500 µl kloramfenikolt adtam. Az így elkészített kultúrákat 180 rpm-en 37 o C-on, kb 3 óra hosszáig növesztettem az optikai denzitását figyelve. OD 600 =0,6 értéknél 0,5 mm IPTG-vel indukáltam, hogy a PGK termelődése megkezdődjön. 4 órán keresztül termeltettem az enzimet. Ezt követően 4000 rpm-mel, 15 percig 4 o C-on centrifugáltam a kultúrákat és a sejtcsapadékot 20 ml NaP i pufferrel felszuszpendáltam, majd folyékony N 2 -ben lefagyasztottam és -80 C-on tároltam A fehérje feltárása és tisztítása A sejt szuszpenziót ultrahangos feltárásnak (szonikálás) vetettem alá, mely 5 1 percig jégben történt, a felmelegedés elkerülése érdekében. Ezt követően rpm-el 4 o C-on 15 percig centrifugáltam. A felülúszót lassan telítettem 2,3 M (357g/l) ammóniumszulfáttal állandó keverés mellett, jeges vízfürdőben. Centrifugáltam rpm-mel, 15 percig, 4 o C-on. A felülúszót tovább telítettem 3,4 M (195 g/l) ammónium-szulfáttal az előzőekhez hasonló módon. Centrifugáltam rpm-mel, 15 percig, 4 o C-on. A csapadékot 20 mm NaP i pufferben ph=6,2 feloldottam. Az ammónium-szulfátot 17

25 kidializáltam a fehérjéből 20 mm-os NaP i pufferben ph=6,2; 5 mm merkaptoetanol jelenlétében. CM-Sepharose oszlopkromatográfia A sómentesített fehérje továbbtisztítását Gradifrac készüléken karboxi-metil-(cm)- Sepharose kationcserélő gyantán végeztem el. A készülék programozható, a megadható paraméterek: az eluens áramlási sebessége, a gradiens, a frakciók szedésének módja ill. a frakciók térfogata. A készülék egy UV detektor segítségével méri a rajta átfolyó oldat abszorbanciáját, ami a fehérjekoncentrációval arányos. Az ennek megfelelő jelet rajzolja ki a rekorder. A kromatográfiás elválasztás előtt az A pufferrel ( 20 mm NaP i ph=6,2) egyensúlyba hoztam. Ezt követően felvittem az oszlopra a dializált fehérjét. Az A puffer segítségével mostam az oszlopot. Ekkor az elegyben lévő azon fehérjék, melyek nem tudtak megkötődni az oszlopon, (mert nincs megfelelő pozitív töltésük) kimosódtak. Ezután B puffer segítségével, mely az A -hoz képest még 1 M NaCl-ot is tartalmazott gradiens elúciót alkalmaztam. A növekvő sókoncentráció következtében a gyantán megkötött fehérjék fokozatosan leszorultak pk értékük alapján más-más iongradiensnél eluálódtak. A frakciókat kémcsövekbe gyűjtöttem. A kromatogram alapján SDS-gélelektroforézis ( pont) segítségével azonosítottam a hpgk-t tartalmazó frakciókat, és azok tisztaságát ellenőriztem az enzimre nézve. A hpgk tartalmú frakciókat összeöntöttem, majd Amicon szűrőn kb. 300 µm koncentrációra betöményítettem. A töményítéshez kda méret-határig visszatartó membránt használtam. A betöményített enzimet dializáltam 20 mm Tris-HCl ph=7,5 (1 mm EDTA, 5 mm DTT) pufferrel szemben, ezt követően a fehérje koncentrációját és aktivitását mértem. Az így előállított fehérje 98 % tisztaságú volt Fehérje vizsgálata SDS-gélelektroforézissel A termelt fehérje tisztaságát SDS-PAGE módszerrel ellenőriztem. Adott ph-jú oldatban a fehérjék különböző fajlagos töltéssel és térszerkezettel rendelkeznek. Az oldathoz adott SDS hatására a fehérjék denaturálódnak, egységesen nyújtott konformációt vesznek fel, valamint hosszegységenként kb. azonos mennyiségű SDS-t kötnek meg, így a töltés/tömeg arány azonos lesz. A több polipeptidláncból felépülő fehérjék alegységeikre disszociálnak. Ilyen körülmények közt a monomereknek az elektromos 18

26 tér hatására bekövetkező vándorlása a gélmátrixban arányos lesz a moláris tömeggel az elektroforézis ideje alatt. A gélelektroforézishez Bio-Rad berendezést használtam. Az elválasztó és a tömörítő gél elegyének elkészítése után az elválasztó gélt a futtató berendezés két üveglapja közé pipettáztam, fölé ioncserélt vizet rétegeztem az egyenletes gélfelszín elérése érdekében. A polimerizálást követően rápipettáztam a tömörítő gélt és belehelyeztem a fésűt. A gél polimerizálása után a mintákat a zsebekbe, a futtató puffert pedig a futtató kádba töltöttem. Az elektroforézist 180 V feszültség mellett 60 percig végeztem. Ezt követően a gélt kivettem, ioncserélt vízben mostam, majd festékoldatban (Bio-Rad, pont) 60 percig festettem. A felesleges festék kimosását követően a fehérjék láthatóvá váltak a gélen Fehérjekoncentráció meghatározása A fehérje koncentrációjának meghatározására 280 nm-en spektrofotométerrel végeztem. A fehérje oldószeréül szolgáló puffer elnyelését is megmértem. A fehérje oldat és a puffer elnyelésének különbségéből számítottam ki a PGK koncentrációját ([PGK]). a Lambert-Beer törvény segítségével: A 280 = ε l [PGK] 2. egyenlet ahol: A 280 a 280 nm-en mért abszorpció ε a PGK moláris abszorbciós koefficiens (0,69 cm 3 /mg cm) l a fényúthossz a küvettában PGK enzimaktivitásának meghatározása A PGK enzimaktivitását 3-PG és MgATP szubsztrátok alkalmazásával, GAPDH segédenzim segítségével határoztam meg a NADH oxidációjának spektrofotometriás követése alapján 340 nm-nél (ε=6220 M -1 cm -1 ). A reakció alapja azon konszekutív folyamat (3. egyenlet), melynek során a PGK által katalizált folyamatban keletkező 1,3- BPG továbbreagál a GAPDH segédenzimmel és eközben a NADH oxidálódik. A PGK aktivitásának meghatározásához az szükséges, hogy a PGK által katalizált folyamat legyen a sebességmeghatározó. Az időgörbe első másodpercéből a kezdeti sebességet határoztam meg. MgATP + 3-PG PGK MgADP + 1,3-BPG 1,3-BPG +NADH + H + GAPDH G-3-P + NAD + P i 3. egyenlet 19

27 Az enzimaktivitási méréseket 20 mm-os Tris-HCl ph=7,5 (1 mm EDTA, 5 mm DTT) pufferben végeztem. A reakcióelegy összetétele: 2,5 mm MgCl 2 2,5 mm ATP 2,5 mm 3-PG 100 mm hidrazin-hcl 0,25 mm NADH kb mm GAPDH kb. 2*10-6 mm PGK A szubsztrátok koncentrációjának meghatározása ATP koncentrációjának meghatározása Enzimatikus meghatározás Az enzimaktivitás meghatározásnál említett konszekutív reakció alapján, hasonló összetételű reakcióelegyben végeztem az ATP koncentrációjának az enzimatikus meghatározását. Különbség, hogy itt a MgATP szubsztrátot kis (kb. 0,1 mm) koncentrációban alkalmaztam, hogy teljes mennyiségében átalakuljon, az enzimeket pedig nagyobb koncentrációban, hogy gyorsan lejátszódjon a reakció. A reakcióelegy összetétele: 5 mm DTT 5 mm 3-PG 10 mm MgCl mm hidrazin-hcl 0,15 mm NADH 0,10 mm GAPDH (kristályos) 0,10 mm PGK (kristályos) 20 mm Tris, 1 mm EDTA, ph=7,5 A NADH 340 nm-nél mért spektrális jelében bekövetkező változást mértem. A NADH koncentrációjának megváltozása, az egyenletek szerint, megegyezik az elegybeli MgATP szubsztrát koncentrációjával, mert az teljes mennyiségében elreagál. Spektrofotometriás meghatározás A Lambert-Beer egyenlet alapján 260 nm-nél ε=15400 M -1 s -1 koefficiens segítségével történt. moláris abszorpciós 3-PG koncentrációjának meghatározása Csak enzimatikusan történt, hasonlóan a nukleotid szubsztrát MgATP enzimatikus meghatározásához. Itt viszont a MgATP-t alkalmaztam kis (kb. 0,1 mm) koncentrációban. A reakcióelegy összetétele hasonló volt a MgATP enzimatikus bemérésénél alkalmazotthoz, de 5 mm 3-PG helyett 5 mm MgATP-t alkalmaztam. 20

28 Szubsztráttelítési kinetikai vizsgálatok 3-PG-vel és MgATP-vel A PGK aktivitását 20 o C-on adott szubsztrát jelenlétében 20 mm Tris/EDTA (ph=7,5) pufferben mértem, mely 1mM EDTA-t és 1mM DTT-t tartalmazott. A NADH-nak a GAPDH által okozott oxidációját követtem 340 nm-nél ( pontban leírtak alapján). A szubsztráttelítési görbék analízisére a vad típusú hpgk enzim esetében az alábbi egyenletet alkalmaztam: [] S [ S] v = vs + vs ( a 1) K S(kat ) + [] S K S(kat ) + [] S K S(akt ) + [] S 4. egyenlet Az egyenlet első tagja a katalitikus hely szubsztráttal való telítődését írja le, vagyis azt az aktivitást, amit akkor fejtene ki az enzim, ha nem állna fenn a szubsztrátfelesleg aktiválás jelensége. Így tehát v S adja meg a katalitikus hely telítéskor, aktiválás nélkül mérhető hipotetikus aktivitást. Az egyenlet második tagja azt az aktivitásnövekedést jelenti, mely az aktiváló hely telítődéséből adódik. A K S(kat) a katalitikus, míg a K S(akt) az aktiváló helyre jellemző állandók, lényegileg az ismert K m állandóval analóg mennyiségek. Az a pedig az aktiválási faktor. Amennyiben a szubsztrát a katalitikus és az aktiváló helyet is telíti, akkor az aktivitás a v S lesz. A mutáns enzimek esetében az egyszerűbb Michaelis-Menten kinetika érvényes a szubsztráttelítési görbékre, az alábbi egyenlet szerint: [] S + [] S v = Vm 5. egyenlet Km Ahol a V m az elérhető maximális reakciósebességet, az [S] a szubsztrát koncentrációját, míg a K m a Michaelis-Menten állandót jelenti. [ S] A szubsztráttelítési vizsgálatokban alkalmazott elegy összetétele: 2,5 vagy 10 mm MgATP (3-PG telítési görbe esetén) 2,5 mm 3-PG (MgATP telítési görbe esetén) 12,5 mm MgCl 2 20 mm Tris, 1 mm DTT ph = 7,5 0,25 mm NADH 5-10 nm vad-típusú ill. 1-3 µm mutáns PGK 0,1-0,2 mm GAPDH Anion aktiválás-gátlás vizsgálatok Az anionaktiválás-gátlás vizsgálatok a PGK azon különleges enzimkinetikai viselkedésén alapulnak, hogy a többértékű anionok alacsony koncentrációban aktiválják, magas koncentrációban pedig gátolják az enzimaktivitást. Kísérleteimet 21

29 pirofoszfát anionnal végeztem. Az anion koncentrációját változtatva mértem a PGK aktivitását, miközben mindkét szubsztrát koncentrációját állandó szinten (0,5 mm 3-PG és 0,5 mm MgATP) tartottam. A kinetikai mérések leírására a vad típusú PGK-k esetén az alábbi egyenletet alkalmaztam: [ L] + [ L] [ L] + [ L] n [ L] + [ L] n v = vu + vu ( a 1) vu + vu ( a 1) 6. egyenlet Kd(act) Kd(act) Kd(inh) Az egyenletben v u az enzim aktivitása anion (L) távollétében adott szubsztrát koncentráció mellett, az a pedig egy aktiválási faktor, mely megmutatja, hogy végtelen ligandkoncentrációnál az aktivitás hányszorosára növekszik. Ebben az esetben az a mindig egynél nagyobb érték. A v u (a-1) azt az aktivitásnövekedést jelzi, mely az aktiváló hely telítődéséből származik, feltételezve, hogy a ligand csak az aktiváló helyhez kötődik. A harmadik tag adja meg a gátlást. Az egyenletben az n hatványkitevő jelzi, hogy több, egymással kölcsönhatásban levő gátlóhely feltételezett az enzim szerkezetében. A ligandkoncentráció (L) függvényében felvett kísérleti aktivitási értékek ezen egyenlet segítségével értékelhetők, vagyis megadhatók a vizsgált ligandra az aktiváló és gátlóhelyekhez tartozó disszociációs állandók (K akt és K inh ), valamint az a és az n paraméterek értéke. Az n a Hill koefficiens, mely megadja a minimális gátlóhelyek számát. Az anionaktiválás-gátlás vizsgálatára használt elegy összetétele: 0,5 mm 3-PG 0,5 mm ATP 1,0 mm MgCl mm Tris, 5 mm DTT ph = 7,5 0,25 mm NADH 0,1-0,2 mm GAPDH 0,05 µm vad-típusú ill. 2-3 µm mutáns PGK változó koncentrációjú (0-10 mm) pirofoszfát anion K I (valódi) gátlási állandót a következő képlet alapján számítottam, feltételezve, hogy az anion a szubsztrátokat kompetitíven kiszorítja: K K K' S(kat) (inh) I = 7. egyenlet [] S + KS(kat) Ahol a K (inh) azonos a 6. egyenletben szereplő K d(inh) állandóval. A valódi gátlási állandó kiszámításához mindkét szubsztrát koncentrációját figyelembe kell venni. 22

30 A mutáns PGK-k esetén az anionok kompetitív gátló hatását a 8. egyenlet írja le, amely a 6. egyenletből úgy származtatható, hogy az a, aktiválási faktor értéke 1. Ekkor csupán aniongátlást figyelhető meg. { v } n [ L] + [] L n v = vu u Kd(inh) 8. egyenlet Pirofoszfát anionnal végzett mérési pontjaim Lineweaver-Burk ábrázolásban való megjelenítéséhez az alábbi egyenletet alkalmaztam: 1 K m 1 [] S 1 = + 9. egyenlet v V V m m Ahol a K m a Michaelis állandót, a V m a maximális reakciósebességet, az [S] pedig a szubsztrát koncentrációt jelenti Differenciál scanning (DSC) mikrokalorimetria A fehérjék térszerkezetének megváltozását a termodinamikai paraméterek megváltozása kíséri. A kalorimetriás módszer segítségével a molekulák hő hatásával szemben mutatott stabilitását, a natív szerkezetű fehérjék hőmérséklet hatására bekövetkező letekeredését (unfolding) vizsgálhatjuk. Így lehetőséget nyújt a mutáns enzimek esetén a feltételezett korrekt térszerkezet kialakulásának ellenőrzésére. A méréseimet VP-DSC MicroCalorimeter-rel végeztem, 50 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA ph=7,5 pufferben 3 µm (0,13 mg/ml) koncentrációjú enzimekkel, a felfűtési sebesség 1 o C/perc volt Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia A cirkuláris dikroizmus segítségével szintén a fehérjék szerkezete ill. szerkezet változása vizsgálható. A távoli UV tartományban ( nm) felvett spektrum a másodlagos szerkezeti elemek meglétéről ill. ezeknek a fehérje szerkezetében betöltött arányáról ad információt. Míg a közeli UV tartománybeli spektrum ( nm) alapján az aromás oldalláncokra, ezek egymáshoz viszonyított térbeli helyzetére, azaz a harmadlagos szerkezetre következtethetünk. A vad típusú hpgk és a mutáns PGK-k térszerkezetének ellenőrzésére a távoli UV-ban felvett spektrumok összehasonlítását végeztem el. Kísérleteimet JASCO 720 spectropolarimeter-t használva, 1 mm-es küvettában 50 mm Tris ph=7,5 pufferben végeztem 9 µm (0,4 mg/ml) koncentrációjú enzimekkel. 23

31 5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5.1 A humán PGK kifejezése és tisztítása Laboratóriumunkban korábban sertésizomból izolált PGK-val dolgoztunk. Azért, hogy irányított mutagenezis kísérleteket végezhessek a PGK génjén, szükség volt egy bakteriális kifejező rendszerre. Mivel a humán PGK génje állt rendelkezésre (4.2.1 pont), ezért ezen enzimre dolgoztam ki az expressziót. A humán PGK szekvenciája 98 %-ban azonos a sertésizom PGK-éval, tehát az új eredetű enzim esetén nem számítottam lényeges eltérésre a korábban vizsgált sertésizom PGK-hoz képest. A plazmidot BL21C+(DE3)-RIL baktériumtörzsbe transzformáltam. A törzs használatának az az előnye, hogy benne az Arg, Ile és Leu kifejezésében közreműködő humán trns-ek is jelen vannak. Ez azért szükséges, mert a humán enzim génjének elején található egy Arg aminosavat kódoló triplett, melyhez tartozó trns-t az E.coli csupán 0,04 % gyakorisággal fejezi ki. Ez a törzs klóramfenikol rezisztenciagénnel rendelkezik. A transzformált sejteket ampicillin és klóramfenikolt tartalmazó lemezekre szélesztettem, így biztosítva, hogy csupán azon sejtek maradjanak életképesek és fejlődjön telep belőlük, melyekbe bejutott a pet11c vektor. A kifejlődött telepek egy sejtből alakulnak ki. Egy telepet 20 ml LB tápoldatba oltottam, IE IU 94 kd 67 kd 43 kd 30 kd 20,1 kd 14,4 kd 5. ábra: SDS gélelektroforézis a hpgk gén indukciójának ellenőrzésére. Az indukció pontban leírtak szerint IPTG segítségével történt: indukálás előtt (IE), indukálás után (IU). A PGK molekulatömege 44,5 kd. 24

32 melyhez 20 µl ampicillin és 20 µl klóramfenikol antibiotikumot is adtam. Ez volt a kezdő kultúra. Egy éjszakán át inkubáltam. Másnap négy darab 2 l-es lombikba osztottam szét a kezdő kultúrát, melyek egyenként 500 ml LB tápoldatot és 500 µl ampicillint, valamint 500 µl klóramfenikolt tartalmaztak. 37 o C-on 180 rpm rázatással növesztettem. A megfelelő sejtszaporulat elérését követően IPTG indukció segítségével fehérjét termeltettem (4.2.6 pont). Az 5. ábrán megfigyelhető a 43 kd körüli sávban, hogy indukálás után a termelt fehérje jelentős mennyiségű volt a mintában. A sejtszuszpenziót centrifugáltam és a csapadékot a további tisztításig -80 o C-on tároltam. Ezután a sejteket ultrahangos feltárásnak vetettem alá (szonikáltam). Ezt követően centrifugáltam, hogy a sejttörmeléket elválasszam az izolálni kívánt fehérjétől. A PGK a felülúszóba került, a sejttörmelék csapadékként jelentkezett. A felülúszót ammóniumszulfáttal 2,3 M-ig telítettem. Ennél az első kisózásnál a fehérjém még nem csapódott ki. Sz F F1 F2 D 43 kd 6. ábra: A hpgk kimutatása SDS-gélelektroforézissel a tisztítási lépések során A minták vétele Sz=szonikálás után, F=centrifugálás után, F1=1. kisózás felülúszó, F2=2. kisózás felülúszó, D=dialízis után történt. Centrifugálás segítségével elválasztottam a kisózott egyéb fehérjéktől, a PGK a felülúszóban volt. Ezt követően 3,4 M-ig tovább telítettem ammónium-szulfáttal. Centrifugálást követően a PGK a csapadékban volt. Ezt oldottam fel 20 mm NaP i pufferben ph=6,2 (5 mm merkaptoetanol) és dializáltam, hogy az ammónium-szulfátot eltávolítsam. A merkaptoetanol redukálószer, amely megvédi a fehérje szabad SHcsoportjait az oxidálódástól oly módon, hogy önmaga oxidálódik. 25