Szövetpótlás biológiai és biomateriális tudományok alkalmazásával

Átírás

1 A Vas Megyei Markusovszky Kórház, Baleseti Sebészeti, Helyreállító és Kézsebészeti Osztálya, Szombathely, közleménye Szövetpótlás biológiai és biomateriális tudományok alkalmazásával (Tissue engineering) DR. SALAMON ANTAL Érkezett: április 8. ÖSSZEFOGLALÁS A hagyományos sebészi eljárásokkal, mint ismert, rendszerint nem állítható helyre teljesen a sérülést követő szövethiányokban az eredeti bőr, szalag, ín, porc vagy a csontszövethez teljesen hasonló struktúra. A tissue engineering, amely a modern biológiai és mérnöki tudományokat alkalmazza, jelentős előrelépést jelent a szövethiányok pótlása és helyreállítása terén. A módszer e célból pluripotens mesenchymalis őssejteket, szövetindukáló polypeptideket (növekedési faktorokat) és a sejtkultúrában kezelt átültetendő sejtek megtapadására szolgáló vázszerkezeteket használ. Az új szövet kialakulásának feltételei géntechnikával tovább javíthatók. Az eljárásról azt tartják, hogy a közeljövőben forradalmasítani fogja, s jelentősen átalakítja a szövetpótlások jelenlegi gyakorlatát. A szerző áttekinti az eddigi években a módszerrel szerzett tapasztalatokat, eredményeket, s bőséges irodalmi listát szolgáltat az olvasó számára. Kulcsszavak: Tissue engineering; Szövetpótlás; Őssejt; Mesenchymalis őssejt; Növekedési faktorok; A. Salamon: Tissue replacement by using biology and biomaterial sciences (Tissue engineering) Conventional surgical methods are not always suitable to restore the lack of different tissues following injuries like skin, ligaments, tendons, cartilages and bones. Tissue engineering, a mixture of biology and modern engineering studies, is able to show perspectives in the field of tissue replacement and restoration. This method is using pluripotent mesenchymal cells, inductive polypeptides (growth factors) and creating special frames for hosting the grown cells. Gene technique is a good method for improving the newly formed tissues. This method seems to be a revolutionary method in the practice of the current tissue replacement procedure. The author gives a review of the present experiences, and the results and the bibliography are presented as well. Key words: Tissue engineering; Tissue transplantation; Mesenchymal stem cells; Stem cells; Growth substances; BEVEZETÉS Az egyes szövetek, szervek károsodása nagy problémát jelent az érintett testrész funkciójának, vagy a beteg életének a fenntartásában. A tissue engineering egy interdiszciplináris terület, amely a biológiai és mérnöki tudományok princípiumait alkalmazza abból a célból, hogy biológiai szubsztitútumokat fejlesszen ki, amelyekkel a hiányzó szöveti funkciók helyreállíthatók, vagy szervek pótolhatók (24, 32). Az eredeti angol kifejezés szószerinti magyarra fordítása nehéz, ezért a jelen ismertetésben az angol megjelölés szerepel. A hagyományos eljárásokkal, mint ismert, nem állítható vissza tökéletesen az eredeti szöveti struktúra, a tissue engineering alkalmazásával azonban lehetőség van arra, hogy az eredetihez teljesen hasonló szövetek alakuljanak ki. A biotechnológiában észlelhető nagy fejlődés következtében a regeneratív medicina új diszciplínaként jelenik meg, s szignifikánsan megváltoztatja az eddigi 340 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

2 szokásos terápiát. Az új eljárás jelentőségét igazolja azon körülmény is, hogy napjainkban, 140 folyóiratban jelentek meg a témával kapcsolatos közlemények, amelyek közül 64% az USA-ból, 25% Angliából és Németországból és Hollandiából származik. Az eljárásnak mind orvosi, mind szociális szempontból nagy jelentősége van, mivel alkalmazásával csökkenthető a donorszövetek, szervek kivétele, s az egészségügyi kiadások is csökkenthetők. A jelen ismertetésnek az a célja, hogy a tissue engineering-re vonatkozó utóbbi években közölt in vitro és in vivo vizsgálatok eredményeit tárgyaló számos irodalmi adat áttekintésével felhívja a szövetpótlással foglalkozó hazai szakemberek figyelmét az új eljárás jelentőségére, amely a következő években várhatóan jelentősen meg fogja változtatni a szövetátültetés eddigi hagyományos módszerein alapuló szemléletet és gyakorlatot. Ez a közlemény a folyóirat profiljának megfelelően csupán a szövetpótlások új lehetőségeit tekinti át, s nem foglalkozik a szervpótlással. Így az ortopédia, traumatológia, plasztikai és helyreállító sebészet valamint a kézsebészet szempontjait érintő olyan kérdések, eljárások kerülnek megtárgyalásra, mint a sebgyógyulás, a sérült, károsodott bőr, a szalagok és inak, valamint a porc- és csonthiányok pótlása. Új szövetek kialakítására három stratégia áll rendelkezésre: 1. Izolált sejtek, sejt szubsztitútumok felhasználása Sejtes implantátumok alkalmazására a donorszövetekből vagy a sérült szövetekből nyerhetők sejtek vagy sejtes aggregátumok. A beültetésre embrionális őssejtek vagy olyan felnőttkori sejtek használhatók, amelyek differenciálódni, proliferálni képesek, s így bizonyos körülmények közt fibroblasttá, chondroblasttá vagy osteoblasttá képesek alakulni. Ilyen pluripotens őssejtek nyerhetők humán embrionális szövetekből, amelyek számos differenciálatlan sejtté sokasodnak (47). Foetalis mesenchymalis sejtpopulációk izolálhatók humán amnion folyadékból, amelyek in vitro gyorsan expandálnak, s értékes lelőhelyül szolgálnak a tissue engineering számára. Az amnion folyadékból készített sejtkultúrák különböző sejtekké képesek differenciálódni (7, 47). Sok felnőttkori szövet tartalmaz másrészt olyan multipotens mesenchymalis őssejteket, amelyek megújulni képesek. Ilyenek vannak a csontvelőben, amely nemcsak haemopoetikus sejteket, hanem olyan őssejteket is tartalmaz, amelyek differenciálatlan sejtként képesek replikációra, s az olyan szövetek regenerációjában játszhatnak szerepet, mint a bőr, szalag, ín, porc és csont. Aránylag könnyen izolálhatók egy csontvelő-aspirátumból, s sejtkultúrában jól expandálnak (6, 28, 35). Az adiposus szövetekből nyert lipoaspiratum is jó lelőhelye a pluripotens mesenchymalis sejteknek, amelyek ugyancsak különböző szövetekké tudnak differenciálódni, s alkalmasak lehetnek a módszer számára (17). Miért van ilyen élénk érdeklődés az embrionális és felnőttkori őssejtek iránt? Azért, mert e sejtek reményt keltően használhatók fel az olyan sérült, károsodott szövetek kezelésében, helyreállításában, ahol egyébként limitált a reparációt szolgáló sejtek száma. Nem kétséges, hogy az embrionális vagy felnőttkori mesenchymalis őssejtek nagy terápiás jelentőséggel bírnak, de szélesebb körű klinikai felhasználásukról még további kutatások végzése szükséges (67). 2. Szövetindukáló szubsztanciák szerepe A tissue engineering sikeres felhasználása purifikált szignál molekulák (növekedési faktorok) alkalmazásától, valamint az olyan módszerek kifejlesztésétől függ, amelyek e molekulákat a célsejtekbe juttatják (32). Ismert ugyanis, hogy a növekedési faktorok olyan folyamatokat képesek indukálni, mint a sejtmigráció, proliferáció, proteinszintézis, enzimak- Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

3 tivitás, szövetmodulálás. Az új szövetet kialakító folyamatban a növekedési faktorok fontos mediátor-szerepet játszanak, s a célsejtek receptor felszínein kötődve szignál-folyamatot váltanak ki, amelynek eredménye thyrosin foszforiláció és a transzkripciós faktorok akciója lesz. A növekedési faktorok ilyen hatása a sejtben proteineket aktivál, majd a sejtmagban gének kapcsolódnak be a folyamatba, amelyek végül a növekedési faktorok működését regulálják (20). A növekedési faktorok, mint szignál polipeptidek tehát fontos szerepet játszanak a tissue engineering alkalmazásával nyert szövet kialakításában. Főleg az alábbi növekedési faktorok szerepét mutatták ki, amelyek a továbbiakban az irodalomban található angol nyelvű megjelöléssel, illetve rövidítéssel kerülnek ismertetésre: Transforming Growth Factor beta (TGF beta), Platelet Derived Growth Factor (PDGF), basic Fibroblast Growth Factor (bfgf), Insulin like Growth Factor I, (IGF I), Epidermal Growth Factor, (EGF), Vascular Endothelial Cell Growth Factor (VEGF). Az eddigiekből kitűnik, hogy a mesenchymalis őssejtek, valamint a növekedési faktorok fent vázolt szerepe jelentős tényező az új szövet kialakításában. A célt ma a tissue engineering és a génterápia alkalmazásával kívánják elérni. E törekvések további alapkutatások végzésével és klinikai tapasztalatok szerzésével vezethetnek végső sikerekhez. Egy új biológiai korszak tanúi vagyunk, amelynek előnyeit az ortopéd-, baleseti és plasztikai sebészetben egyaránt tapasztalni fogjuk. 3. Új szövet kialakítása mátrixszal, vázszerkezettel E célra idővel lebomlásra képes háromdimenziós vázszerkezetek (scaffolds) szolgálnak. Ezek készülhetnek természetes anyagokból (kollagén, fibrin), szintetikus anyagokból készült polymerekből (polylactid, PLA, polyglycolid acid, PGA, polylactid co- glycolyc acid, PLGA), polyvinyl alcohol hydrogelekből (PVA), spongiosus szerkezetekből, lapszerű gél anyagokból, vagy komplex porózus csatornákkal bíró szerkezetekből épülnek fel (10, 19, 24, 32, 43, 45, 49, 56). A cél az, hogy a felhasznált vázanyag idővel lebomoljon a recipiens szervezetben, s új szövettel épüljön át. E vázszerkezetek embrionális vagy a felnőttkori csontvelőből származó őssejtekkel telepíthetők be, megfelelő sejtkultúrában történt kezelés és növekedési faktorok mediátor szerepét követően. Qin Tingwu és munkatársai (50) szerint igen fontos a sejtek vázon történő megtapadása, ami egyrészt a felhasznált anyag természetétől (tömeg, felületi sajátosság, hálózatosság, porozitás, degradációs képesség), másrészt a sejteknek a mátrixszal való interakciójától is függ. A fentiek mellett fontosak a kedvező kezdeti biomechanikai tulajdonságok is az új szövet kialakulásában. Ugyancsak lényeges szempont a sejtek túlélése és a fiziológiás erőkre való reagálása. A vázolt bioaktív konstrukciók alkalmazásával a tissue engineering előnyösebb tényezőkkel rendelkezik a hagyományos módszerekhez viszonyítva. SEBGYÓGYULÁS, BŐRPÓTLÁS A módszer legelőrehaladottabb alkalmazási területe a bőrsebek gyógyításában, bőr transzplantátumok alkalmazásában található. A siker a felhasznált mesenchymalis őssejtkultúrák, illetve a kollagén vagy szintetikus vázanyagok kombinálásán alapszik. Az ilyen konstrukciók feladata a seben át történő folyadékvesztés, így a kiszáradás megelőzése. A fentieket kiegészíti a növekedési faktorok induktív hatása, s a génterápia alkalmazása. Az autológ sejtkultúrákban tenyésztett keratinocyták transzplantációja a tissue engineering egyik legelőrehaladottabb területe. Az ilyen sejtkultúrában előkészített sejtek túlélnek, differenciálódásra, proliferációra képesek, s jó használhatók fel új dermis kialakítására. A bioengineered bőr újonnan képződött keratinocytákat, fibroblastokat tartalmaz kollagén mátrixban, s az ilyen 342 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

4 transzplantátummal égési sebeket, vénás, diabeteses fekélyeket is eredményesen lehet kezelni (2, 9, 60, 63). A sejtkultúrában előállított, epidermisből és biopolymerekből álló bőrpótlók redukálhatják a hagyományos donor autograft szükségletet, s helyreállítják a szöveti funkciót. Az így gyógyult bőr puha és sima lesz. Az utóbbi évtizedben vált ismertté, hogy a növekedési faktorok nélkülözhetetlenek a sebgyógyulás lefolyásában. Az USA-ban a Food and Drog Administration a közelmúltban olyan növekedési faktorokat tartalmazó termékeket hagyott jóvá, amelyek javítják a sebek gyógyulását. Egyes növekedési faktorokkal kapcsolatos vizsgálatok során igen biztató, pozitív eredmények mutatkoztak, mások azonban hatástalannak bizonyultak. Ez utóbbiakban nyilván más tényezők szerepe (szöveti oxigenizáció, baktériumok, a beteg tápláltsági állapota) is közrejátszott (27). A növekedési faktorok stimulálják a sejtproliferációt, s fontos befolyásuk van az extracellularis mátrix lerakódásában, kialakulásában (16, 20). Az eddigi ismeretek szerint egyesek (PDGF, EGF) a célsejteket képesek nyugalmi állapotukból aktiválni. A keratinocyták mobilizálásában, a sejtmigrációban, a mátrixtermelésben főleg a TGF beta szerepe emelendő ki (55). Egyes növekedési faktorok (TGF béta, bfgf) krónikus sebek, lábszárfekélyek gyógyulására gyakorolt pozitív hatását más szerzők is megerősítették (14, 22). Rumalla és Borah (54) szerint a klinikai terápiás eredmények még változóak, de az egyéb olyan stratégia bevetésével, mint a génterápia az eredmények további javulása várható. A krónikus bőrsebek gyógyulási problémáival kapcsolatban Cupp és Bloom (15) megjegyzik, hogy az USA-ban évente 1,25 millió ember szenved el égési sebeket, s 5 milliónak van olyan krónikus bőrfekélye, amely főleg vénás keringési zavar vagy diabetes miatt alakult ki. A rosszul gyógyuló lábsebek kezelése évente 1 billió dollárt emészt fel. A fentiek miatt már több kereskedelembe került termék került kifejlesztésre abból a célból, hogy a sebkezeléshez optimális viszonyokat biztosítsanak. A PDGF hatásos a rosszul gyógyuló sebek kezelésében, de az a hátránya, hogy nagy és ismételten adandó dózisokra van szükség. Előtérbe került ugyanakkor az ilyen növekedési faktorokat kódoló géneknek a célsejtekbe való juttatása. A géninszercióra több lehetőség van. Ilyen például a viralis faktorok (vektorok) használata. A fentiek áttekintésével leszögezhető, hogy a sebgyógyulást tanulmányozó alapkutatások során nyert új megfigyelések továbbá a klinikai tapasztalatok birtokában, a sebkezelésben egy új forradalmi változás várható: az occlusiós kötés terápia, illetve az ezzel kapcsolatos bőr-ekvivalensek alkalmazása. Az autológ epidermalis sejtréteg és a kollagén vagy polimer vázanyagok használata a bőrpótlás új koncepcióját jelentik. A neonatalis epidermalis keratinocytákat tartalmazó polyglycolide mesh vázú transzplantátum például a sebágyba helyezve jó vérellátású dermist alakít ki. Fibroblastok helyezhetők egy hidratált kollagén gél vázra is. Az implantáció során a sejtek a gélen migrálnak, s a kollagén rostok reorganizációja figyelhető meg. Más adatok szerint a lyopreservált, vagy glycerolban konzervált allogén dermis is használható a proliferáló keratinocyták számára. Az ilyen bioanyagok állandó bőrpótlóként használhatók (32). A normál sebgyógyulás során, mint ismert, már sok növekedési faktor befolyásoló szerepét identifikálták, s terápiás próbálkozások is történtek a klinikai gyakorlatban. A génterápia alkalmazásával az eredmények minden bizonnyal tovább javíthatók lesznek. A bioanyagokat felhasználó eljárás különösen jelentős az arc plasztikai rekonstrukciós műtéteiben. A fentiek alapján kétségtelennek látszik, hogy a tissue engineering stratégiájának alkalmazása jelentős előnnyel bír a hagyományos módszerek használatával szemben. SZALAGOK, INAK PÓTLÁSA A sérült szalagok vagy inak eddigi hagyományos műtéti technikával való ellátása során az eredetinél kevésbé teherbíró szövet keletkezik, s ez a körülmény gyakran bizonyos Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

5 funkciócsökkenéssel járhat. Megjegyzendő ugyanakkor, hogy az ilyen sérülések igen gyakoriak lettek, s a szabadidő vagy professzionális sportok elterjedésével sok problémát okoznak, a kezelésükkel járó növekvő kiadások pedig megterhelik az egészségügyet. E téren külön kiemelendők a kéz hajlítóín, továbbá a térd oldal- és keresztszalag sérülései. A tissue engineering alkalmazása potenciálisan javíthatja a sérült szalagok és inak gyógyulási esélyeit, s a tradicionális módszerekkel szemben egy hatásosabb terápiás lehetőséget jelenthet (8). Ami a sejtterápiát illeti, mesenchymalis őssejtek nyerhetők punkcióval a csontvelőből. E sejtek centrifugálás után in vitro expandálnak, s nagy számban állnak rendelkezésre a transzplantáció számára. Az ínsérülés területébe implantálva javítják a sérült ínrész strukturális sajátságait (71). A növekedési faktorok a sejtmigrációt, proliferációt, proteinszintézist, enzimaktivitást indukáló hatásuk miatt e téren is fontos szerepet játszanak. Spindler és munkatársai (61) vizsgálataiból kiderült, hogy a térdízületi oldal vagy keresztszalag sérülésekben egyes növekedési faktorok, így a PDGF, a TGF beta és az EGF expressziója fokozódik, s így stimulálják a mátrix proteinek szintézisét. Pozitív hatás főleg több növekedési faktor kombinált adása után várható. Duffy és munkatársai (18) szerint a sérült porc vagy csontszövetek pótlása során már jobban előtérbe került a növekedési faktorok pozitív szerepének tanulmányozása, ugyanakkor még kevés adat áll rendelkezésre a sérült szalag- és ínpótlás területén. Vizsgálataik szerint a bfgf a sérülés utáni l7. napokban jelen van a gyógyuló ínban, s változó mennyiségű PDGF-t és EGF-t is észleltek. Más szerzők is kimutatták, hogy a sérült ínban jelentkező fibroblast proliferációt, kollagén szintézist több növekedési faktor (PDGF, EGF, TGF béta) is stimulálja (52, 61, 69). Mint ismert, az inak gyógyulási képessége sérülést követően nem megfelelő, de a regenerációs folyamatot a növekedési faktorok elősegítik. A rövid felezési idő miatt azonban még problematikus klinikai alkalmazásuk. In vitro terápiás gének viralis transzferrel Achilles inakon vizsgálva hatásosnak bizonyultak. Génterápia alkalmazásával lehetőség nyílik arra, hogy egy meghatározott növekedési faktort kódoló exogén géntranszfer történjék. Mindez transzfer rendszerekkel, vektorokkal lehetséges. Főleg a viralis vektorok látszanak hatásosnak, amelyek direkt a célsejtekbe vihetők be. Ma még azonban csak kevés potenciálisan terápiás géntranszferről vannak adatok (34). A szalag- vagy ínpótlás céljából alkalmazott acellularis transzplantátumoknak a befogadó szövetbe való beépülése nem ideális. Ezért kerülnek előtérbe a sejtekkel átszőtt bioaktív konstrukciók, háromdimenziós vázanyagok. A mátrix anyaga kollagén, fibronektin, vagy polymerek (PLA, PGA) lehetnek. Bellicampi (4) vizsgálatai szerint az alkalmazott kollagén váz gyorsan, 8 hét alatt lebomlik, felszívódik. A vázra telepíthető őssejtek a csontvelőből nyerhetők. Kereszt- és oldalszalagokon végzett vizsgálataik azt mutatták, hogy a fibroblastok a PLA és PGA vázakon jól megtapadnak. Altman és munkatársai (1) selyemrost mátrixot alkalmaztak a sérült ACL tissue engineering módszerrel történt helyreállítása során. Azt találták, hogy a felnőttkori progenitor sejtek jól megtapadnak és differenciálódnak a vázon. Más adatok szerint a sérült szalag szakítási szilárdsága in vitro kísérletben mesenchymalis sejt kollagén gél konstrukció alkalmazásával jól helyreáll (57). Meany Murray és munkatársai (38) kollagén GAG scaffoldot fejlesztettek ki, s helyeztek rupturált ACL végek közzé. Vizsgálataik szerint a TGF béta, PDGF és bfgf növekedési faktoroknak a sejtkultúrához való hozzáadásával a sejtproliferáció jelentősen megnő, s kollagén produkció észlelhető. Így javulnak a gyógyulás feltételei. A fent vázolt ígéretes kutatások eredményeit még további klinikai tapasztalatokkal kell megerősíteni, s azt eldönteni, hogy a tissue engineering alkalmazásával kapott eredmények mennyivel múlják felül a hagyományos módszerekét (8). 344 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

6 PORCSZÖVET PÓTLÁSA Napjainkban nagyszámú helyreállító műtétet végeznek porchiányok kitöltése céljából. Problémát jelent azonban az, hogy a donor porcszövet vételi lehetősége behatárolt. Az olyan porcsérülések, amelyek nem érik el a subchondralis csontot, előnytelenül gyógyulnak, s rendszerint a porcfelszín degeneratív elváltozása következik be. A csontot is elérő porcsérülésekben fibrosus, fibrocartilaginosus szövet alakul ki hialinszerű porccal. A porcszövet reparatív kapacitása tehát behatárolt, aminek az oka a vérellátás hiánya, a mátrix felől történő alacsony sejtmobilitás. Az elmúlt évtizedekben több porcképző eljárás vált ismertté (débridement, Pridie-felfúrás, abráziós arthroplastica, microfracture technik, periosteum, perichondrium átültetés, autológ chondrocyta transzplantáció), amelyekkel csak mérsékelt eredmények születtek. Nagy előrelépést jelentett a Hangody (25) által kidolgozott osteochondralis graftokkal végzett mozaikplasztika, amellyel a szerző szerint az átültetett graftok túlélnek, s megfelelő ízfelszín alakul ki. A transzplantátumok vételi helye a nem terhelt porcfelszín. A tissue engineering alkalmazása az elpusztult porcfelszín, illetve a porchiányos területek pótlásában nagy előrelépést jelent. Ennek során az embrionális történések utánzása Caplan és Bruder (12) szerint embrionális őssejtek implantációjával lehetséges. A felnőttkori csontvelő mesenchymalis őssejtjei ugyancsak felhasználhatók (11, 28). Chondrocyta sejtkultúrák is alkalmazhatók növekedési faktorok hozzáadása mellett (62). Sejtek nyerhetők továbbá e célból a periosteumból és perichondriumból is (23, 68). Az új porcszövet kialakulásának indukálásában is fontos szerepe van a növekedési faktoroknak. Ilyenek a TGF béta, az IGF I bfgf (21, 39). E faktorok befolyásolni tudják a sejtproliferációt, az extracellularis állomány szintézisét. A rövid felezési idő miatt azonban nagydózisú injekciók adása szükséges, s mellékhatások is felléphetnek, így a klinikai alkalmazásuk még limitált. Génterápia alkalmazásával, sejtmanipulációval lehetővé válik a növekedési faktorok kontrollált expressziója. A géntechnikában főleg az úgynevezett ex vivo eljárás látszik a fenti célra alkalmasabbnak, ilyenkor a sejtmanipuláció az emberi testen kívül történik. A chondrocyta transzplantáció génterápiával való végzése javíthatja az eredményeket. Ennek során chondrocyta biopsia, sejtkultúra készítése, a sejtek géntechnikával való modifikálása történik a transzplantáció előtt. A genetikus információknak a célsejtekbe (target) való juttatása viralis vagy nem viralis vektorokkal végezhető. Az eljárás lényege tehát az, hogy a terápiás proteineket kódoló géneket juttatják be a sejtekbe (géntranszfer) abból a célból, hogy lokálisan érjék el a kívánt hatást (46). Grande és munkatársainak (23) vizsgálatai szerint a periosteumból származó őssejtek könnyen expandálnak sejtkultúrában, s alkalmasak a reparációt elősegítő különböző gének szállítására. A defektusba beépítve nemcsak részt vesznek a reparatív folyamatban, hanem lokálisan növekedési faktorokat secernálnak, s stimulálják a host sejteket a növekedési faktorokkal való reagálásra. A hét BMP vagy Shh gén szignifikánsan növeli a kialakult szövet minőségét, s hialin porcfelszín alakul ki. Más szerzők adatai is megerősítik a tissue engineering és géntechnika előnyös alkalmazását a porchiányok pótlásában (36, 37). A módszer alkalmazása során, akár a bőrsebek, szalagok, inak pótlásában, a porchiányok ellátásában is kifejlesztettek biokompatiblis, lebomlásra képes vázszerkezeteket, scaffoldokat. A Vacanti (65) által kialakított chondrocyta polymer anyag kombináció transzplantációja során in vitro és in vivo állatkísérletekben 8 49 nap alatt II. típusú kollagént tartalmazó porcszövet alakult ki. Később más szerzők is beszámoltak vázanyagok használatáról, melyek során agrosát, illetve kollagén gélt (68), kollagént, hyaluronátot (66), mások polimer anyagokat (PLA, PLAGA) vagy porózus kerámia cilindert használtak vázanyagként (5, 10, 19). E vizsgálatok szerint a szerkezeti mátrix molekulák mellett növekedési faktorok (TGF béta, IGF I) Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

7 is felszabadulnak, s befolyásolják a sejtek viselkedését. A megfelelő vázanyag fontos szerepet játszik a mátrix faktorok hordozójaként. A tissue engineering tehát funkcionális értelemben akkor realizálódik, ha a scaffold korrekt extracellularis szignálokkal támogatja a porcsejteket. Ochi és munkatársai (43) teljes vastagságú térdízületi porcdefektusba transzplantáltak kollagén gél vázon telepített autológ, sejtkultúrában kezelt chondrocytákat 28 klinikai esetben. A 25 hónappal később végzett térd artroszkópia során az esetek 93%-ában kitűnő vagy jó eredményt tapasztaltak. Az operált térdek stabilak lettek, a korábbi duzzanat, fájdalom megszűnt. Az elvégzett biokémiai tesztek szerint a transzplantált terület keménysége hasonló volt a környező porcéhoz. Az eddigi tapasztalatok arra utalnak, hogy a tissue engineering fent vázolt stratégiája sok előnnyel rendelkezik a hagyományos kezelési módokkal szemben. Lehetővé válik a reparatív sejtek bioaktív faktorainak vagy génjeinek a porcdefektusba való szállítása, s mindez szervezett formában végezhető. A módszer tehát a biomedicina egyik fontos területe, amely sejtbiológusok, sebészek és mérnökök közös munkájával gyorsan fejlődik. Célja egyértelműen a sérült ízületi porcdefektus ma még fennálló technikai nehézségeinek a csökkentése, illetve az eredmények javítása. CSONTSZÖVET PÓTLÁSA Biológiailag és biomechanikailag az éphez hasonló csonttal való csontszövetpótlás a baleseti és ortopéd sebészeti kutatásokban az egyik legnagyobb kihívást jelenti. Napjainkban rendkívül nagy számban végeznek a világ országaiban csonthiányt pótló műtéteket. A csontos gyógyulás meggyorsítható autológ csontgraftok alkalmazásával, de homológ konzervált graftokat is használnak. Az autológ csont-transzplantáció általában sikerrel jár, de az átültetésre felhasználható csont mennyisége behatárolt, s a kivétel helye néha fájdalmas lehet. A fenti okok miatt kutatóorvosok, ortopédek és mérnökök biológiai alternatívák kifejlesztésével kívánják növelni a szubsztitúcióra szánt csontgraft funkcionális képességeit, s egyúttal csökkenteni lehetne a hagyományos csontgraft szükségletet (32, 44). Így került e téren is előtérbe a tissue engineering alkalmazása. Az eljárás, amint már ismertetésre került, felhasználja a mesenchymalis őssejtek pluripotens képességét, továbbá a növekedési faktorok mediátor szerepét és a biokompatibilis vázanyagok használatát. A mesenchymalis őssejtek bizonyos körülmények közt osteoblasttá tudnak differenciálódni. Ilyen sejtek fetalis és felnőtt emberi csontvelőből egyaránt izoláltak (47). A csontregeneráció egy komplex folyamat, amelyben a számos sejtes elem mellett helyi regulátorok is szerepelnek. Ilyenek a növekedési faktorok, cytokinek, hormonok és az extracellularis mátrix komponensek. Az eddigi vizsgálatok szerint az EGF és bfgf csontépítő hatása nem jelentős (30). A TGF béta és IGF I azonban gyorsítja a folyamatot (42). Raschke és munkatársai (51) azt tapasztalták, hogy az IGF I és a TGF beta l sietteti az osteotomiás nyílás gyógyulását polylactiddal bevont implantátumok alkalmazásakor. Urist (64) korábbi vizsgálatai szerint a demineralizált csontmátrix (DBP) porc- és csontképződést tud indukálni. Ezen osteoinduktív komponenst Bone Morphogenetic Protein -nek (BMP) nevezte el. E faktorokról, amelyeket úgy az emberi, mint az állati csontokból kivonták, a közelmúltban már számos közlemény jelent meg, s a részlegesen purifikált derivátumok osteoinduktív hatását megerősítették (29, 33). A jelenlegi álláspont szerint e növekedési faktorok egész családja (BMP1, BMP2, BMP3, BMP4) képes osteoinduktív hatás kifejtésére, s ezen polipeptideket izolálták. Emberi BMP proteinek génjeinek klónozását is végezték, s rhbmp-nek jelölték. A BMP1-től eltekintve a többiek a TGF béta családjába tartoznak. Közülük főleg az rhbmp2 csontformáló aktivitása emelendő ki (70). A mesenchymalis őssejtek sejtkultúrában történt 346 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

8 expandálása utáni csontdefektusba való szállítására különböző vázanyagok felhasználására került sor. Seeherman és munkatársai (59) különböző állatokon végzett kísérletekben kollagént, fibrint, szintetikus polimereket (PLA, PGL, PLGA), kerámiával bevont polimereket alkalmaztak a BMP2 által indukált osteogenesis vizsgálatai során, zárt törések gyógyítására. E faktorok véleményük szerint fokozzák a csontmodelláló sejtek kemotaxisát, proliferációját, a vérerek és csontvelőelemek kialakulását. Ruhe és munkatársai (53) PLGA/CA foszfát cement scaffoldot használtak a BMP2 szállítására. E kompozitum szerintük egy injiciálható csontgraft szubsztitútumként alkalmazható a csontregeneráció kiváltásában. Hartwig és munkatársai (41) kísérletes vizsgálataiban a BMP3-al bevont implantátumok felületén megnövekedett csont újdonképződés volt megfigyelhető. Cheng és munkatársai (13) már több BMP típust vizsgáltak egérkísérletekben, s megfigyelték az osteoprogenitor sejteken az aktivitásukat. Vizsgálataik szerint a BMP2, 6 és 9 játszhat fontos szerepet az osteoblasttá történő differenciálódásban. Partridge és munkatársai (45) in vivo vizsgálatokban azt találták, hogy az adenoviralis osteoprogenitor sejtkonstrukció PLGA vázon alkalmazva csontszövet produkciót eredményezett. Más adatok arra utalnak, hogy az IGF I gének mesenchymalis sejtekbe történő adenoviralis transzfere osteoblast differenciálódáshoz, és I-es típusú kollagén kiválasztáshoz vezetett (31). Az elmúlt években egyébként több mátrix vázanyag alkalmazásáról számoltak be, így kollagén, hyaluronat, fibrin (59), porózus hyroxyapatit (10), PLGA (53), macroporózus Ca phosphat cement (3) használatáról jelentek meg közlemények. Hangsúlyozni kell tehát, hogy a csontvelő őssejtek és a rekombináns BMP egyaránt fontos szerepet játszanak a csontdefektusok gyógyulásában. Az utóbbi szükségeli az előbbi sejtek funkcióját. Az ilyen graft kompozitumok jobb eredményt biztosítanak, mint a hagyományos autológ graftok. KONKLÚZIÓK A baleseti, ortopéd- és plasztikai sebészetben valamint a kézsebészetben a sérülések vagy betegségek miatt bekövetkező szövethiányok kezelésében, pótlásában új korszak következik be, amelyet a biológiai és mérnöki tudományok alkalmazásával a tissue engineering és a fejlődő géntechnika jellemez. Ezen interdiszciplináris reparatív technológiát az angol nyelvű világirodalomban biomaterial surgery -nek nevezik. Ennek alkalmazásával a pluripotens mesenchymalis őssejtek, a szövetindukáló polypeptidek (növekedési faktorok, cytokinek), a modern géntechnika továbbá a felhasznált biokompatibilis, könnyen lebomló vázanyagok együttesen egy biológiailag jól összehangolt zenekarhoz hasonlíthatók. Az a törekvés valósítható meg a módszer segítségével, hogy egy specifikus szövet indukálható, készíthető egy specifikus helyen sejtek kiválasztásával és manipulálásával, biológiai stimulusok és mátrixok alkalmazásával E biokémiai és biofizikai princípiumokon alapuló eljárások a biomedicinális kutatások gyorsan fejlődő területét jelentik. Sok technikai kihívást kell még azonban legyőzni, mielőtt a vázolt tudományos eredmények nyomán előállított szövetek a klinikai gyakorlatban, széles körben elterjednek. Naughton és munkatársai (40) szerint azonban az az elképzelés, hogy az ilyen módszerekkel végzett szövetpótló eljárásokkal a szövethiányos terület fiziológiás funkciója helyreállítható, már a tudományos elképzelésből tudományos ténnyé vált ( moved from science fiction to science fact ). A tissue engineering, mint gyorsan fejlődő multidiszciplináris terület mind orvosi, mind egészségügyi, szociális szempontból is nagy jelentőségű, mivel alkalmazásával csökkenthető a hagyományos módszerekkel végzett donorszövetek kivétele, s csökkenthetőek az egészségügyi kiadások. A módszer más specialitások mellett (ortopédia, traumatológia) elsősorban a plasztikai sebészeti gyakorlatban okozhat jelentős változást. Schweinfurth és munkatársai Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

9 (58) szerint a rekonstrukciós műtéteket végző sebészek következő generációja már egészen másként fogja megközelíteni a traumás sebeket, szövethiányokat, komputerekkel, növekedési faktorokkal és sejtkultúrákkal szemben a szikével és varrattal. IRODALOM 1. Altman G. H., Horan R. L., Lu H. H, Moreau J., Martin I., Richmond J. C., Kaplan D. L.: Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments. Biomaterials : Badiavas E. V., Paquette D., Carson P., Falanga V.: Human chronic wounds treated with bioengineered skin: histologic evidence of host-graft interactions. J. Am. Acad. Dermatol : Barralet J. E., Grover L., Gaunt T., Wright A. J., Gibson I. R.: Preparation of macroporous cement tissue engineering scaffold. Biomaterials : Bellicampi L. D., Closkey R. F., Prasad R., Zawadsky J. P., Dunn H. G.: Viability of fibroblast-seeded ligament analogs after autogenous implantation. J. Orthop. Res : Berner A., Hendrich C., Battmann A., Schütze N., Jakob F., Eulert J., Nöth K.: Rekonstruktion von Gelenkknorpeldefekten mit Knorpel-Polymer-Konstruktionen hergestellt durch Beschiftung mit mesenchymalen Stammzellen. Z. Orthop Sonderheft: S Bianchi G., Muraglia A., Daga A., Corte G., Cancedda R.: Microenviroment and stem properties of bone marrow-derived mesenchymal cells. Wound Repair Regen : Bishop A. E., Buttery Lee D. K., Polak J. M.: Embryonic stem cells. J. Pathol : Bosch U., Krettek C.: Tissue engineering von Sehnen und Bandgewebe. Unfallchirurg : Boyce S. T., Warden G. T.: Principles and practices for treatment of cutaneous wounds with cultured skin substitutes. Am. J. Surg : Bruder S. P., Kraus K. H., Goldberg V. M., Kadyla S.: The effect of implants loaded with autogenous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J. Bone Joint Surg A: Caplan A. I.: Mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res : Caplan A. I., Bruder S. P.: Cell and molecular engineering in bone regeneration. In: Textbook of tissue engineering. Ed. Lanza R., Langer W. Georgetown, Texas Cheng H., Jiang W., Philips F. M., Haydon R. C., Peng Y., Zhon L., Luu H. H. et al.: Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenetic proteins (BMPs). J. Bone Joint Surg A: Cowin A. J., Hatzirodos N., Holding C. A., Dunaiski V., Harries R. H., Rayner T. E. et al.: Effect of healing on the expression of transforming growth factor beta (s) and their receptors in chronic venous leg ulcers. J. Invest. Dermatol : Cupp.C. L., Bloom D. C.: Gene therapy, electroporation, and the future of wound healing therapies. Facial Plast. Surg : Declair V.: The importance of growth factors in wound healing. Ostomy Wound Manage : De Ugarte D. A., Ashjian P. H., Elbarbary A., Hedric M. H.: Future of fat as raw material for tissue regeneration. Ann. Plast. Surg : Duffy F. J., Seiler J. G., Gelberman R. H., Hergrueter C. A.: Growth factors and canine flexor tendon healing: initial studies in uninjured and repaired models. J. Hand Surg A: El Amin S. F., Attawia M., Lu H. H., Shah A. K., Chang R., Hickok N. J. et al.: Intergrin expression by human osteoblasts cultured on degradable polymeric materials applicable for tissue engineered bone. J. Orthop. Res : Falanga V.: Growth factors and wound healing. Dermat. Clin : Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

10 21. Fortier L. A., Mohammed H. O., Lust G., Nixon A. J.: Insulin-like growth factor-i enhances cell based repair of articular cartilage. J. Bone Joint Surg B: Fu Z., Shen Z., Guo Z. et al.: Healing of chronic cutaneous wounds by topical treatment with basic fibroblast growth factor. Chin. Med. J : Grande D. A., Mason J., Light E., Dines D.: Stem sells as platforms for delivery of genes to enhance cartilage repair. J. Bone Joint Surg A: Griffith L. G., Naughton G.: Tissue engineering. Current challenges and expanding opportunities. Science : Hangody L.:Autogenous osteochondral mosaicplasty: experimental background and application in clinical practice. Book of the Wellington Knee Meeting. London Hartwig C. H., Esenwein S. A., Pfund A. A., Kusswetter Dagger W., Herr G.: Verbesserte Osteointegration von Titanprüfkörpern unterschiedlicher Oberflachenbeschaffenheit durch Beschichtung mit Bone Morphogenetic Protein (BMP 3). Eine tierexperimentelle Studie im metaphysaren Knochenlager des Hundes. Z. Orthop : Hom D. B.,Thatcher G., Tibesar R.: Growth factor therapy to improve soft tissue healing. Facial Plast. Surg : Jiang G., Jahagirder B. N., Reinhardt R. L.: Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult bone marrow. Nature : Johnson E. E., Urist M. R., Finerman G. A. M.: Bone morphogenetic protein augmentation grafting of resistant femoral nonunions. Clin. Orthop : Kessler S., Ignatius A., Mayr-Wohlfart U., Puhl W., Claes L., Gunther K. P.: Der Einfluss von Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP- 2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und basischem Fibroblastenwachstumfaktor (bfgf) auf Osteointegration, Degradation und biomechanische Eigenschaften eines synthetischen Knochenersatzstoffes. Z. Orthop : I. Sonderheft 1: S Koch H., Jadlowiec J., Campbell P. Merk H., Fu F., Hollinger J.: Quantitative Untersuchung zum Expressionsprofil von Knochenmarkergenen in humanen mesenchymalen Stammzellen nach adenoviraler Transduktion für IGF 1. Z. Orthop : Langer R., Vacanti J. P.: Tissue engineering. Science : Lindholm T. C., Lindholm T. S., Alitalo I., Urist M. R.: Bovine bone morphogenetic protein (bbmp) induced repair of skull trephine defects in sheep. Clin. Orthop : Lou J., Kubota H., Hotokezaka S., Ludwig F. J., Mansle P. R.: In vivo gene transfer and overexpression of focal adhesion kinase (pp 125 FAK) mediated by recombinant adenovirus induced tendon adhesion formation and epitenon cell change. J. Orthop. Res : Lu Xiaofeng, Li Shengfu, Cheng Jingqiu: Bone marrow mesenchymal cells: progress in bone (cartilage) defect repair. J. Biomed. Eng : Madry H., Padera R., Seidel J., Langer R., Freed L. E., Trippel S. B., Vinjak-Novakovic G.: Gene transfer of a human insulin-like growth factor I cdna enhances tissue engineering in cartilage. Human Gene Therapy : Martinek V., Fu F. H., Lee C. W., Huard J.: Treatment of osteochondral injuries. Genetic engineering. Clin. Sports Med : Meaney Murray M., Rice K., Wright R. J., Spector M.: The effect of selected growth factors on human anterior cruciate ligament cell interactions with a three-dimensional collagen-gag scaffold. J. Orthop. Res : Morales T. I., Roberts A. B.: Transforming growth factor beta regulates the metabolism of proteoglycans in bovine cartilage organ cultures. J. Biol : Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

11 40. Naughton G. K.: From lab bench to market: critical issues in tissue engineering. Ann. New York Acad. Sci : Naumann A., Dennis J., Staudenmaier R. Rotter N., Aigner J., Ziegler B: Mesenchymal stemm cells. A new pathway for tissue engineering in reconstructive surgery. Laringo Rhino Otologie, Nesti L. J., Caterson E. J., Wang M. Chang R., Chapowsky F., Hoek J., Tuan R.S..: TGF beta 1-stimulated osteoblasts require intracellular calcium signaling for enhanced alpha5 integrin expression. Ann. New York Acad. Sci : Ochi M., Uchio Y., Kawasaki K. et al.: Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering in the treatment of cartilage defects of the knee. J. Bone Joint Surg B: Parikh S. N., Clarke N. M., Okubo Y., Bessho K., Sebald W.: Bone graft substitutes: past, present, future. J. Postgrad. Med : Partridge K., Yang X., Arke N. et al.: Adenoviral BMP-2 gene transfer in mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo bone formation on biodegradable polymer scaffolds. Biochem. Biophys. Res. Comm : Pelinkovic D., Horas U., Engelhard M.: Gentherapie von Knorpelgewebe. Z. Orthop : Pittenger M. F., Mackay A. M., Beck S. C.: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science : Prockop D. J.: Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoetic tissues. Science : Qin Tingwu, Yang Z., Xie H. et al.: A tissue engineered strain scaffold for three dimensional cell cultures. J. Biomed. Eng : Qin Tingwu, Yang Z., Cai S. et al.: Interaction of cell adhesion to materials in tissue engineering. Chin. J. Repar. Reconstr. Surg : Raschke M., Wildemann B., Inden P., Bail H., Flybjerg A., Hoffmann J., Hass N. P., Schmiedmaier G.: Insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta 1 accelerates osteotomy healing using polylactidecoated implants as a delivery system:a biomechanical and histological study in minipigs. Bone : Rodeo S. A., Taylor S. M., Hidake C.: The characterization of bovine tendon fibroblasts and their response to growth factors in vitro. Trans. Orthop. Res. Soc : Ruhe P. Q., Hedberg E. L., Padron N. T., Spauwen P. H., Jansen J. A., Mikos A. G.: rhbmp-2 release from injectable poly(dl- Lactic-Co- Glycolic Acid) calcium-phosphate cement composites. J. Bone Joint. Surg A: Rumalla V. K., Borach G. L.: Cytokines, growth factors and plastic surgery. Plast. Reconstr. Surg : Salamon A.: Az orvosbiológiai kutatások jelentősége a traumatológiában és ortopédiában. Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet : Schmelden R. H., Masters K. S., West J. L.: Photocrosslinkable polyvinyl alcohol hydrogels that can be modified with cell adhesion peptids for use in tissue engineering. Biomaterials : Schupp K., Kall S., Stehle J., Hendrich C. Schütze N., Jakob F., Eulert J., Nöth U.: In vitro Herstellung eines Kreuzbandkonstruktes aus humanen mesenchymalen Stammzellen in einem Kollagen I Gel. Z. Orthop : Sonderheft 1: S117-S Schweinfurth J. M.: Future management of scarring. Facial Plast. Surg : Seeherman H., Li R., Wozney J.: A review of preclinical program development for evaluating injectable carriers for osteogenetic factors. J. Bone Joint Surg A: Sefton M. V., Woodhouse K. A.: Tissue engineering. J. Cut. Med. Surg Suppl. 1: Spindler K. P., Dawson J. M., Stahlman G. C., Dacidson J M., Nanney L. B.: Collagen expression and biochemical response to human recombinant transforming growth factor beta in the healing rabbit MCL. J. Orthop. Res : Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

12 62. Tallheden T., Dennis J. E., Lennon D. D. S.Sjogren-Jansson E., Caplan A. I., Lindahl A.: Phenotypic plasticity of human articular chondrocytes. J. Bone Joint Surg A. Suppl Terskikh V. V., Vasiliev A.V.: Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes. Intern. Rev. Cytol : Urist M. R., Nilsson O., Rasmussen J., Hiroba W., Lowell T., Schmalzreid T., Fineman G. A.: Bone regeneration under the influence of a bone morphologic protein (BMP) beta tricalcium phosphate composite in scull trephine defects in dogs. Clin. Orthop : Vacanti C. A., Langer R., Schloo B.: Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast. Reconstr. Surg : van der Kraan P. M., Buma P. V., Kuppevelt T. et al.: Interaction of chondrocytes, extracellular matrix and growth factors: relevance for articular cartilage tissue engineering. Osteoarthritis and Cartilage : Vats A., Tolley N. S., Polak J. M., Buttery L. D. K.: Stem cells:sources and applications. Clin. Otolaryngology : Wakitani S., Goto T., Pineda S. J., Young R. G., Mansour J. M., Caplan A. I., Goldberg V. M.: Mesenchymal cellbased repair of large, full-thickness defects of articular cartilage. J. Bone Joint Surg A: Woo S. L., Nijibizi C., Matyas J., Kavalkovich K., Weaver-Green C., Fox R. J.: Medial collateral knee ligament healing. Medial collateral and anterior cruciate ligament injuries studies in rabbits. Acta Orthop. Scand : Yasko A.W., Lane J. M., Fellinger E. J., Rosen V., Wozney J. M., Wang E. A.: The healing of segmental bone defects induced by recombinant human bone morphogenetic protein (rhbmp-2). J. Bone Joint Surg A: Young R. P., Butler D. L., Weber W.: Use of mesemchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J. Orthop. Res : Dr. Salamon Antal 9700 Szombathely, Király u. 11., Tel: 94/ ; salamon.antal@chello.hu PÁLYÁZATI FELHÍVÁS Zinner Nándor pályadíjra A Magyar Ortopéd Társaság pályadíjat hirdet 35 éven aluli orvosok és gyógytornászok számára. Az ortopédiai tárgyú pályamunkákat kész közlemény formájában (maximum 15 oldal) minden év április 30-ig lehet benyújtani a Társaság főtitkárának. A pályadíjnak 3 fokozata kerül odaítélésre: 1. díj: Ft. 2. díj: Ft. 3. díj: Ft. Az elfogadott pályamunkák a Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet és Plasztikai Sebészet folyóiratban soron kívül közlésre kerülnek (az Útmutató szerzőinknek a lap minden évi 1. számában megtalálható). Dr. Bucsi László a Magyar Ortopéd Társaság főtitkára 1113 Budapest, Karolina út 27. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet