Átírás

1 H AGY OM ÁNY OS É S NEM - KONVE NCI ONÁLI S KÖZEGŰ ÖSSZ E T ETT E NZIM E S R E AKCI Ó KI NETI KAI VI Z SGÁLAT A N E M E S T Ó T H Y N Á N D O R D O K T O R I (P H. D. ) É R T E K E Z É S T É M A V E Z E T Ő : B É L A F I N É D R. B A K Ó K A T A L I N T U D O M Á N Y O S F Ő M U N K A T Á R S M Ű S Z A K I K É M I A I K U T A T Ó I N T É Z E T V E S Z P R É M I E G Y E T E M V E G Y É S Z M É R N Ö K I D O K T O R I I S K O L A

2 Hagyományos és nem-onvencionális özegű összetett enzimes reació inetiai vizsgálata Érteezés dotori (PhD) foozat elnyerése érdeében Írta:..Nemestóthy Nándor... **Készült a Veszprémi Egyetem...Vegyészmérnöi... isolája eretében Témavezető:...Bélafiné Dr. Baó Katalin... Elfogadásra javaslom (igen / nem) (aláírás)** A jelölt a dotori szigorlaton... % -ot ért el, Az érteezést bírálóént elfogadásra javaslom: Bíráló neve: igen /nem Bíráló neve: igen /nem ***Bíráló neve: igen /nem. (aláírás). (aláírás). (aláírás) A jelölt az érteezés nyilvános vitáján...% - ot ért el Veszprém/Keszthely, A dotori (PhD) olevél minősítése.... a Bíráló Bizottság elnöe Az EDT elnöe Megjegyzés: a * özötti részt az egyéni felészülő, a ** özötti részt a szervezett épzésben résztvevő használjá, *** esetleges

3 Tartalomjegyzé Kivonat... 5 Abstract... 6 Auszug Bevezetés Irodalmi átteintés Enzimes reació és özegü Enziminetia Inhibíciós inetiá Az összetett enzimes reació fajtái A ping-pong bi-bi mechanizmus Keményítő enzimes hidrolízise Lipázos reació, észterezés Kísérleti anyago és módszere Felhasznált anyago Enzime Egyéb vegyszere Mérési módszere Glüoamiláz ativitásána mérése Keményítő hidrolízis rázatott lombiban Lipázos inetiai mérése rázatott lombiban Az észterezési reació analitiai vizsgálata Kezdeti reaciósebesség meghatározása Eredménye... 42

4 4.1. Keményítő hidrolízis vizsgálata Stabilitás vizsgálata Kinetiai vizsgálato Integrált rendszer Lipázos észterezés inetiai vizsgálata A reació időbeli lefutása Kinetiai paramétere meghatározása A víz hatása A modell gyaorlati felhasználása Összefoglalás Irodalomjegyzé Tézise Theses Publiáció Függelé A ezdeti reaciósebesség meghatározása A inetiai állandó meghatározása Az egyenlet linearizálásán alapuló módszere A nem lineáris regresszión alapuló módszere Köszönetnyilvánítás

5 Kivonat Ebben a disszertációban olyan hagyományos és nem-onvencionális özegű enzimes reació erülne ismertetésre, ahol a folyamatban több szubsztrát vesz részt, többféle termé épződi vagy a reació több lépésből áll, illetve inhibíciós jelensége, és/vagy oldhatósági problémá nehezíti a inetia leírását. Az ilyen fajta összetett enzimes reació inetiájána pontos meghatározásához a Michaelis-Menten modell módosított illetve ibővített verziói szolgálna alapul. A szerző ét enzimes folyamatot, a glüoamilázos eményítő hidrolízist és a lipázos olajsav-i-amil-észter szintézis lefutását, viseledését vizsgálja. Előbbinél a megújuló növényi forrásból származó alapanyagból glüóz nyerhető, mégpedig hulladémentes eljárással, íméletes örülménye özött, vizes özegű enzimes reacióval. Utóbbi folyamán pedig olyan bioenőanyag állítható elő szerves oldószeres reació során, amely biológiai eredetű, örnyezetbarát és az élővizere nézve nem toxius. Az Aspergillus awamori fermentációjával előállított glüoamiláz enzim stabilitás és részletes inetiai vizsgálata után szaaszos evert reatorban, valamint folyamatos műödésű sílap membrán modulban valósítja meg a eményítő hidrolízist, összehasonlítva a ét rendszer hatéonyságát. A szerző az olajsav és az i-amil-alohol Novozym 435 lipázzal történő észterezéséne inetiáját, három- négy- és ötparaméteres ping-pong bi-bi típusú modelle segítségével figyelembe véve az i-amil-alohol és az olajsav szubsztrát gátlását. Vizsgálja a víztartalom hatását a négyparaméteres modell változatlan alalmazása mellett, a látszólagos ativitást változtató modell segítségével. Az előzőeben leírt enziminetiai modell segítségével optimális iinduló paraméter tartományt határoz meg, amely a lehető legnagyobb hatéonyságú észter előállítást eredményezi. = 5 =

6 Abstract Kinetics studies of multireactant enzymatic reactions in aqueous and non-conventional media In this wor inetics of two multireactant inetics systems was investigated. Glucoamylase enzyme for starch hydrolysis was produced extracellularly by fermentation of strain Aspergillus awamori, which was genetically modified to have high level glucoamylase activity. The enzyme has deactivated quicly, a liquid protease inhibitor coctail was selected and applied to enhance stability of the enzyme. The enzyme preparation is being used for glucose production from starch in a flat-sheet membrane bioreactor. Esterification of oleic-acid and i-amyl alcohol by lipase enzyme results i-amyl-oleate which is widely used as a bio-lubricant, easily degradable compound. It was suggested that the inetics of the reaction was a so called Ping-Pong Bi-Bi mechanism. Mathematical model of the reaction in batch system and integrated with continuous water removal was applied to describe the processes. Several simulations were carried out shows that this integration can efficiently enhance the reaction. = 6 =

7 Auszug In dieser Arbeit wurde die Kineti von zwei multireatanten inetischen Systemen untersucht. Das Glucoamylase Enzym für die Hydrolyse von Stäre ist extrazellulär durch Fermentation des Stammes Aspergillus awamori produziert, das genetisch modifiziert wurde, um die Ativität von Glycoamylase zu erhöhen. Das Enzym wurde schnell deativiert, und ein flüssiges Protease Hemmer-Kotail wurde ausgewählt und angewandt, um die Stabilität des Enzymes zu erhöhen. Das Enzympräparat wurde zur Gluoseprodution aus Stäre in einem Flachmembranbioreator verwendet. Die Veresterung von Ölsäure und i-amyl-alohol durch Lipase Enzyme resultiert i- Amyl-oleat, ein breit verwendetes Bioschmierstoff, eine leicht abbaubare Verbindung. Es war vermutet, daß die Kineti der Reation entsprach dem Ping-Pong Bi-Bi Mechanismus. Matematisches Model der Reation wurde verwendet, um das Prozess in Batch und integriertem System mit ontinuierlichen Wasserentfernung zu beschreiben. Verschiedene Simulationen sind ausgeführt worden, die lar beweisen, dass die Integrierung die Reationsgeschwindigeit wesentlich erhöht. = 7 =

8 1. Bevezetés A biomérnöi utatás az elmúlt évtizedeben teret nyert a vegyészmérnöi tudományterületen belül. Az enzime segítségével végrehajtott reacióna számos előnye van a hagyományos szerves émiai szintézishez épest, például: Szeletív reació, nem épződne mellétermée, Enyhe, íméletes reació örülménye, Sztereoszeletiv átalaítás lehetősége, tiszta enantiomer a termé, Környezetbarát eljárás. Dotori munám során olyan hagyományos és nem-onvencionális özegű enzimes reació inetiájána tanulmányozása a cél, ahol a folyamatban több szubsztrát vesz részt, többféle termé épződi vagy a reació több lépésből áll, illetve inhibíciós jelensége, és/vagy oldhatósági problémá nehezíti a inetia leírását. Az ilyen fajta összetett enzimes reació inetiájána pontos meghatározásához a Michaelis-Menten modell módosított illetve ibővített verziói szolgálna alapul. Az enzime által atalizált folyamato gyaori jellemzője, hogy a eletezett termé nagymértében csöenti a terméépződési sebességet. A sebességcsöenés mértéét és oát az inhibíciós enziminetia vizsgálja. Az enziminetia ezdetben a szerezetvizsgálat és egyéb bioémiai alaputatási érdése megválaszolásána eszöze volt, mára a modern nanotechnológiai módszere ezt háttérbe szorítottá. Igen jól használható azonban, ha egyes folyamatoat, onrét reacióat aarun megismerni, optimalizálni, aár vegyészmérnöi szempontoat (oldószer, berendezés, stb.) is figyelembe véve. A onrét vizsgálatohoz ét alapreaciót választottun i: a glüoamilázos eményítő hidrolízist és a lipázos i-amil-oleát szintézist. Előbbinél a megújuló, növényi forrásból származó alapanyagból glüóz, egy fontos gyógyszer- és élelmiszeripari alapanyag nyerhető, mégpedig hulladémentes, örnyezetbarát módon, íméletes örülménye özött, vizes özegű enzimes reació alalmazásával. A lipázos reació folyamán olyan bioenőanyag állítható elő, amelyne egyrészt biológiai eredetű iinduló anyagai vanna: a növényi/állati zsíroból/olajoból nyerhető olajsav ill. az alohol desztillációnál eletező mellétermé, a ozmaolaj, amelyne fő omponense az i-amil-alohol; másrészt nem jelent = 8 =

9 veszélyt az élővizere, amelyet a zebrahalaal elvégzett toxicitás teszt igazolt (nem toxius, LC 50 > 100 mg/l). Ezt az enyhe örülménye özt zajló enzimes észterezést, illetve inetiáját szerves oldószerben vizsgáltam. Mindét enzimes reació több-szubsztrátos, összetett folyamatna fogható fel, hiszen a eményítő hidrolízis során a glüoamiláz enzim glüóz egységeet hasít le a poliszacharid láncból, (egy-egy vízmoleula felvétele özben), s így anna mérete egy-egy egységgel csöen. Az észter szintézisnél az olajsav és az i-amil-alohol a ét szubsztrát, s reacióju folyamán ét termé: észter és víz eletezi (bi-bi reació). Így mindét enzimes folyamatnál ulcsszerepe van a vízne. A eményítő hidrolízisénél nemcsa reaciópartner, de egyben oldószer is, az észter szintézisénél pedig termé, melyne oncentrációja befolyásolja az enzim viseledését. A ét enzimes reació ugyanaor so teintetben ülönbözi is egymástól. A eményítő hidrolízis vizes özegben megy végbe, így a víz - mint reaciópartner - tulajdonéppen végtelen feleslegben van jelen, s így látszólag egy szubsztrátos reacióna teinthető. A lipázos észterezés viszont szerves oldószerben játszódi le. A inetiai vizsgálatohoz iválasztott ét enzimes reació ipari szempontból is fontos, s a laborísérleteet övető méretnöveléshez, a nagyobb léptéű megvalósításhoz alapvető, hogy a folyamato inetiai viseledéséne részletei tisztázotta legyene. = 9 =

10 2. Irodalmi átteintés 2.1. Enzimes reació és özegü Az élő szervezeteben olyan reació is lejátszódna, melye az élő anyagon ívül azonos örülménye özött nem, vagy soal lassabban menne végbe. Az ily módon zajló ülönleges reacióat Berzelius tanulmányozta először, eményítő hidrolízisét énsav és burgonya diasztáz jelenlétében vizsgálva. Megállapította, hogy az anyago a reacióban nem veszne részt, de nélülü a reació nem játszódi le. Az ilyen hatást, mint a émia törvényeivel összeegyeztethetetlent, atalitius hatásna nevezte ban Kühne élesztőel ísérletezve enzimene, élesztőből származóna nevezte el az élő szervezeteben található atalitius hatású anyagoat [Keleti, 1978]. Büchner 1897-ben végzett ísérleteet, melyeel in vitro bebizonyította, hogy a atalitius hatás nem az élő szervezet, hanem valamilyen anyag tulajdonsága. A reaciót atalizáló enzimen ívül a reació özege is jelentős hatással van az ilyen rendszerere. A reaciótípuso aszerint, hogy milyen özegben játszódna le, ét csoportba sorolhatóa [Davison, 1997]: A onvencionális eljáráso azo, amelyeben az enzim, a szubsztrát és a termé is vizes fázisban van jelen. A ezdeti utatáso erre a reacióözegre irányulta és az ipari alalmazáso többsége is ebbe a ategóriába sorolható. A nem-onvencionális eljáráso özé azo a folyamato sorolhatóa, melye nem az előbbi ategóriába tartozna, ahol a reació özege nem a víz, hanem pl.: szerves oldószer, ionos folyadé, szuperritius folyadé. A bioatalitius reaciórendszere leírására egy 3 araterből álló jelölés szolgál. Az egyes betű a ritius reacióomponenseet: az enzimet, a szubsztrátoat és a terméeet = 10 =

11 szimbolizáljá a megadott sorrendben. Az egyes betű jelentése a övetező: a rendszer lehet vizes (A), szerves (O), gőz (V) vagy szuperritius (Sc) fázisban. A ritius reacióomponensere vonatozó további információat a nagybetűhöz apcsolt indexjelölés özli. I index utal arra, hogy a omponens rögzített állapotban van, H jelöli az enzim hidratáltságát (vízburo), az S index pedig a szilárd halmazállapotra vonatozi. I. hagyományos özeg AAA II. nem-onvencionális özeg A. nem-vizes özeg O--, O H --, O I Cseély vizes fázis OAA,OAV,OAO,OVA,OOA 2. Szerves és gőz fázis OOV,OVO 3. Csa szerves fázis OOO 4. Gőz fázis OVV B. nem-hagyományos vizes reator A 1. Kétfázisú rendszere AAO,AOO,AOA 2. Gőz fázis AAV,AVA,AVV 3. Multi-fázis AOV,AVO 4. Speciális esete A 1 A 2 A 3 C. szuperritius özeg O H OO, ScScSc A speciális esete özé sorolható az ionos folyadé, amiben csa 2000-ben végezté el az első enzimes reaciót. = 11 =

12 2.2. Enziminetia Az enzimatalizált folyamatoat tanulmányozva hamar iderült, hogy a reació sebessége nem öveti a másodrendű inetiát [Brown, 1902]. Általánosan elfogadott leírást Michaelis és Menten 1913-ban tette özzé. Enzim-szubsztrát omplex ialaulását feltételezté Henri nyomán [Henri, 1902] az alábbi mechanizmus szerint: E 1 S ES E+ P (2.2.1.) Feltételezté, hogy a reació sebességét (a terméépződés sebességét) az enzimszubsztrát omplex bomlása határozza meg, azaz: [ ES] v = 0 (2.2.2.) 3 Ez aor igaz, ha a három sebességi állandó özül 3 a legisebb. Kifejezté a reacióelegyben levő szabad enzimoncentrációt, az enzim-szubsztrát omplex disszociációs állandóját felhasználva: [ E] S[ ES] [ S] K = = (2.2.3.) [ E] [ ES] A reació sebessége aor éri el maximumát, ha az összes enzim enzim-szubsztrát omplex formában fordul elő. Eor az alalmazott szubsztrátoncentráció végtelen nagy. Vagyis a ezdeti reaciósebesség v 0 és a maximális sebesség V max megfelel [ES] és [E] T arányána. [ S] [ S] T Vmax v0 = (2.2.4.) K S + Ez a leírás vált szinte minden további enziminetiai megoldás alapjává, bár számos igen orlátozó megszorítást tartalmaz. Ezen túl további problémát jelent a modell ísérleti alalmazásánál a ezdeti reaciósebesség mérése, meghatározása. Különösen, ha a özvetlen mérési módszere nem alalmazhatóa. 1 A reaciósebességi állandóat izárólag pozitív indexeel jelölöm, páratlan számoal a balról jobbra hatóat (a reaciót a terméépződés irányába vivő), páros számoal az ellentétes irányúaat. = 12 =

13 2.3. Inhibíciós inetiá Az előző példában csa az enzim és a szubsztrát vett részt a reacióban, természetesen ilyen tiszta helyzete csa ritán fordulna elő (pl. oldószermentes reació ezdeti pillanata). Ha az enzimhez, az enzim-szubsztrát omplexhez más anyag is épes ötődni, és a ötődés által az enzim, enzim-szubsztrát omplex tulajdonságai megváltozna, specifius gátláso alaulhatna i. Enziminetiai értelemben gátlásna csa az enzim, vagy az enzim-szubsztrát omplex részvételével lejátszódó folyamatoat nevezzü (enzim gátlás, inhibíció). A gátló anyagoat a apcsolódási helyü szerint csoportosíthatju. Eszerint megülönböztetün az enzim atív centrumához vagy más ötőhelyre (ompetitív, nem ompetitív) és az enzim szubsztrát omplexhez ötődő (unompetitív) inhibitoroat. A ompetitív gátlás leírására a Michaelis-Menten inetiát a legegyszerűbb esetben az alábbi lépéssel egészíti i [Fromm, 1975]: E+I EI Itt I a gátló anyagot, az inhibitort jelöli, amely reverzibilis módon ötődi az enzimhez. Felírhatju K M -el analóg módon az enzim-inhibitor omplex disszociációs állandóját K I -t (KI=[E][I]/[EI]), bevezetve az inhibitor jelenlétében ialauló relatív sebességet: v i [ ES] = (2.3.1.) V [ E] össz. Ami ifejezhető az enzim anyagmérlegét felírva ([E] össz =[E]+[ES]+[EI]): VmaxS v0 = (2.3.2.) I K m (1+ ) + S K I A fenti mechanizmus szerint lejátszódó terméinhibíció esetén is alalmazható az összefüggés, - például a glüózt eredményező enzimes eményítő hidrolízisnél -, ilyenor a gátló inhibítor helyett a termé oncentrációját ell alalmazni. = 13 =

14 2.4. Az összetett enzimes reació fajtái Az enzime által atalizált reacióat soféle szempont szerint lehet csoportosítani (az enzim típusa, felhasználás, eredet, in vivo, in-vitro stb.), azonban ha mint émiai reacióat teintjü őet, aor a ét legelterjedtebb az Alberty és a Cleland-féle csoportosítás: Alberty ét szempont szerint osztotta be az enzimreacióat: 1. a reació szöchiometriája szerint, 2. a reació folyamán ialauló omplexe száma és jellege alapján. A reació sztöchiometriája itt azt jelzi, hogy az enzimen ívül hány, sztöchiometrius viszonyo szerint reagáló szubsztrát szerepel a reacióban. Egy szubsztrátos reació esetén az enzim hatására egy anyag alaul át egy végterméé. Ilyene a tautomerázo, egyes izomerázo, racemázo stb. által atalizált reació. Látszólag egy szubsztrátos reacióna nevezi azoat, melyeben ugyan ét szubsztrát vesz részt, az egyi azonban a víz, melyne oncentrációja a hagyományos vizes rendszereben végtelen nagy, vagyis a reació folyamán állandó lévén nem szerepel a sebességi egyenleteben. Ilyen pl. a fumaráz, az atoináz, arotonáz, az enoláz, a dehidrázo, hidrolázo stb. által atalizált reació. Két szubsztrátos reació esetén ét anyag alaítja ölcsönösen át egymást az enzim atalitius hatására. Ide tartozi majdnem minden oenzimmel műödő enzim és számos más enzim által atalizált reació: a dehidrogenázo nagyobb része, foszforilázo, hexoináz, foszfatázo stb. A három szubsztrátos reacióhoz tartozna a ülönböző szintetázo, transzaminázo, a Lactobacillus piruvátoxidáza stb. által atalizált reació. A fent említett típuso mind a ét irányban azonos sztöchiometriájú reació. Vegyes sztöchiometriájú reacióna nevezzü azoat, melye egyi irányban más sztöchiometriájúa, mint a mási irányban. Így pl. a ülönböző észterázo által atalizált reació egyi irányban látszólag egy, mási irányban ét szubsztrátosa. E módon reagál az = 14 =

15 acetilolinészteráz hatására az acetilolin a vízzel. Ez utóbbi oncentrációja a reació szempontjából végtelen, így ebben az irányban a reació látszólag egy szubsztrátos. A Cleland-féle nómenlatúra szerint a reagáló szubsztráto illetve a termée számána jelölése uni, bi, ter, quad. Egy olyan reació tehát, melyben ét szubsztrát és ét termé vesz részt bi-bi-ne teinthető. Ilyen a lipázzal történő enzimatius észterezés is. A lehetséges mechanizmuso bi-bi reaciónál a ábrán láthatóa [Keleti, 1978]. A rendezett (ordered) bi-bi mechanizmus szerint először mindét szubsztrát meghatározott sorrend szerint ötődi az enzimhez, majd szintén meghatározott sorrend szerint leváli az egyi termé, majd a mási. A ping-pong bi-bi mechanizmusnál az egyi szubsztrát ötödését övetően rögtön leváli az egyi termé, majd a mási szubsztrát ötődi az enzimhez, s végül leváli a mási termé. A Theorell-Chance mechanizmus olyan reaciósémát ír le, ahol a másodi szubsztrát ötődése és az első leválása gyaorlatilag egyidejűleg övetezi be, így nem tud ialaulni enzim-szubsztrát omplex. A random bi-bi mechanizmusnál nincs meghatározott sorrendhez ötve az egyes szubsztráto ötödése illetve a termée leválása, hanem véletlenszerűen történhetne meg eze a folyamato. Anna eldöntésére, hogy a bi-bi mechanizmuso özül melyi érvényes az adott enzimes reaciónál, a lasszius grafius eljárásoat célszerű első lépésben alalmazni [Keleti, 1978]. A dupla recipro módszerrel apott 1/sebesség - 1/szubsztrát oncentráció egyenese számos esetben de nem mindig eláruljá a mechanizmust. Ha pl. a ülönböző iindulási oncentrációnál apott recipro egyenese párhuzamosa, a ping-pong bi-bi mechanizmus valószínűsíthető. Ha viszont egy özös pontban metszi egymást, aor a rendezett mechanizmus tűni érvényesne. Ha nem egyeneseet apun, nagy valószínűséggel gátláso lépte fel. Ilyen eseteben a grafius módszere alalmazása nem nyújt megfelelő támpontot. = 15 =

16 RENDEZETT BI-BI MECHANIZMUS A B P Q E EA EAB EQ E EPQ PING-PONG BI-BI MECHANIZMUS A P B Q E EA F FB E FP EQ THEORELL-CHANCE MECHANIZMUS A B P Q E EA EQ E RANDOM BI-BI MECHANIZMUS A B P Q EA EQ E EAB E EPQ EB EP B A Q P ábra: A bi-bi reació mechanizmusai = 16 =

17 2.5. A ping-pong bi-bi mechanizmus A lipázos észterezéseel foglalozó irodalomban a ping-pong bi-bi mechanizmust tartjá a legvalószínűbbne [Chulalasananuul, 1990; Bousquet-Dubouch, 2001], bár néhány adat található az ordered útra is, ahol a víz lehet az elsőént leváló termé [Garcia 1999]. A ping-pong bi-bi mechanizmust a ábrán bemutatott sebességi állandó szemlélteti. A+ E 1 2 EA FP 3 4 P+ F + B 5 6 FB EQ 7 8 Q+ E ábra:a ping-pong bi-bi reació mechanizmusa Cleland szerint Mint látható, első lépésént a szabad állapotú enzimmel egyensúlyi folyamatban az A- val jelölt szubsztrát reagál, és így ialaul az EA jelű enzim-szubsztrát átmeneti omplex. Az átmeneti omplex belső átrendeződéssel (ami szintén megfordítható folyamat, sebessége azonban nem összemérhető az egyes elülönített nyíllal jelölt lépéseével), FP jelű módosult enzim-termé omplex formába alaul át. A termé elváli az enzim atív centrumától, és szabad állapotba, az oldatba erül, 3 sebességi állandóna megfelelően. Az így visszamaradó módosult enzim (F) a B-vel jelölt szubsztráttal reagál, létrehozva az FB-vel jelölt módosult enzim-szubsztrát omplexet. A módosult enzim szubsztrát-omplexből - az EA FP átalauláshoz hasonlóan - létrejön az EQ enzim-termé omplex. A Q jelű termé 7 sebességgel eletezi és távozi az enzim felületéről. A folyamat végén a szabad enzim eredeti állapotában 8 sebességgel reagálhat egy Q terméel, vagy 1 sebességgel az A szubsztráttal. Az egyes lépéseet összegezve felírható a terméépződés sebessége, amelyben az összes sebességi együttható szerepel, a reaciót a jobb oldal felé vivő pozitív, míg a bal oldal felé ható negatív előjellel. A terméépződés sebessége az állandóon túl függ a ezdeti enzimoncentrációtól (E 0 ), a szabad enzim pillanatnyi oncentrációjától (E), a ialault módosult enzim-termé és szubsztrát omplexe atuális oncentrációjától, valamint a termée és a szubsztráto oncentrációjától. Az összefüggést a éplet írja le. = 17 =

18 = 18 = ) ( ) ( ) ( EQ FB F FP EA E E PQ AB v = (2.5.1.) Ennyi önálló paramétert meghatározni és ezelni nem célszerű a reació leírásához. Az enzim omplexe oncentrációjána meghatározása soszor nem megoldható, vagy meghatározásu zavarja a reaciót. Érdemes felírni a sebességet befolyásoló önálló tagoat, determinánsoat és összefüggéseiet a sebességi együtthatóal. PQ BQ AB EQ FB Q A F PQ AP AB FP EA P B E ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( = = = = (2.5.2.) A terméépződés sebességét oly módon is le lehet írni, hogy abban özvetlenül nem szerepelne az átmeneti enzim omplexe, hanem a termée és a szubsztráto özött ialauló egyensúlyi állandóént vanna értelmezve. Ezeet az állandóat reacióinetiai paraméterne nevezzü. A ping-pong bi-bi mechanizmusra érvényes általános összefüggést a éplet írja le. iq a eq ia q eq eq q eq q a b eq K BQ K V K K AP V K K V PQ K Q V K K P V K AB V B K V A K V K PQ AB V V v = (2.5.3.) A épletben szereplő egyes állandóat Cleland alapján a táblázatban foglaltam össze.

19 = 19 = táblázat: A egyenletben szereplő inetiai paramétere ( 7 ) E V + = ( 6) E V + = ) ( ) ( K a + + = ) ( ) ( K q + + = ) ( ) ( K b + + = ) ( ) ( K p + + = 5 3 K ib = 4 3 K ip = 1 2 K ia = 8 7 K iq = A reació látszólagos egyensúlyi állandója K eq, amely a jobbra és balra ható sebességi állandó hányadosa, Haldane szerint a éplet szerint értelmezhető. A épletben a táblázat reacióinetiai paraméterei szerepelne. b a q p ib a iq p b ia q ip ib ia iq ip eq K K V K K V K K V K V K K K V K V K K K K K K = = = = = (2.5.4.) Az ismertetett modell azonban túlságosan általános a gyaorlati felhasználáshoz. A so paraméter nehezíti azo egyértelmű meghatározását, mivel ölcsönösen hatna egymásra is. Különösen önnyű hibát elövetni, ha az egyes paramétere értéet nem lineáris regresszióval határozzá meg [Suelter, 1985].

20 Elméleti és gyaorlati megfontoláso alapján felírhatju a fő paramétereet, amelye a terméépződés sebességére hatna: 1. A másodiént ötődő szubsztrát oncentrációja (B) 2. Az elsőént ötődő szubsztrát oncentráció (A) 3. Az enzim oncentrációja (E) 4. A eletezett termée együttes mennyisége (P) Ha csa az első három tényezőt vesszü figyelembe, teintettel arra, hogy a ezdeti reaciósebességre nem hat a eletezett termée oncentrációja, (mivel t=0 pillanatban P=0) a egyenlet írja le a folyamatot., valamint ha figyelembe vesszü a szubsztrát gátló hatását is, a egyenlettel írhatju le a ezdeti reaciósebességet. Vm v= K A K B 1+ + [ A] [ B] (2.5.5.) v = 1+ V K A 1 [ A] + m [ B] K IB + K B [ B] (2.5.6.) A épletben látható négyparaméteres modellt tovább lehet bővíteni a teljes reaciót vizsgálva a termée gátló hatásával. A bővített éplet a alatt látható. Megfigyelhető, hogy tartalmazza a K AB paramétert, amely a látszólagos terméépződés sebessége, a reació ping-pong paramétere. A épletben szereplő inetiai paramétereet a táblázatban foglaltam össze. Vm v = ' K A K AB *[ P] [ B] K B 1 1 * 1 + [ A] [ A]*[ B] K IB [ B] K ' AB = ( Vm * K Q) ( V * K ) m, r eq [ P] K ip (2.5.7.) = 20 =

21 = 21 = táblázat: A egyenletben szereplő reacióinetiai paramétere definíciói Ha a termée oncentrációja onstans, aor az összefüggés a formában írható fel. Az általam tervezett mérése ezdeti szaaszában ezzel az összefüggéssel lehet leírni a reaciót, mivel a rendszer tartalmaz vizet, ami az egyi termé (P), de oncentrációja a ezdeti időszaban, amior a ezdeti reaciósebességre vonatozó feltétele teljesülne, nem változi. (2.5.8.) Látható, hogy a négy (2.5.6.) és az öt (2.5.8.) paraméteres egyenlet özött a fő ülönbség a K AB tagban található. A K AB tag értée azonban aor van jelentős hatással, ha mindét szubsztrát oncentrációja alacsony. Ilyen nagyon alacsony szubsztrát oncentrációval azonban nem terveztem méréseet, ezért a reació ezdeti szaaszában használható a négyparaméteres összefüggés a reació inetiájána leírására V m + = ) ( ) ( K A + + = ) ( ) ( K B + + = ) ( ) ( ' K AB + + = 4 3 K ip = 6 5 K ib = ] [ ] [ 1 ] ]*[ [ ] [ 1 B K K B B A K A K V v BP IB AB A m =

22 2.6. Keményítő enzimes hidrolízise A eményítő a lorofilltartalmú növénye asszimilációs termééből, a glüózból épül fel és a növényi sejteben a tartalétápanyag szerepét tölti be. A eményítő α-d-glüózmoleulá ondenzációja útján eletezett poliszacharid, amelyben a glüózrésze 1,4-es és 1,6-os ötésseel apcsolódna egymáshoz. A eményítő" megnevezés tehát nem egyetlen, jól definiált összetételű moleulából álló vegyületet jelent, hanem poliszacharido everéét. A eményítő a növényi sejteben ülönböző alaú és felépítésű, fehér, szilárd szemcsé formájában raódi le. A szemcsenagyság néhány µm-től µm-ig változi. Mindazonáltal az azonos eredetű eményítőszemcsé miroszópi vizsgálattal jól felismerhető és azonosítható, mert ülső formáju és felépítésü jellegzetes, és a szemcsenagyság eloszlása is jellemző arra a növényre, amelyből származna ábra: A eményítő ét fraciójána szerezete A természetes eményítőszemcsé ét ülönböző (és egymástól el is választható) típusú eményítő fracióból épülne fel. Az egyi az ún. amilóz, mási az amilopetin ( ábra). Az amilóz a szemcsé belsejében, az amilopetin pedig főleg a szemcsé ülső rétegében raódi le. Mindettő α-d-glüózból épül fel. Az amilóz izárólag 1,4-α-glüozid ötéseet tartalmaz és moleulái vízben oldva döntően szabályos spirális alaúa (1 spirálmenet 6 glüózegységet foglal magába). Ezzel szemben az amilopetin moleulá = 22 =

23 elágazó oldalláncoat is hordozna, melye úgy jönne létre, hogy az óriásmoleulát felépítő glüózegysége némelyién a 6-os szénatomhoz is apcsolódi egy glüózmoleula. Az amilopetin evés foszfort is tartalmaz foszforsavészter-csoporto formájában. Az amilóz émiai összetételére jó özelítéssel felírható a (C6H10O5)n összegéplet. Az n (polimerizációfo) értée amilóz esetében 1000 örül van. Ha elteintün a foszforsavészter-csoportotól, a fenti éplet az amilopetinre is érvényes, és itt n értée b A eményítő számos ipari jelentőségű félész termé nyersanyagául szolgál, így pl. dextrine, eményítő szörpö, glüóz. Ezen termée a eményítő részleges vagy teljes hidrolízisével állítható elő. A eményítő hidrolíziseor özbenső terméént a eményítőnél isebb moleulatömegű poliszacharido, ún. dextrine eletezne, amelye további hidrolízise isebb moleulatömegű dextrinehez, majd oligoszacharidohoz, maltózhoz, végül pedig D-glüózhoz vezet táblázat: A eményítő hidrolízisben felhasznált enzime. enzim EC besorolás forrás reació α-amiláz B. amyloliquefaciens Kizárólag az 1,4 ötéseet bontja alfa dextrineet állítva elő főént maltózt és 3, 6 és 7-es foszámú oligoszacharidoat B. licheniformis Kizárólag az 1,4 ötéseet bontja alfa dextrineet állítva elő főént maltózt és 3, 4 és 5-ös foszámú oligoszacharidoat Aspergillus oryzae, A. niger Kizárólag az 1,4 ötéseet bontja alfa dextrineet állítva elő főént maltózt és 3-as foszámú oligoszacharidoat Elcurosító α- amiláz B. subtilis (amylosacchariticus) Kizárólag az 1,4 ötéseet bontja alfa dextrineet állítva elő főént maltózt és 3-as és 4-es foszámú oligoszacharidoat valamint legfeljebb 50% glüózt β-amiláz árpa csira Kizárólag az 1,4 ötéseet bontja a nem reduáló oldal felöl határ dextrineet és ß-maltózt állítva elő Glüoamiláz A. niger Az 1,4 és az 1,6 ötéseet is bontja a nem reduáló oldal felöl ß glüózt előállítva Pullulanáz B. acidopullulyticus Kizárólag az 1,6 ötéseet bontja egyenes láncú maltodextrineet eredményezve A eményítő hidrolízisét manapság már szinte izárólag enzimes úton végzi, amilázo segítségével [Nagodawithana, 1993]. A szaaszos reatoroban megvalósított enzimes lebontás étlépéses folyamat ( ábra). Az első lépésben elfolyósítás = 23 =

24 (liquefaction) a eményítőt vízben szuszpendáljá és részlegesen hidrolizáljá. A másodi lépésben elcurosítás (saccharification) a eletezett oligoszacharidoat bontjá tovább. A folyamatohoz főént α- és β-amilázt, illetve glüoamilázt alalmazna. Keményítő granulátum Gélesítés 35 % hideg vízben p 6,5 Keményítő szuszpenzió Bateriális α-amiláz 1500 U/g 105 C, 5 perc Gélesített eményítő (<1 DE) Elfolyósítás Elcurosítás 95 C, 2 óra Elfolyósított eményítő (~1 DE) 0,3 % D-glüóz 2,0 % maltóz 97,7 % oligoszacharido ph 4,5 glüoamiláz 150 U/g 60 C, 72 óra ph 5,5 gomba α-amiláz 2000 U/g 55 C, 48 óra Glüóz szirup (~99 DE) 97 % D-glüóz 1,5 % maltóz 0,5 % i-malóz 1,0 % oligoszacharido Maltóz szirup (~44 DE) 4 % D-glüóz 56 % maltóz 28% i-maltóz 12 % oligoszacharido ábra: A eményítő hidrolízis lépései A növénye nagy részében α- és β-amiláz enzimet találun. Az α-amiláz jelenlétében a eményítő dextrineig hidrolizál. Ezzel szemben a β-amiláz jelenlétében a eményítő- és a = 24 =

25 dextrinmoleulá végeiről maltózmoleulá hasadna le. Így a természetes eményítő enzimes hidrolízise legfeljebb %-os itermeléssel hajtható végre, mivel az amilopetinből maltóz mellett nehezen hidrolizáló, ún. határdextrine vagy maradédextrine is eletezne. Eze az amilopetin moleula olyan részeiből maradna vissza, melyeben 1,6-ötés van ét glüózrész özött, ezt a ötést pedig az amiláz nem ill. csa nagyon lassan bontja. A glüoamiláz (E.C α-1,4-glucan glucohydrolase) azért jelentős, mert mindét ötésfajtát épes bontani, így a eményítő mindét fraciójána hidrolízise megvalósítható. A glüoamiláz műödése során a eményítő nem-reduáló láncvégéről hasít le glüóz egységeet [Tucer, 1995], így egyrészt glüóz, másrészt egyre isebb lánchosszúságú maltodextrin moleulá épződne: a polimer degradációjána végső periódusában maltohexaóz, -pentaóz, -tetraóz, -trióz, maltóz és végül itt is ét glüóz. A eményítő bontás során az α-amilázos elfolyósítás igen gyors folyamat, mely aár néhány perc alatt 105 C-on megvalósítható. Gondot ooz azonban, hogy a glüoamilázona a termius ativitása soal isebb, ezért az oldatot le ell hűteni özel 50 C-ra és ott végrehajtani a curosítási folyamatot, s maga a hidrolízis is lassú folyamat, nem ritán óra tartózodási időt is alalmazna. A Brit Nemzetözösségi Gombautató Központ (Commonwealth Mycological Institute) már a nyolcvanas éve végén ezdett a glüoamiláz termelő Aspergillus awamori törzseel foglalozni, azo relatíve magas termius stabilitása miatt, azonban ativitásu elmaradt az Aspergillus niger törzseétől. Jelenleg az Aspergillus awamori genetiai módosítását általában a termius stabilitás növelése érdeében végzi, bár így ativitása általában még tovább csöen. A ísérleteimben is használt 2B. 361 U2/1 módosulat előállításánál azonban nem a termius stabilitás növelése, hanem a glüoamiláz ativitás emelése volt a cél, ezért Aspergillus niger törzse genetiai állományát használtá fel az előállítás folyamán. A utató célul tűzté i gabonából történő alohol termelő fermentációban való használhatóságát is, ezért számura a proteinbontó ativitás nem hátrány, hanem előny volt a törzs fejlesztése során. Az előállított törzset azóta már a utatóözpont értéesítette is, jelenleg az ABM Chemicals eresedelmi terméeént forgalmazzá [Koutinas, 2003], elsősorban a malomipar számára. = 25 =

26 A glüoamilázt soféle miróba épes előállítani, az egyi legígéretesebb eze özül napjainban az Aspergillus awamori törzs, amely extracelluláris úton termeli a glüoamiláz enzimet, így inyerése egyszerűen centrifugálással történhet. Az enzim szerezetét a ábra mutatja ábra: Az Aspergillus awamori-ból ivont glüoamiláz szerezete Szerezetileg az enzimet egyetlen lánc alotja, amely 471 aminosavból áll [Aleshin, 1994]. A fehérjelánc 13 jobbra csavarodó α-hélixből épül fel, amint az az ábrán is látható. Az egyes hélixe 9-23 aminosavat tartalmazna. Ligandumént N-acetil-D-glüózamin (NAG) és α-d-mannóz (MAN) moleulá (összesen 14) apcsolódna a fehérjéhez. Eze szerepe a fehérje stabilizálása. A napjainban folyó glüoamilázos utatáso célja újabb, nagyobb ativitású glüoamilázt termelő miroorganizmuso előállítása genetiai módszereel. Az így apott enzimészítménye stabilitása azonban még további javításra szorul. A stabilitás is növelhető genetiai módszereel, amire jó példát mutat be Nielsen, ai 10 óráról 48-ra növelte a glüoamiláz észítmény ativitásána felezési idejét [Nielsen, 2002]. = 26 =

27 A eményítő glüoamilázos hidrolízisénél a legnagyobb problémát a terméinhibíció jelenti [Moreira, 2004]: a épződő glüóz és alacsony polimerizációs foú oligomere, egy adott oncentráció fölött gátoljá a reaciót. Az inhibíció ompetitív típusú, leírására a 2.3. fejezetben bemutatott összefüggés alalmas. A is méretű terméeet tehát célszerű folyamatosan eltávolítani a rendszerből. Ehhez pl. membránszeparációt, illetve azon belül is az ultraszűrést érdemes használni [Giorno, 2000]. A maromoleulá enzimes hidrolízise során a hosszú szénláncú, nagy moleulatömegű szubsztrátot is méretű vegyületté bontjá le, amely gyaran inhibíciót ooz. Ultraszűrő modul segítségével membrán-bioreatorban megvalósítva a reaciót [Drioli, 1999] a méret szerinti szeparáció alapján műödő pórusos membrán egyrészt visszatartja a szubsztrátot és az enzimet, másrészt épes elválasztani az inhibíciót oozó terméet. Ez a fajta folyamat azt igényli, hogy a szubsztrát és a bioatalizátor özvetlenül érintezhessen, amihez a bioatalizátort a membránna arra az oldalára ell rögzíteni, ahol a szubsztrát áramli, illetve rögzítés nélül, egyszerűen a szubsztrátot tartalmazó oldatba everve is műödtethető a rendszer [Gan, 2002]. A eményítő és származéaina enzimes lebontását már többféle, ultraszűrő modullal megépített membrán bioreatorban leírtá. Az egyi első megoldást Tachauer [Tachauer, 1974] ismerteti, ahol árpa malátából nyert α- és β-amilázt használta szabad állapotban, s 18 Da vágási értéű ultraszűrő membránt alalmazta csőmembrán modulban. Szubsztrátént tiszta eményítőt használta, és megállapítottá, hogy a membrán visszatartja az alalmazott enzimeet és a permeátumban főént glüóz, illetve annál átlagosan 2,5-szer nagyobb moleulasúlyú oligomere található. A reator termeléenységét hagyományos evert szaaszos megoldásoéval összehasonlítva megállapítottá, hogy csa alacsony szubsztrátoncentráció esetén versenyépes a membrán reator alalmazása. Jóval isebb (5 Da) cut off -fal rendelező membránt használta spanyol utató [Lopez-Ulibarri, 1997]. Ő egy Aspergillus niger törzs által előállított glüoamilázt alalmazta szabad enzimént hollow fiber modulban. Poliszacharid forrásént manióa lisztet használta, és terméént 99,9 %-ban tiszta glüózt nyerte a permeátumban. Hasonló szubsztráton végezte ísérleteet Paolucci-Jeanjean és munatársai [Paolucci-Jeanjean, 2000] Bacillus licheniformis-ból izolált α-amilázt használva egy 50 Da vágási értéű Carbosep membrán modulban. Vizsgáltá a permeátumba erülő oligomere polimerizációs foát, megállapítva, hogy 1-10 glüóz egységes oligomere özül mindegyi = 27 =

28 özel azonos arányban előfordult, a szerző ezt a nagyobb pórusméretű membrán alalmazásával magyaráztá. Említést érdemelne Ida eredményei, ai Aspergillus niger-ből izolált glüoamilázt használt 1,6 µm pórusméretű erámia membránhoz rögzítve ( ábra). A rögzítés előtt a erámia felületét plazmával módosítottá a nagyobb hatéonyság érdeében [Ida, 2000]. A speciális rögzítés ellenére nem volt imutatható növemény a hagyományos megoldásohoz épest ábra: Az ultraszűrő modul alalmazása eményítő enzimes hidrolízisénél [Ida, 2000] Aspergillus awamorit még nem alalmazta eddig, pedig célszerű volna, hiszen igen jó glüoamiláz ativitással rendelezi. A membrán bioreator ialaításánál az átteintett szairodalma alapján az ultraszűrő membrán pórusmérete fontos szerepet játszi. Úgy tűni, mindenéppen ompromisszumot ell ötni: vagyis ha is pórusméretű membránt alalmazun, tiszta glüóz oldatot aphatun ugyan, de a permeáció sebessége igen icsi lesz, övetezés-éppen a produtivitás csöen. A eményítő glüoamilázos hidrolíziséne gyaorlati alalmazását mint célt szem előtt tartva a rendelezésre álló szairodalmi adato alapján megállapítható, hogy a folyamat ultraszűrő membrán bioreator segítségével megvalósítható és jól megválasztott üzemeltetési paramétereel hatásfoa a hagyományos eljárásoénál nagyobb. = 28 =

29 2.7. Lipázos reació, észterezés Az ipari bioatalízis egyi legjelentősebb enzimcsoportja a lipázo. A arboxil észter hidrolázo özé tartozó triacilglicerol hidrolázo (E.C ) családját nevezzü összefoglalóan lipázona. Az élő szervezeteben általában a nehezen oldódó triglicerideet alaítjá át jobban oldódó, így önnyebben felhasználható zsírsavaá és glicerinné. A lipázo mint töéletes atalizátoro bizonyos örülménye özött a fordított irányú reaciót is atalizáljá. Felhasználásuat is ez a széles reació-választé teszi lehetővé. A ábrán láthatóa a lipáz által atalizált reació uta [Paiva, 2000] ábra: A lipáz által atalizált reació uta [Paiva, 2000] A lipáz enzim igen soféle forrásból nyerhető i, növényi, állati és mirobiális szervezetből egyaránt ülönítette el enzimeet. Szerezetvizsgálatoal megállapítottá, hogy a ülönböző forrásból nyert lipázo formája, mérete igen változatos. A ábrán a = 29 =

30 méréseim során alalmazott Candida antarctica lipáz szerezetét mutatom be [Uppenberg, 1994] ábra: A Candida antarctica lipáz felépítése [Uppenberg, 1994] Ezt a lipáz enzimet 342 aminosav építi fel, fontos szerezet-stabilizáló eleme a 47. és a 89. aminosav özötti S-S híd, valamint a 99. aminosavhoz apcsolódó N-acetil-D-glüózamin (NAG) moleula. Atív centrumát a Ser Asp His triád alotja [Uppenberg, 1994]. A lipázo ativitását jelentősen befolyásolja negyedleges szerezetü, három dimenziós alaju. Az ala ialaítását pedig legnagyobb mértében a örnyezet víztartalma határozza meg. Sava és aloholo észterezése során az észter mellett víz is épződi, ez így a termé általános hatásain túl is hat az enzimre, az enzimstrutúrát befolyásolja a nemovalens ötéseen eresztül és a hidrogénötése felszaítása által; a reagense diffúzióját elősegíti; és a reacióegyensúlyt befolyásolja. A túl alacsony víztartalom általában csöenti az enzimativitást. A magas víztartalom szintén csöentheti a reaciósebességet. Az optimális vízmennyiség gyaran egy szű tartományban van. A lipáz enzimmel nem onvencionális özegben lejátszódó észterezés alalmas mind rövid és özepes moleula tömegű észtere, mind hosszabb szénláncú, többértéű észtere szintézisére. Alalmazható is moleula tömegű észtere előállítására rövid szénláncú sava = 30 =

31 és aloholo felhasználásával. Így állíthatóa elő az illéony aromaésztere, melye fontos élelmiszeripari segédanyago [Bélafi-Baó, 2003]. Nagy moleula tömegű észtere előállítását is vizsgáltá lipáz enzim segítségével, szerves oldószereben, hosszú szénláncú aloholoat és szintén hosszú szénláncú savaat alalmazva szubsztrátént. Halling - ai a zsírsava és zsíraloholo észterezését tanulmányozta n-hexánban, Candida rugosa lipázzal - az ilyen reacióat, inetiai szempontból vizsgálva a bi-bi ping-pong mechanizmus szerinti csoportba sorolja [Halling, 1994] Eltérő méretű szubsztráto észterezését is régóta soan vizsgáltá szerves oldószerben pl. ülönböző rövid szénláncú sava (tejsav) és zsíraloholo észtereine előállítását, amelyene fontos élelmiszeripari felhasználása van [Kiran, 2001]. Hosszú szénláncú sava, zsírsava rövid szénláncú aloholoal lejátszódó lipáz enzimmel atalizált észterezését azonban jóval evesebb esetben tanulmányoztá. Eze özül, nagyságrendjüne öszönhetően, a biodízelre vagyis a metanol zsírsav észtereire összpontosul a legnagyobb figyelem [Shimida, 2002]. Pedig a zsírsava rövid szénláncú aloholoal alotott észtereine, számos ülönböző ipari alalmazási lehetőségü van [Allen, 1996]. Az olajsav az egyi legfontosabb zsírsav a természetben, növényi olajoból gyártható, propanollal, butanollal és más hasonló alohollal épzett észterei enőanyagént alalmazható. A örnyezetbarát módon gyártott tiszta és természetes enőanyago egyre nagyobb figyelmet érdemelne, mivel nem tartalmazna toxius anyagot és biológiailag lebontható. A ozmaolaj szeszipari lepárlási mellétermé, átlagos összetétele: 10 % etanol, 13 % n-propanol, 15 % i-butanol, 51 % i-amil-alohol, 11 % egyéb alohol és víz. Manapság a ozmaolajat elégeti, hogy fedezze a desztilláció energiaigényét. A ozmaolaj olajsavval való észterezését énsav atalizátorral törö utató tanulmányoztá és bioenőanyagot gyártotta ipari célora [Özgülsün, 2000]. Ez az eljárás azonban nem örnyezetbarát, s bár a iinduló anyagai valóban természetes, bio eredetűe, a termében a atalizátorból nyomoban maradó sav nem előnyős a enőanyag felhasználásánál. Ezért a savatalízist mindenéppen célszerű lenne enzimes atalízissel iváltani. A ozmaolaj omponense és a zsírsava észterezését vizsgáltá ameriai és indiai utató [Gulati, 2003], Aspergillus terreus-ból inyert lipáz enzim segítségével nemonvencionális özegben. A táblázatban mutatom be a 48 óra alatt elért onverzióat. = 31 =

32 Mint látható, a ozmaolaj omponensei hasonlóan reagálta a hosszabb zsírsavaal, de az olajsavval nem volt imutatható onverzió táblázat: A. terreus lipáz által atalizált észterezés onverziói n-hexánban 37 Con 48 óra elteltével [Gulati, 2003] Az aalmazott zsírsav metanol i-propanol i-amil-alohol butanol Mirisztinsav (C 14.0 ) 79 % 51 % 62 % 35 % Palmitinsav (C 16.0 ) 64 % 50 % 62 % 20 % Sztearinsav (C 18.0 ) 66 % 62 % 65 % 21 % Olajsav (C 18:1 ) 0 % 0 % 0 % 0 % A ozmaolaj omponenseihez hasonló aloholoból iinduló oleáto előállításáról azonban többen is beszámolta rögzített Candida antarctica lipáz felhasználásával. i-propiloleát és további zsírsavésztere enzimes előállításána inetiai vizsgálatát mutatja be Garcia [Garcia, 1996]. Kinetiai paramétereet is meghatároz, bár megállapítja hogy az alacsony forráspontú i-propanol (82 C) valószínűsíthető azeotróp épzése miatt azo nem teljesen alalmasa a rendszer leírására. Az általa meghatározott 13 db inetiai paraméter miatt azo összehasonlítása is nehézes és mivel a 13 paramétert egyetlen görbére illesztette, azo definiáltsága sem egyértelmű. Szabad állapotú és immobilizált lipázt is használta (Rhizomucor miehei) Oliveira és munatársai [Oliveira, 2001] etil-oleát előállítására. A folyamatot inetiai szempontból vizsgáltá terner omplex ialaulását feltételezve, hatparaméteres modellt használva (2.4. fejezet). Megállapítottá hogy mind a szabad, mind a rögzített enzim atalizálja az olajsav és etil-alohol reacióját, meghatároztá a inetiai modell paramétereit. Szintén etanol és olajsav észterezését vizsgáltá Hazira és munatársai [Hazira, 2001], ai ping-pong mechanizmust feltételezte és meghatároztá a inetiai paramétereet is. Megállapítottá, hogy az alalmazott oldószer is jelentős hatással van az elérhető hozamora, ésőbbi vizsgálatohoz a n-heptán, n-hexán jellegű özegeet javasoltá. Azona a publiációna az eredményét, ahol inetiai szempontból is vizsgáltá az olajsav szerves oldószerben lipáz enzimmel történő észterezését, a táblázatban foglaltam össze. Látható, hogy butil-aloholnál hosszabb szénláncú aloholt egyi szerző sem vizsgált. Rövidebb szénláncú aloholo esetén az alohol gátló hatását minden esetben valamilyen módon feltételezté, de az olajsav ilyen hatását is említi [Goddard, 2000]. A inetia leírására a legtöbb esetben a ping-pong bi-bi modellt használtá, de található anna szélsőségesen eltorzított alalmazására is példa, (Oliveira, 15 nagyságrendnyi eltérés a = 32 =

33 inetiai paramétereben) valamint nagymértéű egyszerűsítése is, pl. egy szubsztrátos reació [Goddard, 2002]. Több esetben a vázolt inetia csa nagyon szű oncentráció tartományban alalmazható. A táblázatból itűni, hogy eze a részletes inetiai vizsgálato nem teinthetőe a reació megfelelő leírásána. Az észterezési folyamat inetiájána meghatározásához fejlesztésere, finomításora van szüség táblázat: Olajsav észterezéséne inetiai vizsgálata Alohol Enzim Modell Hivatozás Megjegyzés i-propilalohol Candida Novozym 435 antarctica butil-alohol immobilizált Candida rugosa etil-alohol immobilizált Rhizomucor miehei etil-alohol immobilizált Rhizomucor mihei etil-alohol szabad, sertés hasnyálmirigyből izolált ordered bi-bi [Garcia, 13 paraméter, a szubsztráto és a termée ompetitív inhibitoro ping-pong bi-bi 5 paraméter a sav és az alohol mint inhibitor random bi-bi 4 paraméter az alohol mint inhibitor Michaelis-Menten 2+1 paraméter az alohol mint inhibitor ping-pong bi-bi 4 paraméter az alohol mint inhibitor 1996] [Zaidi, 2002] [Oliveira, 2001] [Goddard, 2000] [Hazira, 2002] nagy az illesztés hibája, igen so paraméter egyetlen mérésre illesztve 28 % a maradó hiba, szű mérési tartomány (0,1-1 mol/l) 15 nagyságrendnyi ülönbség az egyes paramétere özött, vázi egy szubsztrátos inetia minden alohol oncentrációra más inetiát használ, pszeudo egy szubsztrátos inetia nagyon szű mérési tartomány 0,3-0,8 mol/l = 33 =

34 A sieres észter előállítási módszere alapján a MÜKKI-ben észterezésre már használt Novozym 435 Candida antarctica B lipáz valószínűleg használható a ozmaolaj omponense és olajsav észtereine előállítására nem-onvencionális özegben [Bélafi-Baó, 2003]. Az általam vizsgált észterezési reacióban az olajsav és az i-amil-alohol észterezési reaciója a övetezőéppen megy végbe: olajsav + i-amil-alohol i-amil-oleát + víz Ebben a reverzibilis reacióban a reagense mólaránya, a hőmérsélet, az enzim és a vízeltávolítás a reacióelegyből azo a paramétere, amelye befolyásoljá a onverziót és a reaciósebességet. A lipáz által atalizált észterezés inetiai vizsgálatána tapasztalatai alapján (2.7.2 táblázat) én munámban a ping-pong bi-bi reaciómechanizmus szerinti modellt ívánom alalmazni. = 34 =

35 3. Kísérleti anyago és módszere 3.1. Felhasznált anyago Enzime Keményítő lebontáshoz használt enzim Kísérleteimet Aspergillus awamori miroorganizmusból inyert glüoamiláz enzimmel folytattam, amelyet géntechniai úton tette alalmassá az emelt szintű glüoamiláz termelésére. A GB-58/99 nyilvántartási számú Brit-Magyar TéT együttműödés eretében partnerein a Satae Centre for Grain Process Engineering intézetből (UMIST, Manchester) biztosítottá számunra azt az Aspergillus awamori (2B. 360 U2/1) törzset, amelyne fermentációjával nyertü az enzimet. A fermentáció ülönlegességét az adta, hogy teljes őrlésű gabonát (búzát) használtun fel hozzá. A fermentáció során a glüoamiláz extracelluláris enzimént épződi, s a fermentléből így önnyen (szűréssel, centrifugálással) inyerhető. A szűrlet szárazanyag-tartalma 2,9 %, fehérjetartalma 47 % volt (Kjelhdalhmódszer) a szárazanyagra vonatoztatva. A UMIST utatói orábban arra öveteztette, hogy a fermentlében található cseély mértéű α-amiláz is, de ezt a ésőbbieben nem igazoltá. Sőt fermentációs ísérleteiben az α-amiláz ativitás hiányával támasztottá alá a gyengébb eredményeet. Kísérleteimet nemcsa a reduáló cuor oncentráció mérésével övettem nyomon, hanem néhány esetben egy speciális, curo elemzésére, oligoszacharido elválasztására szolgáló HPLC módszert is alalmaztam. AMINEX 42 A oszlopon semleges ph-n egyszerre határoztam meg a reacióelegye eményítő és egyéb szacharid fracióit. Amint az a romatogramon (3.1 ábra) jól látható, minden esetben izárólag glüózt és eményítőt mértem, oligoszacharidoat nem tudtam imutatni még igen oncentrált oldatoból, a ezdeti időpontoban sem. Eze alapján valószínűsítettem, hogy a ísérlete alatt túlnyomó részben a glüoamiláz enzim volt a meghatározó bioatalizátor, s enne ativitását mértem. = 35 =

36 Keményítő Glüóz Puffer 3.1 ábra: Keményítő hidrolízis romatogramja [Aminex 42-A oszlop Bideszt víz 0,5 ml/min 25 C RI detetor] Észterezéshez használt enzim Novozym 435 enzimet használtun az észterezési reacióhoz, egy eresedelmi Candida antarctica lipázt (E.C Triacylglycerol acylhydrolase), amely maropórusos aril gyantán volt rögzítve, víztartalma 1-2 % m/m. Az enzim a Novo Nordis A/S (Dánia) ajándéa volt. A észítmény névleges ativitása örülbelül 7000 Propil Laurát Egység (PLU/g) volt. Egy propil-laurát egység (PLU) a definíció szerint az az érté µmol-ban ifejezve, amennyi n-propil-laurát eletezi szabványos örülménye özött laurilsav n- propil-alohollal való észterezéseor 15 perc után, atmoszférius nyomáson. = 36 =

37 Egyéb vegyszere Vegyszer Gyártó Megjegyzés (tisztaság) absz. etanol Reanal 99,8 amil-oleát Flua 99,9 citromsav Reanal desztillált víz bidesztvíz az oldatohoz dietil-éter fenoftalien i-amil-alohol álium-nátrium-tartarát Spetrum3D Reanal Sigma Reanal álium-hidroxid Reanal 99% álium-jodid Reanal eményítő Spetrum 3D 98% nem módosított énsav nátrium-hidroxid Reanal Sperum3D n-hexán Reanal 99% olajsav Reanal 99,9% réz(ii) szulfát Spetrum3D sósav oldat Reanal 0,1 N (fatora 1,000) P8514 proteázgátló Sigma = 37 =