Dísznövények mikroszaporítása Dr. Mosonyi István Dániel

Átírás

1 Dísznövények mikroszaporítása Dr. Mosonyi István Dániel

2 A mikroszaporítás fogalma, jelentősége Szelektált fajok illetve fajták vegetatív, fajtaazonos szaporítása in vitro (steril laboratóriumi) és kontrollált körülmények között. ELŐNYÖK Kis helyigény Hatóságilag igazolható kórokozómentes Nincs visszafertőződés Homogén minőség Évszaktól, éghajlattól független Folyamatos előállítást tesz lehetővé HÁTRÁNYOK Fertőződés léphet fel Szomaklonális variabilitás léphet fel Akklimatizációs veszteség nagy Nagy költségigényű Speciális laborhátteret igényel Képzett munkaerőt igényel Nehezen szaporítható fajoknál is jó Új genotípusok gyors felszaporítása Gépesíthető és automatizálható Különösen gyors módszer A tenyészetek könnyen szállíthatók

3 A mikroszaporítás fogalma, jelentősége Dísznövények, gyümölcsök Kína: erdészeti fajok Izrael: szegfű, krizantém, gladiólusz Arab országok: datolya, banán, burgonya, szamóca, pisztácia, rózsa India: főleg fásszárúak, dísznövények, banán A világon évente 700 millió növényt állítanak elő in vitro (2003-as adat).

4

5 növényszám (millió db) Cserepes dísznövények mennyisége a holland virágtőzsdén Phalaenopsis Anthurium Kalanchoe Rosa Hyacinthus Chrysanthemum Dracaena Ficus Spathiphyllum Cyclamen Begonia Poinsettia

6 Dugványozás vs. mikroszaporítás afrikai ibolya esetében Cél: db növény Levéldugványozás Mikroszaporítás Szükséges anyanövények száma (4-5 db levél/növény) Helyfoglalás a növényházban Szaporodási ráta levelenként 667 db 3 db 17 m 2 0,08 m Munkaigény 13,2 h 137,8 h

7 A mikroszaporítás elméleti háttere Növényi sejtek totipotenciája a növény testi sejtjeinek mindegyike megtartja azokat az információkat, ami alapján egy sejtből felépülhet egy teljes növényi szervezet (totipotens = mindenre képes) Gottlieb HABERLANDT 1902-ben fogalmazta meg a totipotencia elvét (Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen, Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien. Math.- Naturwiss. Kl., Abt. J. 111, ) A bizonyításra 1958-ban került sor, STEWARD által. Sárgarépánál már differenciálódott sejtekből kalluszt állítottak elő, valamint megfigyelték, hogy ennek a kallusznak egyes sejtjeiből nem csak szerveket (organogenezis), hanem embriókat is lehet fejleszteni (embriogenezis). NÖVÉNY SEJT NÖVÉNY rendszer dedifferenciálódás - redifferenciálódás

8 A mikroszaporítás szakaszai Előkészítés Steril kultúra indítása Felszaporítás Elongálás és gyökeresítés Akklimatizálás

9 0. Előkészítő szakasz Célja: a sterilizálás megkönnyítése, az osztódó szövettájak aktivizálása Alkalmazott módszerek: a szár lelevelezése indítás előtt 1-2 héttel (sebforradás) átállás felszívatásos öntözésre 2-4 hónappal indítás előtt a hajtáscsúcs eltávolítása 2-4 héttel indítás előtt (oldalrügyek megduzzadnak) magasabb hőmérsékleten illetve fényen nevelés citokininnel való kezelés Hemerocallis anyanövények Az indítás előtt a virágzati szárak megnyúlása már a laboratórium steril környezetében történt.

10 Juvenilis részek fás növények esetében: George et al., 2008

11 Az előkészítő szakasz A rejuvenizálás módszerei: - visszavágás, sérülések okozása - etiolálás - hormonkezelés citokininekkel többnyire kapcsoltan egy fizikai kezeléssel (utána) A dormancia megszüntetése: - magok/rügyek esetében GA kezelés (in vitro is lehet alvó rügyeket könnyebb sterilizálni) akár közvetlenül lehet őket alkoholba mártás után lelángolni - hőkezelések (hideg/meleg) hagymák, évelők stb..

12 Fenyők rejuvenilizálása sorozatos átoltással: George et al., 2008

13 1. Indító szakasz Explantátum (inokulum) kiindulási növényrész kiválasztása Szinte bármelyik rész lehet de célszerű olyat választani, ami merisztémát tartalmaz, vagy merisztémadifferenciálásra hajlamos. Hajtáscsúcs Hónaljrügy Bimbó Felleveles virágzati szár Levél Mag Nódusz Száraz buroklevél Húsos buroklevél Csúcsrügy Hónaljrügyek Tönk Gyökerek

14 1. Indító szakasz Célja: a steril körülmények létrehozása és fenntartása Alkalmazott módszerek: eszközök és edények sterilizálása: hőlégsterilezés ( C) vagy gáz alkalmazása (formaldehid, etilén-oxid) táptalaj sterilizálása autoklávozással (15-30 min, 121 C, 0,1 MPa túlnyomás) explantátum fertőtlenítése: Csapvizes mosás Etanol 70% Na vagy Ca-hipoklorit (NaOCl, Ca(OCl) 2 ) 2-10% Higany(II)-klorid (HgCl 2 ) 0,1% Öblítés steril desztillált vízzel Kombinálhatók táptalajra helyezés steril fülkében lamináris box

15 1. Indító szakasz Felleveles virágzati szárdarabok alvórügyet tartalmaznak a fellevél tövében Csapvizes előmosás

16 1. Indító szakasz Áztatás a fertőtlenítőszeres oldatokban keveréssel kombinálva

17 A sterilitás biztosítása

18 1. Indító szakasz

19

20

21 Az indítási szakasz táptalajai Az inokulum típusától függ. Általában az ásványi elem összetétel ua., a növekedésszabályozók a különbség. Merisztémacsúcs tenyészet: Hajtáscsúcs tenyészet: In vitro magvetés: sokszor elegendő az auxin egyedül auxinként IVS, NES, de 2,4-D nem citokininként: BAP, KIN, 2-iP, TDZ nem kell növ.szabályzó, bár a citokininek a csírázó embrióknál hajtástöbbszöröződést tudnak indukálni (Mimulus, Petunia, Sinningia, Citrus) gibberellinek a magnyugalom megtöréséhez

22 Az indítási szakasz problémái Barnulás: sebfelületen barnul/feketedik a növényi szövet, később a táptalaj is elszíneződhet. Oka: a fenolázok, mono- és polifenoloxidázok, felszabadulnak a sejtmembránokból, ezek szubsztrátjai (hidroxifenolok) pedig a vakuólumokból és reakcióba lépnek egymással polifenolok, kinonok keletkeznek, és fehérjékhez kötődnek, vagy oxidálják őket -> toxikusak Megelőzése: - a sérülések minimalizálása - a fenolos vegyületek eliminálása - öblítés, mosás, kiáztatás - táptalaj gyakori cseréje (naponta, hetente) - folyékony táptalaj használata (jobb diffúzió) - aktív szén vagy PVP(P) használata lekötéshez - a fenoláz enzimek inhibitálása kelátképzőkkel - a fenoláz aktivitás csökkentése (alacsony ph, hőm.) - áztatás antioxidánsban (citromsav, aszkorbinsav) - antioxidánsok adása a táptalajhoz

23 Spathiphyllum torzsavirágzat, mint explantátum

24 2. Felszaporítási szakasz Cél: a tenyészet sokszorozása A táptalaj általában citokinin túlsúlyos, arányaiban kevesebb auxint tartalmaz. A szaporodási ráta mutatja a szakasz hatékonyságát: egy szubkultúrálás alatt fejlődött továbbszaporításra alkalmas új részek (sarjhagyma, sarjhajtás) száma egy explantátumra vonatkoztatva. A felszaporításnak több útja lehetséges.

25 A mikroszaporítás lehetséges útjai Egy- vagy többrügyes hajtásdarabbal Oldalhajtással Járulékos hajtással Járulékos szervvel Szomatikus embrióval Hajtástenyészetben Sejtszuszpenzióban A merisztémából fejlődő hajtás egy- vagy többrügyes darabjainak átoltásával. A merisztémából fejlődő hajtás oldalhajtásainak átoltásával. A merisztémából fejlődött kalluszból regenerálódott hajtások átoltásával. Hajtáseredetű szervek (gumó, hagyma) indukciójával. Sejtszuszpenzióban fejlődött szomatikus embriókból készített mesterséges magvakkal.

26 A szaporítás lehetséges útjai a sokszorosító szakaszban George et al., 2008

27 A hajtáscsúcskultúra (hajtáscsúcsból és oldalhajtásból) George et al., 2008

28

29 A hajtáscsúcskultúra (hajtáscsúcsból és oldalhajtásból) Elsődleges explantátum: - merisztéma - száron lévő rügyek (csúcs- vagy oldalrügyek) - hajtás (20 mm-ig) főleg lágyszárúaknál előnyei: könnyebben megindul több rügyet tartalmaz könnyebben túlél hátrány: vírusfertőzött lehet nehezebb sterilizálni Fásszárúaknál problémák: - egyes rügyekben nagy a mikrobiális szennyezettség - sokszor fenolosodási probléma lép fel - dormancia előny: - a rügyeket könnyű felszínileg sterilizálni Táptalaj: citokinin-túlsúlyos (apikális dominancia gátlása kivéve pl Gymnocladus spp.) Hajtások eredete szerint válogatni, ugyanis előfordulnak járulékosan fejlődöttek is! Kalluszosodás megelőzése: auxin-inhibitorokkal (TIBA, transz-fahéjsav)

30 A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal) George et al., 2008

31 A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal) Elsődleges explantátum: ua. mint a hajtáscsúcskultúránál Nevelés: 5-10 cm-es méretig, amíg a nóduszok jól elkülönülnek Táptalaj: citokininmentes általában (nem kell elágazás!) esetleg GA használata a megfelelően megnyúlt hajtásokhoz Alkalmazás: burgonya, Alstroemeria főleg Szaporodási ráta általában kisebb, mint a hajtáscsúcskultúránál, de kevesebb kallusz fejlődik, és kevesebb adventív hajtás genetikai stabilitás nagy

32 A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal) Egyszikűek Alstroemeria Cymbopogon spp. Poa pratensis Asparagus officinalis Dioscorea spp. Zea mays Orchideák Dendrobium spp. Phalaenopsis spp. Thunia alba Vanilla planifolia Lágyszárú kétszikűek Angelonia salicariefolia Cucumis sativus Glycyrrhiza glabra Rosmarinus officinalis Rorippa nasturtium Solanum tuberosum Fásszárú kétszikűek Carpinus betulus Castanea sativa, C. mollissima Eucalyptus grandis Forsythia ovata Fraxinus pennsylvanica Juglans regia Hevea brasiliensis Leucaena leucocephala Ligustrum obtusifolium Lonicera periclymenum Olea europea Paulownia tomentosa Poncirus trifoliata Prosopis juliflora Prunus armeniaca Quercus robur Salix spp. Syringa spp.

33 Járulékos hajtáskultúra direkt organogenezis Nevezik adventív hajtáskultúrának vagy járulékos rügyindukciónak is. Nem meglévő rügyekből fejlődik a hajtás, de nem is kalluszból. (Kalluszfejlődés viszont előfordulhat a direkt morfogenezissel EGYIDŐBEN). Csak erre hajlamos fajoknál, genotípusnál működik, egyes növényeknél soha. Elsődleges explantátum: levélszövet, szárszövet, virágszirom, gyökérszövet egyes növényeknél korlátozódik: hagymalevélre, magoncszövetre Előnye: gyorsabb és könnyebb megindítani a szaporodást (Saintpaulia merisztéma kioperálás virágzati szárdarab) Alkalmazás: levéldarabokból szárdarabok, virágzati szár Gyökerek Achimenes Kaktuszok Cichorium Saintpaulia Gerbera Armoracia Sinningia Hosta Convolvulus Streptocarpus Lilium Taraxacum Begonia Epiphyllum Hemerocallis

34 A kalluszból kiinduló hajtáskultúra (indirekt organogenezis) George et al., 2008

35

36

37

38 Járulékos szervkultúra Számos haszon- és dísznövényt szaporítanak hajtáseredetű raktározó szervvel. Ezek in vitro is működő módszerek: hagymával: amarillisz, jácint, liliom, vöröshagyma, nárcisz hagymagumóval: kardvirág minigumókkal: burgonya, jamszgyökér, kúszóliliom (Gloriosa) Hajtáseredetű szervek, rügyekből és járulékosan is fejlődhetnek. Magas citokininszint szükséges. Továbbszaporítás: szervekkel Előny: nem kell akklimatizálni!

39 Szomatikus embriogenezis Kiindulás: szomatikus sejt Fejlődés: - direkt embriogenezis (az embrió közvetlenül a testi sejtből keletkezik) - indirekt embriogenezis (először több, nem embriogén mitotikus sejosztódási ciklus előzi meg a felismerhető embriogén struktúra kialakulását) - Az embrió csírázásához pontosan meghatározott környezeti feltételek szükségesek - Folyékony táptalaj szükséges a neveléshez - Bioreaktor rendszerekhez ideális ÜZEMILEG NEM NAGYON ALKALMAZZÁK! Néhány elérhető technológia: Chrysanthemum grandiflorum Cyclamen persicum Euphorbia pulcherrima Rosa sp. Saintpaulia ionantha

40 Oncidium Sugar Sweet PLB-k (protocorm like body) szuszpenziós tenyésztése

41 A sokszorosító szakasz problémái - Citokininfelhalmozódás (gyökeresedésgátlás, bokros növekedés) - Szaporodási ráta csökkenése (citokinin-hozzászokás) - Genetikai variabilitás - Hiperhidratáció (korábbi nevén vitrifikálódás) Tünetek: - rövid internódiumok - duzzadt szövetek - halványzöld, esetleg fehér szín - üvegszerű, áttetsző részek - szalagosodott szár, levél - csavarodott, deformált habitus Előfordulás: - hajtáskultúrában - nóduszkultúrában - kalluszkultúrában különösen hajlamosak: - fásszárúak - Caryophyllaceae

42 A hiperhidratáció A ligninbioszintézis csökkenése miatt az edénynyalábok és tracheidák hiányoznak, vagy abnormális alakúak a szárban és a levelekben. A sejtekben kevesebb a cellulóz a sejtfal kevésbé áll ellen a nyomásnak. Sok vizet vesz fel, megduzzad, deformálódik. Továbbá csökkent a protein- és klorofillszintézis. Befolyásoló tényezők: - magas hőmérséklet, alacsony fényintenzitás/sötét - magas relatív páratartalom a növény körül - magas hormonkoncentráció Megelőzése: - a páratartalom csökkentése - szellőztetés, lezárás megváltoztatása - lombikok aljának hűtése harmatpontig - a táptalaj párolgásának csökkentése (lanolin, vagy ozmotikum használatával) - a táptalaj NH 4+ koncentrációjának csökkentése - az agar vagy szacharóz koncentrációjának növelése - áthelyezés hormonmentes táptalajra - floroglucinol, floridzin használata (a ligninbioszintézis prekurzorai)

43 3. Elongációs és gyökeresítési szakasz Elongáció megnyújtás Rejuvenilizáció miatt kisméretű növények életképtelenek a lombikon kívül Módszerei: -áthelyezés citokininmentes táptalajra -a hormonok lekötése a táptalajban: folyékony táptalajt rétegeznek a szilárd, szaporító táptalaj tetejére

44 3. Elongációs és gyökeresítési szakasz Gyökeresítés a rejuvenilizált növények általában jól gyökeresednek Lehetőségek: In vitro -jobban kontrollálható, de költségesebb is -talajba helyezéskor viszont az in vitro fejlődött gyökerek egy része elpusztulhat, a gyökeresedés kis időre megáll -érzékenyebb növényeknél Ex vitro -a gyökértelen hajtásokat minidugványként kezelik -költségkímélő -a gyökeresedés beindításához auxinos oldatba mártják a növényeket, de nem feltétlen szükséges

45 George et al., 2008

46

47 4. Akklimatizációs szakasz Szoktatás a lombikon kívüli világhoz. Üvegházi körülmények között ahol lehet szabályozni a környezeti paramétereket. Az in vitro fejlődött növények érzékenyebbek: az epidermiszen a kutikula vékonyabb sokszor hiányzik a viaszréteg a sztómák nem eléggé funkcióképesek, nyitva vannak folyton a mezofillumban az oszlopos parenchimasejtek kicsik, egyrétegűek Fontos a magas páratartalom biztosítása, és az erős fény leárnyékolása. A folyamat általában 4 hétig tart, ez alatt a páratartalmat fokozatosan kell csökkenteni, az árnyékolást pedig megszüntetni.

48 4. Akklimatizációs szakasz -A táptalaj lemosása a gyökerekről -A túl hosszú leveleket vissza kell kurtítani -A gyökerek megmetszése segíti azok elágazódását -A növénykék beültetése az akklimatizáló közegbe: A közeg kórokozó és kártevőmentes legyen, jó vízáteresztő: pl tőzeg és perlit keveréke

49 4. Akklimatizációs szakasz Fitotron (növénynevelő kamra) -megfelelő környezet biztosítása C között fajtól függően kezdeti 80-90% RP majd csökkenteni fényintenzitás alacsony később növelni

50 A táptalaj Biztosítja a tenyészet számára szükséges: -tápanyagokat (makro- és mikroelemek) -energiaforrásokat (a fotoszintézis csökkent üzemmódban megy!) -növekedésszabályozó anyagokat (hormonok) -egyéb anyagcsere termékeket, melyet a növények in vitro nem tudnak előállítani (egyes vitaminok) A táptalaj halmazállapota lehet szilárd és folyékony. szilárd táptalaj - egész növényt, szervet (hajtásokat) nevelünk rajta folyékony sejt- és szövetkultúrákhoz alkalmazható jobban

51 A táptalaj összetevői 1. Makro- és mikroelemek makro: N,P,K és Ca, Mg (szervetlen sók formájában) konc.: mg/l mezo: Fe (szerves komplex só formájában Na-Fe-EDTA) mikro: Co, Cu, B, I, Mn, Mo, Zn konc.: 0, mg/l 2. Szénhidrátok mint energiaforrások konc.: 0,5 3 % egyszerű cukrok: glükóz, fruktóz összetett cukrok: szacharóz cukoralkoholok: szorbitol, mannitol csak Rosaceae hasznosítja! szénhidrátok másik szerepe: ozmotikus regulánsok 3. Vitaminok konc.: 0,1 2 mg/l Elsősorban a B csoport vitaminja fontosak: B1 (tiamin), B3 (nikotinsav), B6 (piridoxin) C vitamin felhasználása antioxidánsként 4. Szilárdító anyagok konc.: 5 10 g/l agar (algakivonat), heteropoliszacharidok pl Gelrite 5. Növekedésszabályozó anyagok növényi hormonok 6. Egyéb: természetes kivonatok és pufferek (szerves savak)

52 Makroelemek A növények ionos formában veszik fel a makroelemeket: Ca 2+, Mg 2+, K +, NH 4+, NO 3-, HPO 4 2-, H 2 PO 4-, SO 4 2- A felvétel történhet passzív és aktív mechanizmussal. A passzív felvétel koncentrációfüggő. Hasonló kölcsönhatások az ionok között a táptalajban, mint in vivo a talajban: IONANTAGONIZMUS - magas K +, Ca 2+, konc. esetén a Mg 2+ felvétele gátolt (és vica versa) - magas PO 4 3- konc. esetén a Zn, Fe, Cu felvétele gátolt, a Ca kicsapódhat

53 1. Nitrogén Makroelemek - Nitrogén A növény számára felvehető forma: - az oxidált forma (NO 3- ), - a redukált formák (NH 4+, R-NH 2, R-CO-NH-R ) citromsav almasav fumársav Krebs ciklus Szukcinil-CoA izo-citromsav α-ketoglutársav Glutamát dehidrogenáz cukor karboxilátok Nitrát reduktáz Nitrit reduktáz NO 3 - NO 2 - NH 4 + glutamát -NH 2 Transzamináz szervetlen N források NH 4 + Glutamin szintetáz glutamin Glutamát szintetáz szerves N források egyéb aminosavak A növény számára az anyagcserében csak a redukált N formák használhatók!

54 Makroelemek - Nitrogén Az oxidált formájú nitrátion (NO 3- ) használata mégis elterjedt, mert: - Az NH 4+ magas koncentrációja toxikus a növénynek - a nitrátionnak ph-kontrolláló szerepe van a táptalajban, ha nincs puffer A nitrát felvétele csak savas közegben lehetséges. Nitrát felvétel anion kiválasztás nő a ph Ammónium felvétel proton kiválasztás csökken a ph töltésegyensúly megőrzése a szövetekben! Ha együtt van a táptalajban jelen NO 3- és NH 4+ akkor: 1. Gyors NH 4+ felvétel következtében a ph leesik 4,2-4,6-re (5,4-5,8-ről) 2. A további NH + 4 felvétele gátolt, de a NO 3- felvétele stimulálódik. 3. A táptalaj ph-ja nőni kezd. Ha csak NO 3- van a táptalajban, a szövetekben felhalmozódhat a NO 2- a nitritreduktáz gátlása esetén, és mérgezést okozhat.

55 Aminosavak Jó forrásai a redukált N-nek, de használatuk nem általános, mert drágák. Speciális esetek: - orchideamagvak csíráztatása nem képesek a szervetlen - merisztématenyésztés N források felhasználására Biológiailag aktív aminosavak: csak az α-aminosavak L-izomerjei! Alanin, aszparagin, cisztein, glutamin, glicin, arginin, lizin Kazein-hidrolizátum (CH): tejfehérjék savas hidrolízissel lebontva - olcsóbb, mint a tiszta aminosavak - 18 féle aminosavat (is) tartalmaz - de nem standard az összetétele - 0,1 2 g/l koncentrációban Peptonok: kevésbé vannak szétbontva (aminosavak + peptidek, fehérjetöredékek)

56 Makroelemek 2. Foszfor Szükséges: energiatranszferhez (ATP), fehérje és nukleinsavszintézishez Felvétele foszfát ion formában aktív transzporttal (légzési energiát használ) A növényi szervezetben teljesen oxidált formában: ortofoszfátként (PO 3-4 ) hasznosul. Felhasznált sók: nátrium és káliumsók 1- és 2-értékű foszfátanionokkal Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 K 2 HPO 4, KH 2 PO 4 az egyértékű H 2 PO 4- -et jobban felveszi a növény (ph<7 alatt) Magas koncentrációban növekedésgátló hatású (kicsapja a Ca-ot és egyes mikroelemeket, illetve gátolja a felvételüket).

57 Makroelemek 3. Kálium fő szerepe a töltéskiegyenlítés megmarad kationként a növényben KNO 3,K-foszfát sók, KCl formájában 4. Magnézium klorofill molekulához, MgSO 4 formájában 5. Kén SO 4 2- formában veszik fel, redukálják SH, -S-, -S-S- csoporttá relatíve nem érzékenyek a növények a magas S koncentrációra (50 mm-ig) 6. Kalcium CaCl 2, Ca(NO 3 ) 2 Murashige Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt Makroelem Konc. (mg/l) Makroelem Konc. (mg/l) Makroelem Konc. (mg/l) CaCl 2.2H 2 O 440 CaCl 2.2H 2 O 150 KNO KH 2 PO KNO CaCl 2.2H 2 O 200 KNO MgSO 4.7H 2 O 250 MgSO 4.7H 2 O 400 MgSO 4.7H 2 O 370 NaH 2 PO 4.H 2 O 150 NaH 2 PO 4.H 2 O 300 NH 4 NO (NH 4 ) 2 SO Magas sókoncentráció Közepes sókoncentráció Közepes sókoncentráció

58 Mikroelemek MS (µg/l) Gamborg B5 1. Mangán MnSO 4.H 2 O Cink ZnSO 4.7H 2 O Bór H 3 BO Réz CuSO4.5H2O Molibdén Na 2 MoO 4.2H 2 O Kobalt CoCl 2.6H 2 O Jód KI Vas Na-Fe-EDTA Nikkel, Alumínium, Nátrium, Klór Kelatizáló anyagok: EDTA etilén-diamin-tetraecetsav EDDHA etilén-diamin-dihidroxi-fenilecetsav EGTA etilén-glikol-bisz(2-aminoetiléter)-tetraecetsav DTPA dietilén-triamin-pentaecetsav DHTPA 1,3-diamino-2-hidroxipropán-tetraecetsav

59 Növényben MS Hoagland Növényben MS Hoagland (mmol/kg SZA) (mmol/l) (mmol/l) (mol%) (mol%) (mol%) N ,4 64,4 53 K ,1 21,3 19,9 Ca ,2 13,3 Mg 80 1,5 1 5,1 1,6 3,3 P 60 1,25 2 3,9 1,3 6,6 S 30 1,5 1 1,9 1,6 3,3 Cl 3 6 0,05 0,19 6,4 0,17 Fe 2 0,1 0,05 0,13 0,11 0,17 Mn 1 0,1 0,002 0,06 0,11 0,007 B 2 0,1 0,025 0,13 0,11 0,08 Zn 0,3 0,03 0,002 0,02 0,03 0,007 Cu 0,1 0,0001 0,0005 0,006 0,0001 0,002 Mo 0,001 0,001 0,0005 0,0001 0,0011 0,002 Ni 0, ,0005 0, ,002 Na - 0,1 0,05-0,11 0,17 totál 15,5 93,7 30,

60 Vitaminok A vitaminok a tenyészetek életbenmaradásához és növekedésük serkentéséhez kell. Az intakt növény szintetizálja B 1 (thiamin) B 3 (nikotinsav) B 6 (piridoxin) H (biotin) PABA (paraamino-benzoesav) C-vitamin mezo-inozit in vitro tenyészetek nem biztos. (minél kisebb, annál kevésbé) eszenciálisak, de főleg a B 1 (0,1 10 mg/l) antioxidánsként használható ( mg/l) 100 mg/l, cukorszerkezetű vegyület Murashige Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l) mezo-inozit 100 mezo-inozit 100 mezo-inozit 1000 nikotinsav 0,5 nikotinsav 1,0 nikotinsav 5 piridoxin 0,5 piridoxin 1,0 nikotinamid 0,5 thiamin 0,1 thiamin 10,0 thiamin 5

61 Cukrok - szénhidrátok Cukrok szerepe - szénforrás (sejtépítő anyagok váza), - energiát szolgáltat az organogenezis folyamatához Tenyészet típusa AUTOTRÓF MIXOTRÓF és HETEROTRÓF A légzés szubsztrátja a Calvin ciklusban fixált C a táptalaj cukortartalma Felhasznált cukor típusa: monoszacharid diszacharid bomlik triszacharid bomlik Glükóz - Szacharóz G, F Raffinóz G, F, galaktóz Fruktóz - Maltóz G Galaktóz - Cellobióz G Mannóz - Trehalóz G Ribóz, Xilóz, Arabinóz - Laktóz G, F Savas környezetben, autoklávozás hatására hidrolizálnak a poliszacharidok.

62 Cukrok - szénhidrátok Alkalmazott koncentráció: - általában 0,5-3% (5-30 g/l) - spec. esetekben magas konc. ( g/l) Hatásaik: - szabályozás? a vaszkuláris elemek képződésénél - klorofillszintézist gátolják: ALA szintáz blokkolva kevés a porfirinvázas molekula klorofillhiány - fotoszintézis hatékonysága csökken: RuBisCO blokkolódik csökken a CO 2 fixálás - megnő az antociánok képződése (pirosas szín cukortúladagolásra utalhat) - ozmotikus regulánsok a táptalajban cukoralkoholok: szorbitol, mannitol előnyösebbek erre a célra (B-hiány!) Felvételük: részben passzív permeációval, részben aktív transzporttal aktív transzportnál H + felvétel, és K + vagy H + leadás

63 Táptalajszilárdító anyagok Leggyakrabban alkalmazott zselésítő anyag: Összetétele: poliszacharidok összetett keveréke (galaktóz egységekből álló agaróz és agaropektin láncok) Használata: 0,5-1% koncentrációban (gyártó/tétel függő!) agar (tengeri vörösmoszat) Az agar előnyei: - vízzel gélt képez, ami 100 C-on olvad és ~45 C-on szilárdul meg - az agargélt a növények nem emésztik meg - az agar nem lép reakcióba a táptalaj összetevőivel hátrányai: - nem standard összetételű tételenként változik - szennyeződéseket tartalmaz - csökkenti a tápanyagok diffúzióját a táptalajban - nehezíti a tápanyagok felvételét az ozmotikus potenciál növelése miatt

64 Táptalajszilárdító anyagok

65 mmol/kg agar 1 agar 2 agar 3 agar 4 agar 5 agar 6 agar 7 agar 8 Gelrite N na na K Ca Mg Na P S Cl na na Cu nd Mn Fe Al Cr Cd nd nd Zn Sn nd nd nd Ni nd nd B na na na na na na na Co na na na na na na na

66 Egyéb felhasznált anyagok: Táptalajszilárdító anyagok - Agaróz (az agar gélképzéséért felelős összetevője tisztán) 0,4%-ban csak érzékeny protoplaszt és portokkultúrákhoz hajtáskultúránál hiperhidratációt okoz 0,4%-nál 1,5-2%-nál már nem, de ott csökkenti a növekedést - Gelrite - gellán gumi (heteropoliszacharid, a Pseudomonas elodea termeli) glükuronsav, ramnóz, cellobióz egységekből álló polimer lánc csak kationok (K +, Ca 2+, Mg 2+ ) jelenlétében gélesedik drága, de nagyon tiszta gélt képez nincs benne (annyi) szennyeződés, mint az agarban kisebb koncentráció kell belőle: 0,1-0,3% elegendő egy stabil gélhez - Keményítő (gyenge gélt képez) 5-10% - Zselatin 10%, hátránya, hogy 30 C-on már megolvad, bacik nagyon szeretik - Alginát (nem lehet jól autoklávozni, de jól zselésít)

67 0,15%-os Gelrite gél Táptalajszilárdító anyagok

68 A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók Az in vitro növekedésszabályozás legfőbb tényezői alapvető élettani hatásokat fejtenek ki a növényekre Típusaik: - auxinok - citokininek - gibberellinek - egyéb gátló anyagok Hatásukat befolyásolja: - a minőségük - koncentrációjuk - más szabályozók jelenléte/hiánya - a tenyésztett növényi rész genetikai-fiziológiai tulajdonságai

69 Növekedésszabályozó anyagok - auxinok Auxinok fiziológiai hatás Sejtek és szervek, elsősorban a szár megnyúlásos növekedésének serkentése Tropizmusok létrejötte A sejtosztódás serkentése citokininek jelenlétében Vaszkuláris elemek differenciálódásának szabályozása Gyökér iniciáció hajtásdugványoknál, gyökérdifferenciálódás szövetkultúrában Meghatározó szerep az apikális dominanciában Levél és termésleválás szabályozása Terméskötés, termésnövekedés, termésérés szabályozása Partenokarpia indukciója Gibberellinekkel együttműködve a virágok nemi jellegének meghatározása (magas auxin/gibberellin arány nővirágok képződésének kedvez) Közös kémiai tulajdonságaik: Indol vagy aromás gyűrű és egy karboxil-csoport egymástól 0,55 Å távolságra Vízben kevésbé, szerves oldószerekben jól oldódó kristályos anyagok Gyengén savas kémhatásúak

70 Növekedésszabályozó anyagok - auxinok Természetesen előforduló auxinok IES (IAA) 4-klór-IES 2-fenilecetsav IVS (IBA) Szintetikus auxinok 2,4-D NES (NAA) picloram dicamba

71 Növekedésszabályozó anyagok - auxinok Auxinok alkalmazása növekedésszabályozásra in vitro 1. Kalluszindukció egyszikűeknél 2-10 mg/l 2,4-D kétszikűeknél 1-3 mg/l 2,4-D és valamilyen citokinin kiegészítés indukálás után a 2,4-D-t általában NES-re, vagy IVS-re cserélik, mert megnövelheti a szomaklonális variabilitást! 2. Morfogenezis - gyökér és szárképzés NES vagy IVS használható főként organogenezishez; gyökérképzéshez elég magában az auxin 1-3 mg/l (0,1-10 mg/l) szárképzéshez magas citokinin:auxin arány szükséges 3. Embriogenezis magas 2,4-D koncentrációval indukálunk embriót 1-5 mg/l ezután csökkentjük, különben az embriók nem fejlődnek

72 Növekedésszabályozó anyagok - citokininek Citokininek fiziológiai hatás: Szabályozzák a sejtosztódást, növekedést, fejlődést és differenciálódást Serkentik a sejtmegnyúlást Nem-induktív körülmények között is virágzást válthatnak ki (helyettesíthetik a hidegkezelést, a virágzáshoz azt igénylő növényeknél) Késleltetik a levelek öregedését, serkentik a tápanyagok mobilizálását Apikális dominancia alakítása: az auxin antagonistája, a rügyek képződését serkenti (in vitro körülmények között is) Indukálják enzimek szintézisét Serkentik a kloroplasztiszok érését Elősegítik a gumók képződését Citokininek kémiai szerkezete: Purinvázzal rendelkeznek, melyen 5 helyen lehet eltérő szubsztituens - igen változatos és sokféle vegyület tartozik ide, több, mint 200 jelenleg

73 Növekedésszabályozó anyagok - citokininek Természetesen előforduló citokininek 2-iP zeatin Szintetikus citokininek benziladenin (BA) kinetin (KIN) tetrahidropiranil-ba (PBA) thidiazuron (TDZ)

74 Növekedésszabályozó anyagok - citokininek Citokininek alkalmazása növekedésszabályozásra 1. Járulékos hajtásképzés auxinokkal kombinációban, magas citokinin:auxin arány mellett 2. Embriogenezis kétszikűek: alacsony, 0,1-0,5 mg/l koncentrációban auxin mellett egyszikűeknél már 0,0002 mg/l is gátló hatású lehet! 3. Felhasználás hajtáskultúrákban - hónaljhajtások növekedésének serkentése 0,5-10 mg/l - járulékos hajtásrügyképzés - gyökérképződés gátlása magas, 0,5-10 mg/l koncentrációnál DE: kinetin sok esetben gyökeresedést indukál! 4. Sejtosztódás serkentése kallusztenyészetben alacsony koncentrációban, 0,1 mg/l, az auxin konc. ~tizede

75 A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók Gibberellinek fiziológiai hatás: szármegnyúlás serkentése apikális dominancia erősítése genetikai és fiziológiai törpeség normalizálása fény- és hidegigényes magvak csírázásának indukciója rügyek nyugalmi állapotának megszakítása Gibberellinek felhasználás a mikroszaporításban kalluszképzés és fenntartás morfogenezis gátlása hajtásmegnyúlás elősegítése GA 3 - gibberellin sav

76 K O N C E N T R Á C I Ó A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók Auxin-citokinin egymásrahatás AUXIN CITOKININ magas együttes hatás alacsony gyökérképződés indukálása kalluszindukció egyszikűeknél embriogenezis indukálása járulékos gyökérképzés kalluszból kalluszindukció kétszikűeknél sarjképzés indukálás hajtáskultúránál alacsony magas

77 Növekedésszabályozó anyagok - egyéb Abszcizinsav: alacsony konc. 0,1-1 mg/l esetén serkentheti a kallusznövekedést, magasabb konc. >1 mg/l esetén gátolja azt Etilén: gátolja a sejtosztódást és a morfogenezist, jelenléte nem kívánatos Anti-gibberellinek (gibberellin-antagonisták): klórmekvát (CCC), ancymidol, paclobutrazol növelik a szárazanyagtartalmat, erősítik a hajtásokat, törpésítenek, csökkentik a hiperhidratációt Anti-auxinok: trijód-benzoesav, transz-fahéjsav az auxin hatását reverzibilisen gátolják (nem kívánt kallusznövekedés) Fenolvegyületek: phloroglucinol antioxidáns, csökkenti a vitrifikációt, antibakteriális

78 Könnyezési nedvek: - komplex összetétel: Természetes eredetű kivonatok aminosavak, vitaminok, cukrok, makro- és mikroelemek, hormonok - nem standard, változó összetétel! Acer, Juglans, Cladrastis könnyezési nedvei Terméskivonatok: Kókusztej(-víz), banánkivonat, paradicsomlé, burgonyapép, csicsóka Élesztő és húskivonatok aminosavaknál már volt róluk szó

79 Táptalajok elkészítése Törzsoldatok készítése Törzsoldatok összemérése desztillált vízbe Makroelemek Fe nélkül, 10-20x Fe-EDTA 0,5g/100ml Makroelemek külön 10g/100ml Mikroelemek 1000x Vitamin törzsoldat 100x Hormonok 0,1-1 mg/ml Cukor hozzáadása Feltöltés végtérfogatra ph beállítása Táptalajszilárdító hozzáadása

80 Környezeti tényezők a tenyésztés során - Megvilágítás

81 Környezeti tényezők a tenyésztés során Hőmérséklet A növényi szövetdarabok, explantátumok nem tudnak úgy védekezni a hőmérsékletingadozás ellen, mint az intakt növény! a legtöbb kultúra számára optimális az átl. 25 C (17-32 C) trópusi és szubtrópusi növényeknek az átl 28 C (24-32 C) (pl citrusfélék, rizs, gyapot, Bougainvillea) sötét periódusban 4-5 C-kal alacsonyabb hőmérséklet a hőmérséklet hatással van a citokininek aktivitására magas hőmérsékleten csökken majd megszűnik - föld alatti szervek (hagymák, gumók) in vitro organogenezisére is nagy hatással van a hőmérséklet konstans hőm. esetén jobb ezen szervek képződése mérsékelt égövi fás növények in vitro kultúrája 4-5 C-on, sötétben jól tárolható néhány hónapig (alma, körte, berkenye) magas hőmérséklet (38 C) vírusmentesítésre alkalmas

82 Környezeti tényezők a tenyésztés során - Tartóedények

83 A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Nagyléptékű szaporítás feltételek megléte Technikai feltételek technológiai feltételek Sikeres kísérlet technológia!!! Teljesítménymutatók a termelési folyamat jellemzése: kultúránként eltérő teljesítményadatok Kioperálható merisztémák száma db/ 8 óra Gerbera sarjcsokrainak feldarabolása: db / 8 óra Nóduszkultúrás szaporítás: db / 8 óra Fás szárú növényeknél 20-50%-kal kisebb mutatók Több fajta 20-30%-kal kisebb mutató

84 A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Önköltség: Európában a 60-65%-át a bér és járulékai teszik ki Nem tartozik a jól fizetett tevékenységek közé elvándorlás Virológiai vagy egyéb tesztelést nem igénylő ex vitro növény önköltségének az alakulása: Szűkített önköltség Bér 42% Közterhek 18% Energiaköltség 15% Amortizáció 5% Anyag 10% Kutatás-fejlesztés + PR 10% Összesen 100% + egyéb költségek Általános költségek (15-25%) ÁFA Licencdíj: szegfűnél 0,019 /db krizantém: 0,0067-0,012 /db gerbera: 0,15-0,20 /db

85 A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Terméktípusok: Nem gyökeres hajtások vagy sarjcsokrok (minidugványok) Gyökeresített, de nem akklimatizált in vitro növény Akklimatizált, közegbe ültetett növény (lyuktálcás) Gumók, hagymák közvetlenül közegbe ültethető Néhány ár Betula pendula Purpurea Syringa vulgaris fajták Rózsa, klemátisz fajták Hosta fajták Vírustesztelt Gerbera fajták Spathiphyllum fajták 1,15 /db (72-es tálca), 2,06 (6-os cserép) 0,76 /db (72-es tálca) 1,07 /db (72-es tálca) 0,76 /db (72-es tálca) 2,05 /db 0,3-0,6 /db (162 vagy 72-es tálca)

86 A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Törzsállomány céljára előállított ex vitro növény: Többször tesztelik - meghatározó költségtényező ELISA teszt egy vírusra vásárolt diagnosztikummal: Ft/minta ELISA teszt egy vírusra saját készlettel: Ft/minta PCR teszt egy nagyságrenddel drágább, mint a vásárolt készlettel végrehajtott ELISA teszt

87 A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai A költségek csökkentése: Automatizálási lehetőségek Új(ragondolt) technikák alkalmazása RITA tenyésztési rendszer

88 A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai ForBio Vitron 501 mikroszaporító robot Elektromos-pneumatikus és mechanikus konstrukció Gyökeres, egy hajtással rendelkező növényeket állít elő (nóduszkultúra) Éves teljesítménye: 15 millió növény (eukaliptusz, akác, tikfa) Egyéb automatizált rendszerek: átfolyós táptalajsterilizáló és töltő

89 A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Fotoautotróf mikroszaporítás Szénforrás a levegő szén-dioxidja Cukormentes táptalaj minimális a kontamináció Erőteljesebb növekedés Könnyebb akklimatizálhatóság Bioreaktor rendszerek

90 Gerbera mikroszaporítása A anyanövény B merisztémák C merisztémák D endogén baci E felszaporítási fázis F osztás előtt G osztás után H gyökeresedés I kész in vitro növény J akklimatizálás K 4 hónap múlva MS táptalaj mg/l BA / KIN 0,1-0,5 mg/l IES / NES

91 Afrikaiibolya mikroszaporítása A regeneráció levéllemezen B sz. embriók C sz. embrió D fejlődő hajtások E tőlevélrózsa F - - G kész növény H akklimatizálás I mutáns egyed MS táptalaj + 0,2-0,3 mg/l BA / NES 0,1 mg/l TDZ

92 Köszönöm a figyelmet!