Rheumatoid kórképek autoimmun patomechanizmusának vizsgálata. Ortutay Zsuzsanna

Átírás

1 Rheumatoid kórképek autoimmun patomechanizmusának vizsgálata Doktori értekezés Ortutay Zsuzsanna Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Buzás Edit egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa Hivatalos bírálók: Dr. Sármay Gabriella PhD, DSc Dr. Dérfalvi Beáta PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Füst György PhD, DSc Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kacskovics Imre PhD Dr. Treszl András MD, PhD 1

2

3 Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke...4 Bevezetés...7 Irodalmi áttekintés...9 Az egészséges ízületek felépítése és működése...9 Az ízületek felépítése...9 RA, OA, SNSA patomechanizmusa és klinikuma...13 Rheumatoid arthritis...13 Osteoarthritis...20 Seronegativ spondarthritis...21 A synoviális folyadék összetevőinek változása gyulladásban. Az RA markerei és prediktorai...22 Prediktorok kutatásának szükségessége rheumatoid arthritisben...22 Genetikai markerek...23 Immunológiai markerek...25 Érképződés...30 Az ízületből származó markerek...31 A porckárosodásban szerepet játszó proteázok...31 Glikozidázok...39 Célkitűzések...45 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata...45 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata...46 Betegek és módszerek...47 Mintagyűjtés...47 Betegek...47 Szérum és synoviális folyadék minták...48 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata...48 Glikozidáz tesztek...48 Mátrix metalloproteináz (MMP) aktivitás mérése...49 A glikozidáz és MMP-tesztek statisztikai analízise...49 A porcszövet vizsgálata glükózaminoglikán-specifikus Safranin O festéssel...50 Glikozidáz-specifikus antitestek kimutatása synoviális folyadékban ELISA módszerrel...52 Glikozidáz enzimek aktivitásának vizsgálata áramlási citometria segítségével...53 A RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata...53 A porcmátrix komponensek ellen termelt IgG és IgM típusú ellenanyagok kimutatása ELISA módszerrel...53 A porcmátrix komponensek ellen termelt, ELISA módszerrel kimutatott ellenanyagok statisztikai analízise...55 Eredmények...56 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata...56 Különböző ízületi bántalmakban szenvedő betegek synoviális folyadékában mérhető enzimaktivitások

4 A synoviális folyadék glikozidáz aktivitása, mint a rheumatoid arthritis prediktora A synoviális folyadék enzimaktivitásainak korrelációja...59 A porcmátrix glükózaminoglikán-tartalmának kiürülése exoglikozidáz enzimek hatására...61 A szérumban illetve a synoviális folyadékban mérhető, exoglikozidázokat felismerni képes ellenanyagok szintje...63 Perifériás vérsejtek -D-glükuronidáz aktivitásának vizsgálata áramlási citometriával...63 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata...65 IgG és IgM szintek összehasonlítása a különböző betegcsoportok szérumában és SF-ében...65 A különböző porcmátrix-antigéneket felismerő emelkedett szintű ellenanyagok relatív gyakorisága...68 Klinikai és laboratóriumi paraméterek és az ellenanyag-szint összefüggéseinek vizsgálata RA betegcsoport esetén...70 A különböző porcmátrix-komponensekre specifikus ellenanyagok közötti összefüggések vizsgálata...71 Megbeszélés...74 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata...74 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata...79 Következtetések...82 Az RA patomechanizmusában szerepet játszó enzimek vizsgálata...82 Az RA patomechanizmusában esetlegesen szerepet játszó porc alapállomány molekulákkal reagáló antitestek vizsgálata...83 Összefoglalás...84 Summary...85 Irodalomjegyzék...86 Saját publikációk jegyzéke A disszertáció témájához kapcsolódó közlemények A disszertáció témájához nem kapcsolódó közlemények Köszönetnyilvánítás

5 Rövidítések jegyzéke ACAST Anti calpastatin antibody ADAM A disintegrin and metalloproteinase ADAM TS A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin like motifs AFA Anti fillagrin antibody AKA Anti keratin antibody ANA Anti nuclear antibody ANCA Anti neutrophil cytoplasmic antibody AP Arthritis psoriatica APF Anti perinuclear factor APMA p aminophenylmercuric acetate AS Ankylopoetica spondylitis BSP Bone sialoprotein CCP Cyclic citrullinated peptide CIA Collagen induced arthritis CII II. típusú kollagén COMP Cartilage oligomeric matrix protein CRP C reactive protein CSIF Cytokine synthesis inhibitory factor DMARD Disease modifying anti rheumatic drug EBV Epstein Barr vírus ECM Extracelluláris mátrix EGF Epidermal growth factor ELISA Enzyme linked immunosorbent assay EMMPRIN Extracellular matrix metalloproteinase inducer ESR Erythrocyta sedimentációs ráta, vörösvértest süllyedés 3

6 FGF Fibroblast growth factor GAG Glükózaminoglikán GLUC D glükuronidáz GM CSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor HA Hyaluronic acid HB EGF Heparin binding EGF like growth factor HC gp 39 Human cartilage glycoprotein 39 HEV High endothelial venule Hex Hexosaminidase HLA Human leukocyte antigen HMGB 1 High mobility group protein 1 IBD Inflammatory bowel disease ICAM 1 Intercellular adhesion molecule 1 ICTP I. típusú kollagén karboxiterminális telopeptid IGF Insulin like growth factor IFN Interferon gamma Ig Immunglobulin IGF 1 Insulin like growth factor 1 IGFBP 3 IGF binding protein 3 IL Interleukin IU International unit KO Knock out MHC Major histocompatibility complex MMP Matrix metalloproteinase NAG D N acetil glükózaminidáz NSAID Non steroidal anti inflammatory drug OA Osteoarthritis OD Optikai denzitás 4

7 PAD Peptidylarginine deiminase PERCP Peridinin chlorophyll protein PIIINP III. típusú prokollagén aminoterminális telopeptid RA Rheumatoid arthritis ReA Reactive arthritis RECK Reversion inducing cystein rich protein with Kazal motifs RF Reumafaktor SF Synovial fluid SI Sport injury SNSA Seronegative spondylarthritis TGF Transforming growth factor beta h Helper T lymphocyte TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinases TNF Tumor necrosis factor alpha VEGF Vascular endothelial growth factor 5

8 Bevezetés A gyulladásos és degeneratív ízületi kórképek napjainkban egyre inkább a figyelem előterébe kerülnek. E nagy betegségcsoport esetében az életminőség súlyos romlása következik be, krónikus fájdalom jelentkezik, a kialakuló deformitások gyakran mozgáskorlátozottsághoz és ennek következtében a munkavégző képesség csökkenéséhez, gyakran teljes elvesztéséhez vezetnek. A fentiekben vázolt népegészségügyi probléma megoldása mindmáig várat magára, hiszen a gyulladásos ízületi kórképek autoimmun etiológiája nem ismert pontosan, így oki terápia és megelőzés sem tervezhető. Az ízületi betegségekben a legjelentősebb klinikai tüneteket és a beteg mozgáskorlátozottá válását a hialinporc visszafordíthatatlan károsodása okozza. Ebben a folyamatban a porc alapállomány komponenseinek (II. típusú kollagén és aggrekán) hasítására képes enzimeket tartják a legfőbb effektor molekuláknak. A porcmátrix degradálódásával párhuzamosan a porcsejteket közvelenül is érhetik citotoxikus illetve apoptózis indukáló hatások. Újabban mind több ismeret áll rendelkezésre a porcdegradáció illetve a proteolitikus hasítás folyamataira vonatkozóan. Elsősorban különböző proteázokat hoztak összefüggésbe a porcdestrukciós folyamatokkal, köztük a mátrix metalloproteinázokat, az ADAM család (1), az ADAM TS család (2) tagjait és szerin proteázokat (elasztáz, katepszinek és granzimok) (3,4,5). A glikohidrolázok enzimcsaládja azonban az utóbbi évtizedekben kikerült az arthritis kutatások fókuszából annak ellenére, hogy az 1970 es években számos kutatócsoport leírta a glikozidázok emelkedett szintjét rheumatoid betegségekben (6,7,8). Az érdeklődés hiánya meglepő annak fényében, hogy a legtöbb porc alapállományt felépítő molekula glikozilált, 6

9 közülük néhány extrém mennyiségben hordoz cukoroldalláncot. A szénhidrátok, főként a glükózaminoglikán oldalláncok (melyek pl. az aggrekán esetében a molekulatömeg közel 90 % át teszik ki!) szignifikánsan gátolhatják a sejtközötti állomány proteolitikus hasítását az ízületben. Az utóbbi években számos autoimmun betegség esetében sikeresen azonosították az autoantigéneket. Azonban a széleskörű kutatások ellenére az RA autoantigénje mindez idáig ismeretlen maradt. Mivel az autoimmun ízületi destrukció elsődleges célpontja a hialinporc, az ennek felépítésében résztvevő molekulák, mint az autoimmun folyamatok nyilvánvaló célpontjai vehetők számításba. Az immunrendszer általi felismerésük krónikus, progresszív autoimmun gyulladást eredményezhet. A hialinporc sejtközötti állományát felépítő molekulák közül a II. típusú kollagént tanulmányozták legbehatóbban (9,10,11,12,13). Szintén ismert, hogy az aggrekánt ellenanyagok illetve T sejtek ismerik fel számos különböző ízületi kórkép esetén (14). A fibronektin egy másik porcmátrix komponens, mely RA ban szenvedő betegek szabad ízületi felszínén található, és az immunfelismerés célpontja lehet (15). Számos kutatócsoport foglalkozott az utóbbi években a HC gp 39 molekulával, mint az RA egy lehetséges autoantigénjével (16,17). Azonban az RA autoantigénjének molekuláris természetére vonatkozó kérdés mindeddig megválaszolatlan maradt. 7

10 Irodalmi áttekintés Az egészséges ízületek felépítése és működése Az ízületek felépítése Szöveti felépítés A synoviális ízületekben az ízületi felszíneket hialinporc (üvegporc) borítja (3. ábra), mely a nagyfokú mechanikai igénybevételnek megfelelően módosult. Felnőttekben lényegében avascularis, nyirokelvezetése, idegellátása nincs. Alapállománya közvetlenül érintkezik az ízület üregében található synoviális folyadékkal (SF). A porc alapállományának termeléséért és állandóságának fenntartásáért a porcsejtek felelősek. A porcsejtek (kondrociták) csupán kis számban vannak jelen. Többnyire párosával helyezkednek el a kondronokban. Porcsérülést követően nem, vagy alig képesek osztódni, és a mátrixba ágyazott kondrociták sem tudnak a sérült porcterületre vándorolni, így a hialinporc regenerációra nem képes. A porcszövet alapállománya felelős a porcszövet rendkívüli rugalmasságáért és ellenállóságáért. Szerkezete nagyfokú molekuláris rendezettséget mutat (3. ábra). Az ízfelszíntől, a porcsejtektől való távolságtól, valamint a rendszeres mechanikai terheléstől függően más és más a mátrix szerkezete. A porcfelszínnel párhuzamosan megfigyelhető a felületi, az intermedier, a mély vagy radier, valamint az elmeszesedett porc zónája, míg a porcsejtek felől távolodva a pericelluláris (capsula), territoriális és interterritoriális mátrixrégiókat különböztethetjük meg (18). A mátrix felépítésében számos molekula vesz részt, ezek minősége és mennyisége a mechanikai megterheléssel változik. 8

11 1. ábra: Az ízület felépítése A csontok teherviselő felszíneit porcszövet borítja, mely a fizikai igénybevétlenek megfelelően alakult ki. A porcszövet alapállományában a kodorciták kondronokban helyezkednek el. Az alapállomány szerkezete az ízfelszíntől és a porcsejtektől való távolságtól függően változik. A mátrix felépítésében résztvevő molekulák nagy részét proteoglikánok teszik ki, melyek a rosthálózatot képező kollagénmolekulákhoz kapcsolódnak. Molekuláris felépítés Az ízületi porcmátrix tömegének legnagyobb részét (65 80 %) víz teszi ki, amelyet az erősen negatív töltésű (szulfát csoportokat tartalmazó) glükózaminoglikán (GAG) molekulák kötnek meg másodlagos kötéssel. A GAG ok ismétlődő diszacharid egységekből épülnek fel, melynek egyik tagja mindig egy aminocukor, a másik általában hexuronsav (2. ábra). Terminális cukormolekulájukkal egy központi fehérjeszálhoz (core protein) kapcsolódnak, így proteoglikánokat képeznek. Ilyen GAG molekula pl. a kondroitin szulfát. A proteoglikánok közül a leggyakoribb a nagy 9

12 aggregáló proteoglikán, azaz aggrekán, amely a porc nedves súlyának kb % át teszi ki. 2. ábra: A proteoglikánok sematikus felépítése (19) A proteoglikánok felépítésében a központi fehérjelánchoz (magfehérje) számos cukor oldallánc kapcsolódik. A cukor oldalláncok (glükózaminoglikánok) ismétlődő diszacharid egységekből épülnek föl, melyek egyik tagja egy aminocukor, a másik általában hexuronsav. A GAG-ok erősen negatív töltésűek, így másodlagos kötésekkel nagy mennyiségű vízmolekula kapcsolódik hozzájuk. A kis proteoglikánok jóval rövidebb fehérjelánccal rendelkeznek, mint az aggrekán, és a fehérjevázhoz mindössze néhány glükózaminoglikán oldallánc kapcsolódik. Egyik képviselőjük a dekorin, egyetlen dermatán szulfát/ kondroitin szulfát oldalláncot visel, és feltehetőleg a kollagénrostok átmérőjének szabályozásában játszik szerepet. A biglikán esetében két dermatán szulfát oldallánc kapcsolódik a fehérjéhez, míg a fibromodulin négy keratán szulfát oldallánccal rendelkezik. A porcmátrix makromolekulák másik nagy családja a kollagén család, mely a nedves súly % áért felelős. A hialinporcban előforduló kollagének % a II. típusú kollagén, mely rosthálózatot képez az alapállományban. A minor kollagének közül a rostképzésben, illetve a rostátmérő szabályozásában a IX. és a XI. típusú 10

13 kollagén játszik szerepet. A X. típusú kollagén hipertrófiás porcsejtek környezetében fordul elő, a VI. kollagén a kondron alkotásában vesz részt, az V. kollagén szintén megtalálható az üvegporc alapállományában. A kollagének és proteoglikánok mellett egyéb mátrixproteinek is részt vesznek az alapállomány felépítésében. A link protein a proteoglikán aggregátumok stabilizálásában játszik szerepet. A fibronektin és az ankorin II a sejt mátrix kölcsönhatásban vesz részt. A COMP (cartilage oligomeric matrix protein) az interterritoriális mátrix fontos alkotója. Ezek mellett számos egyéb, jelenleg nem tisztázott funkciójú fehérje is ismert az alapállományban. Mindezek a makromolekulák szövevényes hálózatot alakítanak ki, melynek középpontjában a porcsejtek állnak. A hozzájuk horgonyzott kollagén II. és a minor kollagének a porc húzószilárdságát, a hialuronsav link protein aggrekán aggregátum pedig a porc rugalmasságát biztosítja (18). A synoviális membrán Synoviális membránnak nevezzük az ízületi üregeket bélelő hártyát. Ez borítja az ízületek nem teherviselő felszíneit, az intraarticularis képleteket (szalagok, inak), az ízületi tokot, valamint fedi a csontnak az ízületi felszínét. A synoviális membrán bolyhos felszínű, laza, mesenchymális eredetű kötőszövet. Sejtjei termelik a synovium proteoglikánokban, illetve hialuronsavban gazdag alapállományát, melyben többnyire kevés, lazán rendezett kollagén rostot találunk. Normál körülmények között a synoviális membrán csupán egy két sejtréteg vastagságú (18,20). Ennek felszínén 1 3, viszonylag laza rétegben helyezkednek el a synoviális fedősejtek vagy synoviocyták, melyeknek két típusát különböztetjük meg: az A típusú fagocita tulajdonságú és a B típusú fibroblaszt szerű synoviocytát. Ez utóbbi termeli a hialuronsavat, illetve hozzájárul az ízületi nedv termeléséhez, míg az A típusú synoviocyták a monocita 11

14 makrofág rendszer részét képezik. A fedősejtek alatti kötőszövetes réteg fibroblasztokat, dendritikus sejteket, hízósejteket, vér és nyirokereket foglal magában. Az egészséges synoviális fedősejtek MHC II molekulát expresszálnak felszínükön (21,22), így adott esetben hozzájárulhatnak a lokális T sejt aktivációhoz (23,24). A synoviális folyadék (SF) A synovia elnevezés Paracelsustól származik, akit az ízületi folyadék a tojásfehérjére emlékeztetett. Az egészséges synoviális folyadék tiszta, világossárga, viszkózus, nem rögös folyadék, lényegében plazmaultrafiltrátumnak tekinthető, melyet a porcszövet és a synoviális membrán sejtjei által termelt anyagok módosítanak. Kémhatása enyhén bázikus (ph=7 7,8). Nagy mennyiségben tartalmaz hialuronsavat, melyet a synoviocyták, illetve az alattuk elhelyezkedő kötőszövetes rétegben található fibroblasztok termelnek. Ez a molekula felelős az SF normális viszkozitásának biztosításáért. Az SF fehérjetartalma majdnem teljes egészében a vérplazmából származik. Legfontosabb feladatai az ízületi porc táplálása, az ízület "kenése", az anyagcseretermékek forgalma (25). RA, OA, SNSA patomechanizmusa és klinikuma Rheumatoid arthritis A rheumatoid arthritis (RA) lényegét a 18. században írták le először. Ez a betegség elsősorban az ízületeket támadja meg, és lassú károsodásukhoz vezet, de esetenként egyéb szervrendszereket is érint. Nemcsak fájdalommal, a munka és mozgásképesség elvesztésével, így az életminőség romlásával jár, de a várható élettartamot is csökkenti. 12

15 Kezdetben különböző klinikai megfigyelések alapján különböztették meg ezt a betegséget az egyéb nagy ízületi kórképektől, mint a köszvény, a reumás láz. Olyan megkülönböztető jegyeket ismertek föl, mint a betegség krónikussága, a nőkben való gyakoribb előfordulása és az ízületek deformálódása. A "rheumatoid" megjelölés a görög "rheumos" szóból származik, melynek jelentése folyadék. A "rheumatoid arthritis" megjelölést először Alfred Baring Garrod használta 1859 ben (26). Ő volt az első, aki elkülönítette az RA t a köszvénytől, bár az osteoarthritis (OA) betegség még benne foglaltatott az általa RA nak nevezett betegségcsoportban ben Garrod fia volt az, aki a RA és az OA között a mai napig használt megkülönböztető jegyeket felismerte és leírta, bár az OA kifejezést már 1888 ban is használták (27). Rheumatoid arthritis klinikai képe Az RA első tünetei az ízületi fájdalom és duzzanat, majd néhány óra inaktivitás után jelentkező általános fáradtság és merevség. A leggyakrabban érintett ízületek a proximális interphalangealis ízületek, csukló, térd, boka és a metatarsophalangeális ízületek (. ábra) (28,29). A visszatérő gyulladás végső soron különböző mértékű porckárosodáshoz, illetve rokkantsághoz vezet. A tudományos irodalomban az RA diagnózisának felállításához az American College of Rheumatology által kidolgozott kritériumokat használják (30). Ezek a kritériumok a tünetek és a laboratóriumi eredmények azon részét foglalják magukban, amelyek az RA ban szenvedő betegek túlnyomó többségére jellemzőek, de ezek közül egy sem jelenik meg minden RA ban szenvedő beteg esetén kötelező érvénnyel. Az RA prevalenciája világszerte körülbelül 0,5 1%, nőkben az előfordulása 2 3 szor gyakoribb, mint férfiakban (32,33). Az RA idő előtti halálozáshoz vezethet, mely leggyakrabban szív és érrendszeri okokra vezethető vissza (34,35). A rheumatoid 13

16 3. ábra: Rheumatoid elváltozások a kézen (31) arthritis az osteoporosis fokozott kockázatával jár (36). A rheumatoid arthritis etiológiája Az RA kialakulásának okai mindmáig nem teljesen tisztázottak. Számos tanulmány családon belüli halmozódásról tudósít. Az RA konkordanciája egypetéjű ikrek esetén kb. 15 %, mely a betegség kifejlődésében a genetikai tényezők mellett a környezeti faktorok szerepére is felhívja a figyelmet (37,38). Az RA kialakulásával számos környezeti tényező mutat összefüggést. Ezek közül a dohányzás tűnik a legfontosabbnak (39,40,41), de a szoptatás, a korábbi vérátömlesztés és az elhízás is fontos rizikófaktorok (42). Többféle fertőzést is összefüggésbe hoztak a betegség kialakulásával, úgymint a mycobaktériumokat, proteust, E. colit, a vírusok közül pedig az Epstein Barr vírust (EBV), a rubeola vírusát, a parvovírus B19 et és a retrovírusokat (18). Úgy tűnik, az ízületi károsodásban és a gyulladás kialakulásában a fő szerepet már a betegség korai stádiumában is a citokinek és a hasító enzimek játsszák (43). A citokin 14

17 expresszió mértéke jelentős heterogenitást mutat az egyes RA ban szenvedő betegek esetében (44). Az általános vélemény az, hogy az RA ban a citokinegyensúly a proinflammatorikus citokinek irányába billen az antiinflammatorikus citokinek ellenében. Az RA igen összetett betegség, és bár a kiváltó ok nem teljesen tisztázott, a tünetek kialakulásának hátterében autoimmun patomechanizmus áll. Azok között az antigének között, melyek az autoimmunitás célpontjai lehetnek, szerepel a II. típusú kollagén, a HC gp 39, valamint hősokk proteinek (45). Azonban annak is felvetődik a lehetősége, hogy az autoimmunitás egyetlen porcspecifikus autoantigén helyett ubikviter antigénnel szemben alakul ki (46,47,48). Mindent egybevetve, az RA kifejlődésében mind genetikai, mind pedig környezeti tényezők szerepet játszanak. A betegség egyes HLA DR (pl. HLA DR4) allélekhez való asszociációja feltételezi, hogy RA ban a T sejt közvetített immunválasz játszik fontos szerepet, habár külső körülmények is fontosnak tűnnek a betegség kifejlődése szempontjából. A rheumatoid arthritis patogenezise Széles körben elterjedt nézet szerint az RA a synovium gyulladása, melynek során az ízületi hártya sejtjei számos osztódáson mennek keresztül; így alakul ki a pannus, mely azután rákúszik a porc felszínére és annak károsodását idézi elő (4. ábra) (50). Az RA kifejlődésében számos különböző gyulladásos sejt (például T sejtek, makrofágok) és az ízület állandó sejtjei közötti kommunikáció játszik lényeges szerepet. Az RA patogenezisének megértése igen fontos a specifikus és hatásos terápiás eljárások kifejlesztése szempontjából. 15

18 4. ábra: A rheumatoid arthritis kialakulása a térdízületben (49) Egészséges térdízületben a synovium csupán az egy-két sejtrétegből álló synoviális membránt és az alatta húzódó kötőszöveti réteget tartalmazza. Korai RA-ban a synoviális membrán megvastagszik a synoviális fedősejtek osztódása és megnagyobbodása miatt. A synoviumban új erek képződnek. T- és B-sejtek szűrődnek be a synoviális membránba. Ezek a sejtek az SF-ben is megtalálhatók, ahol nagyszámú neutrofil granulocita is kimutatható. Az RA korai fázisában a synoviális membrán kezd ráhúzódni a porcállományra. Későbbi fázisban (az ábrán: kifejlett RA) a synoviális membrán gyulladásos szövetté, az ún. pannusszá alakul át. Ez ráhúzódik a szomszédos porc- és csontterületekre és degradálja azokat. Rheumatoid synovium RA ban a synoviális fibroblasztok osztódnak, a synovium megvastagszik, új erek képződnek. Az endothelium, mely ezeket az új ereket is béleli, sajátos struktúrává, magas endotheliumú venulává (HEV) alakul (51). A HEV szerkezet specifikus 16

19 adhéziós molekulák és kemokin receptorok expressziójával elősegíti a fehérvérsejteknek az erek üregéből a synoviális szövet terébe történő vándorlását (51, 52). A synoviális membránban található T sejtek főként CD4+, érett, aktivált memória sejtek (53). Ezek mellett B sejtek, monocyták, hízósejtek, makrofágok, dendritikus sejtek, fibroblasztok és mesenchymális sejtek is közreműködnek a gyulladásban. Ráadásul számos pro és antiinflammatorikus citokin is expresszálódik a szövetben (49). A citokin mintázatban az RA ban szenvedő betegek óriási heterogenitást mutatnak, s ez eltérő megbetegedési útvonalakra utal (44). Időközben kialakul a pannus. Ez nagy mennyiségű synoviális membránsejtből áll, és ráterjed mind a porcra, mind a csontra. Az RA pannus szövete a transzformált sejtek számos jellemvonását mutatja: rákúszik a porcra és a csontra, és erodálja őket, új erek képződnek benne, sejtjeiben onkogén expresszió is megfigyelhető (54). A pannus és a porc közötti rést főként aktivált makrofágok és synoviális fibroblasztok veszik birtokba. A gyulladási mediátorok magas szintje stimulálja a mesenchymális sejtek (synoviális fibroblasztok, oszteoklasztok és kondrociták) szövetbontó mátrix metalloproteinázainak (MMP) szekrécióját, így további szövetkárosodást okoznak (49,55). Az interleukin 1 (IL 1) és a TNF stimulálják az endotheliális sejtek adhéziós molekuláinak expresszióját, és fokozzák a neutrofil granulociták toborzását az ízületbe. Ezek a sejtek elasztázt és proteázokat termelnek, melyek a porc felszíni rétegének proteoglikánjait emésztik (56). A proteoglikánok kiürülése lehetővé teszi az immunkomplexek számára, hogy precipitálják a felszíni réteg kollagénjeit (57). A kondrociták és a fibroblasztok az IL 1, TNF illetve aktivált CD4+ T sejtek stimulatív hatására fokozzák a különböző szövetbontó proteázok termelését. A proteolitikus enzimek mind a négy nagy családja (aszparagin, cisztein, szerin és metalloproteinázok) részt vesz a porcszövet normális 17

20 turn overében illetve a patológiás szövetroncsolásban. Ezek a szövetbontási útvonalak nem kizárólagosak, és igen valószínű, hogy a porcszövet alapállományának teljes lebontásában többféle útvonal, illetve a proteázok több családja is részt vesz (27). Állatmodellekben az aktivált CD4+ T sejtek stimulálják az oszteoklasztogenezist, így ízületi károsodást okozhatnak az IL 1 től, illetve a TNF tól független módon is. Újabban fontos szerepet tulajdonítanak a HMGB 1 nek (high mobility group box chromosomal protein 1) is. Ezt a citokint az aktivált monociták és makrofágok termelik és szecertálják az SF be, illetve a synoviális membránba (58,59). HMGB 1 szabadulhat fel számos sejttípus, köztük az endotheliális sejtek nekrózisa, vagy egyéb típusú károsodása során is (60). Az extracelluláris HMGB 1 hatására a makrofágok proinflammatorikus citokineket (TNF, IL 1, IL 6) termelnek (59). Ezen molekula expressziója fokozódott TNF stimuláció hatására (58). A HMGB 1 késői mediátorként hat, és hozzájárul a szisztémás gyulladás fenntartásához (59,61,62,63). Összegzésképpen elmondhatjuk, hogy a rheumatoid arthritis etiológiája mindmáig ismeretlen, bár genetikai, fertőzéses, környezeti és hormonális faktorok is előtérbe kerültek a betegség okainak kutatása során. A betegség molekuláris szinten való megértése számos okból fontos. Tudásunk alapján új modelleket dolgozhatunk ki, melyek segíthetnek több szemszögből megérteni a betegséget. A molekuláris szintű megértés alapján az orvosok elmagyarázhatják a betegnek és családtagjainak a betegség okait és tüneteit. Azonban talán a legfontosabb, hogy ez a tudás segíthet hozzá a hatékonyabb kezeléshez specifikus célmolekulák azonosításával, melyekkel szemben potenciális terápia fejleszthető ki. Osteoarthritis Az osteoarthritis (OA) az arthritisek egyik legrégebben ismert és leggyakoribb 18

21 típusa. Az ízületi porc kopása jellemzi, melyet gyakran az ízület összecsontosodása követ. Leggyakrabban a középkorú és idős embereket érinti, nőket gyakrabban, mint férfiakat. Legtöbbször a kéz, valamint a testsúly hordozásában résztvevő ízületek érintettek, mint a csípő, a térd, a lábak és a gerinc ízületei (5. ábra). 5. ábra: Az osteoarthritis megjelenése kézen (31) Az OA kialakulásának oka sokféle lehet, ami azonban leggyakrabban ismeretlen marad, ilyenkor elsődleges OA ről beszélünk. Ha ismert az ok, akkor másodlagos OA ről van szó. Bár az öregedéssel fokozódik az OA kialakulásának kockázata, ez a betegség nem elkerülhetetlen velejárója az idős kornak. Másodlagos OA kialakulásához vezethet például az elhízás. Ezen kívül sportolásból származó, baleseti, vagy bármely egyéb okból kialakult ízületi sérülés fokozott kockázati tényezőt jelent az OA kialakulása szempontjából. Szintén fontos rizikófaktor a születéstől fogva rendellenes ízület, a köszvény, a cukorbetegség és egyéb hormonális zavarok. A környezeti tényezők mellett a genetikai háttérnek is szerepe lehet a betegség megjelenésében. Míg az arthritis számos formája szisztémás betegség, addig az OA nem támad meg más szervet, kizárólag az ízületek betegsége. (18,64,65,66). 19

22 Seronegativ spondarthritis A seronegativ spondarthritis (SNSA) betegségcsoportot jelent, mely három évtizednél alig idősebb. A spondarthritisek kombinált prevalenciája az átlagpopulációban körülbelül 1 %, amely nagyságrendjét tekintve összehasonlítható az RA val (67). Ebbe a betegségcsoportba soroljuk a spondylitis ankylopoetica t (AS), a reaktív arthritiseket (ReA), az arthritis psoriatica t (AP), a Reiter kórt, valamint az idült gyulladásos bélbetegségekhez társuló spondarthritiseket. Ezen betegségek egy csoportba foglalását Moll és Wright javasolták főként klinikai adatokra támaszkodva (68). Az idesorolt betegek jellemzően nem rendelkeznek reuma faktor pozitivitással, innen a szeronegatív elnevezés. Az ízületek és a gerinc egyaránt érintettek lehetnek. E betegségek kialakulásának feltehetőleg genetikai alapja van, mivel ezek a kórképek a 70 es évek elején felfedezett HLA B27 génnel mutatnak asszociációt, valamint a betegségek családi halmozódása is gyakori (18). Intenzív kutatások ellenére a HLA B27 szerepe a betegség patogenezisében ismeretlen maradt, bár számos elméletet állítottak fel az összefüggés magyarázatára (69). A kutatások azt igazolták, hogy a HLA B27 génje mellett még legalább négy további genetikai marker mutat asszociációt a betegségcsoporttal (70). Az SNSA betegségcsoport további közös jellemzői, hogy asszimmetrikus eloszlásban, főként az alsó végtagi nagy ízületeken lép fel gyulladás, és radiológiai úton kimutatható sacroileitis, szalagmeszesedés, gyulladásos reaktív csontjelenségek figyelhetők meg a gerincen. Az ízületi érintettség mellett jellemzőek a bőr és nyálkahártyatünetek és az iritis. A betegség gyakran spondylitis ankylopoeticahoz asszociált szívmanifesztációkat is mutat. Az RA val szemben rheumatoid csomó nem fordul elő. Számos tanulmány szolgáltat indirekt bizonyítékot arra nézve, hogy a spondyloarthopathiáknak immunmediált patogenezise van. Reaktív arthritisben 20

23 szenvedő betegek nagy részének véréből és SF éből aktivált T limfocitákat mutattak ki (71). Gyulladt sacroilialis ízületből biopsziával vett mintán egyértelműen kimutathatóak különféle proinflammatorikus citokinek, például a TNF (72) fokozott expressziója, és a betegség nagy mértékben javul anti TNF kezelés hatására (73). A synoviális folyadék összetevőinek változása gyulladásban. Az RA markerei és prediktorai Prediktorok kutatásának szükségessége rheumatoid arthritisben A mechanizmus, amely kivédi a fertőzést és megvéd a malignus transzformációtól ugyanaz, mint amely RA ban a szövetet károsítja. A rheumatoid arthritisben szenvedő egyén esetében ezek a szövetkárosító folyamatok az egészséges szövetet veszik célba kórokozó mikroorganizmusok, illetve malignus sejtek helyett. Az RA diagnózisának korai felállítása és a betegség kimentelének megbízható előrejelzése a korai arthritisszel foglalkozó klinikák legfontosabb feladata a betegség kezdeti szakaszában (74). Az RA lefolyása igen eltérő lehet az egyes betegek esetén, az enyhe, a kezelésekre jól reagáló formától az agresszív, a klasszikus terápiás beavatkozásokra nem reagáló formáig. Meglehetősen gyakori a porc komoly károsodásának és a betegség extra artikuláris manifesztációjának korai megjelenése, mely megrövidítheti a beteg életét (75). Azok a betegséget befolyásoló gyógyszerek és új biológiai anyagok egy része, amelyeket bevezettek a klinikai gyakorlatba, képesek csökkenteni a betegségnek mind a klinikai, mind pedig a laboratóriumi tüneteit, illetve gátolni a porckárosodás kialakulását. Ezért ezeket a gyógyszereket korán és megfelelő dózisban kell adni a betegnek. Azonban tekintettel arra, hogy a hibásan alkalmazott agresszív kezelés deformitásokhoz és rokkantsághoz vezethet, illetve ezen gyógyszerek 21

24 költségei igen magasak, szükséges olyan paramétereket találni, melyek hatékonyan jelzik előre az agresszív kórlefolyást. Mindez megmagyarázza, miért került az érzékeny és specifikus prognosztikus faktorok keresése a kutatások középpontjába. Mivel a synoviális membrán a gyulladás fő helye RA ban, nagy szükség van olyan módszerekre is, melyekkel a synoviális szövetben közvetlenül kimutathatók és mérhetők egyes citokinek, kemokinek és szövetbontó enzimek, s ezek alapján a betegség progressziója nyomon követhetővé válik. Mindazonáltal igen nehéz továbblépni az RA ban szenvedő betegcsoportok kórlefolyásának prediktálásától az egyes betegek esetének előjelzésére. Genetikai markerek Az RA családi halmozódása régóta ismeretes. A rheumatoid arthritist kiváltó fertőző ágens azonosítására irányuló kitartó kutatások mindez idáig nem jártak eredménnyel. Egypetéjű ikreken végzett konkordancia vizsgálatok azt jelezték, hogy a nem érintett ikrek több, mint egyharmada idővel érintetté válik. Ráadásul a kétpetéjű ikrek és az érintett szülők utódai esetén tapasztalható kissé emelkedett prevalencia arra utal, hogy a betegségre való fogékonyság egy polimorf genetikai komponenset is magában foglalhat. A szerológiai tipizálás elérhetővé válásával megállapították, hogy az RA a fő hisztokompatibilitási génkomplex II. osztályához tartozó HLA DR4 gyel mutat asszociációt. A betegek közel 75% a hordoz egy specifikus aminosav szekvenciát a HLA DR molekula láncában, a 71. pozíció közelében, az úgy nevezett "shared" (közös) epitópot (77). Számos tanulmány tudósít ezen allélek és a betegség lefolyásának hevessége közötti összefüggésről (78,79). A "shared" epitóp az MHC II molekula antigénkötő zsebében helyezkedik el, így egy arthritogén peptid kötőhelye lehet, vagy 22

25 6. ábra: A "shared" epitóp elhelyezkedése az MHC II molekulában (76) Az - és a -láncok közösen alkotják az MHC II molekula antigén-kötő zsebét. A "shared" epitópként ismert szekvencia a -láncban található (sötéttel jelzett terület). A "shared" epitópot RA-val asszociált gének betegséggel kapcsolt allélei kódolják (pl. HLA-DR4). A "shared" epitóp egy arthritogén peptid kötőhelye lehet, vagy maga szolgálhat olyan autoantigénként, mely T-sejteket aktivál. maga szolgálhat autoantigénként, mely T sejtet aktivál (6. ábra) (76). Az is kiderült, hogy ez a szekvencia az EBV gp 100 és az E. coli dnaj géntermékeiben is megtalálható, így felvetődik annak a lehetősége, hogy ezen szekvencia alapvető lehet az EBV vagy E. coli fertőzés utáni immunreakció beindításában, illetve később az RA kifejlődésében. A molekuláris mimikri elmélete szerint ugyanis a fertőzést követően ezen epitóp elleni immunválasz a gazdaszervezet MHC II fehérjéjével is kapcsolatba lép keresztreakció révén. A "shared" epitóp allélek és az ízületi károsodás kifejlődése közötti 23

26 összefüggésre hatással lehet az aggresszív betegséget befolyásoló kezelés megkezdése a betegség korai stádiumában (80). Immunológiai markerek Az ellenanyagok számos autoimmun betegség esetén előjelzik a betegség kimenetelét. Ezzel szemben RA ban nem ilyen egyértelmű az összefüggés az egyes ellenanyagok jelenléte és a betegség kimenetele között. Számos tanulmány vizsgálta az egyes ellenanyagok jelenlétét és prediktív szerepét. Úgy tűnik, hogy az egyes ellenanyagok külön külön történő kimutatásával szemben több ellenanyag jelenlétének egyidejű vizsgálata fokozza a betegség diagnózisának szenzitivitását és specificitását, korai RA esetén lehetőséget teremthet a betegség lefolyásának predikciójára (81). Reumafaktor A reumafaktor (RF) az IgG molekula Fc fragmense ellen termelődő ellenanyag. A hagyományos technikákkal (agglutináció és immunoturbidimetriás eljárásokkal) elsősorban IgM osztályú RF eket mutattak ki, de radioimmunoassay illetve ELISA technikával mindegyik nagy immunoglobulin osztályhoz (IgM, IgG, IgA) tartozó RF kimutatható (82). Az RF a legtöbb esetben kimutatható RA ban szenvedő betegek véréből, de esetenként egészségesek szérumában is megtalálható, és más betegségek esetében is kimutatható RF a betegek szérumában (83,84). Sőt, a bizonyítottan RF pozitív egyének kisebbségében mutatható ki RA radiológiai vagy/és klinikai jelenléte (85). Más oldalról nézve azonban az RF megjelenése gyakran évekkel megelőzi a RA kialakulását (86,87). Egy felmérés szerint az RF pozitív egészséges egyéneknek 40 szeres esélye van arra, hogy megbetegedjenek RA ban az elkövetkezendő 10 évben, mint az RF negatív egyéneknek (83). 24

27 Az RF magas szintje hevesebb betegség lefolyással párosul (88,89). Ez az immunkomplex lerakódása és a komplementrendszer aktivációja miatt fokozott gyulladás eredménye lehet, vagy egyszerűen erőteljesebb autoimmun válaszra is utalhat. Bár egyes tanulmányok nem találták az RF et prediktívnek az erózióra nézve (90), de ebben az összefüggésben meg kell jegyeznünk, hogy az RF pozitív betegek a kezelések során szeronegatívvá válhatnak és fordítva (91). Összességében elmondhatjuk, hogy az RF negatív betegeken általában előnyösebb a betegség lefolyása és kimenetele, mint az RF pozitív egyének esetében. Egyéb marker ellenanyagok A keringő RF jelenléte illetve hiánya alapján sokáig a szeronegatív és a szeropozitív kategóriákba soroltuk a krónikus perifériás arthritiseket (92). Azonban széles körben felismerték, hogy az RF tesztelése túlságosan aspecifikus ahhoz, hogy ez alapján azonosítsák az RA ban szenvedő betegeket (92,93). Többféle ellenanyagot mutattak ki és teszteltek RA ban szenvedő betegek esetén. Közülük vélhetőleg a citrullinált antigéneket (SA, fillagrin, keratin és CCP) felismerő ellenanyagok a legspecifikusabbak RA ra nézve, és ezek a betegség korai szakaszában is kimutathatóak (94). Újabban azt indítványozzák a szeropozitív RA megjelölést kiterjesztését azokra az esetekre is, amelyekben az RA ra jellemző újabban megismert marker ellenanyagok valamelyike előfordul. Anti fillagrin ellenanyagok (AFA) Az anti fillagrin ellenanyagok (AFA) RA ban a legspecifikusabb szerológiai markerek, melyek a hámszövetekben citrullint tartalmazó epitópokat ismernek fel. Az AFA k specificitása, olyan paraméterekkel való asszociációja, amelyek a betegség aktivitására és súlyosságára utalnak, valamint a betegség kialakulásának igen korai 25

28 stádiumában való megjelenésük arra utal, hogy szerepet játszhatnak a betegség patofiziológiájában. Ezt a feltevést megerősíti az AFA prognosztikus értéke, valamint az, hogy fillagrin ellenes B sejtes autoimmunitást az RA ban szenvedő betegek kétharmadában ki tudtak mutatni (95). Az AFA t eredetileg "anti keratin ellenanyagok" (AKA) néven írták le (96) Azonban kiderült, hogy ezek az ellenanyagok a fillagrin, a citokeratin filamentumokat aggregáló fehérje semleges / savas izoformáját ismerik fel az epidermiszben (97). Az anti perinukleáris faktort (APF (98)) szintén igen specifikusnak és a betegségre még szenzitívebbnek találták, mint az AKA t (99). Az APF is profillagrin változatokat ismer fel a humán nyálkahártya felszíni keratinocitáiban (100). Mára felismerték, hogy az RA ra specifikus anti fillagrin ellenanyagok családjának az AKA és az APF két olyan alcsaládja, melyek szubsztrátjai átfednek. Az AFA célpontjainak további tanulmányozása során kiderült, hogy ezek olyan poszttranszlációsan módosult fehérjék, melyekben az argininek citrullinná módosultak (101,102, 7. ábra). 26

29 7. ábra: Citrullinált fehérjék rheumatoid arthritisben (102) A: Citrullin képződése argininből a PADI enzim hatására B: A harmadlagos szerkezet változása annál erőteljesebb, minél több arginin citrullinálódik. A citrullinált molekula antigenikus tulajdonsága megváltozik, bemutatódik a Tsejtnek, mely stimulálja a B- sejtek anti-citrullinált peptid ellenanyag (a-cit-pepab) termelését. C: A harmadlagos szerkezet változása a citrullinizáció hatására Az AFA mindig megjelenik az RA klinikai tüneteinek megjelenése előtt (103,104, 105). Jelenléte és titere összefügg a betegség aktivitásával és súlyosságával (106,107, 108). Az AFA t a rheumatoid pannus plazmasejtjei termelik (109) RA ban az AFA fő célpontja a reumatoid synoviális membránban lerakódó fibrin deiminált formája. Úgy tűnik, hogy a deiminált fibrinnel szemben kialakuló autoimmunitás az RA patogenezisének kritikus lépése (110). Bár mind az AKA, mind pedig az APF igen specifikus RA ra nézve, használatuk 27

30 mégsem terjedt el széles körben, mivel technikai nehézségek adódnak a szubsztrát standardizálásával, és az immunfluoreszcens tesztek kiértékelése is szubjektív természetű (111). A harmadik autoantigén / autoantitest rendszer, melyről újabban leírták, hogy specifikus az RA ra, nem más, mint az úgy nevezett anti Sa rendszer. Az anti Sa ellenanyag antigénje ismeretlen, és nagy mennyiségben van jelen a méhlepény szövetében illetve a rheumatoid synoviumban (112). Az APF hez és az AKA hoz hasonlóan ezen ellenanyag molekuláris célpontjai feltételezhetően szintén deiminált (citrullinált) fehérjék (113), így ez a rendszer is az AFA k családjának része (95). Az olyan betegeknél, akik már hosszabb ideje szenvednek RA ban szignifikáns összefüggést találtak az anti Sa jelenléte, illetve az RF, AKA, APF valamint a HLA DRB1*04 vagy *01 között (114). Ugyanakkor az anti Sa ellenanyag jelenléte nem mutat asszociációt sem az RF, sem pedig az anti RA33 ellenanyag jelenlétével (115). Megoldatlan kérdés azonban, hogy vajon a fibrin deiminációja a synoviális szövetben a reumatoid gyulladásra specifikus folyamat e, mely peptidil arginin deimináz enzim vagy enzimek érintettek, illetve hogy mely sejttípus(ok) szintetizálják és szecernálják az enzim(ek)et. Ciklikus citrullinált peptid ellenes ellenanyag (anti CCP) Az anti CCP k az ellenanyagok olyan heterogén csoportját alkotják, melyek a citrullinált molekula különböző epitópjait ismerik fel, s így minden beteg szérumában különböző típusa található ennek az ellenanyag molekulának (116). Egyes tanulmányok szerint az anti CCP ellenanyag szintje korrelál az APF, AKA illetve az RF szintjével, de nem teljesen fed át velük, így új diagnosztikai markere lehet az RA nak (117). Sikerült asszociációt találni az anti CCP szintje illetve az ízület 28

31 radiológiai elváltozásai között, ugyanakkor független prediktora a radiológiai károsodásnak és a betegség kialakulásának (118). A gyulladási folyamatra utaló markerek A szövetkárosodás bármely formája gyulladáshoz vezet, melyre a szervezet akut fázis reakcióval válaszol. E folyamat során számos egyéb szisztémás válaszon (mint pl. a láz, leukocitózis, izom proteolízis) kívül a szérumban megjelennek az ún. akut fázis fehérjék, melyek mérése a gyulladási folyamat jelenlétére és kiterjedtségére utalhat (119). Vörösvértest süllyedés (ESR) Az ESR mérése széles körben használt a klinikai gyakorlatban. Reumatológiai megbetegedéseknél a betegség aktivitásának indikátoraként használják. C reaktív protein (CRP) A CRP mérésének prognosztikus értékével becsülik meg általában az RA közeljövőben történő változását, jelenleg ez a legelterjedtebben használt marker a betegség kifejlődésének monitorozására a klinikai gyakorlatban. A CRP szint jól korrelál a betegség klinikai aktivitásával, radiológiai fejlődésével illetve a kezelésekre adott válasszal (120, 121). 29

32 Érképződés A betegség során a synoviális térben jelenlévő sejtek száma ugrásszerűen növekszik, ezen sejtek szükségleteinek biztosítására új erek képződnek, angiogén faktorok (pl. VEGF) jelennek meg. Angiogenezis hiányában a betegség nem terjed tovább, a synoviális sejtek nem képesek a túlélésre, így nem károsítják a szövetet. Egyes megfigyelések szerint a VEGF szérumban mérhető szintje korrelál a betegség aktivitásával (122,123). Az ízületből származó markerek A rheumatoid arthritis legjellemzőbb tünete az ízületek károsodása. A porc alapállomány bontásával párhuzamosan a porcból felszabaduló komponensek mennyisége növekszik a beteg vérében, s ez a betegség előrehaladásának jó markere lehet. Számos, a porcmátrix molekulát tanulmányoztak ebből a szempontból, többek között a II. típusú kollagént (CII) (9,10,11,12,13), a III. típusú prokollagén aminoterminális propeptidjét (PIIINP) (124,125,126,127), az I. típusú kollagén karboxiterminális keresztkötött telopeptidjét (128,129,130), az aggrekánt (131,132,133), a keratán szulfátot (134,135), a human cartilage glycoprotein 39 et (16,136,137,138, 139,140), a cartilage oligomeric matrix proteint (COMP) (133,141), a hialuronsavat (HA) (133,142,143). Az ízületek károsodása RA ban enzimatikus folyamat eredménye, melyben a szakirodalom a mátrix metalloproteinázok (MMP) szerepét emeli ki, de fontos szerepet töltenek be a cisztein proteázok, a szerin proteázok, valamint a glükozidázok is. Mechanikai károsodás és szabad gyökök jelenléte szintén fokozza a degradatív folyamatot. A porckárosító enzimek mennyiségének vizsgálata szintén utalhat a betegség előrehaladottságára; a szérumban illetve a synoviális folyadékban mérhető 30

33 enzimkoncentráció és az enzimek egymáshoz viszonyított mennyisége prediktálhatja a betegség enyhébb vagy súlyosabb formáját. A porckárosodásban szerepet játszó proteázok Mátrix metalloproteinázok (MMP) Az MMP enzimcsalád az egészséges és patológiás szövetátépítésben vesz részt. Hagyományosan az MMP kről azt gondolták, hogy a sejtközötti állomány (extracelluláris mátrix ECM) komponenseit hasítják. Az ECM et hosszú ideig passzív szövetalkotónak tekintették, melynek szerepe a sejtek tartása, mechanikai támaszték, s ennek megfelelően az MMP k szerepét sem vélték egyébnek, mint az ECM átépítése a homeosztázis fenntartására, illetve a sejtvándorlás elősegítésére. Ma azonban már ismert, hogy az ECM növekedési faktorokat, azokat megkötő fehérjéket, egyéb bioaktív molekulákat is tartalmaz, illetve sejtfelszíni molekulák kötőhelyeit, melyek közül számos csak proteolízist követően válik hozzáférhetővé. Ezzel párhuzamosan megváltozott az MMP kről alkotott képünk is: ma már tudjuk, hogy számos sejtfelszíni illetve szolubilis molekula hasításával befolyásolják a sejtek működését. Kulcsszerepet játszanak az egészséges és malignus sejtek migrációjában. Szabályozó funkciójuk is ismert, részben az enzimkaszkádban betöltött szerepük alapján, részben pedig mátrixproteinek, citokinek, növekedési faktorok és adhéziós molekulák feldolgozása révén, melynek során olyan fragmentumokat hozhatnak létre, melyek biológiai hatást fokoznak vagy csökkentenek (144). Az MMP enzimcsalád tagjai cink és kalcium dependens endopeptidázok, melyek hatásukat extracellulárisan fejtik ki (145). Ma 23 humán MMP ismert, de ez a szám folyamatosan növekszik. Számos MMP gént azonosítottak gerinctelen állatokban, sőt növényekben illetve zöld algákban is találtak MMP t (144). 31

34 Szubsztrátok és nevezéktan A korai szakirodalom azt sugallta, hogy minden egyes MMP nek van egy meghatározott szubsztrátja, ez vezetett az MMP k szubsztrát központú elnevezéséhez. Újabban azonban felismerték, hogy az egyes MMP k számos szubsztrát emésztésére képesek, az egyedi MMP k szubsztrátjai átfedhetnek. Így aztán minden MMP kapott egy számot. Azonban ebben a rendszerben is vannak hiányosságok, például nem létezik MMP 4, 5 és 6, mivel az enzimaktivitáshoz nem rendelhető egyedi géntermék, illetve a MMP 18 Xenopus enzim. Az ismert MMP ket foglalja össze az 1. táblázat. A MMP ket főként a monociták / makrofágok szecernálják. Ezek az enzimek képesek számos, a sejtközötti állományt felépítő fehérje, így a kollagének, proteoglikánok, fibronektin és laminin bontására (146). A MMP ket négy csoportba soroljuk: kollagenázok, sztromelizinek, zselatinázok és membrán típusú (membrane type MT ) MMP k (1. táblázat). 32

35 Fehérje neve Alternatív név Kollagén szubsztrát Nem kollagén ECM szubsztrát Nem struktúr ECM szubsztrát MMP 1 Kollagenáz 1 I, II, III, VII, VIII, X. típusú Aggrekán, kazein, nidogén, szerpinek, 1 antikimotripszin, 1 kollagén, zselatin verzikán, proteoglikán link protein, antitripszin, 1 proteináz inhibitor, tenaszcin C IGF BP3, IGF BP5, IL 1, L szelektin, ovosztatin, rekombináns TNF peptid, SDF 1 MMP 2 Zselatináz A I, IV, V, VII, X, XI, XIV. Aggrekán, elasztin, fibronektin, Aktív MMP 9, aktív MMP 13, FGF típusú kollagén, zselatin laminin, nidogén, proteoglikán link RI, IGF BP3, IGF BP5, IL 1, protein, verzikán rekombináns TNF peptid, TGF MMP 3 Sztromelizin 1 II, IV, IX, X. típusú Aggrekán, kazein, dekorin, elasztin, 1 antikimotripszin, 1 proteináz kollagén, zselatin fibronektin, laminin, nidogén, inhibitor, antitrombin III, E perlekán, proteoglikán link protein, kadherin, fibrinogén, IGF BP3, L verzikán szelektin, ovosztatin, pro HB EGF, pro IL 1, pro MMP 1, pro MMP 8, pro MMP 9, pro TNF, SDF 1 MMP 7 Mátrilizin 1, kollagenáz MMP 8 Kollagenáz 2 neutrofil I, II, III, IV, V, X. típusú Aggrekán, kazein, elasztin, enaktin, b4 integrin, dekorin, defenzin, E kollagén laminin, proteoglikán link protein kadherin, Fas L, plazminogén, pro MMP 2, pro MMP 7, pro TNF, transzferrin, szindekán I, II, II, V, VII, VIII, X. Aggrekán, laminin, nidogén típusú kollagén, zselatin 33 2 antiplazmin, pro MMP 8

36 Fehérje neve Alternatív név Kollagén szubsztrát Nem kollagén ECM szubsztrát Nem struktúr ECM szubsztrát MMP 9 Zselatináz B IV, V, VII, X, XIV. típusú Fibronektin, laminin, nidogén, CXCL5, IL 1, IL 2R, kollagén proteoglikán link protein, verzikán plazminogén, pro TNF, SDF 1, TGF MMP 10 Sztromelizin 2 III, IV, V. típusú kollagén, Fibronektin, laminin, nidogén zselatin MMP 11 Sztromelizin 3 Laminin 1 antikimotripszin, 1 proteináz inhibitor, IGF BP1 MMP 12 Makrofág metalloelasztáz Elasztin plazminogén MMP 13 Kollagenáz 3 I, II, III, IV, V, IX, X, XI. Aggrekán, fibronektin, laminin, Plazminogén aktivátor 2, pro típusú kollagén, zselatin perlekán, tenaszcin MMP 9, pro MMP 13, SDF 1 MMP 14 MT1 MMP I, II, III. típusú kollagén, Aggrekán, dermatán szulfát v 3 integrin, CD 44, gciqr, pro zselatin proteoglikán, fibrin, fibronektin, MMP 2, pro MMP 13, pro TNF laminin, nidogén, perlekán, tenaszcin, SDF 1, szöveti transzglutamináz vitronektin MMP 15 MT2 MMP I, II, III. típusú kollagén, Aggrekán, fibronektin, laminin, Pro MMP 2, pro MMP 13, szöveti zselatin nidogén, perlekán, tenaszcin, transzglutamináz vitronektin MMP 16 MT3 MMP I, III. típusú kollagén, Aggrekán, kazein, fibronektin, Pro MMP 2, pro MMP 13 zselatin laminin, perlekán, vitronektin MMP 17 MT4 MMP zselatin Fibrin, fibronektin 34 Pro MMP 1, pro MMP 8, pro MMP 10

37 Fehérje neve Alternatív név MMP 19 RASI 1 MMP 20 Enamelizin Kollagén szubsztrát Nem kollagén ECM szubsztrát Nem struktúr ECM szubsztrát I, IV. típusú kollagén, Aggrekán, kazein, fibronektin, zselatin laminin, perlekán, vitronektin Aggrekán, amelogenin, porc oligomer protein MMP 21 1 antitripszin MMP 23 CA MMP zselatin MMP 24 MT5 MMP zselatin MMP 25 Leukolizin, MT6 MMP IV. típusú kollagén, zselatin Fibrin, fibronektin Pro MMP 2 MMP 26 Matrilizin 2, endometáz IV. típusú kollagén, zselatin Kazein, fibrinogén, fibronektin 1 proteináz inhibitor MMP 28 Epilizin Kondroitin szulfát, dermatán szulfát, Pro MMP 2, pro MMP 13 fibronektin kazein 1. táblázat: A humán MMP k rendszere (144). 35

38 Fiziológiás és patológiás szerep Fiziológiás állapotban a kötőszövetben termelődő MMP k fontos szerepet játszanak az egyedfejlődés során a szövetek újjáépülésében, a menstruációs ciklusban illetve a szöveti károsodást követő javítási folyamatokban. Az MMP k nyilvánvaló szövetkárosító képessége számos betegség kutatása során előtérbe kerül, ahol kötőszöveti leépülés történik (például daganatok, rheumatoid arthritis, periodontális betegségek). Az MMP k fő forrásai a leukociták, részben a makrofágok. A leukociták által termelt MMP k kulcsszerepet játszanak abban, hogy a fehérvérsejtek képesek legyenek elhagyni az ereket és a szövetekbe áramoljanak. Ezzel analóg módon a metasztatikus daganatsejtek is MMP ket használnak, hogy a szövetekből ki illetve belépjenek, és vérellátásukat megoldják (147). Az MMP k szerepe arthiritisben A porckárosodás elsődleges oka arthritisben az, hogy aktív proteázok emésztik a porc két legfontosabb alkotóját: a kollagéneket és a proteoglikánokat. Az MMP k neutrális ph n hasítják legaktívabban a szöveti makromolekulákat (148). Ezen molekulák hasítása által egyrészt a porc stabilitása csökken, másrészt olyan terminális neoepitópok jönnek létre, melyek antigén tulajdonságai eltérnek az intakt fehérjében elhelyezkedő azonos aminosav szekvenciáétól (149). Míg a proteoglikánok lebomlása reverzibilis folyamat, a kollagén emésztődése a sejtközötti állomány visszafordíthatatlan leépüléséhez vezet, ezért a kollagenázok tűnnek a folyamat kulcsenzimeinek (150). Ma még vitatott, hogy pontosan mely MMP k felelősek a kollagén hasításáért az arthritis különböző formái esetében. OA és RA esetén nyilvánvaló különbség van a kollagén anyagcseréjében, tekintettel a korai változások helyének különbözőségére. Ez azt is jelentheti, hogy a kollagén hasításában 36