A mesenchymalis őssejtek terápiás alkalmazásának lehetőségei és korlátai sclerosis multiplexben

Átírás

1 A mesenchymalis őssejtek terápiás alkalmazásának lehetőségei és korlátai sclerosis multiplexben Uher Ferenc Országos Vérellátó Szolgálat, Őssejtbiológia, Budapest

2 A mesenchymalis ős vagy stroma sejtek I. HSC MSC

3 A mesenchymalis ős vagy stroma sejtek II. Agy Thymus Tüdő Csontvelő Szívizom Máj Hasnyálmirigy Zsírszövet Lép Vese Vázizom Nagy és kis erek, kapillárisok

4 Csontvelő Zsírszövet Whartonkocsonya

5 Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells Plasticadherent under standard culture conditions. Express CD105, CD90 CD73 and CD44, and lack expression of CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79 or CD19 and HLADR. Must differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro. CD44 CD73 CD90 CD45 Dominici et al.: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006;8(4):315. Osteo Adipo Chondro

6 Mesenchymalis ős és elődsejtek izolálása Csontvelő Zsírszövet 2500 rpm, 20 perc 600 rpm, 8 perc Kollagenáz, 30 perc, 37 C 1200 rpm, 10 perc Gradiens centrifugálás Mosás Emésztés Mosás Mononukleáris sejtfrakció SVF frakció ~0,0010,002% ~1% További átoltások Első átoltás és szélesztés (1:3 1:5) Növekedés TripszinEDTA MSC kultúra (heterogén) Konfluens stroma tenyészet Primer kultúra (adherens sejtek)

7 Plaszticitásuk MSC CFUF StroCFU Vérképzést támogató stroma Osteoblast OsteoCFU Chondrocyta ChondroCFU Adipocyta AdipoCFU Tendocyta Idegsejt, gliasejt, bsejt, májsejt Nem ortodox plaszticitás Myoblast Szívizomsejt Ortodox plaszticitás

8 Csont Adipocyták Alizarin vörös/giemsa, x10 Olajvörös/metilénkék, x20

9 Az MSCk gyulladásgátló és immunszuppresszív aktivitása Bsejt Sejtosztódás Tsejt Apoptózis Fas Kinurenin NO FasL Sejtsejt Szolubilis faktorok kölcsönhatások Trp TNFa PGE2; inos Sejtosztódás B7H1 (PDL1) TNFR1 IDO IFNg Idolamin 2,3dioxygenáz enzim; LPS B7H4 Nitrogénmonoxid; FasL IFNgR TLR4 Galektin1; MSC Notchligandum(ok) IL10, TGFb, HGF; PGE2 Regulátor Tsejtek (Treg) indukciója. COX2 PGE2 Gyulladás Egyéb HLAG; Hfaktor. TGFb Treg sejtek EP2/4R Sejtsejt kölcsönhatás EP2/4R NKsejt IL10 Dendritikus sejt Macrophag Granulocyta

10 Az MSCk M2 (regulátor) irányú MΦ polarizációt indukálnak Klasszikus úton aktivált M MHCII, B7, inos, IL12, TNFa, APC, Th1 válasz Alternatív úton aktivált M MHCII, B7, inos, IL12, TNFa, IL10, Argináz, APC, Sebgyógyulás, Regeneráció M1 TAM M2 MSC Regulátor M MHCII, B7, inos, IL12, TNFa, IL10, APC, Th2 válasz, Gyulladásgátlás

11 Mesenchymalis őssejtterápia Az MSCk hamar felkeltették mind a kutatók, mind a gyakorló orvosok Az MSCk figyelmét: elsősorban olyan betegségek kezelése során lehetnek ígéretesek, amelyekben egyidejűleg van szükség regenerációra (az elpusztult sejtek/ szövetek viszonylag pótlására) könnyen és a károsodott hozzáférhetők területen (csontvelő, kialakuló zsírszövet, gyulladás, köldökzsinór), illetve jól szaporíthatók immunválasz in vitro kultúrában csökkentésére., csak minimális mértékben immunogének (allogén transzplantáció), multipotensek (plaszticitás), in vivo a szöveti sérülés/gyulladás helyére vándorolnak, jelentős regeneratív képességgel rendelkeznek (trofikus faktorok), gátolják az apoptózist és a fibrózist, elősegítik új kapillárisok képződését, mitochondriumokat és mikrovezikulumokat jutatnak a károsodott sejtekbe, immunszuppresszív és gyulladásgátló aktivitással rendelkeznek (szolubilis faktorok és sejtsejt kölcsönhatások).

12 A mesenchymalis őssejtek klinikai alkalmazása Csont/porc betegségek Szív és érrendszeri betegségek Neurológiai betegségek GVHD/Transzplantációs tolerancia Máj Diabetes Gastrointestinalis betegségek Tüdő Autoimmun betegségek Egyéb Fázis III Fázis II/III Fázis II Fázis I/II Fázis I Autológ Allogén (felnőtt) Allogén (perinatális) Regisztrált klinikai vizsgálatok Klinikai vizsgálatok (%) A jelenleg folyó klinikai trialok általában túl kicsik (fázis I/II) és nagyon sokféle (>50) betegséget érintenek. Az MSCk klinikai alkalmazása rövid távon biztonságos; hosszú távon??? Terápiás hatékonyságuk viszont messze elmarad (fázis III) a preklinikai állatkísérletek alapján remélttől.

13 SM/EAE

14 A sclerosis multiplex 1868, Jean Martin Charrot (Salpetrière, Párizs) A központi idegrendszer autoimmun (?) megbetegedése, amelynek következtében gyulladásos léziók (gócos demyelinisatio) jönnek létre az agy és a gerincvelőben. Myelinhüvely (velős hüvely) Hegszövet

15 Klinikai tünetek Lefolyása Relapsus / remisszió (RRSM) Szekunder progresszív (SPSM) Demyelinisatio a fehérállományban Demyelinisatio a szürkeállományban Axon károsodás Idő (évek) Atrofia Váltakozó remissziók és relapsusok (RRMS) (8590%) Progrediáló (PPMS) Krónikus (jóindulatú?) Centrális vs. perifériás (GuillainBarré syndroma)?

16 A klinikai kép Immunszuppresszív kezelés, gyulladásgátlók

17 Immunválasz Gyulladás a központi idegrendszerben Neurodegeneráció Immunválasz Neurodegeneráció Gyulladás a központi idegrendszerben

18 EAE experimentális autoimmun encephalomyelitis 1888, Louis Pasteur, Párizs 1933, Thomas Rivers (Rockefeller Institute, New York)

19 EAE experimentális autoimmun encephalomyelitis egérben Az egér EAE indukciója során alkalmazott peptid antigének 0 egészséges állat, nincs tünet; 1 bénult farok; 2 gyengülő hátsó lábak vagy 1 béna hátsó láb; MBP myelin basic protein; PLP proteolipid protein; MOG myelinoligodendrocyte glycoprotein. 3 mindkét hátsó láb bénult; 4 gyengülő mellső lábak vagy 1 béna mellső láb; 5 minden végtag bénult vagy elhalálozott állat. Peptid Beltenyésztett egértörzs Encephalitogénszekvencia

20 Az EAE mesenchymalis őssejtterápiája Klinikai score 5 n = MSC (2x10 6 sejt/állat ip) Idő (napok) MOG 3555 CFA Pertussis toxin Pertussis toxin

21 A mesenchymalis őssejtek hatása a lépsejt populációk megoszlására EAEben CD4 % pozitív sejt CD45R (B220) % pozitív sejt CD11b % pozitív sejt CD8 30 Gr Nap Kontroll EAE EAE MSC Nap Nap

22 A mesenchymalis őssejtek gátolják az antigénbemutatást és a Tsejtek osztódását a lépben 3 Hthymidin felvétel (cpm/kultúra) Kontroll APC EAE MSC APC Kontroll T sejt: EAE T sejt: EAE MSC T sejt: MOG peptid: EAE APC

23 Relatív sejtszám Relatív sejtszám Relatív sejtszám A mesenchymalis őssejtek gátolják a CD4 T lymphocyták felszaporodását a gerincvelőben 17. nap 22. nap EAE EAE MSC EAE EAE MSC 12,36 % 8,34 % 6,52 % 3,14 % 8,97 x10 6 5,44 x ,37 % 10,20 x10 6 8,13 % 6,36 x10 6 5,52 % 3,85 % Fluoreszcencia intenzitás Fluoreszcencia intenzitás Kontroll 2,07 % 4,67 x10 6 Fluoreszcencia intenzitás

24 A mesenchymalis őssejtek gátolják a demyelinizációt EAE EAE MSC Kontroll H&E festés (a nyilak a gyulladásos gócokat jelölik) Demyelinizáció (Luxol Fast Blue jelölés)

25 ÖSSZEFOGLALÁS A mesenchymalis őssejtek hatása az EAE progressziójára kettős: Perifériás (a lépben): mérséklik a gyulladáskeltő (CD11b és Gr1 pozitív; monocyta/mφ és granulocyta) sejtek beáramlását; gátolják a CD45R (B220) pozitív B és a CD8 pozitív Tsejtek arányának csökkenését; gátolják az antigénbemutatást és a MOG 3555 specifikus T lymphocyták proliferációját; Centrális (a gerincvelőben): gátolják a CD4 pozitív Tsejtek beáramlását és/vagy osztódását; mérséklik a demyelinizációt és/vagy segítik a remyelinizációt; csökkentik a gyulladást??? Hegyi Beáta; Országos Vérellátó Szolgálat, Őssejtbiológia MSC mikroglia kölcsönhatás in vitro! Madarász Emília és Környei Zsuzsanna; MTAKOKI, Idegi Sejt és Fejlődésbiológia Kutatócsoport Kovács Krisztina és Ferenczi Szilamér; MTAKOKI, Molekuláris Neuroendokrinológia Kutatócsoport

26 Consensus Report of the International MSCT Study Group The rationale for MSC transplantation in MS MSC transplantation: preliminary clinical experience in MS New perspective for the exploitation of MSC in MS: an international consensus Study design Inclusion criteria Exclusion criteria Mesenchymal stem cell product Study protocol Treatment outcomes Multiple Sclerosis 16(4): (2010) Mark S. Freedman, MSc, MD, FAAN, FRCPC, Professor of Medicine (Neurology), University of Ottawa, The Ottawa Hospital, Ottawa, Canada Antonio Uccelli, MD, Head MS Clinic & Neuroimmunology Unit, Department of Neurosciences, Ophthalmology and Genetics, University of Genoa, Genoa, Italy Amit BarOr, MD, FRCPC, Associate Professor, Francesco Frassoni, MD, Director, Stem Cell and Cell Therapy Centre, Ospedale San Martino, Genova, Italy Jacques Galipeau, MD, FRCPC, Associate Professor of Medicine and Oncology, Sir Mortimer B Davis Jewish General Hospital & Lady Davis Institute for Medical Research, McGill University, Montreal, QC, Canada Dimitrios Karussis, MD, PhD, Professor, Head of MS Center Hadassah, Hadassah Hebrew University, Ein Karem, Jerusalem, Israel Katarina LeBlanc, MD, PhD, Professor, Karolinska Institutet, Division of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Stockholm, Sweden Neil Scolding, FRCP, PhD, Professor, University of Bristol Institute of Clinical Neurosciences, Department of Neurology, Frenchay Hospital, Bristol, UK Aikaterini Gkioka, PhD, Professor of Medical School of University of Athens, Director of Hellenic Cord Blood Bank by Medical Foundation of Academy of Athens, University of Athens, Athens, Greece Harold L. Atkins, MD, FRCPC, Medical Director, Regenerative Medicine, Ottawa Health Research Institute, Ottawa, Canada Claude C.A. Bernard, DES, MSc, PhD, DSc, Professor and Associate Director, Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, Clayton/Melbourne, Victoria, Australia Marjorie Bowman, RN, BScN, MS/BMT Research Coordinator, The Ottawa Hospital, Ottawa, Canada Siddharthan Chandran, PhD, MRCP, MRC, Anne McLaren Laboratory for Regenerative Medicine & Cambridge Centre for Brain Repair, Dept of Clinical Neurosciences, University of Cambridge, Cambridge, UK Jeffrey Cohen, MD, Professor of Neurology, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine, Cleveland, OH, USA Klimentini Karageorgiou, MD, PhD, Director of Neurology Department, Athens General Hospital, Athens, Greece Hillard Lazarus, MD, University Hospital/Case Medical Center, Cleveland, OH, USA Heather MacLean, MD, FRCP(C), Assistant Professor, University of Ottawa, Ottawa Hospital MS Clinic, Ottawa, ON Canada Pedro Marın Fernandez, MD, Senior Consultant, Hemotherapy and Hemostasis Service, Hospital Clinic Barcelona, Barcelona, Spain Gianvito Martino, MD, Director Division of Neuroscience/San Raffaele Hospital, Milan, Italy Paul W O Connor, MD, FRCPC, MSc, Director, MS Clinic and MS Research, St. Michael s Hospital, University of Toronto, Toronto, Canada Tomas Olsson, MD, PhD, Professor, Dept. of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet, Neuroimmunology Unit, Stockholm, Sweden Andreas Papasavvas, PhD, Professor of Medical School of Athens, Hellenic Cord Blood Bank by Medical Foundation of Academy of Athens, Athens, Greece Stefano Pluchino, MD, Division of Neuroscience/San Raffaele Hospital, Milan, Italy Albert Saiz, MD, PhD, Head of MS Unit, Hospital Clinic, Barcelona, Spain Sven Schippling, MD, Institute of Neuroimmunology and Clinical MS Research, Hamburg, Germany Mike Scott, PhD, FRCPath, Cambridge University Hospitals, Stem Cell Laboratory, Department of Haematology, Cambridge, UK Shimon Slavin, MD, Professor of Medicine, Scientific & Medical Director, The International Center for Cell Therapy & Cancer Immunotherapy (CTCI), Tel Aviv, Israel Ada Vaknin, MD, PhD, MS Center Hadassah, Hadassah Hebrew University, Ein Karem, Jerusalem, Israel Pablo Villoslada, MD, Director Neuroimmunology Group, Institut Biomedical Research August Pi Sunyer (IDIBAPS) Hospital Clinic, Barcelona, Spain

27 Köszönöm a figyelmet! 10 mm 1 mm