Tézisek. A Gyermekkori Akut Limfoid Leukémia és non- Hodgkin Limfoma Klinikopatológiája. dr. Magyarosy Edina

Átírás

1 Tézisek A Gyermekkori Akut Limfoid Leukémia és non- Hodgkin Limfoma Klinikopatológiája dr. Magyarosy Edina Témavezető: Dr. Tímár József Programvezető: Dr. Jeney András Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Fővárosi Önkormányzat Heim Pál Gyermekkórháza Budapest, 2002

2 BEVEZETÉS A rosszindulatú megbetegedések nem gyakoriak gyermekkorban, élő gyermekre mintegy 15 új tumoros megbetegedés esik évente, jelentőségük mégis igen nagy, hiszen a gyermekkori halálozásban a második helyen állnak a balesetek után. A gyermekkori rosszindulatú megbetegedések között a leukémia a leggyakoribb. A limfomák az agytumorok után a harmadik helyen állnak. A leukémia az éretlen, illetve a kóros fehérvérsejtek malignus burjánzása, amelyek a normális sejteket túlnőve, a csontvelőt, a májat, a lépet, központi idegrendszert, valamint a herét infiltrálják. A leukémiás sejtpopulációt valószínűleg egyetlen kóros őssejt, vagy progenitor sejt klonális proliferációja hozza létre. Az akut leukémiás blasztsejtek nem képesek normális differenciálódásra, további osztódásra azonban igen. A gyermekkori akut limfoid leukémia (ALL) morfológiai, immunológiai és genetikai megjelenését és klinikai lefolyását tekintve heterogén betegcsoport. A gyermekkori ALL oka az egymást követő prenatalis és posztnatalis események valamilyen kombinációjában rejlik, amelyben a genetikai háttér vagy az örökletes tényező is szerepet játszhat. A gyermekkori ALL klinikai tünetei a diagnózis felállítása előtt általában néhány héttel, ritkán néhány hónappal jelennek meg. Az ALL kialakulása során tehát a kezdet és a tünetek megjelenése között valószínűleg van egy rejtett vagy klinikailag tünetmentes időszak. A diagnóziskor meghatározott klinikai és laboratóriumi jellemzők fontos szerepet játszanak a betegség lefolyásában és a kezelés kimenetelében, ilyen az életkor, a kezdeti fehérvérsejt szám, a nem, a leukémiás sejt morfológiája, az immunológiája, a citogenetikája és a molekuláris genetikája. A leukémia kezelésének célja, hogy a tumortömeg agresszív kezelésével lehetséges mértékig csökkentse a daganatos sejttömeget. A konszolidációs kezelés során az indukciós fázist túlélő leukémiás sejt mennyiségének további csökkentése a cél. A fenntartó kezelés a megmaradt leukémiás sejtek elpusztítására törekszik, hogy ne legyenek képesek a hemopoetikus szövetek repopulálására. Fontos prognosztikai jel a leukémiás sejtek eltűnésének gyorsasága a kezelés hatására, ilyen a prednisolonra adott válasz, a hematológiai remisszió (a kezelés megkezdésétől számított 15. és 33. napi csontvelő eredménye), a minimális rezidualis betegség jelenléte. Minimális reziduális betegség (MRD) alatt értjük azt az állapotot, amikor a beteg az indukciós kezelést követően teljes klinikai és hematológiai (morfológiai) remisszióban van, de leukémiás sejtek még kimutathatók a csontvelőben Dr. Magyarosy Edina 2/

3 (illetve perifériás vérében) igen érzékeny technikákkal. A minimális reziduális betegség kimutatására többféle lehetőség van: A daganatos klónra jellemző kromoszomális átrendeződés (transzlokáció. deléció, inverzió) kimutatása molekuláris citogenetikai (FISH), vagy molekuláris genetikai (genomiális DNS PCR, RT-PCR) technikákkal. Az aberráns immunfenotípust (sejtfelszíni marker-kombinációt) hordozó monoklonális blasztsejt populáció arányának meghatározása áramlásos citometriával. A daganatos klón kimutatása az immunglobulin vagy T-sejt receptor (TCR) génjeinek klónspecifikus átrendeződése segítségével. A Wilms tumor asszociált gén (WT 1) expresszió szerepe és alkalmazása a leukémiás betegek kórlefolyásában A WT1 gént először, mint egy a Wilms tumorért (gyermekkori nephroblasztoma) felelős gént 1990-ben izolálták, és hosszú ideig mással nem is hozták kapcsolatba. Később mutációit mutatták ki WAGR-szindrómában és Denys-Drash szindrómában is. A WT1 gén lokalizációja a humán genomban 11p13. A génnek 10 exon régiója van, és két darab hasítási hely révén négy különböző splice variánsa létezik, amelyek egymástól eltérő szerepet tölthetnek be. A WT1 fehérje fontos szerepet játszik az urogenitális szervrendszer fejlődésének irányításán túl a vérképzésben is, melynek során kizárólag az éretlen CD34 + csontvelői progenitor sejtekben expresszálódik, a belőlük differenciálódó CD34 - ún. postprogenitor sejtekben már nem. Ezt a tényt mind az RT-PCR vizsgálatok, mind pedig az immuncitokémiai módszerek alátámasztották. Számos kutatócsoport véleménye szerint a WT1 gén (Wilms tumor asszociált gén) expressziójának folyamatos nyomonkövetése a csontvelőben, de leginkább a perifériás vérben leukémiás betegeknél lehetővé teszi az MRD kimutatását, a kórlefolyás követését, a remisszió megítélését és a recidíva korai felismerését. Annak ellenére, hogy a WT1 génexpresszió jól ismert leukémiákban, eddig még nem vizsgálták a különböző WT1 izoformák expresszióját. Metasztázis asszociált fehérjék és a prognózis összefüggése A CD44 molekula adhéziós glikoprotein időleges proteoglikán, mely limfoid sejtekben un. hyaluronsav- és homing receptorként szolgál (CD44s vagy CD44H). Számos ún. splice variánsa lehetséges, melyek közül a v6 variáns többféle daganat esetében bizonyult hatékony az áttétképző képesség jelzőjének (gasztrointesztinális tumorok), míg B és T limfoid sejtekben aktivációs marker, ugyanakkor laphámok esetében fontos sejtadhéziós molekula. Dr. Magyarosy Edina 3/

4 Az NM23-H1 fehérje a kis GTP-kötő fehérjék családjába tartozik és az NDP-kináz enzimnek felel meg. Számos daganatféleségben expressziója esetén az áttétképző képesség lecsökkent, ami miatt metasztázis-szuppresszornak tekintették. Gyermekkori akut limfoblasztos leukémiában a szérumban megjelenő scd44 szintén a rossz prognózis markere, azonban a CD44v6 variáns expressziójára nézve eddig nem történtek vizsgálatok. Hematológiai daganatokban az NM23-H1-et differenciálódas-inhibitornak tartják. Gyermekkori ALL-ben NM23-expressziót gyakrabban találtak recidíva esetén, ezért kedvezőtlen prognózisra utaló jelnek tekintik, hasonlóan a felnőttkori AML-hez (akut mieloid leukémia). CÉLKITŰZÉSEK Munkám során a következő kérdésekre kerestem választ 1. Mi az értéke az immuncitokémiának a gyermekkori leukémia és limfoma diagnosztikájában? 2. A metasztázis asszociált fehérjéket lehet-e prognosztikai faktornak tekinteni? 3. WT1 génexpresszió alkalmas-e a minimális reziduális betegség kimutatására, a recidíva korai jelzésére ALL-ben? 4. Milyen a WT1 izoformák expressziós mintázata ALL-ben? 5. Milyen eredménnyel jártak az újabb terápiás ALL protokollok? 6. Lehetséges-e gyermekkori limfoma állatmodell kialakítása? ANYAG ÉS MÓDSZEREK Immunhisztokémia Frissen érkezett nyirokcsomókból sejtszuszpenziót készítettünk, a fehérvérsejteket Ficoll denzitás-gradiensen történő centrifugálással izoláltunk és citospin preparátumot készítettünk Shandon készülék segítségével és az Avidin-Biotin-Immunperoxidaze módszert alkalmaztunk. A vizsgálathoz 35 felnőtt limfomás, illetve 10 emlőrákos beteg mintáit használtuk, amelyek különböző testfolyadékokból (mellkasi, hasüregi, gerincvelői folyadékból) valamint aspirációs biopsziás anyagból származtak. Kontrollként 5 nemdaganatos betegségben szenvedő beteg mintája szolgált. Metasztázis asszociált fehérjék meghatározása Metasztázis asszociált fehérjék (CD44v6 és NM 23-H1) immuncitokémiai meghatározása 16 nem-szelektált, frissen diagnosztizált ALL-es betegnél történt a szülők beleegyezésével. Dr. Magyarosy Edina 4/

5 Metasztázis-asszociált fehérjék immuncitokémiai meghatározása: a perifériás vérből fehérvérsejteket Ficoll denzitás-gradiensen történő centrifugálással izoláltunk és a szeparált sejteket citospin centrifugával (Shandon) Superfrost tárgylemezekre centrifugáltuk. A minták indirekt immunfluoreszcens jelölését szobahőmérsékleten végeztük. WT1 gén perifériás vérben történő expressziójának meghatározása akut limfoid lekémiában A Heim Pál Gyermekkórház hemato-onkológiai osztályán 1999 júniusa és 2001 decembere között, 66 gyermek perifériás véréből végeztünk követéses WT1 vizsgálatokat. 27 frissen diagnosztizált leukémiás, illetve 22 más nem rosszindulatú hematológiai betegségben szenvedő gyermeket (kivéve egy mielodiszpláziában szenvedő kisleányt), illetve 17, vizsgálatunk megkezdése előtt diagnosztizált, követés alatt álló leukémiás gyermeket vontunk be. A vizsgálatokhoz rendelkeztünk a szükséges etikai engedélyekkel, illetve a szülők beleegyező nyilatkozatával. A vérvételeket előre meghatározott időpontokban végeztük el az ALL esetén a diagnózis felállítása idején, a 8. napon (a Prednisolon válasz napján), a 15. napon (korai responderek) és 33. napon (azaz az indukciós kezelés végén) a remisszió megállapításának idején. Ezen kívül a konszolidációs kezelés elején (12. hét), az intenzifikációs kezelés előtt (22. hét), valamint az intenzív kezelés befejezése után végeztünk vizsgálatokat. A további kontroll vizsgálatok a fenntartó kezelés alatt és a kezelés befejezése után havonta történtek, recidíva gyanúja esetén sűrűbben. Első lépésként a betegek véréből először limfocitákat szeparáltunk, majd ezekből a sejtekből izoláltuk a totál RNS-t. A DNS amplifikációt Taq polimeráz (Gibco-BRL) segítségével végeztük. A nested PCR lényege, hogy az átírt cdns-ről az első PRC lépésben egy viszonylag nagy terméket szaporítunk fel (ún. outer primer pár segítségével, esetünkben 481 bázispár), majd a második PCR reakció során ezen a szakaszon belül található primer párt (inner, esetünkben 343 bázispár) használunk és kiinduláshoz az outer primerrel felszaporított DNS-t használjuk. A minták megnyugtató értékelhetőségének alapja a többszörös kontroll. Azt hogy az RNS átírása megbízhatóan megtörtént és a kiindulási cdns mennyisége valóban azonos minden mintában, minden estben egy housekeeping gén, a Béta-actin átírásával bizonyítottuk. Dr. Magyarosy Edina 5/

6 Humán tumor xenograft Lymphomás nyirokcsomókat (0,3 cm átmérőjű szövetdarabok) szubkután oltottuk immunszupprimált CBA/CA egerek hátbőre alá a korábban már leírt eljárással. A szubkután növekedő lymphomákat i.p. kezeltünk, amikor a tumorok mérete 0,7-1 cm 3 -t elérte. Általában egyszeri kezelést alkalmaztunk a maximálisan tolerálható dózis 1/10-ével. A tumor volumen megkettőződésének idejét az individuális növekedési görbe alapján határoztuk meg és ebből számoltuk a növekedés-gátlást: kettőződési idő (kezelt) kettőződési idő (kontrol)/kettőződési idő(kontrol) képlet alapján. ALL BFM 90-es és ALL-BFM 95-ös protokoll Az 1971-ben alakult Gyermekonkológiai Hálózat 1990 januárja és 1999 decembere között 619 új akut limfoid leukémiás gyermeket diagnosztizált Magyarországon között 362 beteget az ALL BFM 90-es, között 257 beteget az ALL BFM 95-ös protokoll szerint kezeltünk. Az ALL BFM 90-es és ALL BFM 95-ös protokollok a Berlin, Frankfurt és Münster városok gyermekonkológiai klinikái által kezdeményezett nemzetközi munkacsoport (melynek Magyarország is tagja) által kidolgozott protokollok. A BFM munkacsoport a gyermekkori malignus betegségek kezelésére vonatkozó protokollok kidolgozásán túl folyamatosan értékeli és ellenőrzi azok használatát, illetve újabb verziók kibocsátásával, módosítja azokat. A leukémiás sejtek sajátosságainak meghatározására a következő diagnosztikus módszerek szolgálnak: perifériás vérkenetek, és a csontvelői kenetek citomorfológiai, citokémiai értékelése, immunfenotipizálása áramlásos citometriával történik szimpla vagy kettős immunfluorescenciás jelöléssel. A leukémiás sejtek kromoszóma vizsgálata, áramlásos citometriás vizsgálatával követhető. A DNS tartalom változását (DNS tartalom, ploiditás, kinetika), DNS indexben (DI) adjuk meg. A csontvelő biopszia, csontvelő metszet hisztológiai vizsgálata, valamint a citokémiai reakciók fontos segítséget jelentenek a limfoid és mieloid leukémiák elkülönítésében (fénymikroszkopia, immunhisztokémia, elektronmikroszkopia). A molekuláris biológiai vizsgálatok: immunglobulin génátrendeződés, T-sejt receptor génátrendeződés kimutatása csontvelőből és perifériás vérből PCR módszerrel. Dr. Magyarosy Edina 6/

7 Rizikócsoportba való besorolás A betegek életkora, a leukémiás sejtek száma, fenotípusa, citogenetikai jellegzetességei, kezelésre adott válasza és egyéb klinikai prognosztikai tényezők alapján, a leukémiás betegek különböző rizikócsoportba sorolandók, amelyek az antileukémiás kezelés intenzitását meghatározzák, de alapvető stratégiáját nem. Statisztikai módszerek A központokban észlelt, gyógykezelt és gondozott betegek adatait a munkacsoport központi adatbázisában regisztráljuk és a változásoknak megfelelően, évente felfrissítjük. A statisztikai adatok feldolgozása a BMD-Biomedical Programs segítéségével történik. A túlélési valószínűségi görbék Kaplan-Meier szerint becsült egyoldali konfidencia intervallummal készültek. EREDMÉNYEK Immunhisztokémia a limfoma diagnosztikában A 80-as évek elején vezettük be és alkalmaztuk hazánkban elsőként az avidin-biotin peroxidáz (ABPOX) módszert a limfoma diagnosztikába. 35 esetben mellkasi, hasüregi, gerincvelői folyadékból, valamint nyirokcsomó-aspirációval nyert anyagokat vizsgáltunk. Az immunhisztokémiai vizsgálat segítségével minden esetben elkülöníthető volt a malignus limfoma a reaktív nyirokcsomó elváltozástól. Az immunhisztokémiai eredmények az esetek több mint a felében megváltoztatták a morfológiai diagnózist, amelyek azt bizonyították, hogy az immunológiai markerek alkalmazása nélkülözhetetlen a limfomák diagnózisában. Metasztázis asszociált fehérjék expressziója ALL-ben A CD44v6 és NM23-H1 metasztázis-asszociált fehérjék expresszióját különböző prognózisú gyermekkori ALL esetekben vizsgáltuk. Az ALL-es csontvelőkben a CD44v6 protein a limfoid sejtek felszínén volt kimutatható, míg az NM23-H1 fehérjét inkább a citoplazmában találtuk. A metasztázis-asszociált fehérjék expressziója nem volt eltérő a különböző fenotípusú esetekben (B-, T- vagy bifenotípusos ALL). Az ALL-es esetek fele NM23-H1- pozitívnak bizonyult, azonban ez nem mutatott kapcsolatot az ALL rizikócsoportokkal (alacsony vagy közepes/magas rizikó). Ezzel szemben a CD44v6 + esetek a közepes/magas rizikócsoportban fordultak elő egy kivétellel. A továbbiakban azt is vizsgáltuk, hogy milyen a két fehérje expressziójának egymáshoz való viszonya. Megállapítottuk, hogy az esetek Dr. Magyarosy Edina 7/

8 többségében a tumoros sejtpopuláció csak az egyik metasztázis-asszociált fehérjét expresszálta (10/16), és a kettős expresszió (2/16) vagy a kettős negativitás (4/16) viszonylag ritka jelenség gyermekkori ALL-ben. WT1 expresszió nyomonkövetése akut limfoid leukémiás betegek perifériás vérében A Heim Pál Gyermekkórház hemato-onkológiai osztályán 1999 júniusa és 2001 áprilisa között 66 gyermek perifériás véréből végeztük el a WT1 expresszió kimutatását PCR módszerrel. A kontroll csoportba 22 olyan gyermeket soroltunk, akik egyéb, nem rosszindulatú, hematológiai betegségben szenvedtek (egy mielodiszplaziás betegünket kivéve). Hangsúlyozni szeretnénk, hogy az általunk vizsgált kontroll csoportban nem mutattunk ki WT1 expressziót. Pozitív kontrollként a mielodiszpláziás esetünk szolgált. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy még GCSF kezelést követően sem tudtuk kimutatni WT1+ csontvelői sejtek megjelenését a perifériás vérben. Az akut limfoid leukémiás esetek 96%-a bizonyult WT1 pozitívnak (23/24), a nagyobb érzékenységű nested PCR technika alkalmazásával. Az irodalmi adatoknak megfelelően a WT1 expresszió nem mutatott összefüggést a perifériás vérben észlelt kezdeti fehérvérsejt számmal, a kezdeti blasztsejtszámmal, a morfológiai és immunológiai jellemzőkkel, a rizikócsoporttal, nemmel, korral. A továbbiakban 20 leukémiás gyermek folyamatos monitorozását végeztük a leukémia diagnózisának felállításától számított 2 éven át a kemoterápiás kezelés előre meghatározott ellenőrzési pontjain. Betegeinknél a kezdeti erős WT1 pozitivitás a kezelés 15. és 33. napjára fokozatosan lecsökkent. Az indukció kezelés végén, a klinikai és morfológiai remisszió idején a mindössze 5 esetben észleltünk pozitivitást a 24-ből (5/24). A konszolidációs és reintenzifikációs kezelés végére ez a szám tovább csökkent (2/24). A fenntartó kezelés alatt (a második évben) havonta történtek a kontroll vizsgálatok, amely során az első 6 hónapban ritkábban tapasztaltunk WT1 pozitivitást, majd ezt követően a hónap között szinte mindegyik betegünknél (16/20) átmeneti (néhány hónapos) WT1 expressziót tudtunk kimutatni. A WT1 IZOFORMÁK EXPRESSZIÓJÁNAK VIZSGÁLATA 20 frissen diagnosztizált leukémiás gyermek perifériás vérében vizsgáltuk a különböző WT1 izoformák expresszióját Elsőként ismételt vizsgálatokkal igazoltuk, hogy az adott WT1- mintázat állandó. Dr. Magyarosy Edina 8/

9 A 7 alacsony rizikó csoportba sorolt beteg esetében a WT1 variánsok között döntően a 17AA(+) WT1 izoforma expresszálódott, bár 2 esetben a 17AA(-) WT1 izoforma predomináns expresszióját találtuk. A 2 magas rizikó csoportba tartózó betegünk esetében 17AA(-) WT1 izoforma volt jelen. A közepes rizikójú csoport e tekintetben szinte átmenetet képzett a két előbb említett csoport között, ugyanis a betegek azonos mértékű 17AA(+) illetve 17AA(-) expressziót mutattak. Ebben a csoportban egyetlen esetben sem tapasztaltuk a 17AA(-) izoforma dominanciáját, és a 17AA(+) izoforma túlsúlya is ritka volt. Két beteg esetében ismételt vizsgálatok során sem kaptunk semmilyen PCR terméket a 17AA régióra tervezett primerekkel, annak ellenére, hogy a minták WT1 pozitivitást adtak a KTS régióban. Ebben a két esetben felmerült annak a gyanúja, hogy a 17AA régióban mutáció történt, azonban ennek igazolására további vizsgálatok szükségesek. ÚJ HUMÁN NON-HODGKIN LIMFOMA XENOGRAFTOK KIALAKÍTÁSA ÉS TERÁPIÁS ÉRZÉKENYSÉGÜK Kopper és Steel módszere szerint, kísérletet tettünk NHL xenografok létrehozására. 30 felnőttkori non-hodgkin limfomából egy (HT117), míg 8 gyermekkori NHL-ből két xenograftot sikerült stabilizálni mesterségesen immunszuppresszált CBA egereken. A tumorok megőrizték eredeti szövettani, immunológiai, genetikai jellegüket. A két gyermekkori NHL xenograft esetében vizsgáltuk a klinikailag alkalmazott citosztatikumokkal szembeni érzékenységet. A két tumor eltérő gyógyszer érzékenységet mutatott, a HT58 xenograft MTX, CY, VCR, ADR érzékeny volt, míg a HT 130 tumoros MTX, CY érzékenynek, de VCR rezisztensnek bizonyult. AZ ALL BFM 90 ÉS ALL BFM 95-ÖS PROTOKOLLAL NYERT TAPASZTALATOK ELEMZÉSE 1990 januárja és 1999 decembere között 619 új akut limfoid leukémiás gyermeket diagnosztizáltunk Magyarországon között 362 beteget az ALL BFM 90-es, míg között 257 beteget az ALL BFM 95-ös protokoll szerint kezeltünk. A két protokollal kezelt betegek nem, korcsoport és rizikó csoport szerinti megoszlása hasonló volt. Hasonlóképpen, a leukémiák morfológiája és immunfenotípusa szerinti megoszlásban sem találtunk lényeges eltérést. Az ALL BFM 95-ös protokollal kezelt betegek remissziós rátája (90,6%) valamivel magasabb az előző protokollhoz viszonyítva (88,1%) azonban az eltérés nem szignifikáns. Az össztúlélést tekintve nincs lényeges változás a két csoportban. Az Dr. Magyarosy Edina 9/

10 intenzív kezelés alatt a betegek 6-8%-t veszítettünk el. Ugyanakkor megvizsgáltuk az ALL-es betegek túlélését a rizikócsoportoknak megfelelően is. A statisztikai vizsgálatok arra utalnak, hogy az alacsony rizikócsoportban a ALL BFM 95-ös protokollal kezelt betegek össztúlélése szignifikánsan jobb a korábban alkalmazott protokoll eredményeinél. A toxikus mellékhatások közül saját vizsgálatainkban az idegrendszeri szövődményeket tanulmányoztuk az ALL intenzív kezelése kapcsán. Kórházunk haematológiai osztályán 1990 és 2000 között 122 akut limfoid leukémiás gyermeket kezeltünk BFM szerű protokoll szerint. Betegeink közül 17 esetben észleltünk idegrendszeri szövődményeket az indukciós és konszolidációs kezelés során. Az idegrendszeri szövődmények az akut limfoid leukémia intenzív kezelés során nem ritkák (13%). A súlyos idegrendszeri szövődmények egyetlen esetben sem vezettek eseteinkben halálhoz, de az élet minőségét jelentősen rontották. Ezen idegrendszeri szövődmények etiológiája és pathogenezise nem ismert. 60 akut limfoid leukémiás gyermeket randomizáltunk, a kísérleti csoportba tartozó 30 betegnél intravénás immunglobulint adtunk. Eredményeink azt mutatják, hogy a profilaktikus célból adott immunglobulin az akut limfoid leukémia kezdeti fázisában csökkenti a kimutatott bakteriális infekciók számát, és emeli a szérumban az immunglobulin szintet (IV.). MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉS A immundiagnosztika forradalmi változást hozott a limfoma leukémia diagnosztikájában, melyhez az érzékeny avidin-biotin immunperoxidaz technika kifejlesztése döntően járult hozzá. Ennek eredményeként gyakorlatilag megvalósult a biztos elkülönítése a reaktív és a daganatos elváltozásoknak, illetve a pontos fenotípus meghatározása. Bár a 90-es években újabb forradalmi változás történt a molekuláris technikák megjelenésével, az immuncitokémia a mai napig is a limfoma és leukémia diagnosztikájának alapköve. METASTASIS-ASSZOCIÁLT FEHÉRJÉK EXPRESSZIÓJA ALL-BEN Két metasztázis-társult fehérje (CD44v6 és NM23-H1) jelen van normális limfoid sejtekben is: az NM23-H1 konstitutíven expresszálódik, míg a CD44v6 aktivációs marker. Megvizsgáltuk a CD44v6 és az NM23-H1 metasztázis asszociált fehérjék expresszióját különböző prognózisú gyermekkori akut limfoblasztos leukémiás esetekben. Vizsgálataink során nem találtunk összefüggést a gyermekkori ALL kezdeti NM23-H1- metasztázis szuppresszor expressziója és a betegség rizikócsoportba való besorolása között, Dr. Magyarosy Edina 10/

11 miután az alacsony, illetve közepes/magas rizikócsoportban gyakorlatilag azonos arányban találtunk pozitív eseteket. Egy korábbi vizsgálatban azt találták, hogy az NM23-H1- pozitivitás sokkal gyakoribb a recidívába került gyermekkori ALL-es esetekben, mint a betegség felismerésekor, ezért a szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy az NM23-H1- expresszió a kedvezőtlen prognózis jele lehet az ALL-formában. A saját és a korábbi vizsgálatokat azonban másféleképpen is lehet értékelni. Véleményünk szerint a megtartott NM23-H1-expresszió gyermekkori ALL-ben nem valószínű, hogy a rosszabb prognózis jele, felvetjük inkább annak a lehetőségét, hogy az NDP-kináz enzim expressziója (NM23-H1) rossz terápiás választ okoz. Ezen feltevésünk ellenőrzésére azonban természetesen további vizsgálatok szükségesek. Az irodalmi adatok ugyanakkor többszörösen igazolták azt, hogy felnőttkori AML-ben az NM23-H1-expresszió a rossz prognózis markere. Az NM23-H1 expressziójának gyermekkori ALL-ben és a felnőttkori AML-ben megnyilvánuló eltérő szerepe véleményünk szerint azzal is magyarázható, hogy szemben a normális limfoid sejtekkel, normális mieloid sejtekben az NM23-H1/NDP-kináz nincsen jelen, tehát a malignus transzformáció folyamatában valószínűleg igen eltérő szerepet játszhat a két leukémia-féleség esetén. Vizsgálataink során új megfigyelésünk volt az, hogy a gyermekkori ALL esetek egy részében megjelenik a CD44v6 splice variáns és ezen esetek döntően a közepes/magas rizikójú esetek közé tartoznak. Ez a megfigyelésünk arra utal, hogy a CD44v6 fehérje megjelenése a hematológiai betegségekben (gyermekkori ALL, felnőttkori AML, B-CLL) a rossz prognózis markere hasonlóan számos hámeredetű daganathoz. Ebből a szempontból fontos megjegyezni, hogy normális B-, illetve T-sejtek esetében a CD44v6-expresszió aktivációs marker, ennek jelenléte gyermekkori ALL esetekben jele lehet annak, hogy a tumoros sejtpopulációban ún. aktivált állapotba merevedett blasztsejtek vannak jelen. ÚJ LEHETŐSÉGEK AZ MRD MONITOROZÁSÁRA Munkacsoportunk hazánkban először kezdte vizsgálni leukémiás és nem vérképzőrendszeri megbetegedésben szenvedő betegek perifériás vérében a WT1 gén RNS szintű expresszióját. Vizsgálatainkból a következő tanulságokat vontuk le: 1. A gyermekkori leukémiák több mint 90%-a WT1+, amelyet saját vizsgálataink is megerősítettek. Dr. Magyarosy Edina 11/

12 2. Az irodalmi adatoknak megfelelően saját anyagunkban a WT1 mrns expresszió nem mutatott összefüggést a perifériás vérben észlelt kezdeti fehérvérsejt számmal, a kezdeti blasztsejt számmal, a morfológiai és immunológiai jellemzőkkel, a rizikócsoporttal, nemmel, korral. 3. Az általunk vizsgált kontroll csoportban, azaz a nem rosszindulatú vérképzőrendszeri megbetegedésben szenvedő gyermekek perifériás vérében WT1expressziót kimutatni nem tudtunk. 4. A WT1 expresszió PCR módszerrel perifériás vérből történő kimutatásának módszere a WT1+ gyermekkori leukémiák monitorozására alkalmas. A perifériás vér WT1 expressziójának folyamatos követése kitűnő lehetőséget nyújthat a recidíva akár hónapokkal előre történő jelzésére. Ugyanakkor nem lehet eltekinteni a más módszerek alkalmazásától sem, mielőtt a recidíva diagnózisát felállítanánk. A betegek szorosabb követése ilyenkor lehetőséget nyújthat a recidíva korábbi felismerésére. 5. A kezdeti PCR módszerrel WT1 pozitív betegek, ha WT1 negatívvá válnak, akkor mind klinikailag, mind molekuláris genetikailag remissziósnak tekinthetők. WT1 gén izoformák expressziós mintázata A WT1 gén két splice régiót tartalmaz, amelynek köszönhetően a fehérjének négyféle izoformája létezik. Ezen izoformák különböznek egymástól sejtmagbeli lokalizációjukban, DNS- valamint RNS kötő képességükben és funkciójukban. Az egyes izoformák különböznek a sejten belüli egymáshoz viszonyított arányukban. 1. Megfigyeltük, hogy ugyanazon beteg különböző időpontokban vett mintáiban a WT1 17AA izoformák expressziós mintázat nem változott. 2. Az alacsony mintaszám miatt egyelőre nem állapítható meg összefüggés a WT1 variánsok mintázata és az egyes ALL alcsoportok között. 3. Figyelmet érdemel, hogy két esetben merült fel a gyanú a WT1-17AA régióban bekövetkezett mutációnak. Az ALL BFM 90 és ALL BFM 95-ös protokollok értékelése Az akut limfoid leukémiával kezelt hazai betegeink 90%-ban remisszióba voltak hozhatók mindkét protokoll esetében. A korai halálozás (6-8%) elsősorban alacsony és közepes malignitású csoportban jelentkezik, aminek oka egyrészt az, hogy az indukciós kezelés Dr. Magyarosy Edina 12/

13 mindhárom rizikó csoportban hasonlóan intenzív, másrészt szinte minden évben országosan egy-két beteget vesztünk el a diagnózis felállítását követő első három napon. Az alacsony rizikócsoportú ALL-es betegeink össztúlélése szignifikánsan javult az ALL BFM 95-ös protokoll alkalmazásával. Szerencsére a kevésbé jó prognózisú magas rizikócsoport ágon kezelt betegek száma az összes ALL-es betegnek csak kevesebb, mint 20%-át teszi ki. A kemoterápia intenzívebbé válásával a magas malignitású csoportban az ALL BFM 95-ös protokollal kezelt betegek eredményei jobbak, bár az eredmények még statisztikailag nem szignifikánsak. A közepes malignitású betegeknél a recidívák előfordulása mind a két kezelési protokollban magas. Az ALL BFM 95-ös protokollban, a közepes malignitású betegek fenntartó kezelésénél alkalmazott randomizálás eredményei azt mutatják, hogy egyelőre nincs lényeges különbség a két csoport között. Mindazonáltal, a hazai betegek esetében a túlélési és halálozási eredményeink nemzetközileg is jónak tekinthetők. A JÖVŐ: ÚJ TERÁPIÁS LEHETŐSÉGEK ALL-BEN A kilencvenes évek második felében a B sejtes NHL terápiájának új módját fejlesztették ki, olyan humanizált monoklonális antitesteteket melyek a CD19, CD20 vagy CD22 markerek felismerésekor gátló hatással rendelkeznek. Ezeket az antitesteket sikerrel alkalmazzák manapság B sejtes follikuláris limfomák esetében. A rituximab géntechnológiával előállított chiméra egér/human monoklonális antitest, egy glikolizált immunglobulin, mely human IgG1 konstans régiók és egér eredetű könnyűláncú és nehézláncú változó régiók szekvenciáit tartalmazza. A gyermekkori ALL döntő többsége B-sejtes ALL és jelentős részük CD19/CD20+, felvetődik automatikusan, hogy ezek a CD19 vagy CD20 elleni terápiás antitestek hatékonyak lehetnek gyermekkori ALL esetében is. Ilyen irányú klinikai fázis kettő vizsgálatok folyamatban vannak. A gyermekkori ALL-ek egy részét a BCR-ABL fúziós gén keletkezése jellemzi. CML (krónikus mieloid leukémia) esetében az ilyen génátrendeződéssel jellemzett leukémiákban a fúziós gén protein terméke nem-regulált tirozin kináz aktivitással rendelkezik. A kemoterápiás szerek új családját képezik a tirozin kináz gátlók, melyek közül a legnagyobb klinikai sikert az imatinib mezilát (Gleevec) érte el a CML blasztos fázisában valamint felnőttkori ALL-ben. A szer újabb alkalmazása a c-kit konstitutív aktivitásával jellemzett GIST daganat-csoport (gasztrointesztinális stromális tumor). Kézenfekvőnek látszik, hogy a Gleevec bevezetésre kerüljön a BCR-ABL génanomáliával jellemzett gyermekkori ALL-ben is, ahol hasonlóan fokozott tirozinkináz aktivitás tapasztalható, mint a CML-ben. Miután Dr. Magyarosy Edina 13/

14 azonban a Gleevec gyermekkori ALL-re gyakorolt hatásairól nem állnak rendelkezésre adatok, nyilvánvalóan preklinikai vizsgálatok hivatottak arra, hogy a felvetés realitását teszteljék. Klinikai vizsgálatok igazolták, hogy WT1+ leukémiákban, közöttük ALL-ben is a betegek közel felében anti-wt1 IgM és/vagy IgG mutatható ki a perifériás vérben ami arra utal, hogy a tumorsejtek WT1 fehérjéje tumorantigénként funkcionál, mely immunválaszt indukál. Más laboratóriumokban sikerült in vitro körülmények között hatékony T sejtes anti-wt1 immunválaszt kiváltani. Állatkisérletes modellben a leukémia sejtek WT1 fehérjéje sikeres immunterápiás célpontnak bizonyult. Miután gyermekkori ALL-ben igen nagy gyakorisággal expresszálódik a WT1 fehérje és az esetek döntő többségében ez nem módosult protein (nincsen mutáció), felmerülhet, hogy fel lehet ezt a természetes tumorantigént használni ALL ellenes immunterápia tervezésére. Az irodalmi adatok, melyekben AML esetében próbálkoztak WT1-immunterápiával arra utalnak, hogy egy ilyen eljárás sikeres lehet gyermekkori ALL-ben is. Összefoglalva a fent említett új terápiás lehetőségeket a citosztatikus kezelések mellett, mind kiegészítő kezelési módokat lehet alkalmazni a leukémia, limfoma kezelésében. Dr. Magyarosy Edina 14/

15 AZ ÉRTEKEZÉS ÚJ MEGFIGYELÉSEI A célkitűzéseimben feltett kérdésekre a következő válaszok adhatok a disszertációm alapján: A célkitűzéseimben feltett kérdésekre a következő válaszok adhatok a disszertációm alapján 1. Mi az értéke az immuncitokémiának a gyermekkori leukémia és limfoma diagnosztikájában? A limfoid rendszer daganatainak diagnózisában az 1980-as évek közepéig nagyon nehéz volt a malignus limfoid sejtek elkülönítése a reaktív limfoid sejtektől a szövettani kép alapján. Az általam kidolgozott és bevezetett avidin-biotin immunperoxidáze módszer segítségével minden esetben elkülöníthető volt a malignus limfoma a reaktív nyirokcsomó elváltozástól. Az immunhisztokémiai eredmények az esetek több mint, a felében megváltoztatták a morfológiai diagnózist (I, VI). 2. A metasztázis asszociált fehérjéket lehet-e prognosztikai faktornak tekinteni? A gyermekkori ALL esetek egy részében megjelenik a CD44v6 splice variáns és ezen esetek döntően a közepes/magas rizikójú esetek közé tartoznak. Ez a megfigyelésünk arra utal, hogy a CD44v6 fehérje megjelenése a hematológiai betegségekben (gyermekkori ALL, felnőttkori AML, B-CLL) a rossz prognózis markere hasonlóan számos hámeredetű daganathoz. Ugyanakkor az NM23 fehérjének nincsen prognosztikai szerepe (VII). 3. WT1 génexpresszió alkalmas-e a minimális reziduális betegség kimutatására, a recidíva korai jelzésére ALL-ben? Hazánkban először kezdtük leukémiás és nem vérképzőrendszeri megbetegedésben szenvedő betegek perifériás vérében a WT1 gén RNS szintű expresszióját. Ennek során megállapítottuk, hogy a WT1 expresszió perifériás vérből történő kimutatásának módszere a WT1+ gyermekkori leukémiák monitorozására alkalmas. A perifériás vér WT1 expressziójának folyamatos követése kitűnő lehetőséget nyújthat a recidíva akár hónapokkal előre történő jelzésére. Ugyanakkor nem lehet eltekinteni a más genetikai markerek alkalmazásától sem, mielőtt a recidíva diagnózisát felállítanánk. A kezdeti WT1 pozitív betegek, ha WT1 negatívvá válnak, mind klinikailag, mind molekuláris genetikailag remissziósnak tekinthetők (IX, XVII). Dr. Magyarosy Edina 15/

16 4. Milyen a WT1 izoformák expressziós mintázata ALL-ben? Elsőként vizsgáltuk a gyermekek perifériás vérében a különböző WT1 izoformák expresszióját és megállapítottuk, hogy az adott WT1-mintázat állandó. Két esetben merült fel a gyanú a WT1-17AA régiójában bekövetkezett mutációnak ALL-es betegekben. 5. Milyen eredménnyel jártak az újabb terápiás ALL protokollok? A gyermekkori leukémiák és limfomák kezelése hasonló elvek szerint történik. Az elmúlt 10 évben használt két protokollal elért eredményeket összehasonlítottuk. A túlélést tekintetében a közepes és magas malignításu betegeinknél lényeges különbséget nem találtunk. Az alacsony rizikó csoportú betegek túlélése szignifikánsan jobb volt a ALL BFM 95-ös protokoll esetében (IV, V). A BFM munkacsoportban a mellékhatásokkal foglalkozó csoporttal kidolgoztam egy követési tervet, amely tartalmazza azt a minimális követelményt, amit a gyermekkori ALL-s betegek utánkövetésénél célszerű alkalmazni (VIII, XVI, XVIII). 6. Lehetséges-e gyermekkori limfoma állatmodell kialakítása? A human tumorok immunszupprimált állatokra történő átültetése igen fontos módszerré vált az egyes tumortípusok kísérleti körülmények közötti vizsgálatára. Több gyermekkori NHL eset közül két esetben sikerült non-hodgkin limfoma xenográftot kialakítani, jellemezni és megállapítani a klinikailag alkalmazott citosztatikumokkal szembeni érzékenységét (I, III). Dr. Magyarosy Edina 16/

17 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK IF: Angol nyelvű publikációk I. Martin SE, Zhang HZ, Magyarosy E, Jaffe ES, Hsu MS,Chu EW. Immunological methods in cytology: Deffinitive diagnosis of non-hodgkin's Lymphomas Using Immunologic Markers for T- and B-cells. Am J Clin Path 82: , 1984 (IF:1.778) II. Kopper L, Nagy P, Magyarosy E, Major J, Lapis K. Chemotherapy of human non- Hodgkin's lymphoma (NHL) xenografts. Acta Morphol Acad Sci Hung 34: , 1986 (IF:0.265) III. Kopper L, Nagy P, Révész T, Major J, Magyarosy E, Lapis K. Transplantable Human non- Hodgkin Lymphoma Line in Artificially Immunosuppressed Mice. Anticancer Res 7: , 1987 (IF:1.171) IV. Gimesi A, Eibl M, Koós R, Magyarosy E, Kardos G, Fazekas E, Schmidt M, Borsi J, Schuler D. Immunglobulin prophylaxis during intensive treatment of acute lymphoblastic leukemia in children. Acta Paediat Hung 32: , 1992 V. Schuler D, Szende B, Borsi J, Marton T, Bocsi J, Magyarosy E, Koós R, Csóka M. Apoptosis as a possible way of destruction of lymphoblasts after glucocorticoid treatment of children with acute lymphoblastic leukemia. Ped Heamatol Oncol 11: , 1994 (IF:0.659) VI. Magyarosy E, Martin WJ, Chu EW, Martin SE. Differential diagnostic significance of the paucity of HLA-I antigens on metastatic breast carcinoma cells in effusions. Pathol Oncol Res 5:32-35, 1999 VII. Magyarosy E, Sebestyén A,Timár J. Expression of metastatsis associated proteins, CD44v6 and NM23-H1, in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Anticancer Res 21: , 2001 (IF:1.416) VIII. Jankovic M, Reciputo A, Haupt R, Micalizzi C, Manganini C, Frey E, Lackner H, Maurus R, Beck JD, Langer T, Marx M, Krappmann P, Magyarosy E, Feldges A, van Weel- Sipman M. Committee report. ELTEC: Ten Years of Activity ( ) A Report of the International BFM Study Group. Med Pediat Oncol 38:124, 2002 (IF:1.114) Dr. Magyarosy Edina 17/

18 IX. Magyarosy E, Varga N, Tímár J, Rásó E. Follow-up of minimal residual disease in acute childhood lymphoblastic leukemia by WT1 gene expression in the peripheral blood. The Hungarian Experience. Ped Heamatol Oncol, 20:1-10, 2003 (IF:0.444) Magyar nyelvű publikációk X. Shuler D, Koós R, Magyarosy E, Somló P, Bakos M, Borsi J. A malignus betegségek késői mellékhatásai a gyermekkorban. Gyermekgyógyászat 43: , 1992 XI. Kardos G, Magyarosy E, Kajtár P, Schuler D, Magyar Gyermekonkológiai Munkacsoport: A gyermekkori lymphomákról. Magyar Pediatria 26: , 1992 XII. Kálmánchey R, Magyarosy E, Majtényi K, Koós R. Gyermekkori osteosarcomában előforduló Wernicke-encephalopathia. Orvosi Hetilap 133: , 1992 XIII. Tímár F, Magyarosy E, Kardos G. A gyermekkori csontvelő transzplantációk. Gyermekgyógyászat 44: , 1993 XIV. Kiss A, Babosa M, Magyarosy E, Zimonyi I: Haemotológiai betegségek kardiológiai vonatkozásai. Magyar Pediátria 5(4): 76-79, 1996 XV. Magyar Gyermekonkológiai Munkacsoport: A magyar Gyermekonkológiai Hálózat négy éve ( ) Gyermekgyógyászat 2: , 1999 XVI. Magyarosy E és a Magyar Gyermekonkológiai Munkacsoport. Az ALL BFM 95 protokoll alkalmazása során a gyermekkori acut lymphoid leukemia kezelésében nyert tapasztalataink Gyermekgyógyászat 50: , 1999 XVII. Rásó E, Varga N, Tímár J, Magyarosy E: Minimális reziduális betegség monitorozása gyermekkori akut leukémiában a WT1 gén perifériás vérben történő expressziójának nyomonkövetésével. Magyar Onkológia 44/ XVIII. Magyarosy E és a Magyar Gyermekorvos Társaság Gyermekonkológiai Szekciója: A gyermekkori akut limfoblasztos leukémia kezelésében elért hazai eredmények. Magyar Onkológia 44: XIX. Kovács G, Müller J, Borgulya G, Koós R és a Magyar Gyermekonkológiai Hálózat: A gyermekkori Hodkin-lymphoma kezelési eredményei Magyarországon. Magyar Onkológia 45: , 2001 Dr. Magyarosy Edina 18/

19 Egyéb közlemények Kopper L., Magyarosy E., Jeney A., Lapis K., Szabolcs A., Ötvös L.: Potentiation of antitumor action of 5-fluorouracil with 5-ethyl-2-deoxyuridin in human colorectal tumor xenografts. Oncology 41: , (IF:0,845) Kopper L., Magyarosy E., Nagy P., Számel I., Eckhardt S., Wabrosch D., Répássy D.: Renal cell carcinoma xenotransplantation into immunosuppressed mice. Oncology 41: 19-24, (IF:0,845) Láng J., Kopper L., Petrányi Gy., Magyarosy E., Lapis K.: Retroperitoenal plasmocytic giant lymph node hyperplasia. J Royal Soc. Med. 77: , Láng J., Kopper L., Magyarosy E., Petrányi Gy.: Retroperitoneális plazmasejtes óriássejtes nyirokcsomó hyperplasia. Orvosi Hetilap 122: 19, Szendrői M., Lapis K., Magyarosy E.: A fibronectin szerkezete és funkciója. Biokémia VII(2): 11-15, Tímár F., Kopper L., Magyarosy E., Lapis K.: Humán tumor xenograftok kolóniaképzésének vizsgálata kettősrétegű lágy agarban. Magyar Onkológia 28: , Marosi Anikó, Apjok Enikő, Zombori Marianna, Magyarosy Edina Fővárosi Önkormányzat Heim Pál Gyermekkórháza, Budapest (ig. Smrcz Ervin) A Heim Pál Kórházban működő haemophilia gondozó központ jelenlegi feladatai Gyermekgyógyászat 50(5): , Magyarosy Edina, Marosi Anikó, Apjok Enikő, Fővárosi Önkormányzat Heim Pál Gyermekkórháza, Budapest (ig. Smrcz Ervin) Congenitalis haemolyticus anaemia és acut lymphoblastos leukémia előfordulása. Orvosi Hetilap, : , Dr. Magyarosy Edina 19/

20 Marosi Anikó, Apjok Enikő, Magyarosy Edina, Szabó Teréz, Ajzner Éva Fővárosi Önkormányzat Heim Pál Gyermekkórháza, Budapest (ig. Smrcz Ervin) Súlyos hereditaer V. faktor- hiányos beteg esetének ismertetése Orvois Hetilap, , Melegh Zsombor, Bálint Ildikó, Nagy Kálmán, Magyarosy Edina, Gálántai Ilona, Szentirmay Zoltán N-myc-amplifikáció vizsgálata neuroblastomában PCR-alapu módszerekkel Magyar Onkológia 46./ , Dr. Magyarosy Edina 20/