Doktori tézisek. Doktori tézisek. A Drosophila MRP, az emberi hosszú multidrog rezisztencia-asszociált fehérjék nagykapacitású modellje

Átírás

1 Doktori tézisek Doktori tézisek A Drosophila MRP, az emberi hosszú multidrog rezisztencia-asszociált fehérjék nagykapacitású modellje A Drosophila MRP, az emberi hosszú multidrog rezisztencia-asszociált fehérjék nagykapacitású modellje Szeri Flóra Szeri Flóra Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Budapest 2009 Doktori Iskola vezetője: Témavezetők: Opponensek: Bírálóbizottság elnöke: Bírálóbizottság tagjai: Dr. Mandl József Dr. Váradi András Dr. Sarkadi Balázs Dr. Vellai Tibor Dr. Csanády László Dr. Ádám Veronika Dr. Nyitray László, Dr. Geiszt Miklós

2 Bevezetés Az ABC transzporterek az elővilágban széleskörűen elterjedt integráns membrán fehérjék. Funkciójuk - az ATP kötésének és hasításának terhére történő, sejtmembránokon keresztüli aktív transzport - élettanilag kiemelt fontosságú. ABC transzporterekhez köthető a tumorok multidrog rezisztenciája, valamint számos öröklődő betegség (pl. a cisztikus fibrózis) kialakulása is. Az ABC transzporterek multidomén fehérjék, minimális működési egységük két transzmembrán és két nukleotidkötő domént tartalmaz, amelyet core szerkezetnek neveznek. A negyvennyolc emberi ABC transzportert szekvenciaazonosság alapján hét, míg az ötvenhat Drosophila melanogaster (ecetmuslica) transzportert nyolc alcsaládba sorolták. Ezek egyike az emberben tizenkét tagot számláló ABCC (MRP-CFTR) alcsalád, amelynek öt tagja különleges membránszerkezettel jellemezhető alcsoportot alkot. Ezekben az úgynevezett hosszú MRP-kben a core szerkezetet egy N terminális transzmembrán domén és egy hosszú citoplazmatikus összekötő szakasz egészíti ki. Ilyen szerkezetű MRP fehérjéből az ecetmuslica genomban mindössze egyetlen található, ez vizsgálatunk tárgya, a Drosophila MRP (DMRP). Az emberi hosszú MRP-k organikus anion transzporterek, amelyek számos élettani és klinikai szempontból jelentős folyamatban szerepet játszanak. Hozzájárulnak a szervezet elsődleges védvonalainak, valamint a daganatok multidrog rezisztenciájának kialakításához. Szubsztrátjaik főként endo- és xenobiotikumok glutation, glükuronid és szulfát konjugátumai, ezen toxikus anyagcseretermékek eliminálásában szerepük alapvető fontosságú. Ezen túl más élettani folyamatokban, például a sejtek redox egyensúlyának fenntartásában illetve gyulladásos folyamatokban is jelentősek. Az emberi MRP-k széleskörűen vizsgált fehérjék, ugyanakkor a rájuk in vitro vizsgálatokban jellemző relatíve alacsony aktivitás gátját képezi jobb megismerésüknek. 1 Célkitűzések Vizsgálataink kezdetekor mindössze a DMRP-t kódoló génről és ennek mrns átiratairól álltak rendelkezésre irodalmi adatok, míg a fehérje funkciója ismeretlen volt. A fehérje heterológ rendszerben megvalósított expressziója után elvégzett előzetes vizsgálatainkban azt tapasztaltuk, hogy a DMRP az emberi MRP-k esetében még soha nem tapasztalt magasszintű aktivitással rendelkezik, ezért elhatároztuk, hogy széleskörű összehasonlító vizsgálatokban jellemezzük a fehérje működését. Vizsgálataink során az alábbi célokat tűztük ki: 1. Filogenetikai analízissel tisztázzuk az ecetmuslica valamint a humán ABCC fehérjék rokonsági viszonyait, és az irodalomban közölt téves DMRP doménszerkezet helyett alkalmas membrántopológiai modellt dolgozunk ki. 2. Összehasonlító funkcionális vizsgálatokban modellértékű szubsztrátok és gátlószerek alkalmazásával felmérjük a DMRP szubsztrát és inhibítor profilját. 3. Jellemezzük a fehérje katalitikus ciklusát a nukleotid-kötés és -csapdázás valamint a vanadát-szenzitív ATP-áz aktivitás vizsgálatával. 4. Vizsgáljuk a DMRP endogén expresszióját, valamint megkíséreljük potenciális peszticid szubsztrátok azonosítását. A fenti általános célok megvalósításához az alábbi eszközökre volt szükségünk: a) A DMRP fehérje expressziójára a laboratóriumunkban a humán MRPk jellemzésére már bevált Sf9-bakulovírus rendszerben. b) A DMRP fehérjét specifikusan felismerő antitestre (Steven Robinow, Hawaii). 2

3 Módszerek In silico analízis A fehérjeszekvenciák vizsgálatát a CLUSTALW (1.83) programmal végeztük. A filogenetikai fát a MEGA2 programmal állítottuk elő. A DMRP feltételezett membrántopológiáját a hmrp1 szekvenciájának felhasználásával a HMMTOP online programmal végeztük ( A pacuw21l-dmrp vektor előállítása A DMRP kódoló szekvenciáját tartalmazó SD07655 cdns-t Not I és Sac I felismerőhelyeket kódoló primerekkel sokszoroztuk. A fragmenst a pacuw21l bakulovírus vektorba klónoztuk a Not I és Sac I helyekre. A DMRP kifejeztetése Sf9 sejtekben A Spodoptera frugiperda (Sf9) sejteket a pacuw21l-dmrp konstrukcióval és linearizált BaculoGold (Pharmingen) DNS-sel kotranszfektáltuk. A vírust tartalmazó felülúszókat végpont hígitás módszerrel klónoztuk és amplifikáltuk. Membránpreparátumok készítése Az Sf9 sejteket rekombináns vírusokkal fertőztük és 72 óra elteltével homogenizáltuk. A membránfrakciót differenciál ultracentrifugálással nyertük, a preparátumot 7-12 mg/ml összfehérje koncentrációra állítottuk be. A membránvezikulák ciklodextrin kezelése Az Sf9 membránpreparátumokat 13 különböző kémiai szerkezettel bíró ciklodextrinnel inkubáltunk 1 órán át jégen. A membránokat mostuk, a pelleteket reszuszpendáltuk és azonos összfehérje koncentrációra állítottuk be. Az ecetmuslica minták előállítása A teljes muslicákat és az elkülönített fejeket/testeket DB-ben homogenizáltuk, szűrtük és szonikáltuk, majd meghatároztuk a minták összfehérje tartalmát. SDS-poliakrilamid gélelektroforézis és blottolás PVDF membránra A sejtlizátumokat / membránpreparátumokat SDS-gélben elválasztottuk és PVDF membránokra elektro-blottoltuk. Immunoblott A PVDF membánokat 5% tejben blokkoltuk majd anti-dmrp, anti hmrp1 m6 valamint anti hmrp2 M2I-4 elsődleges antitestekkel inkubáltuk. Ezt követően a membránokat tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel jelöltük. A fehérje-antitest interakciót ECL-lel mutattuk ki, és a blottokat a Quantity One programmal denzitometráltuk. Coomassie festés Az SDS-gélelektrofrézist követően a fehérjéket Comassie festékkel festettük. Az expressziós szinteket a Quantity One programmal határoztuk meg. Nukleotid-kötés és -csapdázás Az Sf9 membránokat 5 percig inkubáltuk 8-N 3 [α 32 P]ATP-vel nukleotid-kötés esetében 0 C-on, míg nukleotid-csapdázás esetében 37 C-on csapdázó anionok jelenlétében. Kötési kísérletekben a mintákat 5 percig UV-fénnyel kezeltük. Csapdázáskor a reakciót csapdázó anionokat és feleslegben adott hideg ATP-t tartalmazó jéghideg mosóval állítottuk le, majd a centrifugált pelletet 5 percig UV-fénnyel kezeltük. A mintákat SDS gélelektroforézissel választottuk el és 3 4

4 autoradiográfiával detektáltuk a jelölődést. Az autoradiográfiás csíkokat immunoblottal azonosítottuk. Vezikuláris transzport mérések A jelölt szubsztrátokat MgATP vagy MgAMP jelenlétében inside-out membránvezikulákkal inkubáltuk. Radioaktívan jelölt szubsztrátok esetében a mintákat gyorsfiltráltuk és a vezikulán belüli radiaktivitást scintillációs folyadékban béta számlálóval határoztuk meg. A fluoreszcens szubsztrátok detektálását FACS- Calibur áramlási citométerben végeztük. A hisztogrammokat a CellQuest szoftverrel értékeltük. Vanadát-szenzitív ATP-áz aktivitás mérése A vanadát-szenzitív ATP-áz aktivitás mérésekor az Sf9 vezikulákat szubsztrátok jelenlétében vagy hiányában MgATP-vel inkubáltuk. és a hidrolízis során felszabaduló inorganikus foszfát mennyiségét kolorimetriásan határoztuk meg. A katalitikus ciklus átmeneti állapotának termodinamikai anlízise Az ATP hidrolízis sebességének hőmérsékletfüggését 17 C-től 37 C-ig terjedő hőmérsékleti skálán 4 C-onként határoztuk meg szubsztrátok jelenlétében, illetve hiányában. A ciklus átmeneti állapotát termodinamikailag jellemző paramétereket a linearizált Eyring egyenlet segítségével határoztuk meg. Linear Free Energy Relationship analízis Az ATP-áz aktivitás sebességét parallel mértük 25 és 37 C-on, vizsgálva az alapaktivitást illetve a szubsztrátok által módosított ATP-áz aktivitásokat. A 37 Con mért sebességi állandók logaritmusát a 25 C-on mért sebességi állandók logaritmusának függvényében ábrázoltuk. Eredmények 1. In-silico vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a DMRP az emberi hosszú multidrog rezisztencia-asszociált fehérjék egyetlen ecetmuslica ortológja, és a fehérje felépítése a hosszú MRP-k körében általános TMD 0 -L 0 -TMD 1 - ABC 1 -TMD 2 -ABC 2 doménszerkezeti modellel írható le. 2. A DMRP fehérjét kifejeztük az Sf9-bakulovírus rendszerben a DMRP és - a laboratóriumunkban már korábban vizsgált - hosszú humán MRPk funkcionális összehasonlítását lehetővé tevő expressziós hatékonysággal. 3. Funkcionális kísérleteinkben modellértékű szubsztrátok alkalmazásával meghatároztuk a DMRP transzportkinetikai paramétereit az alábbi, eltérő kémiai szerkezettel rendelkező vegyületek: a gyulladási mediátor LTC 4, az ösztrogén lebomlási termék ösztradiol-glükuronid, a fluoreszcens kálciumszenzor calcein és fluo3, valamint a fluoreszcens szabadgyök indikátor, a karboxidiklorofluorszcein esetében. Összehasonlító vizsgálatainkban megmutattuk, hogy a DMRP-t a fenti szubsztrátok tekintetében a humán transzportereknél egy-két nagyságrenddel nagyobb transzportaktivitás jellemzi. 4. Vizsgáltuk a DMRP gátlószer profilját és megállapítottuk, hogy a DMRP-re az emberi homológokkal megegyező inhibítor-specificitás jellemző. 5. A DMRP esetében tapasztalt magas aktivitás okait kutatva nukleotid-kötési valamint -csapdázási kísérletekben elemeztük a fehérje katalitikus ciklusát. Megmutattuk, hogy a DMRP az emberi fehérjékhez hasonlóan jelölődik a kísérletekben használt radioaktív ATP analóggal, valamint a humán hosszú MRP-khez hasonló módon képes az ATP hidrolízis átmeneti komplexének kialakítására. 5 6

5 6. A DMRP katalitikus ciklusát tovább tanulmányozva kimutattuk, hogy a DMRP a humán hosszú MRP-khez képest kiugróan magas vanadát-szenzitív alap ATP-áz aktivitással bír. Ezt az aktivitást a humán ortológokkal ismert módon interakcióba lépő vízhajtó hatású köszvény ellenes gyógyszerhatóanyag a probenecid, valamint a mesterséges maleimid glutation konjugátum, az NEM-GS nagymértékben fokozza. 7. Ismert, hogy az ATP hidrolízis és a szubsztrát transzport közötti szoros kapcsoltság révén az ABC transzporterek ATP-áz aktivitását a szubsztrátok serkentik. Ugyanakkor a DMRP-vel végzett ATP-áz aktivitási kísérleteinkben meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a szubsztrátok a DMRP-függő vanadátszenzitív alap ATP-áz aktivitást koncentráció függő módon gátolják. A jelenség magyarázatára hipotézist alkottunk: feltételeztük, hogy az Sf9 sejtek membránjában jelen van egy olyan anyag (endogén szubsztrát vagy alloszterikus aktivátor) amely a fehérje úgynevezett intrinsic ATP-áz aktivitását serkenti. A külsőleg hozzáadott szubsztrátok kompetálnak az endogén módosító anyaggal, ennek eredményeképpen a fehérje ATP-áz aktivitása látszólagosan gátlódik. A dolgozatban a fenti hipotézisünket ciklodextrinekkel végzett kísérleteinkben alá is támasztottuk. 8. A DMRP magasfokú aktivitását alapul véve vizsgáltuk a fehérje katalitikus ciklusa során a sebességmeghatározó átmeneti termék kialakulását kísérő termodinamikai folyamatokat. Megállapítottuk, hogy az alap- illetve a szubsztrátok által modulált aktivitások esetében eltérnek a katalitikus ciklus sebességmeghatározó lépését leíró aktivációs entalpia és aktivációs entrópia értékek, ugyanakkor az átmeneti komplex kialakulását mindkét esetben azonos aktivációs szabadenergia változás kíséri Megmutattuk, hogy a dmrp gén fehérjetermékei endogén módon jelen vannak felnőtt ecetmuslicában, valamint S2 embrionális sejtekben, ezzel fehérjeszinten alátámasztottuk a fehérje ubikviter előfordulását mrns szinten leíró irodalmi adatokat. 10. Funkcionális esszékben azonosítottuk a fehérje két potenciális, mind gazdasági, mind ökológiai vonatkozásban jelentőséggel bíró peszticid szubsztrátját. Következtetések 1. A DMRP az emberi ortológok jól használható modellje, mivel azokkal átfedő szubsztrát specificitással, inhibítor profillal bír, ugyanakkor funkcionális esszékben kiemelkedően magas aktivitás jellemzi. 2. Az Sf9 sejtmembránban jelen van egy ismeretlen endogén szubsztrát vagy allosztérikus aktivátor, amely a DMRP működését modulálja. 3. Munkánk eredményeként elsőként vált lehetővé egy MRP-típusú ABC fehérje katalitikus ciklusának termodinamikai vizsgálata. Megállapítottuk, hogy a DMRP katalitikus ciklusának sebességmeghatározó lépése eltérő termodinamikai paraméterekkel jellemezhető külsőleg hozzáadott szubsztrátok jelenlétében illetve hiányában. Eredményeink jelentősége, hogy bár az MDR és MRP-típusú ABC fehérjék katalitikus ciklusa ismert módon eltér, vizsgálataink alapján feltételezhető, hogy ezen transzporterek katalitikus ciklusában az átmeneti állapot kialakulását kísérő termodinamikai folyamatok hasonlóak. 4. In vitro eredményeink alapján elképzelhető, hogy a rovar illetve az emberi hosszú MRP fehérjék szerepet játszhatnak a fenitrothion és bioallethrin nevű mezőgazdaságban alkalmazott peszticidek méregtelenítési folyamataiban. 8

6 Publikációk A dolgozat alapjául szolgáló közlemények: 1. Tarnay J.N, Szeri F, Iliás A, Annilo T, Sung T.C, Le Saux O, Váradi A, Dean M, Boyd C.D, Robinow S. (2004) The dmrp/cg6214 gene of Drosophila is evolutionarily and functionally related to the human multidrug resistance-associated protein family. Insect Mol. Biol. 13(5): Szeri F, Iliás A, Pomozi V, Robinow S, Bakos É, Váradi A. (2009) The high turnover Drosophila multidrug resistance-associated protein shares the biochemical features of its human orthologues. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1788: Egyéb saját közlemények: 1. Klein I, Ésik O, Homolya V, Szeri F, Váradi A. (2001) Molecular genetic diagnostic program of multiple endocrine neoplasia type 2A and familial medullary thyroid carcinoma syndromes in Hungary. J Endocrinol., 170: Bodó A, Bakos É, Szeri F, Váradi A, Sarkadi B. (2003) The role of multidrug transporters in drug availability, metabolism and toxicity. Toxicol Lett., 140: Bodó A, Bakos É, Szeri F, Váradi A, Sarkadi B. (2003) Differential modulation of the human liver conjugate transporters MRP2 and MRP3 by bile acids and organic anions. J Biol Chem, 278: Köszönetnyilvánítás Ezúton is szeretném köszönetemet kifejezni mindenekelőtt témavezetőimnek, Váradi Andrásnak és Sarkadi Balázsnak, akik munkám során mindvégig támogatták munkámat, kritikai észrevételeikkel, tanácsaikkal nagymértékben elősegítették szakmai fejlődésemet. Nagy köszönettel tartozom Liliom Károlynak a főként, de nem kizárólagosan - termodinamikai és statisztikai kérdéseket érintő tudományos diszkussziók lehetőségéért, valamint dolgozatom kritikai szemléletű áttanulmányozásáért. Köszönet illeti Iliás Attilát a kezdeti lépéseimben, a DMRP fehérje expressziójában, valamint a csapdázási kísérletekben nyújtott segítségéért. Köszönöm továbbá Bakos Évának - diplomamunkás korom témavezetőjének - a sok hasznos tanácsot, amivel a későbbiek során is ellátott. Köszönöm Szakács Gergelynek a tudományos problémák iránt megnyilvánuló intenzív és motiváló érdeklődését, valamint dolgozatom alapos és kritikus áttanulmányozását. Köszönettel tartozom Pomozi Violának az áramlási citometria rejtelmeibe nyújtott bevezetésért, valamint Homolya Lászlónak az itt nem tárgyalt konfokális kísérletekben nyújtott segítségéért. Nagy köszönettel tartozom továbbá Demeter Györgyinek és Kis Juditnak - csoportjaink elhivatott asszisztenseinek - munkám során nyújtott segítségükért. Köszönöm továbbá a Váradi és Sarkadi kutatócsoportok minden tagjának a közvetlen és tudományosan motiváló légkört. Végül, de nem utolsósorban, hálával tartozom szüleimnek, akik munkám során mindvégig mellettem álltak, valamint kislányomnak, aki személyiségével bearanyozta számomra az együtt töltött szabadidőt. 9 10