Vegyületek antheimintikus hatásának felderítésére végzett hazai vizsgálatok féregmodelleken

Átírás

1 Paraît. Hung Vegyületek antheimintikus hatásának felderítésére végzett hazai vizsgálatok féregmodelleken TAKÁTS Csilla Az Allatorvostudománvi Egyetem Parazitológiai Tanszékének Helmintológiai Kutató Laboratóriuma, Budapest A gyógyszeripar világszerte nagy erőfeszítéseket tesz ujabb, az eddigieknél hatékonyabb anthelmintikumok szintetizálására. Mivel a paraziták biokémiája és a gyakorlatban is használt kiváló anthelmintikumok hatásmechanizmusa is kevéssé ismert, még a modern laboratóriumok számára is gondot okoz és időigényes munkával jár l - l uj antheimintikus hatású vegyület felfedezése. Az ilyen célú tevékenység első lépéseiként a különböző szkriningvizsgálatok terjedtek el. "Screen" /"screening"/ angol szó, jelentése a többi között szűrés, szitálás, átvitt értelemben i t t a vegyületek féregellenes hatásának felderítésére alkalmazott laboratóriumi módszer. Az antheimintikus tulajdonságú vegyületek kiválogatása a következő munkafolyamatban valósulhat meg: 1. in vitro szkrinelés, 2. in vivo szkrinelés, laboratóriumi gazdaállat-féregmodellen /primer szkrin/, 3. in vivo szkrinelés,haszonállatgazda-féregrendszeren /szekunder szkrin/. 1. In vitro szkrinelés. Lényege: a férgek 37 C hőmérsékletű közegben érintkeznek az oldatba v i t t és meghatározott koncentrációjú vegyülettel, különböző ideig, majd a férgek mozgásának és egyéb életjelenségeiknek a vizsgálata alapján birálható el,hogy + A Magyar Parazitológusok Társaságának 1972^. április 27-i tudományos ülésén elhangzott előadás alapján.

2 az anyagot további hatásvizsgálatnak érdemes-e alávetni. Bár az in vitro technika metodikailag sokkal egyszerűbb és olcsóbb, mint az in vivo technika, mégsem terjedt el olyan mértékben, mint az utóbbi. Ennek a többi között az is az oka, hogy mig például a baktériumok és a gombák in vitro eredményesen és tömegesen tenyészthetők, addig a parazita férgek a gazdaszervezet nélkül alig vagy egyáltalán nem állithatók elő. A vizsgálatok az élősködő *érgeken kivül a hozzájuk rendszertanilag közel álló szabadon élő helminteken is végezhetők. Az utóbbi években hazánkban is folytak in vitro szkrining-vizsgálatok az EGYT Gyógyszervegyészeti Gyárban, ahol Dr. ÖRDÖGH FERENC vezetésével gyürüsférgeken /a Tubifex rivulariumon és az Enchytraeus albiduson/ több száz vegyületet szkrineltek /dr.ha LÁSZ ZSUZSA szóbeli közlése/. 2. In vivo primer szkrinelés. Az antheimintikus hatású vegyületek elsődleges kiválogatására manapság a gazda-féregmodelleken történő vizsgálatok terjedtek el. E vizsgálatok lényege az,hogy a kivánt féregfajjal mesterségesen fertőzött laboratóriumi gazdaállatot kezeljük a vizsgálandó kémiai anyaggal, ós a hatékonyságot a kezelt állatokban talált átlagos féregszámnak a kezeletlen, kontrollcsoportbeli állatok átlagos féregszámához való viszonyítása alapján biráljuk el. Az 1. táblázat bemutatja a leggyakrabban használt gazda-féregmodelleket. E modellek egyikén vagy másikán szkrineléssel nyert eredmény bizonyos valószínűséggel vonatkoztatható az emberben és a háziállatokban élősködő féregfajokra. Igy pl. ha egy vegyület hatékony a fehér egér Syphaciájára vagy Aspiculurisára, remélhető, hogy hatékonyságot mutat a ló Oxyurisa vagy az ember Enterobiusa ellen i s, mivel mind a négy féregnemzetség az Qxyuridae családba tartozik. Laboratóriumunkban fonálféreg- és galandféregellenes hatékonyságra szkrinelünk. Modellként a következő fajokat választottuk: két fonálféregfajt, a Nippostrongylus brasiliensist patkányban.

3 1. táblázat Gazdaállat Az antheimintikus aktivitás elbirálására leggyakrabban használt gazda-féregmodellek Féregfaj Laboratóriumi egér Schistosoma mansoni Schistosoma japonicum Hymenolepis nana Nematospiroides dubius Nippostrongylus brasiliensis Ascaris lumbricoides /lárvális alakj a/ Syphacia obvelata Aspiculuris tetraptera Trichocephalus muris Trichinella spiralis Laboratóriumi patkány Fasciola hepatica Hymenolepis diminuta Strongyloides r a t t i Nippostronqylus brasiliensis Heterakis spumosa Aranyhörcsög Dicrocoelium dendriticum Opisthorchis felineus Tenge rimalac Metastrongylus apri Dictyocaulus f i l a r i a Dictyocaulus viviparus Nyúl Fasciola hepatica Dicrocoelium dendriticum Trichostrongylus retortaeformis Ascaris lumbricoides Passalurus ambiguus Csirke Choanotaenia infundibulum Raillietina cesticillus Ascaridia g a l l i Heterakis gallinae i l l. a Nematospiroides dubiust egérben és a Hymenolepis nana galandféregfajt egérben. A gazdaként használt laboratóriumi egér és patkány könnyen kezelhető, olcsó és kisméretű állat. A szkrinelendő vegyületből gyakran csak 1-2 gramm áll rendelkezésünkre, ez a kis testsulyu állatok kezelésére elegendő.

4 A mesterségesen létrehozott fertőzés a következő előnyökkel jár: a gazdaállatok egyidősek és meghatározott fiatal korban fertőzhetők, egy állományból származnak, a fertőzésre használt adag tetszés szerint beállitható, a fertőzés megeredésének ideje, a féregpopuláció nagysága megközelítőleg azonos, és ismerve a féreg életciklusát, a kezelések és a leölések a kivánt időben végezhetők. Mindhárom modellnél figyelembe veendő - részben metodikai szempontok: a vizsgálatok során hagyományos tenyészetekből szánmazó egészséges,14-18 g-os laboratóriumi egereket és g-os patkányokat, tehát f i a t a l, a fertőzés iránt nagymértékben fogékony állatokat használunk. A fertőző dózis mértéke minden esetben csak a gazda és a féregfaj ismeretében állapitható meg: a fertőzés ne okozzon klinikai tüneteket, de elegendő féreg fejlődjék ki ahhoz, hogy az eredmények statisztikusán értékelhetők legyenek. A szkrinelendő vegyület oldatát /vagy szuszpenzióját/ a tolerált maximális adagban igyekszünk alkalmazni. Az adag nagyságát olyan módon állapitjuk meg, hogy az állatok életben maradjanak, de a férgek a lehető legnagyobb koncentrációjú anyaggal "találkozzanak". A testsúlyra kiszámitott hatóanyagot szondával j u t tatjuk az állatok nyelőcsövébe, A hatékonyság kifejezésére az /A - B/ x 100 ^ formula alapján /melyben A= a kezeletlen csoport átlagos féregszáma, B= a kezelt csoport átlagos féregszáma/ kiszámitott százalékos értéket használjuk. Ez az érték közvetlenül mutatja, hogy a kezelt állatok egyedi féregszámainak átlagértéke mennyivel csökkent a kontrollok átlagos féregszámaihoz viszonyitva. Például, ha a kezeletlen csoportban a férgek száma 400 és a kezeitben 100 f akkor az aktivitás:

5 400 = 75 % A féregpopuláció 50 %-osnál kisebb mértékű csökkenését annak a jeleként értékeljük, hogy a vizsgált vegyület a parazitával szemben nem eléggé hatásos. 50 %-nál nagyobb hatás esetén a vizsgálatot megismételjük, s ha a hatékonyság elérte a 80 %-ot, a vegyületet további finomabb hatásvizsgálatra javasoljuk. A vizsgálatoknak ebben a szakaszában a szkrinelendő vegyület hatékonyságát ismert, kiváló anth elmintikumokkal összevetve is megvizsgáljuk /lásd később/. 3. In vivo szekunder szkrinelés. A primer szkrinelés során hatékonynak bizonyuló vegyületek további vizsgálata arra irányul, hogy a gazdasági haszonállatok férgei ellen is hatékonyak-e. E vizsgálatokhoz természetes uton fertőződött, vagy mesterségesen fertőzött gazdaállatokat lehet használni. Pl. ha a Hymenolepis nana ellen egérben hatékonynak mutatkozik egy vegyület, akkor érdemes a vizsgálatokat a kutya, a juh, a baromfi, a halak stb. galandférgei ellen is kiterjeszteni. A terepen végzett szekunder szkrinelés biztos választ ad a vegyület hatékonyságáról az illető féregfajjal szemben. Az anthelmintikumok iránt világszerte nagyon nagy a kereslet, nincs elegendő hatékony vegyület forgalomban, hazánkban sem ki elégítő ebben a vonatkozásban a helyzet. A közelmúltban már a hazai gyógyszergyárak részéről is felmerült az az igény, hogy az általuk előállított vegyületek hatásvizsgálatát féregmodelleken is el kell ene végezni ben el is kezdtük e vizsgálatokat és azóta folyamatosan végezzük azokat. A Helmintológiai Kutató Laboratóriumban folyó ilyen irányú munkánkról gazda-féregmodellként részletezve a következőkben számolok be. A/ Nippost ronqylus i brasiliensis - patkányban A vékonybélben élősködő Nippostrongylus [ brasiliensist /Travassos, 1914/ /Trichostrongylidae/ mesterségesen fertőzött patkányban először WHITLOCK /1943/ és ROGERS /1944/ vette igénybe

6 antheimintikus hatás vizsgálatához. Dr. KASSAI TIBOR a Londoni National Institute for Medical Research Parazitológiai osztályán fenntartott törzsből 1965-ben hozott Magyarországra fertőzőképes lárvákat, és kidolgozta e faj fenntartásának módját, modellkénti alkalmazását, majd a rutin szkrinelés hazai metodikáját. A féreg fejlődésmenete. A fertőzés alkalmával a bőr alá fecskendezett fertőző lárvák a véráram utján 72 órán belül eljutnak a tüdőbe. I t t a légutakba vándorolnak, majd a légcső és a garat utján az emésztőtraktusba kerülnek. Rendszerint a fertőzés utáni 4. napon érik el a vékonybelet, ahol - főleg a jejunumban megtelepedve - az 5. napon ivarérettségre tesznek szert, s a 6. naptól kezdve petéket termelnek, amelyek a bélsárral ürülnek a külvilágra. A fertőzöttség a patkányokban a fertőzést követő 20. nap táján megszűnik az erőteljes immunreakció következtében. Metodika. A 3. stádiumu lárvák kitenyésztése végett 5000 lárvával fertőzött patkányok bélsarát a fertőzést követő napon összegyűjtjük. A naponta gyűjtött bélsarat csapviz hozzáadásával dörzsmozsárban pépszerüvé dörzsöljük, miközben sterilizált tőzeget is adunk hozzá a felület növelése és a lárvák jobb oxi génellátása céljából. Az igy kapott pépet szürőpapirkorongra e- gyenletesen felkenjük és Petri-csészében gyengén megnedvesített szivacsra helyezzük. Az igy elkészitett kultúrát 28 C-on tartjuk, ezen a hőmérsékleten 6 nap alatt kifejlődnek és 3-6 hétig fertőzőképesek maradnak a 3.stádiumu lárvák. Felhasználás előtt a lárvákat ugy nyerhetjük ki a kultúrából, hogy a szürőpapirt felkent oldalával lefelé forditva selyemszitára tesszük és C-u csapvizbe helyezzük; a mozgó lárvák a szitán keresztül perc alatt a vizbe vándorolnak. A lárvaszuszpenziót szűréssel, majd alacsony fordulatszámú centrifugálással tovább t i s z t i t j u k. A szuszpenzió lárvatartalmát higitásos módszerrel, sztereomikroszkóp segitségével, 16-szoros nagyitással állapítjuk meg. Ezek után a szuszpenziót ugy higitjuk, hogy 0,1 vagy 0,2 ml-ben legyen a fertőző dózisként használt 1000 lárva.

7 A patkányokat subcutan, tuberkulin-fecskendővel, nagy lyukméretü injekciós tűvel fertőzzük, mivel szűkebb keresztmetszetű tűben a lárvák összetapadhatnak és a tűt eldugaszolhatják. A fertőzés ideje alatt a lárvák egyenletes eloszlását keveréssel biztositjuk, hogy ne ülepedjenek le az edény aljára. Ezután következik a vizsgálandó vegyület megfelelő adagjának nyelőcsőszondán át való beadása. A kezelés időpontját az szabja meg, hogy a vegyületnek a lárvák vagy a k i f e j l e t t férgek elleni hatékonyságát kivánjuk megvizsgálni. A lárvák elleni hatásvizsgálat alkalmával a fertőzést követő napon - amikor a lárvák még nem jutottak el a tüdőbe -, a kifejlett férgek elleni hatékonyság vizsgálatakor pedig a fertőzés utáni 7. napon történik a kezelés. A fertőzött és kezelt patkányokat mindkét esetben a fertőzést követő 9. napon leöljük az azonos számú lárvával és azonos időpontban fertőzött,de nem kezelt kontrollokkal együtt. A vékonybelet kiemeljük, hosszanti irányban felvágjuk, kb.15x15 cm-es gézlapra helyezzük, majd fiziológiai konyhasóoldatot tartalmazó pohárba meritjük ugy, hogy az oldat a belet teljesen ellepje. A poharat egy órán keresztül 37 C-u vízfürdőben tartjuk. Ezalatt a férgek a béltartalomból a pohár aljára ülepednek. A fertőzésre használt 1000 lárva mintegy %-ából f e j lődnek ki érett férgek. A féregszámot állategyedenként a következőképpen állapitjuk meg: 50 ml-es mérőhengerbe gondosan átmossuk az izolátumot, majd a hengert az 50-es j e l i g feltöltjük élettani konyhasóoldattal, alapos felkeverés után 10 ml-t pipettával felszivunk és az ebben található férgek számát kis nagyítással megállapítjuk és öttel szorozzuk. Közben arra is k i terjed a figyelmünk, hogy a férgek ivararányában mutatkozik e eltolódás. A kezelt csoportokban öt-öt, a kontrollcsoportokban t i z - t i z patkányt használunk f e l. Ezen a modellen összehasonlításképpen egy kiváló anthelmintikuiriot, a tiabendazolt négyféle dózisban alkalmaztuk. A 2. és 3. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy a N. brasiliensisnek mind a k i f e j l e t t alakjai, mind a szervezetben vándorló lárvái igen érzékenyek a tiabendazol iránt.

8 2. táblázat A tiabendazol hatékonysága patkányban a Nippo- strongylus brasiliensis lárvális alakjaival szemben Dózis mg/kg Patkányok száma Átlagos féregszám Hatékonyság %-ban + SD X _ , , , ,3 3. táblázat A tiabendazol hatékonysága patkányban a k i f e j l e t t Nippost rongylus brasiliensisszel szemben Dózis mg/kg Patkányok száma Átlagos féregszám X Hatékonyság %-ban + SD , , , ,6 + 0,2 99,8 x Standard deviáció B/ Nematospiroides dubius - egérben A Nematospiroides dubius /Baylis, 1926/ /Trichostrongylidae/ az egerek vékonybelében élősködő fonálféreg. Irodalmi adatok szerint antheimintikus szkrining-vizsgálatokra ezt a fajt SPURLOCK /1942/ használta először, 1970 novemberében a Farbwerke Hoechst

9 /Frankfurt/Main/ helmintológiai laboratóriuma által fenntartott törzsből fertőzőképes lárvákat kaptunk, ettől az időponttól kezdve ezt a fajt is fenntartjuk és szkrining-vizsgálatainkban modellként alkalmazzuk. A féreg fejlődésmenete. Orális fertőzést követően a fertőzőképes lárvák eljutnak a vékonybél felső szakaszába i l l. a Lieberkühn-cryptákon keresztül a mucosa muscularis rétegéig vándorolnak, ahol betokolódnak. A fertőzést követő 6-9. napon végleges helyükre, a bél lumenébe visszavándorolnak és a- teljes ivarérettségig fejlődnek. A peték a fertőzés utáni 6-9. napon jelennek meg a bélsárban. A petetermelés a napon éri el a maximumot, 4-5 hétig magas marad, majd fokozatosan csökken. A fertőzöttség az egerekben hónapig is fennmarad. Metodika. A lárvatenyésztéshez szükséges nagy mennyiségű pete nyeréséhez az egereket 500 lárvával fertőzzük, igy a fertőzést követő 16. napon bélsárgrammonként ezer petét is üritenek. Ettől kezdve gyűjtjük az egerek bélsarát. A bélsárkulturát azonos módon készitjük, mint a N. brasiliensis esetében. Az ott l e i r t eljárástól csupán annyiban térünk el, hogy 22 C-on t a r t juk a tenyészetet. Ezen a hőmérsékleten 6 nap alatt kifejlődnek a fertőzőképes lárvák. A 6-7. napon izoláljuk őket. A lárvák csapvizben +4 C-on 6 héttől 4 hónapig fertőzőképesek maradnak. A lárvaszámolást közvetlenül a fertőzés előtt végezzük, higitásos módszerrel. Az egereket lárvával szondán át fertőzzük. Ezek %-ából fejlődik ivarérett féreg. Mivel ezen a modellen csak a k i f e j l e t t férgek elleni hatékonyság megállapítására végzünk szkrinelést, a vizsgálandó vegyülettel csak a fertőzést követő napon kezelünk. A kezelést követő 4. napon a kezelt állatokat - az azonos számú lárvával és azonos i - dőpontban fertőzött, de nem kezelt kontrollokkal együtt - leöljük, a vékonybelet kiemeljük, és a férgeket 37 C-on élettani konyhasóoldatban izoláljuk, majd mikroszkópos vizsgálattal megállapítjuk az egyedenkénti féregszámot. Egy fonálféreg-ellenes hatásáról ismert kiváló anthelmintikum,

10 a tetramizol ezen a modellen a k i f e j l e t t férgek ellen a következő hatékonyságot mutatta,: 4. táblázat A tetramizol hatékonysága egérben a k i f e j l e t t Ne matospiroides dubiusszal szemben Dózis Egerek Átlagos fé Hatékonysá g mg/kg száma regszám %-a , ,2 60, ,4 96, ,0 C/ Hymenolepis nana - egérben A Hymenolepis nana /Stiles, 1906/ /Hymenolepididae/ az egerek vékonybelében élősködő galandféreg, amely a hazai tenyészetekből származó laboratóriumi egerek mintegy 20 %-ában fordul elő. Fertőző anyagot első alkalommal természetes uton fertőződött e- gerekből nyertünk, majd kidolgoztuk a modellkénti alkalmazásának módszerét. A féreg fejlődésmenete. Az egerek fertőződése a galandféreg fertőzőképes petéinek szájon át való felvételével történik. A peteburokból a gazdaállat emésztőnedveinek hatására az 1. lárva, a hathorgas oncosphaera kiszabadul, és 10 órán belül benyomul a bélbolyhokba, ahol 4 nap alatt kifejlődik a következő lárvaforma, a cysticercoid. A fertőzés után 6-10 nappal a cysticercoid visszatér a bél lumenébe, ahol ivarérettségig f e j lődik. Az ivarérett férgek a vékonybél hátsó negyedében tartózkodnak. A fertőződéstől számitott 15. naptól fertőzőképes peték jelenhetnek meg a bélsárban. A fertőzöttség a napra spontán megszűnhet.

11 Metodika. A kisérleti egerek fertőzésére érett galandféregizekből nyert peték szuszpenzióját használjuk. A peték kiszabaditása céljából az érett izeket csiszolt végül üvegbottal finom selyemszitán szükség szerinti viz hozzáadásával átdörzsölj ük. A kapott szuszpenzió petetartalmát BÜRKER- vagy McMASTER-kamra segitségével állapitjuk meg, A fertőzésre olyen peteszuszpenziót használunk, amelynek 0,1 ml térfogata 100 petét tartalmaz, A g-os, öthetes egerek fertőzését ugy végeztük 1, hogy a peteszuszpenziót szondán át az egerek nyelőcsövébe fecskendezzük. Tapasztalataink szerint az egerek 90%-ában ered meg a fertőzés, és átlagosan 6-8 %-os a kifejlődési arány, Szkriningvizsgálatainkhoz csak azokat az egereket használjuk fel,amelyeket a fertőzést követő napon a felszindusitásos bélsárvizsgálat során galandféreggel fertőzöttnek találunk. A kezeléseket a vizsgálandó vegyülettel a fertőzés utáni napon végezzük, és a kezelt, valamint a kezeletlen kontrollegereket az ezt követő 4. napon öljük le. Felvágjuk a vékonybelet, s az összes galandférget élettani konyhasóoldatba izoláljuk. Tekintettel arra, hogy e müveletek során egy-egy galandféregláncolat nemritkán darabokra szakad, a férgek megszámlálásakor csak a scolexeket vesszük figyelembe, továbbá a mikroszkópos vizsgálatot nemcsak az izolátumra, hanem a vékonybél nyálkahártyájára is kiterjesztjük /előfordul ugyanis, hogy a scolex a bél falában marad megtapadva/. A hatékonyságot a kezelt és a kezeletlen /kontroll-/ csoportokban talált scolexek átlagos számának összehasonlításával, az ismertetett formula alapján számitjuk k i, A galandféreg-ellenes hatásáról ismert Deverminnek /niklozamid/ modellünkön végrehajtott tesztelése során a következő eredményeket kaptuk.

12 5«táblázat A niklozamid /Devermin/ hatékonysága egérben a k i f e j l e t t Hymenolepis nanaval szemben Dózis Egerek Átlagos féreg Hatékonysá g mg/kg száma szám %-ban , ,9 81, , ,0 össze foglalás: Az 1971 decemberéig megvizsgált 171 vegyület antheimintikus hatá sá ra vonatkozóan a 6. táblázatban összefoglalt eredményeket kaptuk. 6. táblázat A hatásvizsgálatok eredményeinek összefoglalása Modell Vizsgált száma vegyületek ebből hatékony Egér - Hymenolepis nana Patkány - N. brasiliensis /ivaré ret t / l i 6 0 Patkány - N. brasiliensis /iá rva/ 55 0 Egér - N. dubius 55 0.

13 TAKÁTS, Cs.: Screening of Compounds for Anthelminthic Action in Model Experiments First results of laboratory screening of locally produced 171 chemicals for anthelminthic action are reported.nippos trongylus brasiliensis in rat,nematospiroides dubius and Hymenolepis nana in mouse were used. Life cycles', maintenance of these helminth species as well as screening procedures are described. Two of the tested compound were found active against H. nana. Irodalom BAKER, N. F.: in "The evaluation of anthelmintics", szerk. E.G. L. Soulsby, Merck and Co. New York, BRACKETT, S. - BLIZNICK, A.: Screening large numbers of new chemical compounds for anthelmintic activity using infections with Nippostrongylus muris in mice Parasit., ERHARDT, A. - LÄMMLER, G. - HINZ, E. - THEMANN, H.: Handb. Exp. Pharm. Eng. Band XVI, Teil 9. Springer-Verlag. Berlin FAHMY, M.A.M.: An investigation of the l i f e cycle of Nematospiroides dubius /Nematoda: Heligmosomidae/ with special reference to the free-living stages. - Z.Parasitenkd KASSAI, T.: A parazitás immunitás némely jelenségének vizsgálata patkány-nippostrongylus brasiliensis modellen. - Parasit. Hung., KASSAI, T. - MÉSZÁROS, F.: Vizsgálatok néhány budapesti állatház laboratóriumi egér- és patkányállományának helmint fertőzöttségéről. - Magyar Állatorvosok Lapja, LEIPER, 3.W.G.: in "The evaluation of anthelmintics", szerk. E. 3.L, Soulsby, Merck and Co. New York, 1964.

14 STEWARD, 3. S : Anthelmintic studies I. A controlled c r i t i c a l enteronemacidal test. - Parasitology, STEWARD, 3. S.s Anthelmintic studies I I. A double enteronemacidal anthelmintic test covering a wide range of activities. - Parasitology, STEWARD, 3. S.s Anthelmintic studies I I I. A taeniacidal testing technique. «Parasitology, Érkezett: I I I. 23. TAKÁTS Csilla Az Állatorvostudományi Egyetem Parazitológiai Tanszék Helmintológiai Kutató Laboratóriuma Budapest, VII. Rottenbiller u. 50.