Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia

Méret: px
Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia"

Átírás

1 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia dr. Medveczky, István dr. Rusvai, Miklós dr. Varga, János dr. Tuboly, Sándor

2 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia dr. Medveczky, István dr. Rusvai, Miklós dr. Varga, János dr. Tuboly, Sándor Publication date 1999 Szerzői jog 1999 dr. Turboly Sándor

3 Tartalom Köszönetnyilvánítás... xvi Előszó... xvii Rövidítések jegyzéke... xviii 1. Bakteriológia Általános bakteriológia A baktériumok jellemzése és helyük az élők világában A baktériumok morfológiája A baktériumok alakja és nagysága A baktériumsejt szerkezete A nukleáris állomány A cytoplasma A cytoplasmahártya A sejtfal A baktériumok burokanyagai A baktériumok csillói A fimbriák (pilusok) A baktériumok spórái A baktériumok morfológiájának vizsgálata Mikroszkópos vizsgálatok A baktériumok megfestése A baktériumok anyagcseréje Autotróf baktériumok Heterotróf baktériumok A szénhidrát-anyagforgalom és a baktériumok energianyerése A nitrogén-anyagcsere A zsíranyagcsere Vitamin- és kiegészítőanyag-igény Pigmenttermelés A baktériumok fontosabb enzimjeinek és anyagcseretermékeinek a kimutatása A nitrogénforgalom enzimjei és anyagcseretermékei A szénhidrátforgalom enzimjei és anyagcseretermékei A baktériumtevékenység gyakorlati hasznosítása A baktériumok tenyésztése A baktériumok növekedése és szaporodása A környezet hatása a baktériumok szaporodására A baktériumok ellenálló képessége a fizikai és kémiai hatásokkal szemben, sterilezés, fertőtlenítés A mikrobák elölésére szolgáló fizikai hatások Hő- és hideghatás A sugárzások hatása Mechanikai hatások A kémiai anyagok hatása Kemoterápia Egyéb kemoterapeutikumok A baktériumok genetikája A genetikai anyag szerkezete és funkciója Extrakromoszomális genetikai elemek (plazmidok) A baktériumok változékonysága A genotípus változékonysága A fenotípus változékonysága (modifikáció) A baktériumok genetikai anyagának a vizsgálata A genetikai anyag megváltoztatásának lehetőségei a baktériumokban Pathogenitás és infectio Pathogen és saprophyta mikroorganizmusok A virulencia A virulencia nem toxikus tényezői iii

4 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia 8.4. A baktériumok toxinjai Részletes bakteriológia A baktériumok rendszertana Bacillus Bacillus anthracis A Bacillus nemzetség gyakoribb saprophyta tagjai Clostridium Clostridium septicum Clostridium novyi Clostridium haemolyticum Clostridium histolyticum Clostridium chauvoei Clostridium perfringens Clostridium colinum Clostridium tetani Clostridium botulinum Clostridium piliforme Staphylococcus Micrococcus Streptococcus Enterococcus Anaerob coccusok Lactobacillus Erysipelothrix rhusiopathiae Listeria Renibacterium Corynebacterium Actinomyces Nocardia Rhodococcus Enterobacteriumok Escherichia Escherichia coli Klebsiella Klebsiella pneumoniae Enterobacter Edwardsiella Shigella Salmonella Citrobacter Serratia Proteus Yersinia Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocolitica Yersinia ruckeri Anaerob, Gram-negatív, pálcika alakú baktériumok Pasteurella Egyéb pasteurella fajok Ornithobacterium rhinotracheale Actinobacillus Haemophilus Brucella Bordetella Moraxella Pseudomonas Aeromonas Vibrio Campylobacter iv

5 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia Helicobacter Arcobacter Spirochaeták Serpulina Serpulina hyodysenteriae Chlamydiák Chlamydia psittaci Rickettsiák Mycoplasmák Ureaplasma Acholeplasma Gombák Dermatophytonok Dimorf gombák Virológia Általános virológia A vírus fogalma A vírusok eredete A vírusok szaporítása Vírusok szaporítása kísérleti állatokban Vírusok szaporítása embrionált tyúktojásban Vírusok szaporítása sejt- és szövettenyészetekben A vírusok tisztítása és koncentrálása A vírusok morfológiája Vírusmorfológiai vizsgáló módszerek Vírusmorfológia A vírusok kémiai összetétele és vizsgáló módszerei Nukleinsavak A vírusnukleinsavak vizsgálata A vírusfehérjék szerepe és felosztása Fehérjevizsgáló módszerek Lipidek Szénhidrátok A vírusok szaporodása (multiplikációja) Adszorpció Penetráció Dekapszidáció (uncoating) Makromolekulák szintézise Virionok összeépülése Virionok kiszabadulása a sejtből A vírus és környezetének kölcsönhatásai Mutáció Vírus vírus kapcsolatok Vírus vírus kapcsolat a genom szintjén Vírus vírus kapcsolat a fehérje szintjén Vírus sejt kapcsolatok Interferonok Sejttranszformáció (oncogenesis) Az oncogenitás mechanizmusa Latens fertőzés Perzisztáló fertőzés Lítikus fertőzés (cytolysis) Vírus szervezet kölcsönhatások A vírus bejutása és terjedése a szervezetben A vírusfertőzés típusai Latens fertőzés Krónikus fertőzés Lassú fertőzések A vírusfertőzések diagnosztikája v

6 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia A vírusok direkt kimutatása A vírusok indirekt kimutatása Védekezés a vírusfertőzések ellen A vírusok ellenálló képessége Fertőtlenítő- és inaktiválószerek Vírusellenes kemoterápia Interferonok és interferoninducerek Szérumok Részletes virológia DNS-vírusok Parvoviridae Parvovirusok Dependovirusok Papovaviridae Papillomavirusok Polyomavirusok Herpesviridae A háziállatok fontosabb herpesvirusai Madarak jelentősebb herpesvirusai Humán herpesvirus-fertőzések Adenoviridae Emlős háziállatok fontosabb adenovirusai Humán adenovirusok Poxviridae Háziállatok fontosabb poxvirusai Hepadnaviridae Nem besorolt DNS-vírusok Az afrikai sertéspestis vírusa Csirkeanaemia-vírus RNS-vírusok Reoviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb reovirusok Birnaviridae A gazdasági haszonállatokat megbetegítő legfontosabb birnavirusok Picornaviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb picornavirusok Caliciviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb calicivirusok Togaviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb togavirusok Flaviviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb flavivirusok Coronaviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb coronavirusok Orthomyxoviridae A háziállatokat megbetegítő influenzavirus A és B genusba tartozó vírusok Mononegavirales Paramyxoviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb paramyxovirusok Filoviridae A Filoviridae családba tartozó fontosabb vírusok Torovirus genus A háziállatokból kimutatott fontosabb torovirusok Rhabdoviridae A haszonállatokat megbetegítő fontosabb rhabdovirusok Bunyaviridae A háziállatokban megbetegedéseket okozó fontosabb bunyavirusok Arenaviridae Az állatorvosi-közegészségügyi szempontból jelentős arenavirusok vi

7 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia Retroviridae A háziállatokat megbetegítő fontosabb retrovirusok Még nem csoportosított RNS-vírusok Bakteriofágok Néhány fontosabb fág Prionok Az állatok prionmegbetegedései Immunológia Immunológia, immunitás, immunrendszer Az immunológia története Az immunitásról általában Az emlősök immunrendszere Centrális (primer) nyirokszervek Perifériás (szekunder) nyirokszervek Phagocytarendszer Lymphocyták Receptorok B-lymphocyták NK (natural killer) sejtek Antigének Az antigének kémiai sajátosságai Az antigének specificitása Az immunrendszer molekuláris egységei Ellenanyagok (immunglobulinok) Természetes ellenanyagok Monoclonalis ellenanyagok Az ellenanyagképzés elméletei Az ellenanyagképzés genetikája MHC hisztokompatibilitási antigének (major histocompatibility complex) MHC I antigének MHC II antigének Házi emlősállatok MHC-antigénjei Lymphokinek és cytokinek Lymphokinek Interleukinek Interferonok Az immunválasz kinetikája Humorális immunválasz Primer immunválasz Szekunder immunválasz Celluláris immunválasz Baktériumokkal szembeni immunválasz Vírusokkal szembeni immunválasz Parazitákkal szembeni immunválasz Gombákkal szembeni immunválasz Transzplantátumokkal szembeni immunválasz Az alotranszplantátumok kilökődésének pathologiája A graft versus host (GHV) reakció pathologiája Nem kilökődő szövet- és sejtféleségek A transzplantáció prognosisa A hisztokompatibilitási antigének és a szövetkilökődés Immunszuppresszív szerek és a transzplantátumok túlélése Daganatokkal szembeni immunválasz Tumorantigének Tumorral társult antigének Tumorra specifikus antigének Differenciálódási antigének Daganatokkal szembeni immunológiai reakciók A daganatsejtek eliminálását gátló mechanizmusok vii

8 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia A daganatok terápiájának lehetőségei Immuntolerancia A magzatok immunválasz képessége Az újszülött állatok immunválasz képessége Az újszülöttek nem specifikus védelmi rendszere Természetes passzív (maternalis) immunitás A maternalis ellenanyagok hatása az újszülöttek immunválasz képességére Az immunkompetencia kialakulása Nem specifikus védelmi rendszerek Gyulladás A komplementrendszer Természetes ellenállás A halak immunrendszere Nem specifikus védekezési mechanizmusok Specifikus védekezési mechanizmusok A madarak immunrendszere Hisztokompatibilitási antigének Immunglobulinok Az embriók immunválasz képessége Szikimmunitás Az immunrendszer phylogenesise Immundeficienciák Primer immundeficienciák Szekunder immundeficienciák Lymphoproliferatív folyamatok okozta deficienciák Autoimmunitás Fiziológiás autoimmunitás Pathologiás autoimmunitás Szervspecifikus autoimmun betegségek A tüdő autoimmun betegségei Az emésztőcső autoimmun betegségei A vese autoimmun betegségei A nemi szervek autoimmun betegségei A szem autoimmun betegségei Az idegrendszer autoimmun betegségei Az endokrin rendszer autoimmun betegségei Az izmok autoimmun betegségei Autoimmun dermatitis Hemolitikus anaemiák Autoimmun thrombocytopenia Szisztémás autoimmun betegségek Szisztémás lupus erythematosus (SLE) Rheumathoid arthritis Allergia I. típusú hypersensitivitás (anaphylaxia) Szérumbetegség Atopiás allergia (idyosyncrasia) II. típusú hypersensitivitás III. típusú hypersensitivitás, immunkomplex- (IC-)képződés (Arthus-féle reakció) IV. Késői típusú (sejt közvetített) hypersensitivitás Az immunprophylaxis Passzív immunizálás (szérumterápia) Aktív immunizálás (vakcinázás) Attenuált vakcinák Inaktivált vakcinák Antigéneket tartalmazó vakcinák Kombinált oltóanyagok Szintetikus vakcinák viii

9 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia Bioszintetikus (rekombináns) vakcinák Anti-idiotípus vakcinák ISCOM (immunstimulating complex) vakcinák Az immunprophylaxis lehetőségei és korlátai Adjuvánsok A vakcinákkal szemben támasztott igények Immunmoduláció Immundiagnosztika Szerológiai próbák Celluláris próbák Jelzéses módszerek Allergiás diagnosztikai próbák Irodalom ix

10 Az ábrák listája 1. A baktériumsejt szerkezete. Osztódó Listeria monocytogenes. Az éppen lefűződő két sejtben a maganyag szétvált, az osztódás csaknem befejeződött, miközben a harmadik leánysejtben a maganyag szétválása éppen folyamatban van, a sejt lefűződése még épphogy csak megkezdődött. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) Osztódó Listeria monocytogenes, mindkét leánysejtben a cytoplasmamembránból betüremkedő nagyméretű mezoszóma (membrántest). A mezoszóma érintkezik a maganyaggal. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) Osztódó Staphylococcus aureus. Az újonnan képződött két sejtben az osztódás tovább folytatódik, jól látható a mezoszóma. A vastag sejtfalat kívülről burok veszi körül. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) Corynebacterium pseudotuberculosis. Középen a gombolyagszerűen feltekeredett DNS. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) Erysipelothrix rhusiopathiae. Hosszú, karcsú pálcika, vastag, a Gram-pozitívakra jellemző sejtfal. Jól látható a nukleáris állomány, a mezoszóma és a poliriboszómaszemcsék tömege. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) Actinomyces pyogenes. Az osztódó sejtet először egy vékony cytoplasmamembrán fűzi ketté. A membrán mindkét leánysejtben kapcsolatban van a kromoszómával. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) Osztódó Escherichia coli. A maganyag szétválása még folyamatban van, miközben a két sejt lefűződése is előrehaladt. A sejtfal vékony és rajta kívülről a lipopoliszacharid réteg (külső membrán). (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 8 8. Az Escherichia coli peptidoglükánjának szerkezete. Az egymással párhuzamosan futó heteroglükánláncokat két azonos tetrapeptid alegység kapcsolja össze A Staphylococcus aureus peptidoglükánjának a vázszerkezete. (M = N-acetil-muraminsav; G = N- acetil-glükózamin) Glicerin teichosav. Ala = alanin, R = hidrogén, glükóz, aminocukrok stb A Salmonella typhimurium lipopoliszacharidjának szerkezete.kdo = keto-dezoxi-oktánsav, Hep = glicero-mannoheptóz, Glü = glükóz, Gal = galaktóz, P = foszfát Csillós Escherichia coli baktérium. (45 000, az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) Fimbriák Escherichia coli baktériumok felületén ( ) Clostridium tetani spóraszerkezete ( , az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) A glükolízis folyamata. A kettős nyilak a glükózból keletkezett 2 molekula glicerin-aldehid reakcióit jelzik; egy molekula glükózból összesen 2 molekula piroszőlősav, 2 ATP, 2 NADH+2 H + keletkezett Az Enterobacter aerogenes glükózfermentációja és lehetséges végtermékei A lactobacillusok glükózfermentációja Az alaninlebontás lehetséges folyamatai a baktériumokban A baktériumok szaporodásának szakaszai. A lag, B exponenciális, C stacioner, D regresszív fázis A penicillinek szerkezete A szulfonamidok és a diamino-pirimidinek támadáspontja a folsavszintézisben Staphylococcus aureus antibiotikum-érzékenységének vizsgálata Resistest-korongokkal Escherichia coli laktóz operonjának és kapcsolt regulátorgénjének szerkezete. A laktóz operon a kromoszóma 10. percében helyeződik; a számok az egyes génekben, lókuszokon talált bázispárok számát mutatják Fágkonverzió okozta antigénszerkezet-változás a Salmonella E-csoportban Egy R-plazmid szerkezeti modellje Az A-E jelzi a plazmid transzferjében szerepet játszó gének, rezisztenciatranszfer-faktorok egy részét; Nm = neomicin, Km = kanamicin, Sm = streptomicin, Szu = szulfonamidok, Kl = kloramfenikol, Te = IS-elemek segítségével a plazmidba épülő tetraciklinrezisztencia, transzpozon Bacillus anthracis egér lépében (tolridiukékkel festve, 1250 ) Clostridium septicum fonalai tengerimalac hashártyájáról készített kenetben (fukszinnal festve, 1250 ) Clostridium tetani levestenyészetből, spórák és vegetatív alakok (Gram-festés, 1250 ) Clostridium botulinum levestenyészetből (Gram-festés, 1250 ) x

11 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia 30. Staphylococcus aureus agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Streptococcus equi subsp. zooepidemicus levestenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Erysipelothrix rhusiquthiae telepek neomicint tartalmazó szűrőpapír körül Listeria monocytogenes agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Actinomyces pyogenes véresagarról (Gram-festés, 1250 ) Mycobacterium bovis szarvasmarha nyirokcsomóban (Ziehl Neelsen-festés, 1250 ) Mycobacterium bovis, M. tuberculosis és M. avium telepei Petragnani-féle tojás táptalajon Dermatophilus congolensis agartenyészetből. Elágazódó, haránt feltöredezett fonalak (Gram-festés, 1250 ) Escherichia coli telepek neutrálvörös-laktóz agaron Salmonella typhimurium telepek bizmut-szulfit-agaron Fusobacterium necrophorum fonalak elhalt szövetekben (fukszinnal festve, 1250 ) Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae agar táptalajon Staphylococcus dajkatelepek mellett Haemophilus paragallinarum telepek főtt vért tartalmazó agartáptalajon, Staphylococcus dajkatenyészet mellett Brucella abortus vetélt szarvasmarhamagzat burkában, intracellulárisan (Köster-féle festés, 1250 ) Bordetella bronchiseptica agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Campylobacter fetus subsp. venerealis agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Serpulina hyodysenteriae agartenyészetből (fukszinnal festve, 1250 ) Serpulina hyodysenteriae elektronmikroszkópos képe (8000 ) Leptospira pomona elektronmikroszkópos képe (8000 ) Chlamydia psittaci vetélt juhmagzatban (30 000, az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) Mycoplasma bovis elektronmikroszkópos képe ( , az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) Mycoplasma arginini telepei agaron (Stipkovits László anyagából) Rhizopus sp. sporangiumának felépítése (fukszinfestés, 1250 ) Aspergillus fumigatus tenyészet Sabouraud-agaron Penicillum sp. spóratartó képletei (fukszinfestés, 1250 ) Candida albicans Sabouraud-agarról (fukszinfestés, 1250 ) Vírusok szaporítása embrionált tyúktojásban. Az embrionált tyúktojás szerkezetének és a choroallatois hártyára történő oltásnak a sematikus rajza Egyrétegű sejttenyészet készítése Sejtklónozás Vírustisztítás és -koncentrálás affinitás kromatográfiás eljárással Vírustisztítás és -koncentrálás gradiens ultracentrifugálással (inkomplett és komplett virionok) Negatívkontraszt-EM technika Vírusárnyékolás A virionpartikula (adenovirus) szerkezete. A római számok az egyes struktúrpolipeptidek sorrendjére utalnak a poliakvilamid gélben végzett elektroforézist követően Helikális szimmetriájú virion Az ikezahedron képe élközéppontos, lapközéppontos és tengelyszimmetrikus vetületben Kapszomerek felépítése (trimerek, penta- és hexamerek, dimerek) Binális szimmetriájú virion Komplex szimmetriájú virion Vírusnukleinsav-térképezés (dr. Benkő Mária felvétele). Az egyes sávokban restrikciós enzimmel kezelt vírusnukleinsav-fragmensek elektroforetikus képe látható. Az elektroforetogram azonossága a vizsgált vírusminták azonosságát valószínűsíti (pl. az 1. és 3., valamint a 7. és 9. minta Ragadós végű fragmensek Nukleinsav-klónozás Nukleinsav hibridizációs eljárás Heteroduplex technika A vírus-dns-nukleotidsorrend meghatározásának sematikus rajza Nukleotidsorrend meghatározáshoz használt poliakrilamid gél fényképe (dr. Benkő Mária felvétele) Hibridomasejt-előállítás folyamata xi

12 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia 77. Hibridomasejt mikroszkópos képe (A: egy B-lymphocytából és egy myelomasejtből, B: két lymphocytából és két myelomasejtből összeolvadt hibridomasejt) Vírusok szaporodásának lépései (magyarázat a szövegben) Vírusok szaporodási ciklusa Az adszorpciós fehérjék speciális elhelyeződése A penetráció általános formái (magyarázat a szövegben) Dupla szálú DNS-vírusok (DNS/2) makromolekuláinak szintézise (Lomniczi (1978) után módosítva). Magyarázat a szövegben Szimpla szálú DNS-vírusok (DNS/1) makromolekuláinak szintézise (parvovirus) Pozitív szálú RNS-vírusok (+/RNS) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben) Negatív szálú RNS-vírusok (-RNS) makromolekuláinak szintézise(magyarázat a szövegben) Dupla szálú RNS-vírusok (RNS/2) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben) Pozitív szálú RNS-t DNS-re átíró vírusok (+/RNS/DNS/2) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben) Vírusok nukleokapszidjainak összeépülése (magyarázat a szövegben) Vírusok kiszabadulása az eukaryota sejtből bimbózással (budding) A rekombináció típusai (magyarázat a szövegben) Orthomyxovírusok rekombinációja (antigén csuszamlás) Fenotípusos keveredés, transzkapszidáció (magyarázat a szövegben) Vírus sejt kapcsolatok (Lomniczi (1978) után módosítva) A vírusfertőzések típusai a sejt szintjén Az interferonok indukciója Az interferonok vírusellenes hatása Malignus transzformáció (mikrotumor) egyrétegű szövettenyészetben (900 ) (Nász I. felvétele) A c-onc- és v-oncgének elhelyeződése a genomban A sejtzárványok típusai (Fenner (1987) után módosítva) cytoplasma Vírusok cytopathogen hatása (sejtlekerekedés). Aujeszky-vírussal (K-61 törzs) fertőzött sertésvesesejt (SEM 1400 x) Vírusok cytopathogen hatása (syncytium) Aujeszky-vírussal (utcai vírustörzs) fertőzött sertésvesesejtek (SEM 1400 ) Nem fertőzött egyrétegű sertésvese-sejttenyészet (SEM 1400 ) Enterális kórképet okozó vírusok támadáspontja A perzisztáló vírusfertőzések típusai (Fenner (1987) után módosítva) A vírusizolálás folyamata Plakkok szövettenyészetben Reovirusok elektronmikroszkópos képe fertőzött sejtben (Az Országos Állat-egészségügyi Intézet felvétele) Rotavirusok immun-elektronmikroszkópos képe (Az Országos Állat-egészségügyi Intézet felvétele) Parainfluenza 3 vírus IF képe fertőzött sejt cytoplasmájában (dr. Köves Béla felvétele) Adenovírus IF képe fertőzött sejtmagban Filterhibridizációs eljárás Polimeráz-láncreakció (PCR) folyamatábrája Vírusneutralizáció hatásmechanizmusának sematikus képe (A: eredményes vírusfertőzés, B: neutralizáló ellenanyagok jelenlétében a vírus nem tud fogékony sejtreceptorához kapcsolódni) Plakkszámlálással történő infektív titermeghatározás szövettenyészeten (Dr. Kükedi András anyagáról készült felvétel) Hemagglutináció-gátlás sematikus képe Hemagglutináció-gátlás Egyes vírusellenes szerek szerkezeti képlete Bovin parvovirus (Az Országos Állategészségügyi Intézet archívumából) Ritchie A. felvétele Parvovirusgenom Parvovirusok szaporodása Bovine papillomavirus (EM). (Az Országos Állategészségügyi Intézet archívumából) Ritchie A. felvétele Papillomavirusok elhelyezkedése a papillomában Papillomák kutya szájában Szarvasmarha herpesvirus (BHV 3) (Országos Állategészségügyi Intézet archívuma, Ritchie A. felvétele) (EM) xii

13 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia 125. Herpesvirus genom osztályok Herpesvirusok multiplikációja. Murray és mtsai. (1990) után módosítva Adenovirus negatív kontraszt elektronmikroszkópos képe (Országos Állategészségügyi Intézet archívumából) Ritchie A. felvétele Adenovirusok multiplikációja Adenovirusok CP-hatása: zárványképződés borjúvese szövettenyészeten Poxvirus (papagájhimlő) virionjának EM képe. (Országos Állategészségügyi Intézet archívumából) Ritchie A. felvétele Poxvirusok multiplikációja Poxvirus zárványok Poxvirus által okozott pockok CAM-on Hepadnavirus szerkezete Hepadnavirusok multiplikációja (Murray és mtsai. (1990) után módosítva) Afrikai sertéspestis vírus sematikus képe Afrikai sertéspestis: hemadszorpció és cytoplasmazárványok fertőzött sertéslymphocytatenyészetekben Reovirus virionjainak negatívkontraszt-elektronmikroszkópos képe (Ritchie, A. felvétele) Birnaviridae. A fertőző bursitis vagy gumboroi betegség vírusával fertőzött sejt EM képén jól látható a citoplasmazárványokban a virionok parakristályos rendeződése. (Az Országos Állategészségügyi Intézet archívumából.) Picornavirus virionjainak negatívkontraszt-elektronmikroszkópos képe (Ritchie, A. felvétele) Calicivirus virionjainak negatívkontraszt-elektronmikroszkópos képe (Ritchie, A. felvétele) Coronavirus virionjának negatívkontraszt-elektronmikroszkópos képe (Ritchie, A. felvétele) Orthomyxovirus (sertésinfluenza) virionjának negatív kontraszt elektronmikroszkópos képe (Ritchie, A. felvétele) Paramyxovirus (parainfluenza 3) virionjának negatívkontraszt-elektronmikroszkópos képe (Ritchie, A. felvétele) Rhabdovirus (VSV - New Jersey) virionjának negatívkontraszt-elektronmikroszkópos képe (Ritchie, A. felvétele) A retrovirusok csoportosítása A bakteriofágok csoportosítása Prionmolekula szerkezete A fertőző fehérje modell (magyarázat a szövegben) Az agyszövet alapállományának szivacsszerűvé válása (spongioform encephalopathia). Szarvasmarha BSE (külföldi eset) (dr. Vetési Ferenc felvétele) A thymus kéreg- és velőállománya (hematoxilin-eozin festés, 160 ) Plazmasejtek csoportja a lép folliculusaiban (ELMI, 14500, az OÁI felvétele) Centrum germinativum a nyirokcsomóban (hematoxilin-eozin festés, 160 ) A SALT működése Macrophagok receptorai T-lymphocyták receptorai A lymphocyták differenciálódása B-lymphocyták receptorai Kemospecifikus antigének Az immunglobulinok alapszerkezete Az immunglobulinok doménszerkezete Az immunglobulin molekula fragmentumai Az IgG-molekula felépítése Az IgM-molekula felépítése Az IgA-molekula felépítése Anti-idiotípus antitestek Hibridomasejtek előállításának vázlata Az Ig-ok képződésének genetikája Az MHC-fehérjék és a T-sejt receptorszerkezete A T-sejt-felismerés mechanizmussa Primer immunválasz Szekunder immunválasz A kettős felismerés modellje A T-sejt-aktiválódás módja xiii

14 Állatorvosi járványtan I. - Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia 175. A bakétriumokkal szembeni immunválasz Virusokkal szembeni immunválasz Parazitákkal szembeni immunválasz A transzplantátum sorsa a recipiensben (I. R. Tizard után) A transzplantátum kilökődése A daganatsejt felületi antigénjei A daganatsejt és az immunrendszer kölcsönhatása NK sejt felületi struktúrája A B-sejtes tolerancia formái Az immuntolerancia kiváltása egerekben A szarvasmarhamagzat immunológiai fejlődése A szarvasmarhamagzat immunválasz képessége A maternalis immunitás formái A maternlis Ig-ok felszívódása borjakban A colostrum-ig-ok felszívódása az enterocytákban (ELMI, ) Ig-ok az enterocyták plazmájában (ELMI, ) Colostrumból származó lymphocyta az epithelsejtekben (ELMI ) A komplementrendszer működése A Cooper-féle séma A pemphigus formái (I. R. Tizard után) Az anaphylaxiás reakció vázlata A cytotoxikus reakció vázlata IC-k az endothelsejtekben IC-k a tüdőszövetben IC-k a veseglomerulusokban A plazmidklónozás vázlata A vakcinázást követő immunstatus alakulása Az ABR próba Az antiglobulin-próba vázlata A Marrack-féle rácselmélet Az identitási reakciók Az AGP próba A Mancini-féle próba Szérumfehérjék immun-elektroforézise Szérumfehérjék immun-elektroforézise agarközegben Rocket-elektroforézis A direkt komplement kötési próba vázlata Az indirekt komplementkötési próba vázlata ELISA próba vázlata Adenovírusok kimutatása szövettenyészetben Direkt IF eljárás Indirekt IF eljárás xiv

15 A táblázatok listája 1. Egyes Clostridium fajok morfológiai és biokémiai sajátságai A C. perfringens fontosabb toxinjai és az okozott kórképek Az állatokban gyakran előforduló Staphylococcus fajok biokémiai sajátságai A fontosabb Streptococcus fajok biokémiai sajátságai A fontosabb Enterobacterium nemzetségek biokémiai tulajdonságai Egyes Salmonella szerotípusok antigénjei (Kauffmann White-séma) A fontosabb Pasteurella fajok biokémiai sajátságai A Brucella fajok és biotípusok tulajdonságai A fontosabb Campylobacter fajok biokémiai tulajdonságai A háziállatokban előforduló fontosabb Leptospira-szerotípusok és az okozott kórképek Az állatokban előforduló fontosabb Mycoplasma fajok és az általuk okozott kórképek Baltimore-féle genetikai rendszer A vírus és környezetének függőségi viszonyai A vírusok geno- és fenotípusában bekövetkező változások A vírusokban bekövetkező mutációk típusai és eredményei Interferonok típusai és fizikokémiai jellemzői (egér interferon) Retrovirus gének és funkciójuk Vírusok cytopathogén hatása Perzisztáló fertőzések kialakulásának okai Állatok parvovirusok okozta megbetegedései A parvovirus-fertőzés eredménye vemhes sertésben Papillómavirusok által okozott megbetegedések Papillómavírusok által okozott kórképek Aujeszky-vírus fehérjéinek biológiai szerepe Alphaherpeszvirinae alcsaládba tartozó vírusok Betaherpesvirinae alcsaládba tartozó vírusok Gammaherpesvirinae alcsaládba tartozó vírusok Adenovirusok taxonómiája Adenovirusok strukturproteinjei A Chordopoxvirinae alcsaládba tartozó vírusok A prionok által okozott megbetegedések állatokban és emberben A proinok inaktiválása A thymectomia és a bursectomia következményei Lymphocyták százalékaránya a perifériás vérben Az antigén molekulatömege és antigénhatása közötti összefüggés Az immunglobulin osztályok sajátosságai Szérum immunglobulinok koncentrációja háziállatokban (mg/100 ml) Ember, házi- és laboratóriumi állatok immunglobulin-osztályai és -alosztályai Az immunglobulinok mennyisége a colostrumban és a tejben (mg/ml) Ig-ok felezési ideje napokban Az immunrendszer phylogenesise Primer immundeficienciák háziállatokban Szekunder immundeficienciák háziállatokban A lymphoid szöveteket károsító vírusok Autoimmun kórképek A kutyák hemolitikus anaemiája A túlérzékenységi reakciók Vércsoport antigének háziállatokban A vakcinák típusai Élő és inaktivált vakcinák összehasonlítása Immunmoduláló szerek Szerológiai próbák A szerológiai próbák érzékenysége, a próbákkal kimutatható proteinek mennyisége xv

16 Köszönetnyilvánítás A szerzők megköszönik a lektorok észrevételeit és tanácsait, amelyek segítettek a könyv végleges anyagának kialakításában. Köszönik továbbá a bakteriológia egészéhez (Fodor László), illetve egyes fejezeteihez (Stipkovits László, Szigeti Gábor, Veresegyházi Tamás) adott szakmai tanácsokat, Bakonyi Tamás, Makrai László, Soós Pál tanszéki munkatársaknak pedig a könyv szerkesztéséhez nyújtott segítségét. Köszönet illeti a társintézményeket (ÁOTE Kórbonctani és Igazságügyi Tanszék, Freie Universität Berlin, MTA Állatorvostudományi Kutató Intézet, Országos Állategészségügyi Intézet) a könyv képanyagának gazdagításáért. xvi

17 Előszó Tanszéki elődeink (Preisz, Aujeszky, Hutÿra, Manninger, Szent-Iványi) egyedülálló szellemiségük mellett örökül hagyták ránk nemcsak a mikrobiológia és a fertőző betegségek összefüggéseinek kutatását, hanem az oktatás töretlen korszerűsítésének feladatát is. Az Állatorvosi mikrobiológia (bakteriológia, virológia, immunológia, szerk.: Szent-Iványi Tamás) legutóbbi kiadása óta 15 év telt el. Ez idő alatt a diszciplina alapvető változásokon ment át, amikor a molekuláris biológia rohamos fejlődése lehetővé tette a mikrovilágban végbemenő szüntelen változások és módosulások megismerését, értelmezhetővé tette az embert és az állatvilágot fenyegető fertőző betegségek körének új kórképekkel való bővülését, vagy a korábban klasszikusnak ismert betegségek módosult járványtani sajátosságokban való megjelenését. A mikrobiológia interdiszciplináris tudományág, ennek megfelelően könyvünk tartalmazza mindazokat az ismereteket, amelyek a korszerű bakteriológia, virológia és immunológia területén összegyűltek, de elsősorban a fertőző betegségek oktatnának, járványtanának, pathogenesisének, és immunprophylaxisának megalapozását szolgálja. A szaknyelvi írásmód tekintetében az Orvosi helyesírási szótárban (szerk.: Fábián P., Magos P., Akadémiai Kiadó, Budapest 1992.) leírtakat követtük. Reméljük, hogy a könyvet nemcsak az egyetemi hallgatóink, hanem a mikrobiológia különböző területeit művelő szakemberek és gyakorló kollégáink is hasznosíthatják. Budapest, január. A szerkesztő xvii

18 Rövidítések jegyzéke ADCC = antibody dependent cellmediated cytotoxicity AGP = agargél precipitációs próba ALV = madár leukózis vírus APC = antigen presenting cells c-onc = sejt onkogénje CAM = chorioallantois membrán CD = cluster of differentiation CP = cytopathogen CPE = citopathogén hatás DI = defektív interferáló (partikula) Dnáz = dezoxiribonukleáz DNS = dezoxiribonukleinsav ECF = eosinophil chemotactic factor ELISA = enzyme linked immunosorbent assay EM = elektronmikroszkóp ESP = eosinophil stimulation promoter Fab = fraction antigen binding FC = fraction crystalisable GALT = gut associated lymphoid tissue H-E = hematoxilin eozin H-lánc = haevy (nehéz) polipeptidlánc H= hemagglutinin-fehérje HA = hemagglutináció(s) HAG = hemagglutináció(s) IEM = immunelektronmikroszkópos IF = immunfluoreszcencia IFN = interferon Ig = immunglobulin IIF = indirekt immunfluoreszcencia IL = interleukin J-lánc = joining (kötő) lánc xviii

19 Rövidítések jegyzéke KK = komplementkötési próba L-lánc = light (könnyű) polipeptidlánc LAT= latenciához kapcsolódó transzkript MHC = major histocompatibility complex mrns = messenger (hírvivő) RNS N = neuraminidáz-fehérje NK = natural killer sejt NP = nukleoprotein PCR = polymerase chain reaction PFU = plaque forming unit PrP = prion protein RIA = radio immuno assay RNáz = ribonukleáz RNS = ribonukleinsav RSV = Rous-szarkóma virus S = Svedberg konstans SALT = skin associated lymphoid tissue SEM = scanning elektronmikroszkóp SPF = specific pathogenic free (specifikus kórokozóktól mentes) TCID 50 = tissue culture infective dose Th = T-helper lymphocyta Ti = T-iniciator lymphocyta Tk = T-killer lymphocyta Tm = T-memória sejt TNF = tumor necrosis factor trns = transzfer RNS Ts = hőérzékeny mutáns (temperature sensitive) V-onc = vírus onkogénje VN = vírusneutralizáció xix

20

21 1. fejezet - Bakteriológia 1. Általános bakteriológia 1.1. A baktériumok jellemzése és helyük az élők világában A baktériumok a legegyszerűbb sejtszerkezetű, egysejtű, önálló életre képes mikroorganizmusok, a természetben csaknem mindenütt megtalálhatók. A talajban, a természetes vizekben, a levegőben, a növényzeten, az emberi és állati test felületén, továbbá a külvilággal közvetlen összeköttetésben álló szervekben (emésztőcsatornában, légutakban, húgy- és nemi utakban stb.) egyaránt előfordulnak. Az egy adott helyen előforduló baktériumok faja és száma általában jellemző (természetes baktériumflóra), bár a rendelkezésre álló tápanyagok milyenségétől és egyéb környezeti feltételektől függően tág határok között változik. A baktériumoknak igen sok faja ismert, ezek túlnyomó többsége ártalmatlan, saprophyta, amelyek a természetben szabadon élnek és különféle elhalt növényi és állati eredetű szerves és szervetlen anyagokat használnak fel, bontanak le vagy alakítanak át anyagcseréjük során A saprophyta baktériumok biológiai jelentősége mégis igen nagy, mert más mikroorganizmusokkal együtt, anyagcsere-folyamataik révén részt vesznek a szén, a nitrogén és más elemek természetes körforgalmában, és ezzel hozzájárulnak a magasabb rendű szervezetek létfeltételeinek a megteremtéséhez. A baktériumok elenyésző töredéke betegséget képes előidézni, azaz pathogen (pathos=szenvedni). Az orvosi és állatorvosi bakteriológia elsősorban a pathogén fajokkal foglalkozik. A baktériumok rendszertani helye ma sem teljesen tisztázott. Sejtszerkezetük alapján a baktériumokat a kékeszöld algákkal (cyanobacteriumokkal) együtt a sejtmag nélküli prokaryota élőlények, a baktériumoknál magasabb rendű szervezeteket pedig, így a növényi és az állati, egy- és többsejtű organizmusokat is az eukaryota, a valódi sejtmagot tartalmazók csoportjába soroljuk. A baktériumok elnevezése a Linné-féle binominális nómenklatúra alapján a nemzetség (genus) és a faj (species) megjelölésével történik. A nemzetséget nagy, a fajt kis kezdőbetűvel írjuk. 2. A baktériumok morfológiája 2.1. A baktériumok alakja és nagysága A baktériumok gömb, pálcika vagy spirális alakúak. A gömb alakúak (coccusok) átlagos átmérője 1 µm. A gömb lehet szabályos, de zsemle, bab, vese vagy lándzsa alakú is. A coccusok osztódásuk után szétválhatnak egymástól, vagy együtt maradva kéttagú (diplococcus) vagy többtagú láncokat (streptococcus) alkotnak. Vannak azonban olyan fajok is, amelyek a tér különböző irányaiba osztódva négytagú (tetragenus), nyolctagú (sarcina) csoportokat vagy szabálytalan, szőlőfürtszerű halmokat (staphylococcus) alkotnak. A pálcika alakú baktériumok (bacillusok) rendszerint 2 5 µm hosszúak, szélességük 0,5 1 µm. Vannak azonban ennél hosszabb, 5 10 µm hosszú vagy egészen rövid coccoid alakú baktériumok is. A pálcika alakú baktériumok néha megnyúlnak, hosszú fonalakat képeznek. A fonalak hosszúsága akár a 100 µm-t is elérheti. A pálcikák alakja lehet szabályos egyenes vagy kissé görbült. A pálcikák két vége egyes baktériumfajoknál kihegyesedik, ilyenkor orsó alak jön létre (fusiform baktériumok), vagy egyik vége bunkószerűen megvastagodik (corynebacterium). A pálcika alakú baktériumok néha jellegzetes térbeli alakzatokat formálnak, hosszú láncokat képeznek, párhuzamosan egymás mellett helyeződnek (paliszád forma) vagy egy-egy pontjukon egymáshoz tapadva X, Y vagy a kínai írásjelekre emlékeztető alakokat formálnak. A csavart, spirális alakú baktériumok általában 1 5 µm hosszúak, szélességük 0,5 1 µm, vannak azonban olyan fajok is, amelyek hosszúsága akár a 100 µm-t is meghaladhatja. A spirális alakú baktériumok, ha csak egy csavarulatuk van, vessző (comma), ha azonban több, S alakúak, vagy dugóhúzószerűen csavartak (spirillumok). A spirillumokhoz hasonló alakú, de azoktól eltérően nem merev, hanem hajlékony mikroorganizmusok a spirochaeták. A pathogen spirochaeták hossza általában 5 30 µm között változik, a saprophyta spirochaeták hossza azonban ennek többszörösét is eléri. Bár a baktériumok nagysága és alakja az egyes fajokra vagy még inkább azok csoportjaira jellemző, az alakot és a nagyságot lényegesen befolyásolják a környezeti feltételek, így a tenyészet kora, a tenyésztésre használt 1

22 Bakteriológia táptalaj összetétele, a hőmérséklet stb. A fajra jellemző alakú és nagyságú baktériumok a fertőzött, beteg vagy elhullott állatok váladékaiban, szöveteiben, valamint a kóros anyagokból frissen, optimális viszonyok között kitenyésztett tenyészetekben láthatók. Idősebb, többször átoltott vagy kedvezőtlen feltételek között kifejlődött tenyészetekben gyakran jönnek létre a típusostól eltérő, széttöredezett, szemcsés, hólyag, bunkó vagy hosszú fonal alakú, elfajult degenerációs (involúciós) alakok A baktériumsejt szerkezete A baktériumsejt több jellegzetes összetevőből épül fel (1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. ábra). Ezek egy része, így a maganyag, a cytoplasma, a cytoplasmahártya és a sejtfal a baktérium léte szempontjából nélkülözhetetlen. Más alkotórészek viszont, így a burok, a csillók, a fimbriák és a spóra, csupán a baktériumok egyes csoportjaiban találhatók meg és legalábbis optimális tenyésztési viszonyok között, in vitro nem létfontosságúak. A baktériumok (és a kékeszöld algák) sejtszerkezete alapvetően különbözik az egy- vagy többsejtű eukaryota szervezetek sejtjeitől egyebek mellett abban, hogy nincs maghártyával körülvett magjuk, hiányzik belőlük az eukaryotákra jellemző sejtszervecskék többsége, sejtfalukban pedig, néhány faj kivételével, olyan speciális szerkezeti anyag (mukopeptid, peptidoglükán, murein) található, amely az eukaryota sejtekben nem fordul elő. 1. ábra - A baktériumsejt szerkezete. Osztódó Listeria monocytogenes. Az éppen lefűződő két sejtben a maganyag szétvált, az osztódás csaknem befejeződött, miközben a harmadik leánysejtben a maganyag szétválása éppen folyamatban van, a sejt lefűződése még épphogy csak megkezdődött. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 2

23 Bakteriológia 3

24 Bakteriológia 2. ábra - Osztódó Listeria monocytogenes, mindkét leánysejtben a cytoplasmamembránból betüremkedő nagyméretű mezoszóma (membrántest). A mezoszóma érintkezik a maganyaggal. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 3. ábra - Osztódó Staphylococcus aureus. Az újonnan képződött két sejtben az osztódás tovább folytatódik, jól látható a mezoszóma. A vastag sejtfalat kívülről burok veszi körül. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 4

25 Bakteriológia 4. ábra - Corynebacterium pseudotuberculosis. Középen a gombolyagszerűen feltekeredett DNS. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 5

26 Bakteriológia 5. ábra - Erysipelothrix rhusiopathiae. Hosszú, karcsú pálcika, vastag, a Grampozitívakra jellemző sejtfal. Jól látható a nukleáris állomány, a mezoszóma és a poliriboszómaszemcsék tömege. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 6

27 Bakteriológia 7

28 Bakteriológia 6. ábra - Actinomyces pyogenes. Az osztódó sejtet először egy vékony cytoplasmamembrán fűzi ketté. A membrán mindkét leánysejtben kapcsolatban van a kromoszómával. (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 7. ábra - Osztódó Escherichia coli. A maganyag szétválása még folyamatban van, miközben a két sejt lefűződése is előrehaladt. A sejtfal vékony és rajta kívülről a lipopoliszacharid réteg (külső membrán). (A Freie Universität, Berlin, Állatorvosi Fakultása Elektronmikroszkópiai Laboratóriumának felvétele) 8

29 Bakteriológia 2.3. A nukleáris állomány A baktériumok prokaryoták, membránnal körülvett magjuk nincs. A nukleáris állomány egyetlen, szabad véggel nem rendelkező, körkörös, gombolyagszerűen felcsavarodott dupla szálú, óriás DNS-molekula, amely rendszerint a sejttest közepén helyeződik, elektronmikroszkópos vizsgálattal jól felismerhető. A felcsavarodott DNS-fonalak tömegét nukleoidnak, baktériumgenomnak, baktériumkromoszómának nevezzük. A DNS-fonalak funkciójukat illetően megfelelnek az eukaryota sejtek DNS-ének, a genetikai információt tárolják. A DNS-fonal egy ponton, legalábbis időszakosan, kapcsolódik a cytoplasmamembránhoz. Valószínű, hogy ez a pont a baktérium hosszirányú növekedésének és a DNS-fonal megkettőződésének a kiindulópontja is. A DNS megkettőződését, amely a növekedő baktériumokban igen gyors és csaknem folyamatos, rendszerint megkésve követi a sejttest osztódása, így a baktériumsejtben, a növekedés stádiumától függően egyszerre 1 4, egyes fajokban azonban ennél is több maganyag található A cytoplasma A baktériumok cytoplasmájának nincs finomabb belső szerkezete. A cytoplasma mintegy 80%-a víz. A cytoplasma tartalmazza a nukleáris állományt, a riboszómákat, fajonként változóan egyéb pl. polimetafoszfát- (metakrómás), poliszacharid-, és lipoidszemcséket stb., ezenkívül oldott állapotban nagyszámú enzimet, egyéb fehérjéket, ribonukleinsavakat és ásványi sókat. A riboszómák nm nagyságú, a cytoplasma fő tömegét adó szemcsék, amelyek kb. 40% fehérjét (polipeptidláncokat) és 60% RNS-t tartalmaznak. A riboszóma-rns szimpla szálú, a bázisok közül adenint, guaniant, citozint, uracilt tartalmaz. A baktériumok riboszómái kisebbek, mint az eukaryota sejtekben található riboszómák, ülepedési sebességük 70 S. A baktériumsejt nyugalmi állapotában a riboszómák több alegységre disszociálódnak. A riboszómák egy része azonos mrns-hez kapcsolódva poliriboszómákat képez. A riboszómák száma a baktériumokban folyó fehérjeszintézisnek megfelelően változik. Számuk a gyors növekedés időszakában a legnagyobb. A baktériumok cytoplasmájának bázikus festékek iránti affinitása zömmel a riboszómaszemcséknek köszönhető. A riboszómán folyik a fehérjeszintézis (transzláció). 9

30 Bakteriológia A riboszómákon kívül a baktériumok egyes csoportjainak cytoplasmájában még egyéb, a riboszómáknál jóval nagyobb, speciális festési eljárásokkal kimutatható szemcsék is találhatók.a metakrómás (volutin-) szemcsék fonalas vagy ciklikus szerkezetű polimetafoszfátokból állnak, bázikus festékek iránt erős affinitásúak. Foszfáttartalékként szolgálnak a sejt anyagcsere-folyamataihoz. A cytoplasmában található poliszacharidszemcsék (pl. glükogén) valószínűen tartalék tápanyagok. Hasonló szerepe lehet pl. a mycobacteriumokban és a corynebacteriumokban található lipoidszemcséknek is A cytoplasmahártya A baktériumok cytoplasmáját a cytoplasmamembrán határolja. Vastagsága 5 10 nm, a membrán szárazanyagának átlagosan mintegy 55 60%-a fehérje, 25%-a pedig lipoid, zömmel foszfolipid. A cytoplasmahártya a fő ozmotikus határfelület a baktériumsejt plazmája és környezete között. A víz, a krisztalloidok és a kis molekulatömegű tápanyagok egy része diffúzió és ozmózis útján jut be a baktériumsejtbe. A legtöbb molekula transzportját azonban specifikus szállító rendszerek, a membránon átnyúló kötőfehérjék és permeázok szabályozzák a baktériumsejt szükségleteinek megfelelően. A cytoplasmahártya igen gazdag enzimekben. Megtalálhatók benne, illetve a felületén a membrán átjárhatóságát szabályozó permeázok, a citrátciklus enzimjei, a citokróm enzimek, a sejtfal szintézisét végző enzimek stb. A cytoplasmahártya a baktériumok egy részénél a plazma felé helyenként zsákszerűen vagy kesztyűujjszerűen betüremkedik. Ezek a betüremkedéseka mezoszómák (membrántestek). A mezoszómák az aktív sejtműködés időszakában nagyobb felületet nyújtanak a megnövekedett enzimaktivitáshoz és valószínűleg részt vesznek a sejtosztódás folyamatának megindításában is. A cytoplasmahártya önmagában nem képes ellenállni a baktériumsejtben uralkodó nyomásnak. Ha a baktériumok felületéről a sejtfalat lizozimmel vagy egyéb, a peptidoglükánt bontani képes enzimmel leoldjuk, vagy kialakulását penicillinnel megakadályozzuk, izotóniás vagy hipotóniás közegben a cytoplasmahártya fölreped és a baktériumsejt szétesik. Hipertóniás oldatban a sejtfaluktól megfosztott baktériumok zsugorodnak, legömbölyödnek s egy ideig életképesek maradnak. A Gram-pozitív baktériumokból előállított, sejtfal nélküli képleteket protoplasztoknak, a Gram-negatív baktériumokból nyert s a cytoplasmahártyán kívül még többkevesebb lipoproteid-, lipopoliszacharid-komplexet is tartalmazó, legömbölyödött baktériumokat pedig szferoplasztoknak nevezzük. A protoplasztok (és szferoplasztok) hipertóniás tápoldatokban fenntarthatók, tömegük egy ideig növekszik, a sejtfal hiánya miatt azonban általában osztódásra képtelenek. A protoplasztok azonban bizonyos körülmények között osztódni képesek. Ezek az L-formák (Lister nevéből). Spontán vagy indukálószerek (pl. lizozim, penicillin) hatására jönnek létre. A mikroszkópos képben függetlenül attól, hogy eredetileg pálcika vagy gömb alakú baktériumokból származtak polimorfok, rendszerint hosszú fonal alakúak. Mivel e fonalak igen vékonyak, áthaladhatnak a baktériumokat visszatartó szűrőkön (szűrhető baktériumok). Az L-formák kevésbé érzékenyek a környezet ozmotikus viszonyaira, mint a protoplasztok. Az L-formák alkalmanként visszaalakulhatnak eredeti baktériumformává A sejtfal A sejtfal a cytoplasmát körülvevő merev, de bizonyos határokon belül tágulni is képes támasztóelem, amely megszabja a baktériumsejt alakját és lehetővé teszi, hogy a sejthártya ellenálljon a cytoplasmában uralkodó nagy ozmotikus nyomásnak. Vastagsága az egyes fajoktól függően nm, a baktériumsejt tömegének mintegy 10 40%-át teszi ki. A sejtfal a bakteriológiában szokásos festési eljárásokkal nem vagy alig festődik meg. Jól feltüntethető azonban, ha a fixált kenetet csersavoldattal pácoljuk, majd ezután festjük. A csersavas kezelés ugyanis megakadályozza a festékoldat bejutását a sejtbe, és így csak a sejtfal festődik meg. A baktériumok sejtfalának merevségét a hálószerűen felépülő peptidoglükán váz adja. A peptidoglükán váz egymással váltakozva kapcsolódó N-acetil-glükózamin- és N-acetil-muraminsav- (amely az N-acetilglükózamin tejsavétere) molekulákból felépülő, hosszanti elrendeződésű poliszacharid fonalakból és az ezeket harántirányban összekötő peptid alegységekből és peptidhidakból áll. A peptid alegységek rendszerint 4 5 aminosav-molekulából állnak (esetenként azonban tri- vagy hexapeptidek) és a peptidoglükán váz muraminsavmolekuláinak tejsavéteréhez kapcsolódnak peptid kötéssel. A Gram-negatív baktériumok többségében, de a Gram-pozitív fajok egy részében is (pl. a Bacillus megateriumban, a Corynebacterium diphtheriaeben) a peptid alegységek közvetlenül kapcsolódnak egymáshoz (8. ábra). 8. ábra - Az Escherichia coli peptidoglükánjának szerkezete. Az egymással párhuzamosan futó heteroglükán-láncokat két azonos tetrapeptid alegység kapcsolja össze 10

31 Bakteriológia A Gram-pozitív baktériumfajok többségében viszont a peptid alegységek nem közvetlenül, hanem peptidhidak segítségével kapcsolódnak egymáshoz (9. ábra). 9. ábra - A Staphylococcus aureus peptidoglükánjának a vázszerkezete. (M = N-acetilmuraminsav; G = N-acetil-glükózamin) 11

32 Bakteriológia Az egyes baktériumfajok között a peptidoglükán váz aminocukor-molekuláinak a tekintetében alig van eltérés, jelentős különbségek vannak azonban a peptid alegységeket és peptidhidakat felépítő aminosavak milyenségében, számában és szekvenciájában. A peptid alegységekben a leggyakoribb a 8. ábrán szereplő aminosav-összetétel (pl. Escherichia coli és Bacillus subtilis fajokban), a diamino-pimelinsavat azonban gyakran lizin (pl. a Staphylococcus aureusban) vagy ornitin (pl. egyes Spirochaeta és Lactobacillus fajokban) helyettesíti. A peptidhidak aminosav-összetétele ugyancsak változatos (glicinből, alaninból, szerinből stb. álló rövid homo- vagy heteropeptidek). Különbség van az egyes baktériumfajok között abban is, hogy míg pl. a Staphylococcus aureus törzsekben a peptidoglükán aminocukor fonalainak mindegyik muraminsav-molekulájához kapcsolódik peptid alegység, s ily módon a peptidoglükán vázat igen szilárddá tevő sok keresztirányú kötés alakul ki,addig az Escherichia coli baktériumok muraminsav-molekuláinak csak mintegy 30%-ához kapcsolódik peptid alegység, ezért a keresztkötések száma kevesebb, a sejtfal vázszerkezete lazább. Bár a peptidoglükán váz hálózatosan az egész sejt felületét összefogja, egy-egy poliszacharid lánc mindössze diszacharid (N-acetil-glükózamin, N- acetil-muraminsav) egységet tartalmaz. A peptidoglükán vázat lipoproteid-molekulák rögzítik a cytoplasmamembránhoz. A Gram-pozitív baktériumok sejtfalának a vázszerkezete peptidoglükán fonalból áll, a Gram-negatív baktériumoké azonban valószínűleg csupán kettőből. A Gram-pozitív baktériumok többségében a peptidoglükán vázszerkezet hézagait és felületét teichosavak borítják. A teichosavak polialkoholokból, ribitol- vagy glicerinfoszfátból (10. ábra) álló polimerek, amelyekbe rendszerint alanin és baktériumfajonként vagy - csoportonként eltérő összetételű és számú cukormolekulák (esetenként diszacharidok vagy oligoszacharidok) kapcsolódnak. Egyes Gram-pozitív baktériumokban (pl. a Bacillus subtilisben, a Micrococcus luteusban) a teichosavakat cukroknak uronsavakkal alkotott komplexei helyettesítik. A teichosavak és a hozzájuk kapcsolódó cukormolekulák képezik a Gram-pozitív baktériumok sejtfalantigénjeit (hapténjeit). A poliszacharidok mellett egyes Gram-pozitív baktériumok sejtfalában (pl. Streptococcus és egyes Staphylococcus fajokban) találhatók még fehérjeantigének is. A mycobacteriumok sejtfala pedig hosszú szénláncú zsírsavak (mikolsavak) formájában jelentős mennyiségű lipoidot és viaszanyagokat is tartalmaz. A Gram-pozitív baktériumok teichosavakkal borított peptidoglükán váza porózus, így a viszonylag nagy molekulájú anyagok számára is könnyen átjárható. Ezért a Gram-pozitív baktériumok igen érzékenyek a nyálban, a könnyben, a vérsavóban és a szövetnedvekben előforduló lizozim iránt. A lizozim hasítja a peptidoglükán váz két aminocukor-komponense között kialakult kötéseket, ezért a fonalas szerkezet szétesik, a baktériumok elvesztik sejtfalukat, legömbölyödnek. 10. ábra - Glicerin teichosav. Ala = alanin, R = hidrogén, glükóz, aminocukrok stb. 12

33 Bakteriológia A Gram-negatív baktériumok sejtfalának peptidoglükán vázszerkezetét kívülről lipoproteid-lipopoliszacharid- (LPS-)komplexek borítják. E két réteget együtt külső membránnak is nevezik. A lipoproteid-lipopoliszacharid komplexek teszik ki a sejtfal tömegének 80 90%-át. A lipoproteid-molekulák közvetlenül kapcsolódnak a peptidoglükán vázhoz. Ezt fedi a LPS-réteg oly módon, hogy a molekulák poliszacharid része felületesen helyeződik. A Gram-negatív baktériumok LPS-e citotoxikus és egyúttal antigén hatású. Az LPS-komplex a Gram-negatív baktériumok endotoxinja és O-antigénje. A toxicitásért az LPS foszfolipidje (lipid-a), az antigenitásért pedig a poliszacharid komplex a felelős. A lipid-a zsírsavkomponensei valamennyi enterobacteriumban nagyon hasonlóak, de lényegesen különböznek ettől más Gram-negatív baktériumok foszfolipidjének zsírsavösszetevői. Az LPS-komplex poliszacharidja is két részre bontható, mégpedig a lipid-a-hoz kapcsolódó magra (core) és a típus (O-) specifikus oldalláncokra (11. ábra). Ez utóbbiak a Gram-negatív baktériumok O-antigénjei. A mag mindössze néhányféle cukormolekulából épül fel, és ez képviseli az R telepküllemű Gram-negatív baktériumok sejtfalantigénjeit. A mag cukorösszetétele alapján az eddig e tekintetben legjobban megismert Salmonella nemzetség baktériumai mindössze öt csoportba sorolhatók. A maghoz kapcsolódnak az O-specifikus oldalláncok, amelyek 3 5 egyszerű cukorból álló, ismétlődő egységekből épülnek fel. Egy-egy O-specifikus oldallánc akár ismétlődő, lineáris triszacharidot vagy elágazó tetra-, illetve pentaszacharidot tartalmazhat. Az oldalláncok hossza és cukorösszetétele igen változatos, gyakran olyan cukormolekulák is előfordulnak bennük, amelyek a természetben másutt nem találhatók meg. A Gram-negatív baktériumok O-antigénjeinek specificitását az LPS-komplex perifériásan helyeződő cukormolekuláinak milyensége, szekvenciája és térbeli helyzete szabja meg. Az O-specifikus oldalláncok cukormolekulái, a Gram-negatív S teleptípusú baktériumokat hidrofillé teszik, ezért az ilyen baktériumokból stabil szuszpenziók készíthetők. Az O-specifikus oldalláncok részleges vagy teljes elvesztése együtt jár az O-antigenitás elvesztésével, és rendszerint maga után vonja a baktériumok telepküllemének megváltozását is (S R mutáció). 11. ábra - A Salmonella typhimurium lipopoliszacharidjának szerkezete.kdo = ketodezoxi-oktánsav, Hep = glicero-mannoheptóz, Glü = glükóz, Gal = galaktóz, P = foszfát 13

34 Bakteriológia A peptidoglükán vázhoz kapcsolódó lipoproteid- és LPS-komplexek a Gram-negatív baktériumok sejtfalát tömörré, a nagyobb molekulák számára átjárhatatlanná teszik. A sejtfal tömörségének a kialakulásában kationok, főleg kalciumionok is, szerepet játszanak. A tömörség miatt a Gram-negatív baktériumok nem vagy csak alig érzékenyek a lizozim és a penicillin iránt. Érzékennyé tehetők azonban, ha a sejtfal átjárhatóságát híg lúgokkal vagy kationkötő szerekkel fokozzuk. A sejtfal a baktériumok növekedése során a cytoplasmamembránon levő lítikus enzimek hatására egy vagy több ponton felnyílik. A cytoplasmában szintetizálódott N-acetil-muraminsav-pentapeptid-molekulák, uridindifoszfáthoz kötődve aktiválódnak, majd N-acetil-glükózamin-molekulával kapcsolódva, a cytoplasmamembránhoz kötött hordozólipid segítségével kerülnek a sejtfalba, ahol beépülnek a peptidoglükán vázba. A baktériumok sejtfalában, továbbá az ahhoz kapcsolódó felületi rétegekben levő fehérje és poliszacharidantigének vizsgálhatók különféle szerológiai próbákkal, pl. a Gram-pozitív baktériumfajok jelentős részét a sejtfalban található haptének precipitációs próbával való vizsgálata alapján soroljuk szerocsoportokba, míg a Gram-negatív fajok felületi LPS-antigénjeik alapján, agglutinációs próbával oszthatók O-szerocsoportokba. A sejtfal- és a különböző felületi antigének speciális preparálási eljárásokkal kinyerhetők, különféle elektroforetikus módszerekkel, pl. keresztimmun-elektroforézisessel, poliakrilamidgél-elektroforézissel nagyságuk, molekulatömegük, immunoblot eljárással pedig immunológiai specificitásuk is meghatározható. Mindezek a vizsgálatok értékes adatokat szolgáltatnak az egyes baktériumfajok rendszertani besorolásához, rokonsági fokuk és kórtani szempontból is fontos antigénjeik megismeréséhez A baktériumok burokanyagai A baktériumok egy része burkot (tokot) termel. A burok laza szerkezetű, éles határ nélküli, nyálkaszerű vagy tömörebb, többé-kevésbé jól körülhatárolt anyag. A buroktermelő képesség genetikai adottság, a fenotípusban való megjelenése azonban függ a tenyésztés körülményeitől és a rendelkezésre álló tápanyagok milyenségétől. A burokanyagok kémiai összetétele fajonként, baktériumcsoportonként igen változatos, rendszerint poliszacharidok vagy ritkán tisztán polipeptidek. A burokanyagok többsége antigénhatású. A burokanyagok jelenlétét gyakran felhasználjuk a pathogen baktériumok szerológiai csoportosítására. A baktériumok burokanyagai legegyszerűbben tus- vagy nigrozinfestéssel vizsgálhatók. A vizsgálandó baktériumszuszpenzió 14

35 Bakteriológia egy cseppjéhez kevés finom szemcséjű tust vagy nigrozint keverünk, tárgylemezen vékony rétegben széthúzzuk, majd szárítás után mikroszkópban vizsgáljuk. A tus vagy nigrozin miatt sötét környezetben jól láthatók a fénylő baktériumok és a körülöttük levő burok (negatív festés). A burok megfestésére igénybe vehetők speciális festési eljárások is. A pathogen buroktermelő baktériumok az állati testből rendszerint burkos formában tenyészthetők ki. A buroktermelő képesség egyes fajokban összefügg a kórokozó képességgel. A buroktermelő képesség elvesztése gyakran együtt jár a baktériumtelep küllemének megváltozásával (S R mutáció). A burok- vagy toktermelés előfordul saprophyta baktériumfajokban is. A saprophyta aerob spórás baktériumfajok egy része pl. glutaminsavból álló polipeptidburkot,a Leuconostoc mesenteroides pedig glükóztartalmú táptalajon dextránból álló burkot képez A baktériumok csillói A baktériumok egy része aktív mozgásra képes, amely a fajok túlnyomó többségében csillók (flagellumok) segítségével történik. A csillók igen vékony, a baktériumtestnél sokszorta hosszabb, hullámos lefutású, fonal alakú képletek (12. ábra), amelyek a cytoplasmamembránból indulnak ki és a Gram-negatív baktériumokban két pár gyűrű alakú lemezkével (bazális test) részben a cytoplasmamembránhoz, részben pedig a sejtfalhoz vannak rögzítve. A Gram-pozitív baktériumok csillói egyetlen lemezkepárral vannak rögzítve a cytoplasmamembránhoz. A csillók gyors rotációs mozgása eredményezi a baktériumtest elmozdulását. A csillók vékonyságuk miatt közönséges fénymikroszkópban csupán előzetes fémgőzölés vagy speciális pácolási és festési eljárások együttes alkalmazásával tehetők láthatóvá. 12. ábra - Csillós Escherichia coli baktérium. (45 000, az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) 15

36 Bakteriológia A csillók elhelyeződése és száma jellemző az egyes fajokra vagy a fajok csoportjaira. Azokat a baktériumokat, amelyeknek csak egy csillójuk van monotrich, a mindkét végén egy-egy csillós baktériumokat amfitrich, a körülcsillósokat pedig peritrich baktériumoknak nevezzük. A lofotrich baktériumoknak a baktériumtest egyik vagy mindkét végén ecsetszerűen elhelyezkedő csillóik vannak. A csillók összehúzódásra képes, helikális szerkezetű fehérjékből (flagellinekből) épülnek fel. A csillófehérjék immunológiai fajlagossága lehetővé teszi egyes baktériumfajok osztályozását a csillóantigének alapján. A csillófehérjék felépítését több gén kódolja. Az e gének szerkezetében végbemenő változások a csillóantigének megváltozásával, esetleg a csillók elvesztésével járnak. A csillófestési eljárások nehézkessége miatt a csillók jelenlétére rendszerint a baktériumok mozgásából következtethetünk. A mozgás vizsgálható mikroszkópban függőcsepp készítményben, fedőlemezzel lezárt natív kenetben vagy különféle félfolyékony táptalajokban végzett tenyésztéssel. A csillós baktériumok egy része, pl.a Proteus vulgaris, a szilárd táptalajok felületén élénken rajzik A fimbriák (pilusok) Számos, főleg Gram-negatív baktériumfaj felületén találhatók igen vékony, csak elektronmikroszkóppal látható, a baktériumtestnél rövidebb, szőrszerű vagy annál sokszorta hosszabb, a baktériumtestről hajfonatszerűen lelógó fonalak, fimbriák vagy pilusok. Az eddig megismert fimbriák két csoportra oszthatók. A közönséges fimbriák vékony, a baktériumtestnél rendszerint rövidebb proteincsövecskék, peritrich vagy poláris helyeződésűek (13. ábra). Biológiai szerepük csak részben ismert, növelik a baktérium felületét, elősegítve ezzel az anyagforgalmat, a légzést, a 16

37 Bakteriológia membránokhoz kötött folyamatokat, másrészt pedig tapadási (adhéziós) képességet kölcsönöznek a baktériumoknak. A fimbriákkal ellátott baktériumok agglutinálják a legkülönfélébb állatfajok vörösvérsejtjeit, erős a tapadóképességük az állati és növényi sejtekhez. Adhezív sajátságuknál fogva (pl. az emésztőcső, a légutak stb. hámsejtjeihez való tapadás miatt) a pathogen baktériumok egy részénél virulenciafaktorként szerepelnek. 13. ábra - Fimbriák Escherichia coli baktériumok felületén ( ) A közönséges fimbriák finomabb morfológiájuk, számuk, a sejt felületén való elhelyezkedésük, adhezív sajátságaik, továbbá antigénspecificitásuk alapján több csoportba sorolhatók. Leggyakoribb az 1-es típusú fimbriák előfordulása a különféle enterobacteriumok felületén. A fertilitási (F) fimbriák hasonló szerkezetűek, mint a közönséges fimbriák, azoknál azonban hosszabbak, számuk egy-egy baktériumsejten rendszerint nem több mint Képződésüket extrakromoszomális genetikai elemek, plazmidok kódolják. Ezek a fimbriák szerepet játszanak a baktériumok konjugációjában és az ezt követő DNS-átvitelben A baktériumok spórái A spórák a baktériumsejtben képződő kerek vagy ovális képletek (endospóra). A spóraképzés csupán néhány baktériumcsoport sajátsága. Bár a spóraképzés az adott faj genetikai sajátsága, a spórásodás csupán akkor indul meg, amikor a környezet a baktériumfaj szaporodása szempontjából kedvezőtlenné válik (tápanyagok hiánya, anyagcseretermékek felszaporodása, beszáradás stb.). A megindult spórásodás a baktérium kedvező tápoldatba helyezésével megállítható. A spórásodás lehetővé teszi a baktériumok életben maradását kedvezőtlen környezeti feltételek között is. A spóraképződés a baktérium maganyagának és a cytoplasma egy részének (az RNS-nek és kevés fehérjének) a tömörülésével indul meg. A maganyagot és a körülötte levő cytoplasmát a betüremkedő cytoplasmahártya lefűzi a baktériumsejt többi részéről, ezzel kialakula spóraprotoplaszt (prespóra). A spóraprotoplaszt membránja kétrétegű, egy belső és egy külső részből áll. A két membrán között képződik a vékony sejtfalréteg és egy vastag, ugyancsak peptidoglükánból álló cortex. Ezt követi a külső membránon a spóraköpeny kialakulása. A spóraköpeny diszulfidhidakkal összekötött többrétegű (kitinszerű) fehérje (14. ábra). Egyes fajokban a spóraköpenyt még egy vékony lipoprotein hártya is borítja. A spóra a baktériumtest maradékának az autolízisével válik szabaddá. Az érett spórák semmilyen anyagcsere-folyamatot sem mutatnak. 17

38 Bakteriológia 14. ábra - Clostridium tetani spóraszerkezete ( , az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) A spóratok cortexének felépítése hasonlít a sejtfal peptidoglükánjához, de eltérők lehetnek a peptidoglükánba kapcsolódó peptid alegységek és egyéb szubsztituensek, ezért antigenitás szempontjából a spóra jelentősen különbözhet ugyanazon faj vegetatív egyedeitől. A spóraképzés csak bizonyos feltételek között következik be. A Bacillus anthracis levegőn, a Clostridium fajok viszont anaerob viszonyok között, egyes fajok nehezen, mások könnyebben spórásodnak. A spórásodás folyamatátszámos gén szabályozza, amelyek a kromoszómán szétszórtan (valószínűleg lókuszon) helyezkednek el. Az egyik vagy másik gént érintő mutáció a spórásodást különböző szakaszokban állítja meg. A spórák a festékeket nehezen veszik fel, ezért a szokásos módon festett készítményekben a spórák színtelen, kerekded képleteknek látszanak, speciális festési eljárásokkal azonban megfesthetők. A spórák alakja és helyeződése jellemző az egyes baktériumcsoportokra. A spóra helyeződhet a baktériumsejt közepén vagy excentrikusan. Ha a spóra vastagabb, mint a baktériumsejt, a spórás baktérium orsó alakúvá válik (clostridium), ha az ilyen spóra poláris helyeződésű, dobverő vagy teniszütő alak (plectridium) jön létre. Kedvező környezeti körülmények közé kerülve a spórák kicsíráznak, vegetatív baktériumokká válnak. A spórák kicsírázása is több szakaszban megy végbe. A spórás baktériumok egy része megfelelő táptalajokba helyezve közvetlenül vegetatív alakká válik és szaporodik, más fajok spórái azonban csak akkor csíráznak ki, ha előzőleg valamilyen módon (pl. 10 percig 80 C-on való hőkezeléssel, alacsony ph-n való tartással, redukálószerekkel kezelve stb.) aktiváljuk őket. Aktiválásnak tekinthető a spórák korosodása (érése) is. Az aktiválás valószínűen felszakítja a spóraköpeny diszulfidhídjait, ezáltal kedvezővé teszi a permeabilitási viszonyokat a kicsírázáshoz. Az aktiválást felhasználjuk egyes pathogen clostridiumok kitenyésztésekor. A spórák víztartalma igen kicsi, rendszerint nem több mint 20%. Kis víztartalmuk és a spórát körülvevő vastag tok miatt a beszáradással, hővel, sugárzásokkal és kémiai szerekkel szembeni ellenálló képességük lényegesen nagyobb, mint a vegetatív baktériumsejteké. A spórák többsége néhány perces forralást is elvisel, egyes clostridiumspórák azonban akár több órás forralás után is életképesek maradnak. 3. A baktériumok morfológiájának vizsgálata 18

39 Bakteriológia 3.1. Mikroszkópos vizsgálatok A baktériumok alaki sajátságai, kis méreteik miatt csak mikroszkópban vizsgálhatók. A mikroszkópos vizsgálatokat általában közönséges fénymikroszkóppal, sötét látóteres, fáziskontraszt- vagy fluoreszcens mikroszkóppal, esetenként elektronmikroszkóppal végezzük. A közönséges fénymikroszkópban a baktériumok vizsgálatához immerziós lencséket használunk. A lehető legnagyobb feloldóképesség elérése és a fényveszteség minimálisra csökkentése végett a tárgylemezre kent készítmény és az objektív közé egy csepp cédrusolajat cseppentünk. A vizsgálatkor az immerziós lencsét a cédrusolajhoz érintve a kondenzorból a vizsgálni kívánt készítményen át a tárgylencsébe jutó fénysugár csupa azonos törésmutatójú közegen halad át (homogén immerzió). Homogén immerziós lencséket használva a feloldóképesség 0,2 0,4 µm, így a legkisebb méretű baktériumok is láthatóvá válnak. A homogén immerziós lencsék nagyítóképessége általában szoros, a közönséges fénymikroszkópban használt nagyítás pedig szoros. A sötét látóteres mikroszkópban a tárgyat speciális (parabolid vagy kardioid) kondenzorból kilépő ferde fénysugarakkal világítjuk meg. A ferdén haladó fénysugarak a tárgylemezen levő kenet korpuszkuláris elemeibe ütközve megtörnek, s egy részük bejut a tárgylencsébe. Ily módon a látótér sötét marad, a benne levő baktériumok vagy egyéb korpuszkuláris elemek pedig fénylenek, csillognak. A sötét látóteres mikroszkóp különösen alkalmas a baktériumok mozgásának a vizsgálatára. A fáziskontraszt-mikroszkópban a fényt gyűrűs diafragmával ellátott kondenzoron keresztül vetítjük a tárgyra. A kondenzor úgy van beállítva, hogy a tárgylemezen áthaladó meg nem tört fényt a mikroszkóp objektívébe épített, ugyancsak gyűrű alakú fázislemezkére fókuszálja. A készítményen áthaladó, baktériumokba vagy egyéb korpuszkuláris elemekbe ütköző fénysugarak törést és elnyelődést (s ezáltal bizonyos fáziskésést is) szenvednek, így nem a fázislemezke gyűrű alakú perifériás részén, hanem annak transzparens középső szakaszán jutnak keresztül. A fázislemezke a baktériumokon és az egyéb korpuszkuláris elemeken áthaladó megtört fénysugarak fázisát a meg nem tört fénysugarakhoz képest kb. 1/4 hullámhosszal késlelteti. A fáziseltolódást a fénysugarak interferenciája miatt szemünk fényintenzitásbeli különbségként érzékeli. Ha a baktériumokon áthaladó fénysugarak fázisa késleltetett a meg nem tört fénysugarakéhoz képest, akkor a baktériumok a fáziskontrasztmikroszkópos képben a környezetükhöz képest sötétebbek (pozitív fáziskontraszt), ha pedig a fázislemezkét úgy állították elő, hogy az a gyűrű alakban áthaladó meg nem tört fénysugarak fázisát késlelteti, a készítményben levő korpuszkuláris elemek a környezetükhöz képest világosabbak (negatív fáziskontraszt). A fáziskontrasztmikroszkóp, hasonlóan a sötét látóteres mikroszkóphoz, elsősorban élő mikroorganizmusok vizsgálatára szolgál, de benne, szemben az utóbbival, nem csupán a kontúrok, hanem a sejttest finomabb részletei is láthatók. A fluoreszcens mikroszkópban a tárgy megvilágítására ultraibolya sugarakban gazdag fényforrást (rendszerint higanygőzlámpát) használunk. A tárgylemezen levő preparátumot előzetesen fluoreszkáló festékkel (pl. akridinoranzszsal, rodaminnal, fluoreszceinnel) kezeljük. A megfestett baktériumok az ultraibolya sugarakat elnyelik és hosszabb, már a látható fény hullámtartományába eső fény formájában kibocsátják, fluoreszkálnak. Mivel a készítményre vetített fénynyalábból a látható fénysugarakat kiszűrjük, a látótér sötét, a megfestett baktériumok pedig az ultraibolya sugarak hatására kék, zöld vagy sárga színben csillognak. A fluoreszcens mikroszkóp előnye, hogy az így vizsgált készítményben a keresett baktériumok gyorsan megtalálhatók. A fluoreszcens-mikroszkópban nemcsak elölt, hanem erősen hígított fluoreszcens festékekkel intravitálisan festett élő baktériumok és más korpuszkuláris elemek is vizsgálhatók. Fluoreszcens mikroszkópban vizsgáljuk az immunfluoreszcens készítményeket is, amelyek készítése során nem a vizsgálni kívánt mikroorganizmusokat festjük meg, hanem a velük szemben termelt specifikus ellenanyagokhoz kötünk fluoreszkáló festéket. A vizsgálandó mintát a fluoreszcens festékhez kötött ellenanyaggal (ellenanyag-festék konjugátummal) összekeverve az ellenanyag kötődik az antigénhez, ezért a készítményben levő baktériumok (vírusok, egyéb korpuszkuláris elemek, oldott antigének) fluoreszkálnak. Másmás festékkel konjugálva az ellenanyagokat, az immunfluoreszcens eljárás alkalmas a különféle baktériumok (vírusok, antigének) egymástól való megkülönböztetésére is. Az elektronmikroszkópban a tárgy megvilágítására igen rövid hullámhosszú, nagy sebességű elektronsugarakat használunk. Az elektronsugarakat mágneses terek terelik a megfelelő irányba, a képalkotás a vizsgálni kívánt tárgy egyes részeinek eltérő sugártörő képességén alapszik. Mivel a sejtek, az egyéb, biológiai eredetű korpuszkuláris elemek vagy makromolekulák elektronsugár-szórásában nincs lényeges különbség, a sugártörés fokozása végett a készítményeket speciális kezeléseknek (fémgőzölésnek, negatív kontrasztozásnak stb.) vetik alá. Az elektronsugár által alkotott képet lumineszkáló ernyőn teszik láthatóvá vagy filmre rögzítik. A 19

40 Bakteriológia vizsgált tárgy különböző részeinek a képen különböző fényintenzitású, sötét vagy világos tartományok felelnek meg. A hagyományos (transzmissziós) elektronmikroszkópban az elektronsugár áthatol a vizsgálni kívánt vékony rétegű mintán. Az utóbbi évtizedekben azonban megjelent az elektronmikroszkópnak egy továbbfejlesztett változata (a pásztázó vagy scanning elektronmikroszkóp), amelyben az elektronsugár az útjába ferdén elhelyezett készítménybe ütközve (azt letapogatva) másodlagos sugárzást gerjeszt. Ezt a másodlagos elektronsugárzást felfogva és felerősítve a vizsgált mintából háromdimenziójú (sztereo) kép nyerhető. Az elektronmikroszkóp feloldóképessége nanométer nagyságrendű, ami lehetővé teszi nemcsak a baktériumok, vírusok és különféle sejtes elemek alakjának, méretének és finomabb szerkezetének tanulmányozását, hanem fehérje-, nukleinsav- és egyéb óriásmolekulák lefényképezését is A baktériumok megfestése A baktériumok natív (élő) és megfestett állapotban egyaránt vizsgálhatók. A natív (fedőlemezzel lezárt nedves kamra vagy függőcsepp) készítményeket normál fénymikroszkópban, fáziskontraszt- vagy sötét látóteres mikroszkópban vizsgáljuk. A natív készítmények előnye, hogy bennük a baktériumok megőrzik eredeti alakjukat, emellett mozgásuk is vizsgálható. A baktériumokat leggyakrabban festett állapotban vizsgáljuk. A baktériumok megfestésére kezdetben természetes eredetű festékeket (hematoxilint, lakmuszt stb.) használtak, majd ezeket felváltották a szintetikus festékek. Az első szintetikus festékek anilin- (aminobenzol-)származékok voltak, ezért a bakteriológiában használatos festékeket bázikus anilinfestékek néven szokás emlegetni, bár közülük több nem anilinszármazék. A bakteriológiában használt festékek (bázikus fukszin, metilénkék, genciánaibolya, toluidinkék, szafranin stb.) többsége bázikus jellegű, amelyek elsősorban a cytoplasma savanyú komponenseit (a DNS-t, az RNS-t, a foszfátszemcséket stb.) festik meg. A festőoldatok egyszerű vizes oldatok vagy tartalmaznak bizonyos, a festékeknek a baktériumsejtbe való bejutását elősegítő anyagokat (karbolsavat, kálium-hidroxidot vagy újabban felületaktív anyagokat stb.). Az egyszerű festési eljárások során a baktériumtartalmú anyagokból előállított keneteket vagy lenyomati készítményeket megszáradásuk után Bunsen-égő lángja felett áthúzva vagy metil-alkohollal fixáljuk, majd néhány percig festjük, vízzel leöblítjük, megszárítjuk s mikroszkópban immerziós lencsével vizsgáljuk. A fixálás, sőt afestés sem öli el feltétlenül az összes baktériumot, ezért a rögzített és megfestett készítményeket is óvatosan kell kezelni. A baktériumok szerkezeti elemeinek és az egyes baktériumcsoportoknak egymástól való megkülönböztetésére többféle összetett, differenciáló festési eljárást dolgoztak ki. A Gram-festés során a kenetet valamilyen anilinfestékkel (pl. genciána-, kristályibolyával, metilviolával) 3 5 percig festjük. Ezután a tárgylemezről a festéket leöntjük, hígított jód- (lugol-)oldatot csepegtetünk rá, majd kb. egy perc múlva a kenetet vízöblítés nélkül tömény alkohollal (vagy alkohol és aceton azonos arányú keverékével) kivonjuk (differenciáljuk). Ezután vízöblítés, majd vizes szafraninnal vagy hígított karbolvizes fukszinnal kontrasztfestés, újból öblítés és szárítás következik. A megfestett baktériumokban a lugololdat hatására jód-pararozanilin keletkezik, amely a Gram-pozitív fajokból alkoholos kezeléssel sem vonható ki, a Gram-negatív fajok viszont az alkoholos kezelés hatására elszíntelenednek. Az előbbiek a mikroszkópos képben ibolyakék, az utóbbiak pedig piros színűek. Ziehl Neelsen-féle festés. A sav- és alkoholálló baktériumok sejtfaluk nagy lipoid- és viaszanyag-tartalma miatt egyszerű festési eljárásokkal nem festhetők meg. Ezeknek a baktériumoknak a festésére szolgál a Ziehl Neelsen-féle festés. A készítményt karbolvizes fukszinoldattal (Ziehl-féle fukszinnal) öntjük le, a festékpárnát egymás után háromszor óvatosan gőzölésig melegítjük. A megfestett készítményt előzetes vízöblítés után néhány másodpercig 5%-os kénsavoldattal, majd tömény alkohollal kivonjuk. Újabb vízöblítés, majd vizes metilénkékkel való kontrasztfestés után vizsgáljuk. A sav- és alkoholálló baktériumok, amelyek a felvett festéket a savas és az alkoholos kezelés hatására sem adják le, pirosak, minden egyéb baktérium és sejtes elem pedig kék színű. A Ziehl Neelsen-féle festés nemcsak a sav- és alkoholálló baktériumok szelektív festésére, hanem a baktériumok spóráinak a megfestésére is alkalmas. A spórák ugyanis szintén savállók. Ziehl Neelsen szerint festve a spóra piros, a baktériumsejt többi része pedig kék színű. 20

41 Bakteriológia A Gram- és a Ziehl Neelsen-féle festési eljáráson kívül még számos speciális festési eljárás létezik. E festési eljárások közül az állatorvosi bakteriológiában gyakrabban használtakat az egyes baktériumcsoportok tárgyalásakor ismertetjük. 4. A baktériumok anyagcseréje A baktériumok vegyi összetétele fajonként és a szaporodáshoz rendelkezésre álló közeg összetétele szerint tág határok között változik. Tömegük 75 80%-a víz. Szárazanyaguk 2 15%-a ásványi anyagokból (sókból), 2 15%-a fehérjékből és egyéb nitrogéntartalmú anyagokból, 50%-ig terjedő mennyiségben szénhidrátokból, 2 40%-a pedig zsír- és viaszanyagokból áll. A baktériumok anyagcseréje hasonlóan az eukaryota sejtekéhez energianyeréssel járó (katabolikus) és a baktériumsejt anyagainak felépítéséhez szükséges szintetikus (anabolikus) folyamatok összessége. A baktériumok (az autotrófoktól eltekintve) energianyerés céljából nagy molekulájú anyagokat bontanak el, miközben a köztianyagcsere egyes termékeiből és a környezetből felvett anyagokból saját testanyagaikat is felépítik. A baktériumok a vizet, tápanyagaikat és minden egyéb szükséges anyagot a környezetből veszik fel. Az anyagcsere vizes fázisban zajlik le, ezért a víz a baktériumok növekedéséhez, szaporodásához nélkülözhetetlen. A nagy molekulájú anyagokat (poliszacharidokat, fehérjéket stb.) extracelluláris enzimjeik által elbontva teszik alkalmassá a sejtbe való bejutásra. Változatos enzimkészletük következtében alig van olyan természetes anyag, amelyet a baktériumok egyik vagy másik csoportja ne tudna elbontani Autotróf baktériumok A baktériumok egy része testanyagainak felépítéséhez csupán szervetlen anyagokat igényel. Ezek az autotróf baktériumok. Nitrogénszükségletüket a levegő nitrogénjéből, ammóniából vagy különféle szervetlen nitrogénsókból fedezik, szénforrásként pedig a levegő szén-dioxidját hasznosítják. A szerves anyagaik előállításához szükséges energiát vagy színtestjeik segítségével a napfényből fotoszintézis útján (fotoautotrófok), vagy különféle szervetlen anyagoknak (pl. ammóniának nitritté, nitriteknek nitrátokká, elemi kénnek, szulfidoknak szulfáttá stb.) oxidálásával nyerik (kemoautotrófok). A fotoautotróf baktériumokban a fényenergia elnyelésére bíbor, vörös, barna vagy zöld színű baktérium-klorofillek és különféle karotinoid festékek szolgálnak. A magasabb rendű növényekben és az algákban lezajló fotoszintézis abban különbözik a baktériumok fotoszintézisétől, hogy a növényekben a szén-dioxid redukciójához szükséges hidrogéndonor a víz, ezért szabad molekuláris oxigén keletkezik. A baktériumok fotoszintézisekor hidrogéndonorként különféle redukált (a víznél kisebb redoxpotenciálú) szervetlen (kénhidrogén, hidrogén stb.) és szerves anyagok szolgálnak, ezért szabad oxigén nem keletkezik. Az autotróf baktériumok közül néhány faj csak szerves anyagok hiányában használ fel szervetlen anyagokat, ezek a fajoka fakultatívautotróf baktériumok. Az autotróf baktériumoknak kórtani jelentőségük nincs, kivétel nélkül saprophyták, nagy számban találhatók a természetes vizekben és a talajban. A kemoautotrófok közül általános biológiai szempontból fontosaka nitrifikáló baktériumok. Ezek a talajba jutott ammóniát (aerob viszonyok között) energianyerés céljából NO 2-vé (pl.a Nitrosomonas fajok) vagy a NO 2-t NO 3-má (pl.a Nitrobacter fajok) oxidálják, ezáltal az ammóniából a növények számára felvehető nitrogénsókat állítanak elő Heterotróf baktériumok A heterotróf baktériumok testanyagaik felépítéséhez és energiatermelő folyamataikhoz szerves vegyületeket igényelnek. A környezetből felvett szerves anyagokat változatlanul vagy megfelelő átalakítás után felhasználják saját testanyagaik felépítésére, vagy energiatermelés céljából elbontják azokat. A heterotrófok szervesanyagigénye igen változatos. Szénhidrátforrásként felhasználnak különféle poliszacharidokat (glükogént, keményítőt, dextrint, pektint, cellulózt stb.), oligo-, di- és monoszacharidokat, ez utóbbiak között hexózokat és pentózokat, cukoralkoholokat, alkoholokat (glicerint, mannitot stb.), glükozidokat (szalicint, eszkulint stb.), különféle szerves savakat stb. Nitrogénigényük szerint a heterotrófok ugyancsak igen változatosak, egy részük számára elegendő a levegő molekuláris nitrogénje vagy különféle szervetlen ammóniumsók, mások azonban növekedésükhöz aminosavakat, sőt ezenkívül még különféle kiegészítő anyagokat (pl. vitaminokat, nukleinsavakat, hemoglobint) is igényelnek. Zsírokra a baktériumoknak általában nincs szükségük, ezeket anyagcseréjük során különféle szénhidrátokból és nitrogéntartalmú anyagokból állítják elő, egyes baktériumcsoportok (pl. a leptospirák) számára azonban a hosszú szénláncú zsírsavak esszenciális növekedési faktorok. 21

42 Bakteriológia A heterotróf baktériumok közül egyesek (pl.a Mycobacterium leprae, a Rickettsia fajok többsége, a Chlamydia nemzetség tagjai stb.) csupán élő sejtekben képesek szaporodni. Ezeket nevezzük paratróf baktériumoknak is. E sajátságuk valószínűen enzimrendszerük hiányos voltával áll kapcsolatban. A pathogen baktériumok kivétel nélkül heterotrófok, ezért az anyagcsere további tárgyalása során ezekre szorítkozunk A szénhidrát-anyagforgalom és a baktériumok energianyerése A heterotróf baktériumok energianyerési folyamatainak kiindulási anyagai igen változatosak, elsősorban szénhidrátok, amelyeket számos lépésben, enzimek segítségével bontanak le. A keletkező energia egy részét a baktériumok, közvetlenül vagy nagy energiájú foszfátkötésekben (guanozin trifoszfát, GTP, adenozin-trifoszfát, ATP stb.) való tárolás után felhasználják energiaigényük (aktív transzport, bioszintézis, mozgás) fedezésére, a másik része pedig szabad hő formájában távozik. A baktériumok energiájukat főleg oxidatív (aerob) és fermentatív (anaerob) folyamatok útján nyerik, de ismert számos más, kevésbé gyakori (pl. dekarboxilálás, dezaminálás, hidrolízis) energianyerési folyamat is. Azokat a baktériumokat, amelyeknek az energiaszerzéshez a levegő molekuláris oxigénjére van szükségük feltétlen (obligát) aerob baktériumoknak nevezzük.a feltétlen anaerob fajok csupán oxigén nélkül képesek szaporodni, a baktériumok nagy többsége viszont jól szaporodik levegő jelenlétében, de szükség esetén levegő nélkül is meg tud élni. Ez utóbbiak a feltételesen (fakultatív) anaerob baktériumok. A fermentáció során az energianyeréshez rendelkezésre álló anyagok oxidációja hidrogénelvonással, molekuláris oxigén jelenléte nélkül történik (anaerob oxidáció). A baktériumok túlnyomó többsége az energiát különféle szénhidrátok fermentálásával nyeri, vannak azonban olyan baktériumcsoportok is, amelyek erre a célra nitrogéntartalmú anyagokat (fehérjéket, aminosavakat, purin-, pirimidinbázisokat stb.) és különféle egyéb szerves anyagokat is felhasználnak. A nagymolekulájú poliszacharidokat, oligoszacharidokat és diszacharidokat a baktériumok először monoszacharidokká hidrolizálják. A glükózt közvetlenül, az egyéb monoszacharidokat (hexózokat) pedig előzetes (többnyire fruktóz-foszfáttá való) átalakítás után használják fel. A glükóz fermentációjának első szakasza a legtöbb anaerob és fakultatív anaerob baktériumfajban a glükolízis lépcsői szerint megy végbe (15. ábra). A fermentáció során a hidrogént szubsztrátspecifikus dehidrogenázok (oxidoreduktázok) vonják el. A glükózmolekulákból piroszőlősav keletkezik, miközben energia szabadul fel. A dehidrogenáz enzimek prosztetikus csoportja (NAD = nikotinsavamid-adenin-dinukleotid) a felvett két hidrogénatomot a folyamat végén keletkező piroszőlősavnak, egyéb intermedier anyagcseretermékeknek (szerves savaknak, aldehideknek stb.) vagy a környezetben rendelkezésre álló más redukálható anyagoknak (pl. cisztinnek, tioglükolátnak, tioszulfátnak stb.) adja át. Ily módon a dehidrogenáz enzimek újabb hidrogénatomokat képesek felvenni, a piroszőlősavból pedig tejsav keletkezik. A fermentáció során tehát hidrogénakceptorként nem molekuláris oxigén, hanem különféle intermedier anyagcseretermékek és egyéb redukálható anyagok szolgálnak. A redukált NAD-ról folyó hidrogénleadás miatt az anaerob baktériumok erős redukáló hatást fejtenek ki. 15. ábra - A glükolízis folyamata. A kettős nyilak a glükózból keletkezett 2 molekula glicerin-aldehid reakcióit jelzik; egy molekula glükózból összesen 2 molekula piroszőlősav, 2 ATP, 2 NADH+2 H + keletkezett 22

43 Bakteriológia Bőséges mennyiségű glükóz jelenlétében a fermentáció csupán tejsav keletkezéséig megy. Könnyen fermentálható (kis redoxipotenciálú) szénhidrátok hiányában azonban a piroszőlősav és a tejsav fermentatív bontása tovább halad, s végtermékként baktériumfajoktól és -csoportoktól függően különféle szerves savak, alkoholok stb. és gázok keletkeznek. A baktériumok fermentatív úton nemcsak glükózt (és más hexózokat), hanem számos egyéb szénhidrátféleséget is elbontanak energianyerés céljából. Ennek során a felszabaduló energia mellett zömmel szerves savak (pl. a pentózokból ecetsav), különféle alkoholok, aldehidek stb. és gázok keletkeznek. Egyes baktériumcsoportok a szénhidrátok mellett vagy azok helyett, energianyerés céljából nitrogéntartalmú komponenseket, pl. aminosavakat is elbontanak. Az aminosavak fermentatív bontásából rendszerint szerves savak, ammónia és szén-dioxid keletkezik. Az aerob (oxidatív) energianyeréskor az elbontandó anyagok végső oxidációja a levegő molekuláris oxigénjének a jelenlétében történik (légzés, respiráció). Az energianyerési folyamatok oxidatív módja is legtöbbször dehidrogénezéssel, s csak ritkán közvetlen oxidációval indul meg. Esetenként a dehidrogénezést vízmolekulák felvétele előzi meg. A glükózbontás piroszőlősavig a fermentációnál megismert módon folyik. A 23

44 Bakteriológia piroszőlősav és a tejsav, valamint az egyéb, különféle eredetű, részben átalakított vagy elbontott szénhidrátok, szerves savak, zsírsavak stb. további bontása az aerob baktériumok és a fakultatív anaerob baktériumok többségében a citrátciklusnak megfelelően történik. Az aerob folyamatokban azonban a dehidrogenáz enzimek NAD-ján levő hidrogén a flavin enzimek (flavin-mononukleotid, flavin-adenin-dinukleotid) prosztetikus csoportjain aktiválódik, hidrogénionná alakul, az elektronok pedig a citokróm enzimrendszer tagjain keresztül szállítódva a citokróm-oxidáz segítségével a levegő molekuláris oxigénjére adódnak át. Ily módon a szubsztrátokból lehasított hidrogén végül H 2O 2-dá (a baktériumok egy részében vízzé) oxidálódik, miközben jelentős mennyiségű energia szabadul fel. A baktériumok oxidatív energianyerése során tehát a szénhidrátok végül is szén-dioxiddá és vízzé oxidálódnak. A fakultatív anaerob baktériumok egy részében (és egyes, egyébként obligát aerob baktériumokban is) a citokróm enzimrendszer elektronjainak akceptora nem csupán molekuláris oxigén, hanem különféle redukálható anyagok, pl. nitrátok, nitritek, szulfátok és különféle szerves anyagok is lehetnek. Ezek a baktériumok molekuláris oxigén hiányában is képesek oxidatív úton energiát nyerni. Az ide tartozó fajok egy része a talajban él, és abban (anaerob viszonyok között) jelentős nitrogénveszteséget okoz, mert a nitrátot, nitritet ammóniává, nitrogén-oxiddá vagy elemi nitrogénné redukálja (denitrifikáló baktériumok). Bár a baktériumokban a glükózból való energianyerés fő útja a glükolízis és a citrátciklus, ugyanazon baktériumokban a glükózbontás más (kevésbé hatékony) útjai is léteznek. A sejtben keletkező hidrogén-peroxid a baktériumokra erősen mérgező. Elbontásukról a kataláz és a peroxidáz enzimek gondoskodnak. A H 2O 2-ból kataláz hatására víz és molekuláris oxigén keletkezik. A peroxidáz a H 2O 2- ból keletkező oxigént különféle szerves anyagok (pl. glutation) közvetlen oxidálására használja fel. Az obligát anaerob baktériumokból hiányzik a citokróm enzimrendszer és nem termelnek sem kataláz, sem peroxidáz enzimeket. Ez utóbbi enzimek hiánya az egyik oka annak, hogy az anaerobok oxigén jelenlétében nem tudnak szaporodni, sőt egyesek levegővel érintkezve rövid idő alatt (toxikus szuperoxidok keletkezése miatt) el is pusztulhatnak. Az aerob és fakultatív anaerob baktériumokban a szénhidrátok bontása többnyire teljes, az energiakihasználás lényegesen jobb hatásfokú, mint az anaerob baktériumokban. Bár a heterotróf baktériumok testanyagaik felépítéséhez a szerves anyagokat nem nélkülözhetik, egyes fajok, így pl.a Bacillus anthracis, a Brucella abortus, egyes Haemophilus fajok, a Campylobacter nemzetség baktériumai és mások szaporodásukhoz szén-dioxidot is igényelnek. A szén-dioxidot ezek a fajok aminosavaikba, valamint purin- és pirimidinbázisaikba építik be, azok szintézise során. A Lactobacillus fajok pl. szénforrásként csaknem kizárólag szén-dioxidot használnak, a rendelkezésre álló szénhidrátokat pedig energiaforrásként hasznosítják. Az obligát aerob baktériumok energiájukat oxidatív úton nyerik. Pathogen és saprophyta fajok egyaránt találhatók közöttük. A pathogenek közül ide tartozik pl.a Bacillus anthracis, a Brucella és a Mycobacterium fajok, a saprophyta fajokat pedigaz Acetobacter aceti, a Pseudomonas, a Micrococcus fajok stb. képviselik. Egyes obligát aerobok kissé csökkentett oxigéntartalmú légkörben szaporodnak a legjobban. Ezek a mikroaerofil baktériumok. Vannak olyan obligát aerob baktériumok is (pl. a tengervízben szabadon vagy halakon, puhatestűeken élő Photobacterium fischeri és mások), amelyekben a flavinfermentek által felvett hidrogén luciferáz enzimek segítségével a levegő molekuláris oxigénjével egyesül, miközben fény keletkezik. Ez a jelenséga biolumineszcencia. A világítóbaktériumok a tengervízben élnek, nem kórokozók, csupán élelmiszer-higiéniai jelentőségük van. A kórokozó baktériumok többsége fakultatív anaerob. Ezek a baktériumok a rendelkezésre álló tápanyagoktól és azok redoxipotenciáljától függően mind aerob, mind anaerob viszonyok között képesek energiát nyerni. A fakultatív anaerob E. coli baktériumok pl. a glükózból fermentációs úton tejsavat, ecetsavat, hangyasavat, borostyánkősavat, ezenkívül kevés etil-alkoholt, majd a hangyasavból szén-dioxidot és H 2-t képeznek. Bőséges oxigénellátás mellett oxidatív úton a glükózból tejsavon és ecetsavon keresztül, zömmel szén-dioxid és víz keletkezik. Az ugyancsak fakultatív anaerob Enterobacter aerogenes glükózfermentációja (16. ábra) során ugyanolyan szerves savak és gázok keletkeznek, mint az E. colinál, de lényegesen kisebb mennyiségben, ezenkívülaz Enterobacter fajok glükózból még egy speciális anyagcsereterméket, acetil-metil-karbinolt (acetoint) is termelnek. 16. ábra - Az Enterobacter aerogenes glükózfermentációja és lehetséges végtermékei 24

45 Bakteriológia A baktériumok egy jelentős csoportja obligát anaerob. Az obligát anaerobok (pl. a Clostridium, Bacteroides, Fusobacterium fajok, propionsavbaktériumok) csupán fermentatív úton képesek energiát termelni. Szaporodásuk anaerob viszonyok között is csak akkor indul meg, ha elegendő kis redoxipotenciálú tápanyag áll rendelkezésre. A fermentáció végtermékei jellemzőek az anaerobok egyes csoportjaira. A lactobacillusok egy része glükózból csupán tejsavat (homofermentáció), más része a tejsavon kívül egyéb anyagokat, pl. ecetsavat, hangyasavat, etil-alkoholt, szén-dioxidot és hidrogént is termel (heterofermentáció) (17. ábra). A propionsavbaktériumok a szénhidrátokból tejsavat, propionsavat, alkoholokat és különféle egyéb anyagokat állítanak elő. A sebfertőzést előidéző clostridiumok fermentációjuk során főleg vajsavat, ecetsavat és különféle gázokat, CO 2-ot és H 2-t termelnek. A clostridiumok erőteljes fermentációja magyarázza a gázoedemás betegségekben a szövetek megsavanyodását és sercegését. 17. ábra - A lactobacillusok glükózfermentációja 25

46 Bakteriológia A heterotróf baktériumok energiájuk zömét szénhidrátokból nyerik. Az energianyerés mellett azonban a baktériumok a cukormolekulák egy részét felhasználják saját poliszacharidjaik felépítésére. A baktériumsejtbe bejutott cukormolekulák, főleg hexózok, először nagyenergiájú vegyületekről makroerg kötésű foszfátcsoportot vesznek át, majd további nukleotid-trifoszfát felhasználásával uridin-, adenintrifoszfát stb. cukorkomplexek alakulnak ki. Az így létrejött cukornukleotidok cukormolekuláiból épülnek fel a baktériumsejtben (pl. a glükogén), a sejtfalban (a mukopeptidváz, a teichosavak, a sejtfalantigének) és az egyes baktériumok burkában található homo- vagy heteropolimer poliszacharidok. Valószínű, hogy a cukormolekulákat szállító nukleotidfoszfátok milyensége befolyásolja az egyes cukrok beépítésének sorrendjét (és ezáltal fajlagosságát) az egyes bakteriális poliszacharidokba. A baktériumokban lejátszódó bioszintetikus folyamatok összetettségét jelzi, hogy egyes (igénytelenebb) baktériumfajok valamennyi szerves anyagukat akár egyetlen szerves vegyületből (pl. citrátokból, acetátokból vagy más szénforrásból) is fel tudják építeni A nitrogén-anyagcsere A baktériumok nitrogénforrásként fehérjéket, aminosavakat és egyéb szerves nitrogéntartalmú vegyületeket, ammóniumsókat vagy ammóniát, sőt egyes fajok molekuláris N 2-t használnak fel. A baktériumok egy jelentős csoportja proteolitikus enzimjei segítségével képes elbontani a növényi és állati fehérjéket. Ezeka rothasztó baktériumok. A rothasztók a fehérjéket peptidekké és aminosavakká bontják. A fehérjebontók között egyaránt vannak pathogen és saprophyta fajok. A fehérjebontás történhet anaerob (rothadás) vagy aerob viszonyok (korhadás) között. Az aerob fehérjebontók fő képviselői a szaprofita Proteus fajok, a pathogenek közül ide tartozik pl.az Actinomyces pyogenes. Az anaerob fehérjebontás fő képviselője a Clostridium putrefaciens, a kórokozók közül ide tartozik pl. a C. botulinum, a C. histolyticum. A rothadás során keletkezett aminosavak tovább bomlanak, részben dekarboxilálódnak és egyebek mellett különféle igen bűzös vegyületek, aminok (pl. kadaverin, putreszcin, hisztamin), közös néven hullamérgek (ptomainok) keletkeznek, részben pedig dezaminálódnak és különféle szerves savakká (ecetsavvá, tejsavvá, vajsavvá, valeriánsavvá stb.) és gáznemű anyagokká (ammóniává, hidrogénné, szén-dioxiddá stb.) fermentálódnak, miközben energia szabadul fel (18. ábra). A szerves savakból további oxidációjuk során végső termékként szén-dioxid és víz keletkezik. Ezek mellett az aminosavakból keletkezhetnek még további jellegzetes anyagcseretermékek, így pl. a kéntartalmú aminosavakból kénhidrogén, a triptofánból indol, az argininből és más nitrogéntartalmú anyagokból ammónia. 18. ábra - Az alaninlebontás lehetséges folyamatai a baktériumokban 26

47 Bakteriológia A baktériumok többsége a fehérjéket nem képes elbontani. Ezek nitrogénszükségletüket aminosavakból, nitrátokból vagy ammóniából fedezik. Végül vannak olyan (kivétel nélkül saprophyta) baktériumok, amelyek a levegő molekuláris nitrogénjét is fel tudják használni nitrogénforrásként. Ezeknek a baktériumoknak egy része (pl. az aerob Azotobacter fajok, az anaerobok közül néhány Clostridium faj) a talajban és a természetes vizekben szabadon él. A levegő molekuláris nitrogénjéből ammóniát, majd aminosavakat, ezekből pedig fehérjét képeznek (a nitrogénből bőséges oxigénellátás mellett, vas- és molibdéntartalmú nitrogenáz enzimek képeznek ammóniát. Az ammónia alfa-ketoglutársavba kapcsolódva glutaminsavvá alakul). A fehérjék elrothadnak, a felszabaduló ammóniából pedig az autotróf nitrifikáló baktériumok a növények számára felszívható nitrogénsókat állítanak elő. A molekuláris nitrogént megkötni képes baktériumfajok egy másik csoportja (a Rhizobium fajok) a pillangós virágú növények gyökérzetén képződött gümőcskékben él. A levegő nitrogénjéből ammónián keresztül ezek is glutaminsavat képeznek, amelyet részben a baktériumok, részben pedig a gazdanövény használ fel saját fehérjéinek a felépítésére (szimbiózis). Molekuláris nitrogént és ammóniát megkötni képes baktériumok előfordulnak a kérődzők előgyomraiban is. A nitrogénből az aminosavakon keresztül ott is fehérje, majd az emésztés során a fehérjékből újra aminosavak képződnek, amelyek felszívódva hozzájárulnak a kérődzők aminosav-szükségletének a fedezéséhez. A baktériumok aminosav-szintézisét szolgáló nitrogénforrás rendszerint ammónia, függetlenül attól, hogy a nitrogén szerves anyagok bontásából vagy nitrátokból származott, a szénforrás pedig az intermedier anyagcsere valamelyik köztiterméke. A baktériumok glutaminsav-szintézise pl. alfa-keto-glutársavból, NH 3 felvételével, redukált NAD-foszfát jelenlétében, glutamát képződésén keresztül megy végbe. A glutamátból transzaminálással a megfelelő alfa-ketosavak jelenlétében majdnem minden aminosav szintetizálható. A glutaminsav aminocsoportja adja a nitrogénatomot a purin- és pirimidinbázisok szintéziséhez stb. Az aminosavszintézist végző enzimek többsége, szemben az energianyerés enzimjeivel, nem a cytoplasmamembránon, hanem a cytoplasmában található. Egyes baktériumfajok, bár nitrogénigényük nitráttal vagy ammóniumsókkal fedezhető, bizonyos aminosavakat nem tudnak szintetizálni, ezért csak akkor indulnak szaporodásnak, ha a szükséges aminosavakat készen kapják. A baktériumok fehérjéinek szintézise a riboszómán (poliriboszómán), az mrns-molekulák nukleotidszekvenciájának megfelelően, transzfer RNS-ek által szállított aminosavakból történik. Amint az a leírtakból kitűnik, a baktériumoknak fontos szerepük van a természet nitrogén-körforgalmában. Az elhalt növényi és állati fehérjék nitrogéntartalma a baktériumos bontás során ammóniává és részben közvetlenül molekuláris nitrogénné alakul. Az ammóniát és a nitrogént ismét baktériumos tevékenység juttatja vissza a talajba, a növények által felvehető nitrogénsók formájában. A növények fehérjéi részben állatokba kerülnek, és a folyamat kezdődik elölről. 27

48 Bakteriológia 4.5. A zsíranyagcsere A baktériumok cytoplasmahártyája és néhány baktériumcsoport (pl. mycobacteriumok, corynebacteriumok) sejtfala jelentős mennyiségű lipoidot is tartalmaz. Egyes baktériumfajok extracelluláris lipáz enzimeket termelnek, amelyekkel a környezetükben található zsírokat elbontják. A lipoidok, bár szerepükről a baktériumokban viszonylag keveset tudunk, a szénhidrátokhoz hasonlóan beépülnek a baktériumsejt szerkezeti anyagaiba vagy energianyerésre használódnak el. A baktériumokban a lipoid anyagok hosszú szénláncú szabad zsírsavak, zsírsavakból álló nagy molekulájú polimerek (pl. a cytoplasmában található béta-hidroxi-vajsav szemcsék) vagy különféle glükolipidek (pl. a Gram-negatív baktériumok sejtfalában levő foszfolipidek, a mycobacteriumok sejtfalában található mikolsav-cukor komplexek) formájában találhatók. A glükolipidek foszfátjához gyakran aminosavak is kapcsolódnak. A zsírsavak bioszintézise a baktériumokban éppen úgy, mint a magasabb rendű szervezetek sejtjeiben, a pantoténsav-tartalmú koenzim-a segítségével folyik Vitamin- és kiegészítőanyag-igény A heterotróf baktériumok egyes csoportjai növekedésükhöz nitrogén- és szénhidráttartalmú szerves anyagokon kívül különféle kiegészítő anyagokat, pl. vitaminokat, egyes baktériumcsoportok hemoglobint, bizonyos anyagcsere-folyamatokhoz pedig vasat stb. igényelnek. A baktériumoknak zsírban oldódó vitaminokra és C-vitaminra nincs szükségük. A legtöbbjük a B-vitamincsoport tagjait is előállítja, egyeseknek azonban egyiküket-másikukat készen kell kapniuk. A B-vitamin-csoport tagjai a baktériumokban éppúgy, mint az állati sejtekben, különféle enzimek prosztetikus csoportjai. B 1-vitamint igényelnek a sajtérésben szerepet játszó propionsavbaktériumok, B 2-vitamin szükséges a legtöbb Lactobacillus faj számára stb. A Haemophilusnemzetség baktériumai növekedésükhöz nikotinsavamidot (V-faktort) és hemoglobint (Xfaktort), a brucellák B 1-vitamint, nikotinsavamidot, pantoténsavat stb. igényelnek. A para-amino-benzoesavat a baktériumok többsége szintetizálja, de egyeseknek (pl. a sertésorbánc-baktériumnak) készen kell kapniuk. A vitaminigény ismerete egyrészt a baktériumok mesterséges táptalajokban való tenyésztése szempontjából fontos, másrészt a baktériumok vitaminigénye alapján egyes anyagok vitamintartalma biológiai úton meghatározható. A kérődzők előgyomraiban és egyéb állatfajokban a bélcsőben (főleg a vastagbélben) élő baktériumok vitamintermelése a gazdaszervezet szempontjából is hasznos Pigmenttermelés A baktériumok egyes csoportjai színanyagokat, pigmenteket termelnek. A színanyagok vagy a baktériumtestben vannak, vagy kidiffundálnak a sejtből, és ennek megfelelően vagy csak a baktériumok színeződnek el, vagy a környezetük is. A színanyagok az anyagcsere során keletkező másodlagos termékek. Kémiai természetük igen különböző (többnyire vörös, narancs vagy sárga színű, vízben nem oldódó karotinoidok, vízoldékony fenazinok) és csak néhány baktériumfajnál ismert. Biológiai szerepük is csak részben tisztázott, valószínű, hogy szerepet játszanak a baktériumsejt fénytől (napfénytől és ultraibolya sugárzástól) való védelmében, továbbá redoxi folyamatokban. A baktériumok pigmenttermelését lényegesen befolyásolják a tenyésztés körülményei. A pigmenttermelés a frissen izolált törzsekben a legkifejezettebb, különösen akkor, ha azokat a tenyésztést követően, bőséges levegőellátás mellett, szobahőn, normál megvilágításnak kitett helyen több napig tároljuk. A pigmenttermelő képesség genetikailag meghatározott tulajdonság, jellemző az egyes baktériumfajokra, és így segítséget nyújthat a baktériumok fajának meghatározásában. A pigmenttermelők között egyaránt vannak pathogen és saprophyta fajok. A pathogenek közül pl.a Staphylococcus aureus aranysárga, de egyes törzsei citromsárga vagy fehér, a fakultatív pathogen Mycobacterium fajok egy része sárga-vörös pigmenteket termel. A Pseudomonas aeruginosa tenyészeteiben kétféle festékanyagot, kék színű piocianint és sárga színű fluoreszceint is termel, ennek megfelelően tenyészetei zöld színűek. A saprophyták között is akadnak pigmenttermelők, pl.a Serratia marcescens vörös-rózsaszín, a Chromobacterium fajok kék-ibolya, a sókedvelő (halofil) baktériumok pedig vörös pigmenteket termelnek. A saprophyta pigmenttermelők előfordulnak a talajban, a természetes vizekben és a levegőben is. Élelmiszerekre kerülve színelváltozásokat idézhetnek elő. A baktériumok anyagcseréjük során még számos más anyagot, egyebek mellett pl. méreganyagokat (toxinokat), különféle antibiotikus hatású anyagokat stb. termelnek, ezekről azonban a megfelelő fejezetekben lesz szó. 28

49 Bakteriológia 4.8. A baktériumok fontosabb enzimjeinek és anyagcseretermékeinek a kimutatása A baktériumok anyagcseréjében szerepet játszó extracelluláris és intracelluláris enzimek, valamint az anyagcsere-folyamatokban keletkező termékek jellemzőek az egyes fajokra vagy a fajok egyes csoportjaira, ezért vizsgálatuk diagnosztikai szempontból igen fontos. Erre a célra szolgálnak a biokémiai próbák. A biokémiai próbákat rendszerint hagyományos módon, táptalajokon, tenyészetekben végezzük, a kérdéses anyagok bontásának, beépítésének stb. vizsgálatára alkalmas speciális táptalajok felhasználásával. Az utóbbi években azonban már kereskedelmi forgalomban is beszerezhetők több tulajdonság egyidejű vizsgálatára alkalmas készletek. Ezek olyan, több rekeszre osztott műanyag csövek vagy lemezek, amelyek különböző, egymástól elválasztott szakaszaiba más-más biokémiai sajátság vizsgálatára alkalmas, kismennyiségű speciális táptalajt töltöttek. A beoltás az egyes rekeszek hosszú tűvel való átszúrásával, vagy külön-külön történik. Hasonló készletek segítségével vizsgálható egyszerre akár több tucat intracelluláris enzim stb. A leolvasott eredmények számítógépprogram segítségével, más mikroorganizmusok sajátságaival összehasonlítva értékelhetők A nitrogénforgalom enzimjei és anyagcseretermékei A nitrátredukció vizsgálatához olyan levestáptalajt vagy peptonvizet használunk, amely 0,1% mennyiségben KNO 3-ot is tartalmaz. A keletkező nitriteket a Griess Ilosvay-féle reagenssel mutatjuk ki. A baktériumok egyes csoportjai képesek elbontani a fehérje-anyagforgalom során keletkezett karbamidot.az ureáz enzim kimutatására az 1 2% karbamidot és fenolvörös indikátort tartalmazó táptalajok szolgálnak. A karbamidból ammónia keletkezik, amely a táptalaj ph-ját lúgossá változtatja. A karbamidot gyorsan bontó (pl. Proteus) fajok tenyészetei beoltásuk után már néhány óra múlva, másoké ellenben csak több nap után lúgosodik meg. A fenilalanin-dezamináz enzim kimutatására 1 2% fenilalanint is tartalmazó ferde agaron szaporítjuk el a baktériumokat. A fenilalaninból keletkező fenil-piroszőlősav a táptalajra cseppentett néhány csepp vas(iii)- klorid-oldattal zöld színreakciót ad. A kéntartalmú aminosavakból és a különféle szulfátok redukciójából kén-hidrogén keletkezik. A kénhidrogén kimutatására a táptalajokhoz vassókat keverünk, vagy a levestenyészet fölé ólom-acetáttal átitatott papírcsíkot helyezünk. Mindkét esetben feketedést észlelünk. A vassókból kénhidrogén hatására vas-szulfid, a papírcsíkon pedig ólom-szulfid keletkezik. Egyes baktériumfajok triptofánból indolt termelnek.az indolt a tápfolyadékban a Kovács-féle reagens segítségével, színreakció alapján mutatjuk ki. Bizonyos aminosavak, pl. arginin, lizin vagy ornitin dekarboxilezése szintén jellemző egyes baktériumfajokra. Az aminosav-dekarboxiláz enzimek kimutatására olyan táptalajokat használunk, amelyek a kérdéses aminosavat 1 2%-os mennyiségben tartalmazzák. A dekarboxilezés során keletkező aminok a tápfolyadékot meglúgosítják, ami indikátorral jelezhető A szénhidrátforgalom enzimjei és anyagcseretermékei A gyakorlati diagnosztikában igen fontos a baktériumok szénhidrátbontásának (poli-, di- és monoszacharidok, cukoralkoholok, glükozidok stb.) a vizsgálata.a szénhidrátbontó képesség vizsgálatára olyan táptalajokat használunk, amelyek különféle sókat, 1% peptont és indikátort (peptonvíz), valamint a vizsgálni kívánt szénhidrátféleséget tartalmazzák. Azok a baktériumok, amelyek a táptalajban levő szénhidrátot savtermelés közben bontják el, a táptalajt megsavanyítják, s ez az indikátor színátcsapásából felismerhető. Az anaerob baktériumok szénhidrátbontásának a vizsgálatánál az indikátorok színátcsapásának a megfigyelése többnyire nem használható, mert az indikátorok az erőteljes redukciós hatás miatt a szénhidrátok bontása nélkül is elszíntelenednek, ilyen esetekben a ph elektromos úton való mérése igazít útba. A baktériumfajok egy része a szénhidrátokból nemcsak savat, hanem gázt is termel. A gáztermelés a peptonvízbe nyílásával lefelé helyezett kis erjesztőcsövecske segítségével vizsgálható. A metilvörös-próbával azt vizsgáljuk, hogy valamely baktériumfaj a glükózból sok vagy csupán kevés savat termel-e. A vizsgált baktériumfajt glükóztartalmú levestenyészetbe oltjuk. Az erősen savtermelők esetében a ph 4,4 alá süllyed, amit a tenyészethez adott néhány csepp metilvörös indikátor színe jelez. 29

50 Bakteriológia A baktériumok egyes csoportjai glükózból acetil-metil-karbinolt (acetoint) is termelnek, amely lúgos közegben, bőséges levegő jelenlétében piros színű diacetillé oxidálódik (Voges Proskauer-féle próba). Az acetointermelést, a metilvörös próbával párhuzamosan, ugyancsak glükóztartalmú levestenyészetben vizsgáljuk, a több napos tenyészethez kálium-hidroxidot és néhány kristály kreatint adva. Az anaerob és fakultatív anaerob baktériumok tenyészeteiben az erőteljes redukálóhatás kimutatható a táptalajba kevert festékek, pl. metilénkék elszíntelenedésével. Redukáló hatás eredménye lehet a táptalajban a kénsavas sókból keletkező kénhidrogén, fémes tellur vagy szelén kiválása sóikból stb. A tejalvasztás szintén jele lehet egyes baktériumfajok szénhidrátbontásának. A tejcukrot bontó fajok savtermelésük miatt a tejet megalvasztják. Egyes fajok az alvadékot proteolitikus enzimjeik segítségével el is folyósítják. A szénhidrátbontás típusát (OF-próba) olyan táptalajban vizsgáljuk, amely glükózt (vagy valamely más, a vizsgált baktériumok által felhasználható szénhidrátot) tartalmaz. A vizsgálni kívánt törzzsel egyszerre két táptalajt tartalmazó csövet oltunk be. Az egyiket aerob, a másikat anaerob (pl. paraffinnal lezárva) viszonyok között tenyésztjük. Az obligát aerobok csupán aerob (oxidatív), az anaerobok csupán anaerob (fermentatív) módon, a fakultatív anaerobok viszont mindkétféleképpen képesek a táptalajba kevert szénhidrátot bontani. A szénhidrátokból a bontás során sav (és esetleg gáz is) keletkezik, amelynek jelenléte a táptalajba kevert indikátorral jelezhető. A citokrómoxidáz enzim a terminális oxidációban a redukált citokrómról az elektronokat molekuláris oxigénre viszi át, így a citokrómokat oxidálja. Színreakció segítségével mutatható ki oly módon, hogy az oxidázreagenssel (1%-os tetrametil-parafeniléndiaminnal) átitatott szűrőpapírcsíkon finoman szétdörzsölünk egy keveset a vizsgálandó baktériumfaj tenyészetéből. Ugyancsak fontos a baktériumok kataláz enzimjének a kimutatása. A kataláztermelés kimutatható, ha a vizsgálni kívánt baktérium levestenyészetébe néhány csepp 3%-os hidrogén-peroxidot csepegtetünk, vagy ha a tárgylemezre cseppentett hidrogén-peroxidban terítjük szét a baktérium agartenyészetének egy kacsnyi mennyiségét. A kataláz enzim jelenlétét élénk pezsgés jelzi. Több baktériumfaj extracelluláris enzimeket is termel, amelyek a baktériumok környezetében levő nagy molekulájú anyagokat építőköveikre bontják, alkalmassá téve arra, hogy a baktériumok cytoplasmahártyáján át bejutva tápanyagforrásul szolgáljanak. Az extracelluláris enzimek között vannak olyanok is, amelyek az élő szöveteket is megtámadják, így az extracelluláris enzimek jelenlétének nemcsak diagnosztikai, hanem kórtani szempontból is jelentősége van. A proteolitikus enzimeket termelő baktériumok képesek a natív fehérjék elbontására. Ezek közül a rothasztók a fehérjéket teljes mértékben lebontják, mások viszont csupán zselatin, kazein stb. hidrolízisére képesek. A mélyreható fehérjebontás a tenyészetben kénhidrogén, más gázok, szerves savak és igen bűzös aminok keletkezéséről ismerhető fel.a zselatinhidrolízist a zselatintartalmú táptalajok elfolyósodása jelzi. Speciális, fehérjékre ható enzimek a koaguláz és a fibrinolizin.a koaguláz enzim serkenti a véralvadást. A koagulázt termelő fajokat nyúl citrátos vérplazmájába oltva az eredetileg folyékony plazma rövid idő alatt megalvad. A fibrinolizin a koagulált plazmát feloldja.a lecitináz enzimet termelő fajokat tojássárgáját is tartalmazó táptalajokon tenyésztve, körülöttük a lecitinbontás folytán opálos udvar keletkezik. Ha a vizsgált törzs lipázt is termel, a telep körül kicsapódott zsírsavcseppekből álló, gyöngyházfényű udvar is keletkezik. Néhány baktériumfaj foszfatáz enzimjével képes a szervezet különféle foszfátésztereit (pl. glicerin-foszfátot) hasítani. A táptalajba kevert színtelen fenolftalein-foszfátból az enzim hatására keletkező szabad fenolftalein ammóniagőzben vörös színt ad A baktériumtevékenység gyakorlati hasznosítása Mivel a baktériumok anyagcsere-tevékenységük során igen sokféle anyagot elbontanak, fontos szerepet játszanak a természetben a különféle anyagok (nitrogén, szén, foszfor, kén stb.) körforgalmában. A rothadás során a baktériumok (és más mikroorganizmusok, gombák stb.) együttes tevékenységének eredményeként elbomlanak a növényi és állati eredetű szerves anyagok. A nitrogéntartalmú anyagokból végső 30

51 Bakteriológia soron ammónia és molekuláris nitrogén, a szénhidrátokból és zsírokból pedig szén-dioxid és víz keletkezik. Az elhalt növényi és állati szervezetek szerves anyagai mikrobás tevékenység eredményeként elemeikre bomlanak (mineralizálódnak) és visszajutnak a természetbe. A talaj nitrogénsóinak fontos forrása az istállótrágya.a trágyaérés során mind a fehérje-, mind a szénhidráttartalmú anyagok elbomlanak. Az istállótrágya szakszerű érlelésekor a tömörítéssel anaerob viszonyokat létesítünk. A keletkező nitrogéntartalmú bomlástermékeket a talajban élő nitrifikáló baktériumok alakítják át nitritté és nitráttá. Ha viszont a trágyát szakszerűtlenül, aerob viszonyok között érlelik, a keletkező nitrogéntartalmú bomlástermékek zöme ammónia vagy molekuláris nitrogén formájában elillan. A trágyaérés során a szénhidráttartalmú anyagok bontásából jelentős mennyiségű hő keletkezik, ami elegendő a helyesen összerakott trágya önsterilizálódására (füllesztés). A rothasztó baktériumok hatása érvényesüla szennyvizek ártalmatlanná tételében is. A sok szerves anyagot tartalmazó szennyvizet bő levegőztetéssel aerob, oxidatív bontásnak, majd megfelelő medencékben ülepítve anaerob bontásnak (rothadásnak) vetjük alá, s az ily módon szerves anyagaik java részétől megszabadított vizet használjuk fel öntözésre vagy vezetjük a folyókba. A szennyvizekben még megmaradt szerves anyagok a vizekben végbemenő baktériumtevékenység hatására lebomlanak (a víz öntisztulása). A természetes vizek öntisztulási képességének azonban határa van. A folyóvizekbe vezetett túlságosan sok szerves anyagot vagy méreganyagokat (fenolt, higanyt, ólmot stb.) tartalmazó szennyvizek megakadályozzák a baktériumos tevékenységet, ezáltal lehetetlenné téve az öntisztulást. A szennyvizek megfelelő kezelése, a folyók és a tavak öntisztulási folyamatainak lehetővé tétele alapvető környezetvédelmi érdek. A baktériumok anyagcsere-folyamatait már régóta felhasználjuk különféle ipari célokra is. A tejsavas erjedést előidéző baktériumok, elsősorban a Streptococcus lactis ésa különféle lactobacillusok (L. delbrückii, L. plantarum stb.) fermentálóképességét használjuk ki a nedvdús, nagy szénhidráttartalmú takarmányok silózással való tartósításakor. A kellően aprított takarmánytömegben a tömörítés és a növényi anyagok autolízise következtében anaerob viszonyok alakulnak ki. A tejsavtermelő baktériumok a takarmány szénhidrátjainak néhány százalékát elbontva 1 2% tejsavat állítanak elő, amely elegendő a takarmány tartósításához. A baktériumok szénhidrátbontó tevékenységének eredményeként a szilázs belseje jelentősen fel is melegszik. A szilázsban feltétlenül anaerob viszonyokat kell teremteni, mert egyébként olyan baktériumok szaporodnak el, amelyek a szénhidrátokból nem tejsavat, hanem ecetsavat, vajsavat, különféle egyéb szerves savakat és gázokat termelnek. A tömörítés lényeges azért is, hogy a keletkező hő a szilázs hőmérsékletét testhőmérséklet fölé emelje, 37 C körüli hőmérsékleten ugyanis a szilázsban elszaporodhat pl. az ugyancsak anaerob Clostridium butyricum, amely a szénhidrátokból vajsavat és egyéb, az állatok számára kellemetlen szagú anyagokat képez. A silózással analóg folyamatok játszódnak le a különféle élelmiszerek savanyítással való tartósításakor is. Széles körben használunk baktériumkultúrákat a tejtermékek előállításakor is. A tejcukrot bontó baktériumok hatására a tej kazeinje kicsapódik, a tej megalszik. Streptococcusokat, lactobacillusokat és ritkábban gombákat használunk különféle aludttej termékek (joghurt, kefir stb.) előállítására. Sok baktérium- és gombafajt veszünk igénybe a sajtok előállításához. Ugyancsak általános a különféle baktérium- és gombatenyészetek használata az erjesztőiparban. Aerob úton, különböző Acetobacter fajok (A. aceti, A. xylinum) segítségével állítjuk elő, híg alkoholtartalmú folyadékokból az ecetsavat. Anaerob vagy aerob úton különböző gomba- és baktériumtenyészetek segítségével, ipari méretekben állítjuk elő a tejsavat, citromsavat, egyes aminosavakat (pl. glutaminsavat, szerint, triptofánt, valint), vitaminokat (pl. aszkorbinsavat, B 12-vitamint, riboflavint, antibiotikumokat) vagy használunk mikrobákat különféle vegyületek (pl. szteroid hormonok) átalakítására. Baktérium- (és gomba-)fajokból állítanak elő számos enzimet, pl. proteázokat, lipázokat. A termofil fajokból (lásd később) előállított enzimek előnye, hogy magas hőmérsékleten is működnek. Ilyen enzimeket használunk különféle mosóporokba, tisztítószerekbe keverve, továbbá speciális laboratóriumi célokra (restrikciós endonukleázok, DNS-polimerázok stb.) is. Mezőgazdasági hulladékokból baktériumok és gombák segítségével jelentős mennyiségű biogáz termelhető. Egyes, elsősorban Pseudomonas fajok képesek nagymolekulájú szénhidrogének lebontására. Ezek felhasználhatók olajszennyeződések, illetve egyébként elbonthatatlan vagy csak nehezen átalakítható szerves vegyületek biológiai úton történő ártalmatlanná tételére. 5. A baktériumok tenyésztése 31

52 Bakteriológia A baktériumok, kevés kivételtől eltekintve, mesterséges viszonyok között táptalajokon tenyészthetők.a táptalajoknak a vízen és a különféle ásványi sókon kívül tartalmazniuk kell a szükséges tápanyagokat, vitaminokat és kiegészítő anyagokat, emellett izotóniásnak és megfelelő ph-júnak, továbbá sterilnek kell lenniük. A táptalajok nitrogénforrásként komplett fehérjéket (vért, vérsavót, tojást stb.), különféle állati vagy növényi fehérjékből (húsból, kazeinből, szójából stb.) enzimes emésztéssel vagy savas kezeléssel előállított fehérjehidrolizátumokat (peptont, triptont stb.), aminosavakat vagy csupán ammóniumsókat tartalmaznak. A fehérjehidrolizátumokban bőven találhatók peptidek és aminosavak. Szénhidrátforrásként a táptalajok különféle poliszacharidokat, cukrokat, cukoralkoholokat, glikozidákat, szerves savakat stb. tartalmaznak. Vitaminforrásként a táptalajokhoz rendszerint élesztőkivonatot, egyes kényesebb fajok tenyésztésekor pedig még egyéb kiegészítő anyagokat (pl. nukleinsav-hidrolizátumot, hemoglobint) is adunk. A táptalajok folyékonyak, félfolyékonyak vagy szilárdak. Tápanyagaik általában természetes anyagok (húslé, húskivonat, pepton, tripton, glükóz, egyéb szénhidrátok), vannak azonban olyanok is, amelyeket ismert kémiai anyagból, aminosavakból, szénhidrátokból, sókból stb. állítunk elő (szintetikus táptalajok). Egyes szintetikus táptalajok csupán a baktériumok által még hasznosítható legegyszerűbb anyagokat tartalmazzák (minimális táptalajok). A baktériumoknak a táptalajokkal szembeni igénye igen sokrétű, ennek megfelelően sokféle, változatos összetételű táptalajt használunk. A táptalajokat a különböző komponensekből a laboratóriumban többnyire magunk állítjuk össze, manapság azonban kereskedelmi forgalomban, por vagy granulátum formájában csaknem minden fontosabb táptalaj előre elkészítve is megvásárolható. A kész portáptalajok megfelelő mennyiségét vízzel összekeverve, felfőzve, majd autoklávozva állítjuk elő a használatra kész táptalajokat. A Petri-csészékbe, kémcsövekbe stb. frissen kiöntött táptalajok néhány napig hűtőben tárolhatók. A szilárd táptalajok gélek, alapanyaguk tápfolyadék, amelybe agar-agart vagy ritkábban zselatint keverünk. A zselatin testhőmérsékleten folyékony, ezért szilárd táptalajként csak szobahőn használható. Az agar-agar tengeri moszatokból előállított, szálas szerkezetű anyag, 1 2% mennyiségben a táptalajhoz adva C között megolvad, C alatt pedig szilárd géllé dermed. Az agar-agar kémiailag poliszacharid, amelyet a baktériumok nem bontanak el. A szilárd táptalajok alkalmasak a baktériumok tiszta tenyészetben való izolálására. A bakteriológiai vizsgálatok során a vizsgálandó anyagokból egy keveset szilárd táptalajok felületére kenünk (szélesztés). A beoltott táptalajokat megfelelő viszonyok közé helyezve (inkubálva) azok felületén a baktériumok telepeket képeznek. A szilárd táptalaj felületén kinőtt baktériumtelepek összességét nevezzük tenyészetnek, baktériumkultúrának. Primer tenyészetben az egyes fajok rendszerint nem önállóan, hanem más fajokkal együtt fordulnak elő. A baktériumok fajának meghatározásához szükséges alaki, tenyésztésbeli, anyagcsere- stb. sajátságok vizsgálata céljából színtenyészeteket állítunk elő. A színtenyészetek előállítását megkönnyíti, ha a táptalajba olyan anyagokat keverünk (pl. különféle fémsókat, festékeket, antibiotikumokat stb.), amelyek csak bizonyos fajok szaporodását teszik lehetővé (szelektív táptalajok) vagy ezek mellett még olyan anyagokat is (pl. különféle cukrokat és indikátorokat), amelyeknek felhasználása alapján a kinőtt baktériumtelepek egymástól megkülönböztethetők (differenciáló táptalajok). A szilárd táptalajokon egy-egy telep rendszerint egy vagy csupán néhány baktériumból indul fejlődésnek. Az egy telepből továbboltott tenyészetet (szubkultúrát) nevezzük törzsnek. A táptalajok felületén fejlődött telepek alakja, nagysága, konzisztenciája jellemző az egyes baktériumfajokra. Folyékony táptalajok. A szilárd táptalajokon színtenyészetben izolált baktériumtörzsek folyékony táptalajokban is elszaporíthatók. Folyékony táptalajokban a törzseket rendszerint azért szaporítjuk, mert bennük olyan változásokat (zavarosodás, üledék- vagy hártyaképződés, sav- és gázképződés stb.) indítanak meg, amelyeket diagnosztikai szempontokból értékesíthetünk vagy azért, mert bennük a baktériumok olyan anyagokat termelnek, amelyekre az immundiagnosztikai vizsgálatokhoz van szükségünk (pl. tuberkulin, mallein), vagy pedig azért, mert így juthatunk nagy mennyiségű baktériumhoz és baktériumtermékekhez, amelyekre különféle ipari célok (oltóanyagok, antibiotikumok termelése stb.) végett van szükségünk. A tenyésztés körülményei. A kórokozó baktériumokat, kevés kivételtől eltekintve, 37 C hőmérsékleten, termosztátban tenyésztjük néhány napig. Közönséges levegőn, esetenként csökkentett oxigénnyomású, széndioxiddal dúsított légtérben (mikroaerofilek) vagy az oxigén kizárásával, anaerob viszonyok között tenyésztünk. A mikroaerofil viszonyok kialakítása érdekében a lezárt tenyésztőedényből a levegő egy részét kiszivattyúzzuk, és helyére szén-dioxidot töltünk. A kereskedelmi forgalomban azonban kaphatók olyan, fóliába zárt vegyszerkombinációk, amelyeket a tenyésztőedénybe helyezve és néhány ml vizet adva hozzá, majd a tenyésztőedényt lezárva, az oxigén egy részét megkötik és kevés szén-dioxidot is fejlesztenek, s ezáltal alakulnak ki mikroaerofil viszonyok. 32

53 Bakteriológia Az anaerob baktériumok tenyésztésére szolgáló táptalajoknak megfelelően kis redoxipotenciálúaknak kell lenniük, s bőven kell tartalmazniuk könnyen fermentálható tápanyagokat. A kis redoxipotenciál fenntartása végett a táptalajokba könnyen redukálható (hidrogénfelvételre képes) anyagokat (pl. szulfátokat, tioglikolátot, ciszteint) keverünk. A frissen készített és beoltott táptalajok inkubálásához anaerob viszonyok létesíthetők oly módon, hogy a tenyészetek fölötti légtérből az oxigént kémiai úton pirogalluszsav és kálium-hidroxid összekeverésével vonjuk el, vagy pedig úgy, hogy a táptalajokat vastag falú edénybe (anaerosztátba) tesszük, belőle a levegőt kiszivattyúzzuk vagy palládium katalizátor és hidrogén jelenlétében a levegő oxigénjét vízzé alakítjuk. A már izolált anaerob fajok többsége tovább szaporítható oly módon, hogy a törzset lágy (0,1 0,2% agaragar-tartalmú) agar aljába vagy szervdarabokat (pl. májat, darált húst) tartalmazó (anaerob) leves táptalajokba oltjuk, majd a táptalaj felszínét a levegőtől paraffinnal elzárjuk. Az oxigénre még nyomokban is érzékeny, szigorúan anaerob fajok (pl. Bacteroides, Fusobacterium) beoltásához és tenyésztéséhez speciális eljárásokat és berendezéseket (pl. levegő kizárásával készült preredukált táptalajokat, speciális, CO 2-túlnyomás alatt tartott oltókamrákat, forgó tenyészeteket) veszünk igénybe A baktériumok növekedése és szaporodása A baktériumok egyszerű, haránt irányú kettéosztódással szaporodnak. Osztódás előtt a baktériumtest megnagyobbodik, a pálcika alakú baktériumok megnyúlnak, a cytoplasmahártya a sejttest egy pontján betüremkedik és fokozatosan lefűzi a keletkező két új sejtet. A cytoplasmahártya külső felületén a lefűződéssel egyidejűleg megindul a sejtfal képződése is. A sejtosztódás folyamata a sejtfal kialakulásával fejeződik be. Ha az osztódáskor a sejtfal lefűződése zavart szenved, felpuffadt vagy hosszú, fonal alakú képletek jöhetnek létre. A csíraszám meghatározása. Szaporodás közben, optimális viszonyok között, in vitro, a baktériumok számának változása bizonyos törvényszerűségeket mutat. Ez jól érzékelhető, ha a folyékony táptalajba oltott baktériumok számát időről időre meghatározzuk.az összcsíraszámot (élő és elpusztult baktériumok együtt) a baktériumok előzetes megfestése után, a vérsejtszámláláshoz hasonlóan (pl. Bürker-kamrában) vagy egyéb speciális sejtszámláló készülékkel határozhatjuk meg.az élőcsíraszám meghatározására legtöbbször a hígításos módszert használjuk. A vizsgálandó baktériumszuszpenzió egységnyi mennyiségéből hígítási sorozatot készítünk, és a hígításokból adott mennyiséget agarlemezre szélesztve vagy a lehűlő agarba keverve a képződő telepeket megszámláljuk. A telepek számából többé-kevésbé pontosan meghatározható az eredeti baktériumszuszpenzió csíraszáma. Az összcsíraszám kielégítő pontossággal meghatározható a baktériumtenyészet sűrűségének fotoelektromos úton való mérésével is. A tenyészet kialakulásának fázisai. Az új tenyészet kialakulásaa nyugalmi szakasszal (lag fázis) kezdődik (19. ábra). A beoltást követő néhány órán belül az élő baktériumok száma lényegesen nem változik. A nyugalmi szakasz a baktériumok alkalmazkodásának az időszaka. Ez az idő szükséges ahhoz, hogy a baktériumok megtermeljék mindazokat az enzimeket, amelyek az új környezetben rendelkezésre álló tápanyagok felhasználásához szükségesek. 19. ábra - A baktériumok szaporodásának szakaszai. A lag, B exponenciális, C stacioner, D regresszív fázis 33

54 Bakteriológia A nyugalmi időszakban a baktériumsejtekben igen élénk bioszintézis folyik, osztódás azonban lényegében nincs. A nyugalmi szakasz hossza a baktérium faji sajátságain kívül függ a rendelkezésre álló tápanyagoktól, a beoltott tenyészet mennyiségétől, korától stb. Időtartama annál rövidebb, minél fiatalabb az átoltott tenyészet s minél gazdagabb tápfolyadékba oltjuk. A nyugalmi fázis rövidül akkor is, ha a törzset ugyanolyan táptalajba oltjuk, mint amilyenben korábban tenyésztettük. A nyugalmi szakasz végén megindul a baktériumok osztódása. Mivel a baktériumok osztódása során egy baktériumból kettő, kettőből négy lesz stb., az élő baktériumok számának növekedése igen gyors. Ez a szakasza logaritmusos (exponenciális) szakasz. A logaritmusos szakaszban az új generáció keletkezésének idejét (a generációs időt) a baktériumok faja és a környezeti feltételek befolyásolják. Optimális viszonyok között tenyésztve a gyorsan szaporodó E.coli törzsek generációs ideje perc, a jóval lassabban szaporodó Mycobacterium fajoké kb óra. A logaritmusos szakasz végén a baktériumok szaporodása lelassul, az osztódó és a folyamatosan elpusztuló baktériumok száma egyensúlyba kerül, kialakula stacioner szakasz. A stacioner szakasz létrejöttének oka az, hogy a gyors szaporodással párhuzamosan elfogy a rendelkezésre álló tápanyag, s feldúsulnak a tenyésztőfolyadékban a káros anyagcseretermékek. A szaporodás ütemének a csökkenésében szerepet játszik a baktériumok számára rendelkezésre álló biológiai tér nagysága is. Bizonyos sűrűség (a könnyen tenyészthetőknél kb baktérium/ml) elérése után a baktériumok szaporodása akkor is lelassul, ha tápanyag még rendelkezésre áll. Folyamatos tápanyag-utánpótlással, a keletkező káros anyagcseretermékek (pl. a szénhidrátok bontásából keletkező szerves savak) közömbösítésével, megfelelő légtér fenntartásával (pl. aeroboknál bő oxigénellátással) a baktériumok szaporodásának a logaritmusos szakasza megnyújtható. Ezt az eljárást hívjuk folyamatos tenyésztésnek. A folyamatos tenyésztést alkalmazzák ipari célokra (pl. antibiotikumok, különféle szerves savak előállítására stb.). A stacioner szakaszt követi a baktériumok rohamos pusztulása, a csökkenő (regresszív) szakasz, amely végül a tenyészet kihalásához vezet. Hossza baktériumfajonként igen változó. Vannak olyan fajok, amelyeknek a tenyészetei néhány nap alatt kihalnak (pl. Haemophilus, Actinobacillus, Pasteurella fajok), másokéi, ha a kiszáradástól megóvjuk őket, hónapokig, esetleg évekig is életben maradnak (pl. Salmonella fajok). A spórás baktériumok tenyészetei a spórák képződése következtében több évtizedig életképesek maradnak. Levestenyészetben a baktériumok könnyebben indulnak szaporodásnak, de lényegesen rövidebb ideig maradnak életben, mint szilárd táptalajokban. A baktériumtörzsek fenntartása. A bakteriológiai diagnosztikában gyakran szükséges az egyes baktériumtörzsek fenntartása. A hosszabb-rövidebb ideig fenntartani kívánt törzseket megfelelő táptalajba (pl. lágy agarba, tojás táptalajokba) oltjuk, és a tenyészeteket tartalmazó kémcsöveket a kiszáradástól való megóvás végett légmentesen lezárva, hűtőszekrényben tároljuk. A törzseket a baktériumok fajától függően időnként át kell oltani. A baktériumtörzsek tartós tárolására a fagyasztás és a fagyasztva szárítás (liofilezés) szolgál A környezet hatása a baktériumok szaporodására 34

55 Bakteriológia A baktériumok növekedését és szaporodását, ezen keresztül pedig alaki tulajdonságaikat, anyagcseréjüket és esetenként genetikai anyagukat is lényegesen befolyásolják a környezeti feltételek. Nedvesség. A baktériumok szaporodásukhoz nemcsak tápanyagokat, hanem elegendő nedvességet is igényelnek. Az egyes baktériumfajok nedvességigénye változó. Legmegfelelőbb, ha a közeg 75 90% vizet tartalmaz. A víztartalom csökkenésével a baktériumok élettevékenysége fokozatosan lassul, a beszáradással pedig előbb-utóbb megszűnik. A spórák beszáradva is hosszú ideig, akár évtizedekig is életképesek maradnak. A baktériumtevékenységnek a vízveszteséggel párhuzamos csökkenését használjuk ki az élelmiszerek (gyümölcsök, gabonafélék stb.) szárításos tartósítására. A beszáradás azonban nem minden körülmények között jár a baktériumok pusztulásával, sőt a baktériumok (más mikroorganizmusok, állati és növényi sejtek stb.) hosszú időre megbízhatóan konzerválhatók fagyasztva szárítással (liofilezéssel). Liofilezéskor a tartósítandó baktériumtenyészet védőkolloidban szuszpendált néhány tized ml-ét ampullába mérjük és speciális készülékben gyorsfagyasztva vákuumban beszárítjuk, majd az ampullát leforrasztjuk. Az ily módon beszárított, vákuumban tartott törzsek a szennyeződés veszélye nélkül évekig fenntarthatók. Hőmérséklet. A baktériumok széles hőmérsékleti határok között képesek szaporodni. A hidegkedvelő (pszichrofil) baktériumok 15 C vagy ez alatti hőmérsékleten szaporodnak a legjobban. Több közülük pigmentet is termel. Ide tartoznak egyes Achromobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, Spirillum fajok stb. Megtalálhatók a természetes vizekben és az arktikus talajokban, a tengerekben és az óceánokban élő baktériumok többsége ide tartozik. A hidegkedvelők ártalmatlan baktériumok, mégis fontosak, egyrészt élelmiszer-higiéniai szempontból, mert hűtőszekrényben tartott élelmiszerek megromlását idézhetik elő, másrészt azért, mert alacsony hőmérsékleten képesek szerves anyagokat bontani, ezáltal közreműködnek a vizek öntisztulásában. A hőkedvelő (termofil) baktériumok szaporodásához a C az optimális, de számos faj e fölötti hőmérsékleteken is képes szaporodni. Hőforrások vizében, trópusi talajokban stb. fordulnak elő. Hőkedvelő variánsok találhatók pl.a Bacillus, a Clostridium nemzetségek fajai között. A mezofil baktériumok legjobban C között szaporodnak. A hőmérsékleti optimum felett szaporodóképességük viszonylag gyorsan megszűnik, az alacsony hőmérsékletet azonban sokkal inkább elviselik. A kórokozó baktériumok kivétel nélkül mezofilek. Ezek közül egyesek csak testhőmérsékleten képesek szaporodni (stenotermiás fajok), mások azonban jóval tágabb határok között is (pl.a Listeria monocytogenes 4 42 C között). Kémhatás. A baktériumok szaporodását erősen befolyásolja a környezet kémhatása. A legtöbb baktérium számára az enyhén lúgos, ph 7 7,6-os kémhatás az optimális, a baktériumok azonban e határok alatt és felett is egy ideig tovább szaporodnak. Vannak olyan fajok, pl. a lactobacillusok, amelyek számára a kissé savas kémhatás, a ph 6 6,5 előnyösebb, mások képesek erősen lúgos közegben, ph 7 9 között is szaporodni. A közeg ph-ja a baktériumok szaporodása során termelt anyagcseretermékek miatt jelentősen változhat, esetenként a tápfolyadék olyannyira megsavanyodhat, hogy a tenyészet kihal. A ph jelentős eltolódását a táptalajokba kevert pufferekkel akadályozzuk meg. Az ozmotikus viszonyok (a környezet sókoncentrációja) szintén befolyásolják a baktériumok szaporodását. Optimális az izotóniás közeg (0,9% NaCl). Hipotóniás oldatban a baktériumok megduzzadnak, legömbölyödnek, cytoplasmahártyájuk felreped. A hipertóniás oldatokat a baktériumok egy bizonyos sókoncentrációig elviselik, ezután a szaporodás megáll, a sejtek összezsugorodnak, elpusztulnak. Egyes fajok, így a saprophyta sókedvelő (halofil) baktériumok szaporodásához 20 30% sótartalom az optimális. A pathogen fajok között is akadnak olyanok (pl. Streptococcus, Staphylococcus fajok), amelyek 8 15% só jelenlétében is megélnek. Az ozmotikus viszonyok változtatását (sózás, pácolás, magas cukorkoncentráció stb.) rendszerint a közeg egyidejű megsavanyításával (ecetsav, citromsav, benzoesav, szorbinsav stb. hozzáadásával) használjuk ki az élelmiszerek tartósítása során. 6. A baktériumok ellenálló képessége a fizikai és kémiai hatásokkal szemben, sterilezés, fertőtlenítés Gyakran van szükségünk környezetünkben, a tárgyakon, eszközökön, élelmiszerekben stb. található mikrobák (baktériumok, gombák, vírusok, paraziták) elpusztítására, eltávolítására vagy legalább számuk jelentős csökkentésére. E célok elérésére különféle fizikai eljárások és számos kémiai anyag áll rendelkezésünkre. Ha 35

56 Bakteriológia valamennyi mikroba megsemmisítéséről vagy eltávolításáról van szó, sterilezésről, ha pedig csupán a pathogen mikrobák elpusztítása és egyéb mikrobák számának a jelentős csökkentése a cél, fertőtlenítésről beszélünk. A környezet kedvezőtlen irányú változása a baktériumok szaporodását lelassítja, megállítja, sőt, ha a kedvezőtlen hatás elég erős, a baktériumokat el is pusztítja. Ha csupán a baktériumok szaporodása gátolt, bakteriosztatikus, ha viszont a baktériumok el is pusztulnak, baktericid (virucid, fungicid) hatásról beszélünk. A bakteriosztatikus hatás reverzíbilis. A szaporodásukban gátolt baktériumok egy ideig még életképesek maradnak, ha azonban a behatás erőssége növekszik vagy hosszabb ideig tart, a baktériumok fokozatosan elpusztulnak. A baktériumok és egyéb mikrobák pusztulása időarányos folyamat. A baktériumok számára kedvezőtlen behatás kezdetekor a mikrobák pusztulása tömeges (exponenciális), míg a baktériumok számának a csökkenésével a pusztulás tempója jelentősen lefékeződik, s az utolsó mikroba elöléséig jelentősen több időre van szükség, mint ahogy az a pusztulás exponenciális szakaszában számítottból következne. Akár fizikai behatásokat (pl. hőt), akár kémiai anyagokat (fertőtlenítőszereket) veszünk igénybe a mikrobák elölésére, minden eljárásra vonatkozóan meg kell határoznunk azokat a konkrét feltételeket (hőmérsékletet, időt stb.), amelyek biztonsággal elegendők valamennyi mikroba elpusztítására. A mikrobapusztulás kinetikájának az ismerete különösen fontos az élelmiszeriparban, egyebek mellett pl. a konzervekben található mikrobák hőkezeléses megsemmisítése során, egyrészt az élelmiszer természetes állapotának minél jobb megőrzése, másrészt a mikrobák biztonságos elölése végett A mikrobák elölésére szolgáló fizikai hatások Hő- és hideghatás Magasabb hőmérsékleten a baktériumok (és egyéb mikrobák) fehérjéi denaturálódnak. A vegetatív baktériumok (és vírusok) legtöbbje C-on, a mycobacteriumok és a gombák pedig 80 C körüli hőmérsékleten perceken belül elpusztulnak, míg a baktériumok spóráinak az elpusztítására biztonságosan csak az autoklávban való hőkezelés alkalmas. Hőhatáson alapul a pasztőrözés, a frakcionált sterilezés, a hőlégszekrényben való sterilezés, a kifőzés, az autoklávban történő csíramentesítés, az elégetés, leégetés és az izzítás. Csírátlanítás hővel. A csírátlanítás történhet nedves vagy száraz hővel. Zömmel a nedves hővel való csírátlanítást használjuk. A pasztőrözés során a kezelendő folyadékokat (tejet, sört, gyümölcsleveket stb.) 30 percre C-ra, másodpercre C-ra vagy néhány másodpercre 85 C körüli hőmérsékletre hevítik. Ez a hőkezelés alkalmas a kezelt folyadékok csíraszámának a jelentős csökkentésére, de nem érhető el vele sterilitás. Az ultrapasztőrözés, amely során a tejet néhány másodpercre túlhevített gőzzel C-ra hevítik, viszont rendszerint már minden mikrobát elöl, az így kezelt tej steril. Különféle hőérzékeny anyagokat, tejet, tojást, vérsavót tartalmazó táptalajok sterilezésére szolgál a frakcionált sterilezés (tyndallozás). A táptalajokat 3 napon át naponta fél órára C-ra hevítjük (vagy áramló gőzbe helyezzük), közben pedig 37 C-on tartjuk. Az első hevítés rendszerint elpusztítja a táptalajban levő vegetatív baktériumokat, a további hevítések pedig elölik a spórákból kicsírázó vegetatív alakokat. A hővel való sterilezés egyik legrégibb módja a kifőzés. Különféle műszerek, laboratóriumi eszközök és ruhaneműk is sterilezhetők ily módon. A forrásban levő víz perc alatt elöli az összes mikrobát, kivéve a legellenállóbb baktériumspórákat. A kifőzés hatékonyságát nagyban növeli, ha a vízhez 2% szódát, kis mennyiségű fenolt vagy felületaktív anyagot adunk. A hőkezelési eljárások közül a leghatékonyabb az autoklávban való sterilezés. Az autoklávok megfelelő szelepekkel ellátott, dupla falú, nyomásálló készülékek, amelyekben nagynyomású vízgőzzel sterilezünk. Az autokláv felfűtésekor keletkező vízgőz 112 C-on fél óra alatt (0, Pa túlnyomáson) vagy 121 C-on perc alatt (10 5 Pa) minden mikroorganizmust elöl. Ennél magasabb hőmérsékleten 133 C-on ( Pa) való hőkezelésre csak kivételesen van szükség. Az autoklávban laboratóriumi üveganyagok, fémeszközök, táptalajok, kötszerek, ruhaneműk stb. egyaránt sterilezhetők. A száraz hővel való sterilizálásra leggyakrabban a hőlégszekrényt használjuk. A szigetelt falú, zárt, elektromos vagy gáz fűtésű hőlégszekrényekben a levegőt C-ra hevítjük. Kétórás hőkezelés elég a sterilitás eléréséhez. Fontos, hogy a hőmérséklet a hőlégszekrény minden részében elérje a kívánt hőfokot. Hőlégszekrényben sterilezhetők laboratóriumi üveganyagok, fa- és fémeszközök, de hőérzékeny vagy gyúlékony anyagok nem. 36

57 Bakteriológia A kevésbé értékes eszközök, anyagok, fertőzött kórházi, laboratóriumi hulladékok legegyszerűbben elégetéssel sterilezhetők, illetve tehetők ártalmatlanná. A laboratóriumi eszközök sterilezésére a leégetést vagy az izzítást (pl. oltókacs) vesszük igénybe. Hideghatás. A hőmérséklet csökkenése a baktériumok szaporodását lassítja, majd megállítja, de a baktériumok (és egyéb mikrobák) a fagypont alatti hőmérsékleten sem pusztulnak el. A természetes vizek jegébe fagyott baktériumok hónapokig életképesek maradnak. A hűtőszekrényben 5 C-on tartott élelmiszerek a baktériumok és gombák anyagcsere-tevékenységének csökkenése miatt néhány napig tárolhatók. A mélyhűtés, 20 C-on vagy az alatt, néhány hónapos tárolást tesz lehetővé (élelmiszerek, laboratóriumi minták stb.). A hűtést és a fagyasztást felhasználjuk azonban baktériumok, vírusok és egyéb sejtek élő állapotban való fenntartására is. A táptalajokon elszaporított, kevésbé igényes baktériumok hűtőszekrény-hőmérsékleten néhány hétig tárolhatók. Tartós fenntartásuk mélyhűtött (fagyasztott) állapotban C közötti hőmérsékleten vagy még inkább folyékony nitrogénbe süllyesztve, 196 C-os hőmérsékleten lehetséges. Folyékony nitrogénben tartva tárolunk spermát, embriót, baktérium- és vírustörzseket, sejtvonalakat stb. A túlélés akkor optimális, ha a fagyasztás gyors, a felolvasztás pedig lassú. Az ismételt fagyasztás és felolvasztás a baktériumokat (és más sejteket is) előbb-utóbb elpusztítja A sugárzások hatása Az elektromágneses sugárzások energiát hordoznak. A sugárzás energiatartalma fordítottan arányos a hullámhosszal. A nagy energiájú sugárzások közül a kozmikus sugárzás, a gamma-, a röntgen- és az ultraibolya sugárzás egyaránt károsítja a sejteket, közöttük a baktériumokat is. A nagy energiatartalmú ionizáló sugárzások közül a jó áthatolóképességű, rendszerint kobaltizotópból származó, gamma-sugárzást használjuk ipari méretekben, légmentesen zárt, műanyag fóliába csomagolt injekciós tűk, fecskendők, kötszerek, gyógyszerek és részben különféle élelmiszerek sterilezésére. A gamma- sugárzás előnye, hogy a sugárzás a csomagoláson is áthatol, hátránya viszont, hogy a sugárzás, mint minden radioaktív sugárzás, permanens és minden irányba szóródik, ezért a sterilezés csak speciális körülmények között végezhető. A nem ionizáló sugárzások közül az ultraibolya sugárzást használjuk csíramentesítésre. Az ultraibolya sugárzás teljes spektruma ( nm) károsítja a sejteket, a legnagyobb baktericid hatása azonban, főleg a DNS károsításának a következményeként, a nm hullámhosszúságú UV sugaraknak van. Az ultraibolya sugárzás baktericid hatását használjuk ki az UV (germicid) lámpák, (rendszerint ultraibolya sugarakban gazdag fényt kibocsátó higanygőz lámpák) használatakor. Az UV lámpák felhasználhatók laboratóriumokban, kórházakban stb. a légtér és a felületek csíramentesítésére. Alkalmazásuknak azonban határt szab, hogy a sugárzás hatékonysága a sugárforrástól való távolsággal négyzetes arányban csökken, a sugárzás áthatolóképessége kicsi, s a hatékonyságot a felületen található szennyeződések a sugárelnyelés miatt jelentősen csökkentik. Az UV lámpák használata során ügyelni kell arra, hogy sugárzás a szembe és bőr felületére ne juthasson. A napfény a látható fény mellett ultraibolya sugarakat is tartalmaz. A leginkább károsító rövidhullámú UV sugarakat a légkörben található ózon, vízgőz, füst kiszűri, egy része azonban eléri a földfelszínt. A napfény antibakteriális hatása részben szárító hatásának, részben pedig a benne található UV sugárzásnak köszönhető. A legelőkre, rétekre kijutott baktériumok a napfény hatására, az évszaktól függően, néhány héttől néhány hónapig terjedő időszak alatt, rendszerint elpusztulnak. Bár a látható fénysugarak antibakteriális hatása gyenge, a baktériumokat (és egyéb sejteket) bizonyos festékekkel intravitálisan megfestve, a fénysugarak baktericid hatásúvá válnak (fotodinámiás szenzibilizálás). A fotodinámiás hatás a baktériumokban a fontos sejtanyagok oxidálódásával kapcsolatos Mechanikai hatások A nyomás csak szélsőségesen nagy értékek ( Pa) felett károsítja a baktériumokat. A rázás, különösen, ha a baktériumtenyészethez üveggyöngyöt vagy egyéb, finom eloszlású korpuszkuláris anyagot keverünk, előbb-utóbb a baktériumok egy részének a feloldásához vezet. Szűrés. Folyadékok és légnemű anyagok szűréssel is csíramentesíthetők. A szűrők pórusnagysága olyan, hogy a baktériumok és egyéb sejtes elemek nem tudnak átjutni rajtuk. A bakteriológiában használatos szűrők pórusnagysága 0,22 0,65 µm között változik, vannak azonban ezeknél nagyobb és kisebb pórusátmérőjű szűrők is. Korábban a szűrők égetett agyagból, kovaföldből (pl. Berkefeld-szűrő), mázatlan porcelánból készültek, ma inkább a Seitz-féle azbesztszűrőket, üvegszálból készített szűrőket vagy újabban különféle cellulóz észterekből 37

58 Bakteriológia készült membránszűrőket használunk. A szűrőszerkezetet speciális, vastag falú edényzetre (szívópalackra) szereljük s autoklávban sterilezzük. A szűrőkön a folyadékot nyomással, szívással vagy egyszerre mindkettővel sajtoljuk át. A folyadékok szűrésére használt szűrők igénybe vehetők levegő (vagy gázok) sterilre szűrésére is. A membránszűrők között vannak olyanok, amelyek kis pórusnagyságuknál ( nm) fogva alkalmasak a vírusok nagyság szerint differenciált visszatartására is (ultraszűrők). ASeitz-szűrők azbesztből préselt korongok, egyszer használatosak. Az üvegszűrők szűrőfelülete préselt üveghab vagy üvegszál. Többször használhatók, használat után ezeket a szűrőket kénsavval és többszöri vízöblítéssel a visszamaradt anyagtól meg kell tisztítani. A membránszűrők (Millipore, Gelman, Sartorius stb.) cellulóz észterekből készült vékony lapok. Előnyük minden más szűrővel szemben, hogy a pórusnagyság szabályozható és egy-egy szűrőnél valamennyi azonos méretű, a szűrendő folyadékból keveset adszorbeálnak, a szűrés rajtuk keresztül gyors. Egyszer használatosak, autoklávban sterilezhetők. Beszerezhetők ipari szűréshez alkalmas nagyságban, de fecskendőre rögzíthető, tokba foglalt méretben is. Az előbbiek több száz liter, az utóbbiak néhány milliliter folyadék gyors sterilre szűrésére alkalmasak. A membránszűrőket széles körben használjuk biológiailag veszélyes anyagokkal dolgozó laboratóriumok, oltókamrák stb. belépő és távozó levegőjének a sterilre szűrésére is. A membránszűrők felhasználhatók kis baktériumtartalmú folyadékok (pl. ivóvízminták) csíraszámának a meghatározására is. A szűrőn egységnyi folyadékmennyiséget átszűrünk, majd a membránszűrőt szilárd táptalaj felületére helyezzük, és a táptalajt termosztátba tesszük. A membrán felületén kinőtt telepek számából következtethetünk az átszűrt folyadék csíraszámára. Ultrahangkezelés. Az ultrahang-generátorok nagy frekvenciájú hanghullámokat bocsátanak ki, amelyek a baktériumok membránjára kifejtett mechanikai hatás révén a baktériumok többségét elpusztítják. Az ultrahangkezelés nem alkalmas sterilezésre, de gyakran igénybe vesszük baktériumok és más sejtek feltárására, a sejtfal, a nukleinsavak, a különféle enzimek stb. viszonylag ép állapotban való kinyerésére A kémiai anyagok hatása Fertőtlenítő (dezinficiáló) hatása igen sokféle vegyi anyagnak van. A fertőtlenítőszerként használt anyagoktól megkívánjuk, hogy csíraölő hatásuk széles spektrumú legyen (baktériumok, vírusok, gombák, paraziták), vízben vagy alkoholban oldhatók, kellően stabilak, kellemes illatúak vagy legalább szagtalanok legyenek, ne vagy kevéssé legyenek mérgezők emberre, állatra és a környezetre, alkalmazásuk ne okozzon környezetszennyezést, a fém-, textil- és egyéb anyagokat ne károsítsák, szennyező anyagok hatásukat lehetőleg ne csökkentsék, kellő tisztító (mosó) hatásuk legyen és mindemellett alkalmazásuk gazdaságos legyen. Mivel mindezen igényeknek megfelelő fertőtlenítőszer nincs, az egyes fertőtlenítőszereket, illetve azok kombinációit az alkalmazás körülményeinek és céljának megfelelően kell megválasztanunk. Újabban forgalomba kerülnek olyan fertőtlenítőszerek, amelyek mosó- (tisztító-)anyagok mellett többféle, egymás hatását kiegészítő fertőtlenítőszert tartalmaznak, ezekkel a szerekkel a tisztítás, fertőtlenítés egyszerre elvégezhető (egyfázisú fertőtlenítőszerek). A fertőtlenítést klórvízzel elsőként Semmelweis Ignác alkalmazta az orvosi gyakorlatban a gyermekágyi láz megelőzésére, 1846-ban. A fertőtlenítőszerek hatékonyságát az elpusztítandó mikroorganizmusok ellenálló képességén túl a kérdéses szer hatóanyag-koncentrációja, a fertőtlenítőoldat hőmérséklete és ph-ja,a behatás ideje, a fertőtlenítendő felületek és anyagok minősége, továbbá azok szennyezettsége szabja meg. A fertőtlenítőszer koncentrációját az elpusztítandó mikroorganizmusok ellenálló képességének megfelelően választjuk meg. A vegetatív baktériumokkal szemben kis, a mycobacteriumokkal szemben viszonylag nagy, a spórás baktériumokkal szemben pedig csupán nagy töménységű oldatokkal boldogulunk. A fertőtlenítőszerek hőmérsékletének emelésével és a behatás idejének növelésével a csíraölő hatás a legtöbb esetben fokozható. Általában minél melegebb oldatban használjuk a fertőtlenítőszereket, annál rövidebb idő alatt hatnak. A szennyező anyagok a fertőtlenítendő felületeken, kevés kivételtől eltekintve, valamennyi fertőtlenítőszer hatékonyságát csökkentik, esetleg meg is szüntetik. A szennyeződés ugyanis egyrészt hatóanyagot köt meg, másrészt megakadályozza, hogy a fertőtlenítőszerek érintkezzenek az elpusztítandó mikrobákkal. A fertőtlenítendő felületeket ezért előzetesen alaposan meg kell tisztítani. 38

59 Bakteriológia A fertőtlenítőszerek igen nagy száma miatt csupán néhány, az állatorvosi gyakorlatban használatos vagy egyébként fontos fertőtlenítőszert említünk meg. Klór és klórtartalmú szerek. A klór, vízben oldott formájában (klórvíz), illetve a klórt különböző kémiai kötésekben tartalmazó formában, a legáltalánosabban használt fertőtlenítőszer. A klórgázt gáz halmazállapota és maró tulajdonságai miatt ma már csak speciális viszonyok között (pl. vízművekben) a vezetékes ivóvíz szükség szerinti klórozására veszik igénybe. A különböző klórtartalmú fertőtlenítőszerek a klórt szerves vagy szervetlen kötésben tartalmazzák. Hatékonyságukat az oldataikban belőlük keletkező hipoklórsav és hipoklorit-ionok mennyisége szabja meg. A klórszármazékok erős oxidálószerek, a baktériumok sejtfalát és a fehérjék S-H kötéseit károsítják. A szervetlen kötésű klórt tartalmazó szerek közül a nátrium-hipokloritot és kevés nátriumhidroxidot tartalmazó klórlúgot (H-lúg) és a kalcium-hipoklorit-tartalmú klórmeszet, a szervesek közül pedig a benzolszulfonkloramid-nátriumot (Chloramin B, Neomagnol) használjuk a legáltalánosabban. A hipokloritok tárolás közben gyorsan bomlanak, a szerves kötésű klórt tartalmazók lényegesen stabilabbak. A szervetlen kötésűek azonnal hatnak, ezért rövid hatási idővel is használhatók. A szerves kötésűekből a klór lassan válik le, ezért hosszabb behatási időt igényelnek. Az utóbbiakban a klórleválás sav hozzáadásával gyorsítható. A szervetlen kötésű klórt tartalmazók szennyező anyagok hatására gyorsan kimerülnek, hatástalanná válnak, a szerves kötésű klórt tartalmazó szerek kimerülése lassúbb. A vegetatív baktériumokkal szemben a klórlúg és a klórmész 1 2%-os oldatban perc alatt, a mycobacteriumokkal szemben pedig 3 5%-os oldatban 2 3 óra alatt hatékony, 8%-os oldata a spórákat is elöli. A klórmész alkalmas kutak vizének a fertőtlenítésére is, g/m 3 víz mennyiségben. A Neomagnol 1 2%-os oldatban elsősorban kézfertőtlenítésre, konyhai edényzet fertőtlenítésére használatos. Fenol és fenolszármazékok. A fenol (karbolsav) erélyes fertőtlenítőszer, de maró és mérgező volta miatt gyakorlati célokra ma már alig használatos. Annál elterjedtebbek azonban metilált (krezolok, xylenolok) és klórozott (mono-, di-, tri-, penta-, hexaklórfenolok) származékai. A fenol és a fenoltartalmú szerek használhatóságát korlátozza, hogy a természetes vizek élővilágára a fenol nyomokban is toxikus. A fenolszármazékok baktericid hatása jobb, mint a fenolé, de legtöbbjük vízben nem vagy alig oldódik, ezért szappanokban emulgeálják (krezolszappan, Lysol) vagy alkoholban oldják, esetleg felületaktív anyagokkal keverik. Nátriummal kötött sóik vízoldékonyak (pl. pentaklórfenol-nátrium). A fenol és fenolszármazékok elsősorban a cytoplasmamembránt és a sejtfalat károsítják, megváltoztatják a cytoplasmamembrán permeabilitását és a sejtfal ellenálló képességét. A fenolok és a krezolok 1 3%-os oldatban a vegetatív baktériumokat és a gombákat perceken belül elölik. Lipoidoldékonyságuknál fogva jól használhatók a mycobacteriumokkal szemben is, 3 5%-os oldatuk 24 óra alatt baktericid hatású. A spórák elölésére csupán más szerekkel keverve használhatók. A fenolt 0,5%-os koncentrációban vérsavók konzerválására használjuk. A fenolszármazékok közüla pentaklórfenol-nátrium jó gombaölő (fungicid) hatású, 1 2%-os oldatban perc alatt elöli a legellenállóbb gombákat is. 1%-os oldatban tenyésztojások héjának fertőtlenítésére használható, 5 perces bemártással. A hexaklorofent 1 3%-os koncentrációban használjuk kézfertőtlenítésre, szappanokba keverve, de hintőporokban, samponokban is alkalmazzuk. Aldehidek. Közülüka formaldehid és egyes dialdehidek (pl. glutáraldehid) használatosak vizes oldatban vagy gáz halmazállapotban. Az aldehidek a baktériumok enzimjeinek és egyéb fehérjéinek a károsításán keresztül fejtik ki hatásukat. A formaldehid használatát korlátozza, hogy toxikus és erősen izgatja a nyálkahártyákat. A formaldehid (vizes oldata, a formalin) hatékonyságát a szennyező anyagok lényegesen nem rontják. A formalin 3 5%-os oldata a vegetatív baktériumokat és a gombákat kb. fél óra, a mycobacteriumokat pedig 2 3 óra alatt öli el. Jó sporocid hatású, 5%-os oldata 8 24 óra alatt a spórákat is elpusztítja. A formaldehid gáz halmazállapotban is használható. A formaldehid a formalinból hevítéssel vagy káliumpermanganát hozzáadásával szabadítható fel. Zárt helyiségekben 80 légköbméterre 2 liter formalint számolva, legalább 75%-os relatív páratartalom mellett 12 óra alatt kielégítő csíraölő hatása van. Gáz halmazállapotban elsősorban tenyésztojások és keltetőgépek fertőtlenítésére használják. A formalin baktericid hatása10 C alatt csaknem teljesen megszűnik, ezért mind oldatait, mind pedig gáz halmazállapotban legalább C-on kell használni. Etilén-oxid. A gáz halmazállapotú fertőtlenítőszerek közül, a formaldehidtől eltekintve, az etilén-oxid, a propilén-oxid, a béta-propiolakton, az etilén-imin stb. használatosak. A baktériumok nukleáris állományát és fehérjéit károsítják. Az etilén-oxid gyúlékony és toxikus, a formaldehiddel szemben azonban előnye, hogy jól penetrál és kis relatív páratartalom mellett használható. Gőzeit belélegezni nem szabad, emberben tüdőödémát okoznak. Zárt kamrákban (gázsterilizálókban) használva 500 mg/l koncentrációban, 20 C körüli hőmérsékleten 4 5 óra alatt sterilizál. Előnyösen használható hőre vagy egyéb fertőtlenítőszerek hatására érzékeny anyagok, 39

60 Bakteriológia kényesebb műszerek sterilizálására. A béta-propiolakton és az etilén-imin különféle oltóanyagok (főleg vírusvakcinák) inaktiválására szolgál. Felületaktív anyagok (detergensek, nedvesítőszerek). A szappanok (amelyek hosszú szénláncú zsírsavak nátrium- és káliumsói) régóta és széles körben használatosak a szenny eltávolítására és ezáltal a mikrobák számának a csökkentésére, csíraölő hatásuk azonban nincs. A szappanoknál jobb hatékonyságúak a szintetikus detergensek. A fertőtlenítőszereknek ebbe a csoportjába kémiailag nagyon különböző vegyületek tartoznak, közös tulajdonságuk azonban, hogy valamennyien felületaktívak, csökkentik a felületi feszültséget, ennélfogva jól nedvesítenek, habzanak, adszorbeálódnak, penetrálnak, szennyoldó képességük erős, elősegítik a vízben oldhatatlan vagy alig oldódó anyagok vízoldékonyságát, toxicitásuk pedig igen kicsi. Az anionaktív detergensek (szintetikus szappanok) önmagukban fertőtlenítőszerként nem használhatók. Jó detergens és szennyoldó hatásuknál fogva azonban előnyösek különféle tisztító- és mosószerekben. A kationaktív detergensek (invertszappanok) közül a kvaterner ammóniumsók, (Sterogenol, Nitrogenol) használatosakalegszélesebb körben. A kationaktív detergensek természetes szappanokkal vagy anionos detergensekkel nem keverhetők, mert gyorsan inaktiválódnak. Hatásukat fehérje és egyéb szennyező anyagok, továbbá a hígításukra használt vízben jelenlevő Ca- és Mg-sók erősen rontják, viszont stabilak, jó nedvesítőképességűek, és magas hőmérsékleten is használhatók. A baktériumok cytoplasmamembránját károsítják, növelik a membrán permeabilitását. A Sterogenol 1%-os oldatban perceken belül elöli a vegetatív baktériumokat és a legtöbb gombafajt is. A mycobacteriumokkal szemben hatásuk bizonytalan, sporocid hatásuk gyakorlatilag nincs. Az amfoter felületaktív anyagok (Tego, Tagonin stb.) hosszú szénláncú aminosav-származékok. Hatékonyságuk lényegében megegyezik a kationaktív detergensek hatékonyságával. Az amfoterek egyikével-másikával szemben a Pseudomonas fajokban rezisztenciát észleltek. Elsősorban élelmiszer-ipari üzemekben használatosak. A nem ionos detergensek, kémiailag poliészterek és éterek fertőtlenítőszerként nem használatosak, de jó felületaktív hatásuk miatt mosószerekbe keverve vagy fertőtlenítőszerekkel kombinálva azok hatékonyságát jelentősen növelik. Jód és jódkomponenst is tartalmazó fertőtlenítőszerek. A jód egyike a legjobb és régóta használt antimikrobiális szereknek. Erős oxidálószer. Elemi jód és kálium vagy nátrium-jodid formájában alkoholban és vízben oldva, jódtinktúraként felületes sebek, sérülések kezelésére vesszük igénybe. A jodofórok szerves kötésű jódot, nem ionos felületaktív anyagot és az igénybevétel céljának megfelelő kiegészítő anyagokat tartalmazó fertőtlenítőszerek. Mivel a jódot szerves kötésben tartalmazzák, az elemi jódtól eltérően maró és korrozív hatásuk nincs. A fertőtlenítő hatás a komplexből szabaddá váló jódnak köszönhető. Viszonylag stabilak, detergens hatásuknál fogva jól nedvesítenek és penetrálnak. Hátrányuk, hogy csupán C körüli hőmérsékleten használhatók, magasabb hőmérsékleten az oldatok jódvesztesége ugrásszerűen megnő. A jodofórok között vannak olyanok, amelyek a jódkomplexen és a felületaktív anyagon kívül jelentős mennyiségű foszforsavat is tartalmaznak, ezek szennyezőanyagok iránt kevésbé érzékenyek. A jodofórok 0,5%- os oldatban perceken belül elölik a vegetatív baktériumokat, 0,5 1%-os oldatban pedig a mycobacteriumokat és a gombákat is. Sporocid hatásuk gyakorlatilag nincs. A jodofórok közül néhányat kifejezetten a bőr-, tőgyfertőtlenítés céljára fejlesztettek ki. Ezek a jódkomplex mellett bőrbarát anyagokat (citromsavat, glicerint stb.) is tartalmaznak, ezért 0,5%-os oldatban kéz- és tőgyfertőtlenítésére használatosak. Savak, lúgok. Erélyes fertőtlenítőszerek, hatékonyságuk a ph-értékkel vagy a molekulaszerkezettel áll összefüggésben. A fehérjéket denaturálják. Önállóan ritkán használatosak. 1,6 2% nátrium-hidroxidot tartalmaz a klórlúg. Gyengén fertőtlenítő hatásúa kalcium-hidroxid, amely mésztej formájában épületek és istállóberendezések fertőtlenítésére használatos.a szerves savak inkább bakteriosztatikus hatásúak. Közülük a szalicilsavat, a benzoesavat élelmiszerek tartósítására vesszük igénybe. Fémsók. Közülük a konyhasó bakteriosztatikus hatását a vízelvonásnak és az ozmózisos nyomás növekedésének köszönheti. A higany- és ezüstsók viszont erélyes baktericid hatásúak, a higanytartalmú mertiolát és merfen a gombák elleni fertőtlenítésre, valamint 1: es hígításban vérsavók konzerválására használatos. A tenyésztojások héján levő gombák, a tojásokat 1:5 000-es koncentrációjú oldataikban 5 percig fürdetve biztosan elpusztíthatók. 40

61 Bakteriológia Alkoholok. Az alkoholok közül az etil-alkohol 70%-os vizes oldatban vagy 2 4% jóddal kiegészítve (jódtinktúra) jól használható a bőrfelület (pl. vérvételek és injekciók beadása előtt) és felületes sebek fertőtlenítésére. Az alkoholok a fehérjéket denaturálják, és károsítják a magas lipoid tartalmú cytoplasmamembránt. Az alkohol elöli a vegetatív baktériumokat, de nem hat a spórákra. A magasabb szénatomszámú alkoholok közül a propil-alkoholok ugyanúgy használhatók, mint az etil-alkohol Kemoterápia A kemoterápia célja a szervezetbe jutott kórokozók (baktériumok, vírusok, gombák, paraziták) elpusztítása vagy fejlődésének a gátlása különféle kémiai anyagokkal (kemoterápiás szerekkel) a szervezet meggyógyulása vagy legalább a gyógyulás elősegítése érdekében anélkül, hogy ezzel komolyabban károsítanánk a gazdaszervezetet. Az egyes betegségek gyógykezelésére régóta használtak tapasztalati alapon különböző kémiai anyagokat. Így pl. a kínafa kérgét a malária okozta lázas rohamok enyhítésére vagy higanyt a syphilis gyógykezelésére, a mai értelemben vett kemoterápia kezdetét azonban az 1900-as évek elején a szerves arzént tartalmazó salvarsan előállítása, a szulfonamidok hatásának 1933-ban való felfedezése, továbbá a penicillin 1929-ben való felfedezése és az 1940-es évek elején való tömeges ipari előállítása jelentette. Ma már igen nagyszámú kemoterápiás szer ismert, ezek egy része mikrobák (baktériumok és gombák) által termelt természetes anyag vagy szintetikus úton előállított anyagok, mint pl. a szulfonamidok és más szerek. A kemoterápiás szerek kémiai szerkezetének, biokémiai tulajdonságainak (hatékonyság, toxicitás, felszívódás, kiürülés stb.) és használatának a részleteit a gyógyszertan tárgyalja, ezért a továbbiakban csupán az antibiotikumok, a szulfonamidok és néhány egyéb kemoterapeutikum antibakteriális hatásával és a velük szemben kialakuló rezisztenciával kapcsolatos kérdésekre térünk ki Antibiotikumok A baktériumok és egyes gombák számos olyan anyagot termelnek, amelyek más mikrobák fejlődését gátolják vagy kellő koncentrációban el is pusztítják azokat. Az ilyen hatású anyagokat összefoglalóan antibiotikumoknak, magát a jelenséget pedig antibiózisnak nevezzük. Az antibiotikumok rendszerint kis molekulatömegű, szekunder metabolitok. Egy részüket gombák, legtöbbjüket azonban a baktériumokhoz tartozó, természetes viszonyok között a talajban található Streptomyces, ritkán egyéb baktériumfajok tenyészeteiből állítják elő. Az antibakteriális hatású anyagok között vannak olyanok is, pl. a bakteriocinek, amelyek csupán saját vagy közel rokon fajokra hatnak. A bakteriocinek kis molekulatömegű polipeptidek, a baktériumok sejtfelületén levő specifikus receptorokhoz kötődnek, baktericid hatásúak. Az eddig megismert bakteriocinek termelődését extrakromoszomális genetikai elemek, plazmidok kódolják. A bakteriocineket éppen korlátozott hatékonyságuk miatt gyógykezelésre nem vagy csak ritkán használják. Az antibiotikumok kémiai szerkezete és hatásmódja igen változatos. Ma már több mint háromezerféle antibiotikumot ismerünk, közülük azonban gyógyászati célokra alig néhány tucatot használunk. Az antibiotikumok egy részének kémiai szerkezetét ismerjük, másokét nem. Egy részüket szintetikus úton is elő tudjuk állítani, másokét szintetikus úton átalakítjuk vagy megváltoztatjuk. A továbbiakban csupán az orvosi, állatorvosi szempontból fontos antibiotikumokkal foglalkozunk. Penicillinek. A penicillin volt az első használatba vett antibiotikum. A penicillint a Penicillium notatum, a P. chrysogenum és számos más Penicillium faj is termeli. A penicillin nem egységes szerkezetű anyag. A molekula központi magjához (6-amino-penicillánsavhoz) kapcsolódó eltérő szerkezetű oldalláncok különféle penicillinek létrejöttét eredményezik. Leggyakrabban a benzil-penicillint (penicillin G-t) állítják elő (20. ábra). 20. ábra - A penicillinek szerkezete 41

62 Bakteriológia A penicillin a baktériumok sejtfalának a szintézisét gátolja oly módon, hogy megakadályozza a peptidoglükán vázszerkezet peptid alegységei és peptidhídjai között transzpeptidációval kialakuló keresztkötések létrejöttét. A penicillin hatásának kitett baktériumok lekerekednek, felpuffadnak, hosszú, deformálódott fonalakat képeznek, s mivel a sejtfal nem tud ellenállni a cytoplasma nyomásának, előbb-utóbb feloldódnak. A penicillin az osztódó baktériumokra hat, a hatás baktericid jellegű. A penicillin elsősorban a Gram-pozitív baktériumokra hat, de hatékony a Gram-negatív coccusokkal, a spirochaetákkal és a rickettsiák egy részével szemben is. Penicillinrezisztencia a baktériumokban leggyakrabban penicillináz enzimek hatására jön létre. A penicillináz enzimek a penicillin központi magjának béta-laktám gyűrűjét felbontják (béta-laktamázok), s ezáltal a penicillin hatástalanná válik. Penicillinázt termel pl. a Staphylococcus törzsek nagy része és számos Gram-negatív bélbaktérium is. A penicillináz enzimek termelése a baktériumok egy részében indukálható. Az enzimet gyakran plazmid kódolja. A rezisztencia másik oka lehet a penicillin központi magjához kapcsolódó oldallánc lehasadása a penicillin-amidázok hatására. Ez utóbbi enzimeket főleg különféle gombák termelik. A Gram-negatív baktériumok kevésbé érzékenyek a penicillinre, aminek egyik oka az, hogy a penicillin a Gram-negatív baktériumok sejtfalában levő lipopoliszacharid-komplexek miatt nem tud eljutni a sejtfal peptidoglükánjához. A penicillin G-savra érzékeny, hatásspektruma viszonylag szűk, a penicillináz enzimek könnyen elbontják. A penicillinmolekula oldallánca a penicillint termelő gomba tápfolyadékához adott különféle anyagokkal befolyásolható. Ha a penicillin előállítása során a tápfolyadékhoz fenoxi-ecetsavat adunk, a gomba ezt beépíti a penicillinmolekulába, annak oldalláncaként. Ezáltal savstabil penicillin állítható elő (penicillin V). A penicillinek egy másik csoportját képezika félszintetikus penicillinek. Ezek előállítása során a gomba tenyészetéből a penicillin alapvegyületét, a 6-amino-penicillánsavat nyerik ki, s ehhez kémiai szintézissel in vitro, különféle, a hatékonyságot, a savérzékenységet és a penicillináz enzimekkel szembeni ellenálló képességet előnyösen befolyásoló oldalláncokat kötnek. Az így előállított penicillinféleségek (meticillin, 42

63 Bakteriológia oxacillin, ampicillin stb.) előnyösebben használhatók terápiás célokra, mint a gomba által természetes úton előállított benzil-penicillin. Cefalosporinok. A cefalosporinok a penicillinekkel rokon béta-laktám antibiotikumok, amelyeknek alapvegyületét ugyancsak gombák (Cephalosporium acromonium stb.) termelik. Az alapvegyület különböző módosításával készülnek a félszintetikus származékok. A cefalosporinok gátolják a baktériumok sejtfalához szükséges acetil-muraminsav-pentapeptid egységek cytoplasmában való szintézisét. A cefalosporinok hatásspektruma közel áll a penicillinekéhez. Hatásuk baktericid. Előnyük, hogy laktamáz enzimekre kevésbé érzékenyek, kevéssé allergizálnak. Az első generációs cefalosporinokhoz (cefalotin, cefazolin stb.) képest a félszintetikus, második generációs készítmények (cefamandol, cefoxitin stb.) számos Gram-negatív baktériummal szemben is hatékonyak, a harmadik generációs készítmények (cefotaxim, cefoperazon stb.) pedig ezek mellett még számos előnyös farmakokinetikai sajátsággal (lassabb kiürülés, jó szöveti penetráció) is rendelkeznek. Bacitracinok. A bacitracinokat a Bacillus licheniformis és rokonai termelik, kis molekulatömegű oligopeptidek, amelyek az állati szövetekben található proteolitikus enzimekkel szemben ellenállóak. A bacitracinok főleg a Gram-pozitív baktériumokra hatnak, akadályozzák a sejtfal szintézisét azáltal, hogy meggátolják a baktériumsejtben szintetizálódott acetil-glükózamin, N-acetil-muraminsav pentapeptidkomplexek sejtfalhoz szállítását. Aminoglikozidok. Az aminoglikozidok egymással szerkezetileg rokon antibiotikumok, amelyek közül a streptomicin,a neomicin, a kanamicin, a gentamicin és a spectinomicin használatos a leggyakrabban. Az aminoglikozidokat, kevés kivételtől eltekintve, különféle Streptomyces fajok, a streptomicint a Streptomyces griseus, a neomicint a Streptomyces fradiae stb. termelik. Széles terápiás skálájú antibiotikumok, egyaránt hatnak a Gram-pozitív és a Gram-negatív baktériumfajokra, hatásuk alacsony koncentrációban bakteriosztatikus, magasabb koncentrációban baktericid. A streptomicint széles körben használjuk az ember gümőkórjának a gyógykezelésére. Az aminoglikozidok a baktériumok riboszómáihoz kapcsolódva részben gátolják a fehérjeszintézist, részben pedig hibás (funkcióképtelen) fehérjemolekulák termelését okozzák. A streptomicin a baktériumriboszóma 30 S alegységének egyik fehérjemolekulájához kapcsolódva fejti ki gátló hatását. Az aminoglikozidokkal szembeni rezisztencia oka lehet a riboszómákat kódoló gének mutációja, pl. a streptomicinrezisztencia során a streptomicint megkötő riboszómafehérje szerkezetének megváltozása, aminek következtében a streptomicin nem tud a riboszómához kötődni, vagy az aminoglikozidok enzimekkel való inaktiválása (acetilálással, foszforilálással stb.). A streptomicinnel és más aminoglikozidokkal szemben is mutáció útján viszonylag gyorsan magas szintű rezisztencia alakul ki. Az aminoglikozidokat inaktiváló enzimeket gyakran plazmidok kódolják. A streptomicinnel szembeni rezisztencia rendszerint nem jár együtt más aminoglikozidokkal szembeni rezisztenciával. A streptomicinrezisztens baktériumtörzsek egyike-másika olyan mértékben hozzászokhat a streptomicinhez, hogy a továbbiakban csupán streptomicin jelenlétében képes szaporodni. Ez a jelenség a streptomicinfüggőség (dependencia). A dependencia nem csupán streptomicinnel, hanem egyéb aminoglikozidokkal és néhány más gyógyszerrel szemben is kialakítható (gyógyszer-dependencia). A dependencia oka valószínűleg az, hogy a gyógyszerhatás miatt a riboszómán keletkezett hibás fehérjék a baktériumok számára nélkülözhetetlenné válnak. Egyes streptomicindependens Salmonella törzseket vakcinaként használnak. Tetraciklinek. A tetraciklineket különféle Streptomyces fajok termelik. Közülük a klórtetraciklint, az oxitetraciklint és a doxiciklint használjuk széles körben. Az egyes tetraciklin-változatok a molekula vázához kapcsolódó szubsztituensekben különböznek egymástól. A doxiciklint az oxitetraciklinből állítják elő szintetikus úton. Széles terápiás skálájú antibiotikumok, hatékonyságuk spektruma nagyjából megegyezik egymással, a Gram-pozitív és a Gram-negatív baktériumokra, ideértve a chlamydiákat és a rickettsiákat is, egyaránt hatékonyak. A doxiciklin előnye egyebek mellett, hogy per os adva jobban felszívódik, magasabb és tartósabb vérszint alakul ki, mint a két másik tetraciklin alkalmazását követően. A tetraciklinek hatása inkább bakteriosztatikus, mint baktericid. A baktériumsejtbe aktív sejtmunka eredményeként jutnak be, s a fehérjeszintézist gátolják azáltal, hogy megakadályozzák az aminosavakat szállító transzfer-rns riboszómákhoz való kötődését. A tetraciklinekkel szembeni rezisztenciának rendszerint az az oka, hogy a gyógyszer nem tud kellő koncentrációban bejutni a baktériumsejtbe a transzportrendszer hibája vagy a sejtfalban megjelenő specifikus fehérjék gátló hatása miatt. A teraciklin-származékok között csaknem mindig keresztrezisztencia áll fenn. Klóramfenikol. A klóramfenikolt a Streptomyces venezuelae termeli. Szerkezete viszonylag egyszerű, ezért ma már inkább szintetikus úton állítják elő. Széles terápiás skálájú antibiotikum, a baktériumok riboszómáinak 50 S alegységéhez kapcsolódva gátolja a polipeptidszintézist. A klóramfenikol a baktériumsejtben enzimes úton, 43

64 Bakteriológia acetilálódással inaktiválódik. A klóramfenikol használatát korlátozza, hogy emberben aplasztikus anaemiát okozhat, ezért olyan állatoknak, amelyeknek a húsa vagy bármely terméke emberi fogyasztásra szolgál, nem adható. Makrolid antibiotikumok. A makrolid antibiotikumok egymáshoz hasonló szerkezetű, különböző Streptomyces fajok tenyészeteiből előállított anyagok. Kis koncentrációban bakteriosztatikus, nagyobb koncentrációban baktericid hatásúak. Közülük terápiás célokra leggyakrabbanaz eritromicint, az oleandomicint, a spiramicint, a tilozint és a tilmikozint használjuk. Valamennyi ide tartozó antibiotikum, a klóramfenikolhoz hasonlóan, a baktériumriboszóma 50 S alegységének egyik proteinjéhez kapcsolódva a fehérjeszintézist gátolja. A csoportból az eritromicin a leghatékonyabb, amely gátolja a legtöbb Gram-pozitív baktérium, a Gram-negatív coccusok, több más Gram-negatív baktériumcsoport és a mycoplasmák fejlődését is. A tilozin hatékony a mycoplasmákkal szemben is, a tilmikozin pedig, amely egy új félszintetikus makrolid, jól használható a pasteurellák és a haemophilusok okozta tüdőgyulladások gyógykezelésére. Az eritromicinnel szembeni rezisztencia rendszerint más makrolid antibiotikummal szembeni keresztrezisztenciát is jelent. Az eritromicinrezisztencia a törzsek egy részében a riboszómát kódoló gének mutációjának köszönhető. Rifamicinek. A rifamicinek a Streptomyces mediterranei által termelt antibiotikumok. Szerkezetileg közel állnak a makrolid antibiotikumokhoz. A DNS-ről mrns-t másoló RNS polimeráz működését gátolják. Félszintetikus származékai közül a rifampicin a humán tuberculosis gyógykezelésében használatos, más kemoterapeutikumokkal kombinálva. Az állatorvoslásban, eritromicinnel együtt, a csikók Rhodococcusequi okozta pneumoniájának a gyógykezelésére vesszük igénybe. Tiamulin. A tiamulin az egyes basidiumos gombák (Pleurotus mutilis stb.) által termelt pleuromulinből előállított, félszintetikus antibiotikum. A tiamulin és más pleuromulinszármazékok a baktériumok fehérjeszintézisét gátolják a 70 S riboszómához kötődve. A tiamulin igen alacsony koncentrációban hatékony a mycoplasmákkal és a vel szemben, de igénybe vehető a leptospirák, haemophilusok, pasteurellák okozta fertőzések gyógykezelésére is. A tiamulinnal szembeni rezisztencia a riboszóma több lépcsős mutációjának a következménye. A tiamulin elleni rezisztencia rendszerint együtt jár az eritromicinnel és tilozinnal szembeni rezisztenciával is. Linkomicin. A linkomicin a Sreptomyces lincolnensis tenyészetéből előállított antibiotikum. A riboszómákhoz kötődve a fehérjeszintézist gátolja. Hatékony a Gram-pozitív baktériumokra, továbbá a mycoplasmákra és a Serpulina hyodysenteriaere is. A vele szembeni rezisztencia rendszerint együtt jár eritromicin- rezisztenciával és fordítva is. Gyakran spectinomicinnel kombinálva használjuk. Polimixinek. A polimixinek ciklikus oligopeptidek, felületaktívak, a baktériumok cytoplasmamembránjához kapcsolódnak. Hatásukra a cytoplasmamembrán fokozatosan áteresztővé válik, a baktériumsejt feloldódik. A polimixinek főleg a Gram-negatív baktériumokra hatnak, terápiás célokra a polimixin-b-t és a polimixin-e-t (colistint) vesszük igénybe. Polien antibiotikumok. Az ide tartozó antibiotikumokat különböző Streptomyces fajok termelik. Közülük a fungicidint (nistatint) és amfotericin B-t gombák okozta fertőzések gyógykezelésére használjuk, az előbbit viszonylag magas toxicitása miatt lokálisan, az utóbbit viszont szisztémásan is. A polien antibiotikumok a cytoplasmamembrán szteroljaihoz (a gombasejtekben az ergoszterolhoz) kötődnek és ezáltal fokozzák a membrán permeabilitását Egyéb kemoterapeutikumok Szulfonamidok. A szulfonamidok a baktériumok folsavszintéziséhez szükséges paraamino-benzoesav kompetitív antagonistái. A baktériumok paraamino-benzoesavból, pteridinből és glutaminsavból dihidrofolsavat, majd abból tetrahidro-folsavat képeznek. A tetrahidro-folsavat a baktériumok intermedier anyagcseréjük során egyebek mellett a metionin, a purinbázisok, a timin, a pantoténsav stb. szintéziséhez veszik igénybe. Szulfonamidok jelenlétében zavart szenved a folsavszintézis (21. ábra), a folsav hiánya miatt pedig a baktériumok szaporodása fokozatosan megszűnik. Mivel a paraamino-benzoesavat a baktériumok intermedier anyagcseréjük során maguk állítják elő, az antagonista hatás eléréséhez a szulfonamidoknak megfelelő koncentrációban kell jelen lenniük. Számtalan szulfonamidféleség létezik. A folsavat maguk előállító baktériumfajok az egyes szulfonamidokra különböző mértékben érzékenyek. Azok a baktériumfajok, amelyek a folsavat exogén forrásokból fedezik, a szulfonamidokra eleve rezisztensek. A szulfonamidok bakteriosztatikus hatásúak. Esősorban a Gram-pozitív baktériumfajok szaporodását gátolják, hatnak azonban néhány Gramnegatív baktériumcsoportra is. 44

65 Bakteriológia 21. ábra - A szulfonamidok és a diamino-pirimidinek támadáspontja a folsavszintézisben A szulfonamidokkal éppúgy, mint más kemoterápiás szerekkel szemben, a baktériumokban rezisztencia alakulhat ki. A rezisztencia létrejöhet oly módon, hogy a kérdéses baktériumtörzs több paraamino-benzoesavat termel vagy a folsavszintézist végző enzim affinitása nő meg a paraamino-benzoesav iránt, továbbá oly módon, hogy a szulfonamidokat a baktériumok acetilálással vagy egyéb módon elbontják. Diamino-pirimidinek. Ugyancsak a baktériumok folsavszintézisét, a dihidro-folsavat tetrahidro-folsavvá alakító dihidro-folsav-reduktáz enzim működését gátolják. Közülük legszélesebb körben a trimetoprim használatos. A gátlás nem kompetitív, ezek a szerek irreverzíbilisen kötődnek az átalakítást végző enzimhez. Mivel ezek az anyagok a baktériumok folsavszintézisének egy másik lépcsőjét gátolják, fokozzák (potenciálják) a szulfonamidok hatását. Nitrofurán származékok. A furángyűrű NO 2 csoportjának szubsztituálásával állítják elő őket. Az ide tartozó vegyületek közül a furazolidon, a nitrofurazon és a nitrofurantoin használatos a legszélesebb körben. A baktériumok fehérjeszintézisét gátolják, főleg a Gram-negatív baktériumok ellen hatnak. Magasabb koncentrációban vagy hosszabb ideig adagolva toxikusak. Élelmiszer-termelésre igénybe vett állatoknak nem adhatók. Quinolonok. A quinolonszármazékok a baktériumok DNS-ének a megkettőződését (a DNS szétcsavarodását) gátolják. Közülük az oxolinsav és a nalidixinsav hatékony a legtöbb Gram-negatív baktériumfajra, de mivel gyorsan kialakul velük szemben rezisztencia, önállóan csak ritkán, többnyire más antibakteriális szerekkel kombinálva használjuk őket. A fluorquinolonok (ciprofloxacin, norfloxacin, enrofloxacin, ofloxacin stb.) hatékonysága az előbbi kettőnél lényegesen jobb, a Gram-negatív baktériumok okozta fertőzések gyógykezelésére vesszük őket igénybe. Az antibakteriális szerek használata. A szulfonamidokat, antibiotikumokat és számos más kemoterapeutikumot széles körben használjuk az állatgyógyászatban is. Mivel rendszeres alkalmazásuk fokozza a rezisztens, gyakran egyszerre több, különféle antibiotikummal szemben rezisztens (polirezisztens) baktériumtörzsek kialakulásának és gyors szelektálódásának a veszélyét, e szereket csak akkor szabad használnunk, ha az valóban indokolt. A gyógykezelés céljára azt az antibiotikumot vagy gyógyszer-kombinációt kell használnunk, amelyik a kitenyésztett kórokozó gyógyszer-rezisztenciájának a vizsgálata alapján a leghatékonyabb (célzott antibiotikum kezelés). A rezisztencia kialakulásának megelőzése érdekében célszerű, hacsak lehet, antibiotikumkombinációkat igénybe venni. A kezelést a betegség lehető legkorábbi szakaszában kell elkezdeni, a terápiás dózis maximumát adva a mielőbbi magas vér- és szöveti koncentráció kialakítása érdekében, emellett az antibiotikum-szintet célszerű a klinikai tünetek megszűnte után is legalább néhány napig fenntartani. Bár az antibiotikumokat leggyakrabban gyógykezelésre vesszük igénybe, használjuk őket preventív célból, sőt egyeseket hozamfokozóként is takarmányba vagy ivóvízbe keverve. Antibiotikumokat használunk a laboratóriumban is szelektív táptalajok készítéséhez, továbbá szövettenyészetekhez adva a baktériumszaporodás gátlására. A gyógyszerek iránti érzékenység vizsgálata. Az antibiotikumok és más kemoterápiás szerek iránti érzékenység in vitro vizsgálatára számos módszer ismeretes. Ezek közül gyakorlati célokraa korongdiffúziós módszer 45

66 Bakteriológia segítségével való vizsgálat a legalkalmasabb. A vizsgálandó baktériumtörzs friss, megfelelő sűrűségű szuszpenziójából egy kis mennyiséget élesztőkivonatot nem tartalmazó táptalajra szélesztünk. Ezután egymástól megfelelő távolságra a táptalajra helyezzük a különféle, meghatározott mennyiségű antibiotikumot, egyéb kemoterapeutikumot tartalmazó (eltérő színnel jelölt vagy számozott) papírkorongokat, majd a táptalajokat óráig tenyésztjük. A korongokban levő szer a táptalajba diffundál és a baktériumfaj érzékenységétől függően kisebb-nagyobb mértékben akadályozza a baktériumok szaporodását (22. ábra). A korongok körül kialakult gátlási gyűrűk átmérője alapján eldönthető, hogy a vizsgált baktériumtörzs melyik gyógyszerre érzékeny, mérsékelten érzékeny vagy rezisztens, s kiválasztható az adott betegség gyógykezelésére szóba jöhető leghatékonyabb kemoterapeutikum. Mivel a gátlási gyűrű nagyságát egyebek mellett lényegesen befolyásolja a felhasznált táptalaj milyensége, a beoltásra használt baktériumtenyészet kora, sűrűsége, a papírkorongokba tett gyógyszer mennyisége, a gyógyszerérzékenység vizsgálatának módszereit standardizálták. Nagyobb laboratóriumokban a gyógyszereket tartalmazó korongok felhelyezésére és az eredmények leolvasására ma már automata berendezéseket használnak. 22. ábra - Staphylococcus aureus antibiotikum-érzékenységének vizsgálata Resistestkorongokkal A korongdiffúziós módszerrel kapott eredmények a baktériumok relatív gyógyszerérzékenységéről tájékoztatnak. Ha a gyógyszerérzékenység pontos ismeretére van szükségünk a vizsgálandó baktériumtörzset a gyógyszert növekvő mennyiségben tartalmazó folyékony vagy szilárd táptalajba oltjuk, s a szaporodás vagy annak hiánya alapján meghatározzuk a vizsgált anyag legkisebb hatékony gátló koncentrációját (minimális gátló koncentrációk, MIC), illetve azt a koncentrációt, amely a baktériumokat el is öli (minimális baktericid koncentrációk, MBC). Az antibiotikumból vagy egyéb kemoterapeutikumból adandó tényleges dózist és az elérni kívánt vér- és szöveti antibiotikumszintet a célállaton végzett kísérletek eredményei alapján határozzuk meg, figyelembe véve a gyógyszer felszívódóképességét, szöveti megoszlását, lebomlását, kiürülésének módját, tempóját stb. A pontos adagról, az alkalmazás módjáról és a kezelés szükséges időtartamáról a fentiek figyelembevételével összeállított használati utasítás tájékoztat. 7. A baktériumok genetikája 46

67 Bakteriológia 7.1. A genetikai anyag szerkezete és funkciója A baktériumok genetikai anyaga, amely az örökletes tulajdonságok hordozója, dupla szálú DNS. A baktériumokban éppen úgy, mint a magasabbrendű szervezetek sejtjeiben, a DNS-ben tárolt információt a nukleotidtripletek sorrendje határozza meg. A baktériumok haploid mikroorganizmusok, az egyes tulajdonságokat meghatározó gének egyetlen körkörös, szabad vég nélküli, óriás DNS-molekulában (baktériumkromoszómában) foglalnak helyet. A kromoszómán kívül a baktériumok egy részében extrakromoszomális genetikai elemek, plazmidok is találhatók. Az E. coli baktériumok genetikai állományát képviselő kromoszomális DNS 1 1,4 mm hosszú, molekulatömege 2,7x10 9, kb. 4,6x10 6 bázispárt tartalmaz. Génenként bázispárt feltételezve az E. coli kromoszómája kb gént foglal magában. Hasonló nagyságrendű (0, bázispár) a többi baktériumfaj kromoszómája is. A baktérium kromoszómájában a gének lineárisan helyeződnek el. Az egy funkciót (pl. E. coliban a laktózbontást) kódoló gének a kromoszómában általában egymás után helyezkednek el, a bonyolult, összetett funkciókat (pl. a spórásodást, osztódást stb.) azonban rendszerint a kromoszóma különböző helyein (lokuszain) levő több gén együttesen kódolja. Egy gén egy polipeptidláncot kódol. A kromoszómában az egyes specifikus fehérjéket kódoló (struktur-)gének mellett a tárolt információ kifejeződését szabályozó regulátorgének, promoter- és operátorszekvenciák, továbbá IS (inserted sequences) szakaszok is találhatók. A baktériumkromoszóma éppen úgy, mint az eukaryota sejtekben, szemikonzervatív módon kettőződik meg. A replikáció megindulásakor a cirkuláris DNS egy rövid szakaszán a kettős szál szétcsavarodik, s a szétcsavarodott DNS- szál mindegyikének belső oldalán, DNS-polimerázok segítségével, mindkét irányban megindul a komplementer szálak felépülése. A szülőkromoszóma dupla szálú DNS-ének a szétcsavarodása speciális enzimek (kicsavaró fehérjék, DNS-girázok) hatására jön létre. A baktériumokban a kromoszóma megkettőződése egy ponton, míg az eukaryota sejtekben egyszerre több ponton indul meg. E. coli baktériumokban a DNS megkettőződésének a startpontja a kromoszóma 74. percénél, az izoleucin-valin (ilv) gének közelében van. Az újonnan képződött két dupla szálú DNS-molekula mindegyike egy-egy szülői és egyegy újonnan szintetizált (komplementer) szálat tartalmaz. A baktériumkromoszómában tárolt információ kifejeződése a transzkripcióval indul meg. A transzkripció során a DNS-dependens RNS-polimeráz enzim szimpla szálú mrns-t, trns-t és rrns-t szintetizál. Az RNS-képzést a DNS indítószekvenciájához (a promoter régióhoz) specifikusan kötődni képes RNS polimeráz indítja meg. Az RNS-lánc szintézise a DNS stop jelzésénél fejeződik be. A stopjelek az indítószekvenciákhoz hasonlóan specifikus nukleotidsorrendű szakaszok. Az RNS-szintézishez (néhány bakteriofág kivételével) csak az egyikdns-szál szolgál templátként. Az mrns-molekulák közvetítik a DNS nukleotidtripletjeibe írt (kód) információt a riboszómákhoz. A fehérjeszintézis során a riboszómán keletkező polipeptidláncok aminosavsorrendjét, s ezáltal a fehérjék funkcióját és fajlagosságát az mrns-molekulák nukleotidtripletjeinek (kodonjainak) a sorrendje határozza meg. A mrns-ek már szintézisük befejezése előtt kötődnek a riboszómákhoz. Élettartamuk igen rövid, E. coliban átlagosan 2 perc. A riboszómákról történő leválásuk után enzimatikus úton elbomlanak. A riboszóma RNS-nek kódfunkciója nincs, fehérjékhez kapcsolódva a baktériumok riboszómáiban találhatók. A riboszómákon folyik a fehérjeszintézis. A riboszómák megfelelő felületet adnak az mrns, a trns és a képződött peptidmolekulák kötődéséhez a fehérjeszintézis során. A bakteriális rrns-ek egyetlen génről íródnak át egy pre-rns-sé, majd ez a molekula esik szét több kisebb (16 S, 30 S stb.) RNS-sé. A kis rrns molekulák fehérjékhez kapcsolódnak, s csak a mrns-ek megjelenésekor, a fehérjeszintézis megindulásakor egyesülnek komplett, működőképes egységgé. A trns molekulák szállítják az aktivált aminosavakat a riboszómákhoz. A baktériumokban eddig identifikált trns-félék száma között változik, azaz az enzimek egyféle aminosavat nem csupán egyféle trns-hez képesek kötni. A trns fonalak a komplementer bázisok között kialakuló hidrogénkötések miatt lóhere alakban föltekeredtek. A lóhere egyik hurkához kötődik az aktivált aminosav, a másikon keresztül kötődik a trns a riboszómához, a harmadik hurok pedig az antikodont hordozza. Jóllehet a baktériumsejtben található RNS több mint 98%-a riboszóma-rns, mégis a DNS-nek kevesebb, mint 1%-a szolgál ezek templátjaként. A bakteriális DNS túlnyomó többségéről mrns szintetizálódik. A fehérjeszintézis a riboszómák mrns-hez való kapcsolódásával indul meg. A peptidláncok a riboszómán az mrns kodonjainak megfelelően trns által szállított aminosavakból épülnek fel. Az összes bakteriális polipeptid szintézise N-formil-metioninnal kezdődik, amely a szintézis befejeződésekor rendszerint leszakad. A 47

68 Bakteriológia peptidlánc képződésének megindulásához legalább három különféle fehérjére (lánckezdő faktorokra) is szükség van. Ugyancsak speciális fehérjék (elongációs faktorok) segítik elő a polipeptidlánc képződése során az aminosavakat szállító trns-ek riboszómához kapcsolódását és a trns-ek áthelyeződését a riboszóma egyik helyéről a másikra. A polipeptidlánc szintézise a stop tripletek (nonszensz kódok) leolvasásával ér véget. A peptidlánc terminációját, a lánc végi aminosavhoz kapcsolódó trns lehasadását, a polipeptidlánc leválását a riboszómáról ugyancsak specifikus fehérjék (release-faktorok) segítik elő. Egy mrns molekula egyszerre több (egymással szomszédos géneken elhelyezkedő) fehérje szintézisére nézve is hordozhat információt (policisztronos mrns). Az egy mrns által kódolt különféle funkciójú fehérjék (pl. E. coli béta-galaktozidáz, galaktozid-permeáz) nem feltétlenül szintetizálódnak azonos mennyiségben. Egy mrnsről egyszerre több riboszóma (poliriboszóma) is képezhet fehérjét, így ugyanarról az mrns-ről eltérő hosszúságú peptidláncok szintetizálódhatnak. A fehérjeszintézis befejeztével a riboszóma alegységeire válik szét. A peptidláncok elkészülte után a terminális aminosavak egy része lehasad vagy esetenként a peptidlánc feldarabolódik, s a funkcióképes fehérje (enzim) ezekből az átrendezett peptidláncokból áll össze. A génkifejeződés szabályozása. A baktériumokban az egyes génekben kódolt sajátságok kifejeződésének (expressziójának) a szabályozása meglehetősen bonyolult. A bakteriális DNS egy részéről permanensen íródik át mrns, így az enzimek (fehérjék) egy része (pl. a glükózbontást végző enzimek) kisebb-nagyobb mennyiségben mindig megtalálhatók a baktériumsejtben (konstitutív enzimek). Mások (pl. a laktóz bontását, egyes gyógyszerek inaktiválását stb. végző enzimek) csak akkor szintetizálódnak, ha az enzim szubsztrátja a környezetben megjelenik (indukálható enzimek). A fentieken kívülvannak olyan enzimek (pl. az aminosavak bioszintézisét végzők), amelyek az adott enzim végtermékének (korepresszorának) a táptalajba keverésével represszálhatók (represszálható enzimek). Az indukálható és represszálható fehérjék (enzimek) kódjaként szolgáló mrns molekulák transzkripciójának megindulása speciális fehérjemolekuláktól, a represszoroktól függ. A represszorfehérjéket is kromoszóma-dns,a regulátorgének kódolják. Minden represszor egy vagy több fehérje szintézisét állítja le. A represszor specifikus helyen kötődik a megfelelő DNS-hez és meggátolja az adott mrns molekula transzkripciójának megkezdődését. A DNS represszorfehérjét megkötő szakasza az operátorrégió (operátorlokusz). Azokat az egymással szomszédos DNS szakaszokat, amelyekről egyetlen mrns molekula szintetizálódik (egyetlen promoter régió szabályozása mellett) nevezzük operonoknak.az operonok funkcionális egységek, egy-egy anyagcsere-folyamatot végző enzimek kódját és az ezek kifejeződését szabályozó géneket tartalmazzák. Az E. coli laktóz operon, amely a laktóznak a baktériumsejtbe való bejutását és lebontását végző enzimeket kódolja, szerkezete ismert, transzkripcióját egy regulátorgén szabályozza (23. ábra). A represszorfehérje az operátorrégióhoz kötődve mindaddig gátolja az adott struktúrgének transzkripcióját, ameddig az indukáló anyaggal (pl. a laktózoperon esetén a laktózzal) nem találkozik. Az indukátor kötődése inaktiválja a represszorfehérjét, így az adott génszakaszokra vonatkozóan megkezdődhet az mrns-másolás. 23. ábra - Escherichia coli laktóz operonjának és kapcsolt regulátorgénjének szerkezete. A laktóz operon a kromoszóma 10. percében helyeződik; a számok az egyes génekben, lókuszokon talált bázispárok számát mutatják 48

69 Bakteriológia A represszorok működése a génkifejeződés negatív szabályozása, mert a represszor hiánya az adott enzim vagy enzimek állandó termelését okozza (konstitutív mutánsok). A génkifejeződésnek azonban van pozitív szabályozása is, ami pl. a glükózbontást végző enzimek szintézisének serkentésében jut kifejeződésre. A baktériumok glükózbontása során az egyik bomlástermék csökkenti a sejtben a ciklikus adenozin-monofoszfát (camp) mennyiségét. A camp egy specifikus, ún. katabolitaktivátor fehérjéhez (CAP-hoz) kapcsolódik, majd együtt a promoter specifikus helyeihez kötődve növelik a szomszédos operonok transzkripciójának s ezáltal a glükózbontásnak a sebességét. A baktériumok különféle anyagainak szintézisét végző enzimek expresziójában működnek végtermékgátló mechanizmusok is, amikor valamely végtermék tápfolyadékban való megjelenése leállítja az adott anyag szintézisét végző enzimet kódoló gén (vagy gének) transzkripcióját. Az E. coli tenyészet tápfolyadékához adott triptofán pl. gátolja a triptofánszintézist végző enzimek génjeinek(operonjának) atranszkripcióját. IS-elemek. Az IS-elemek aránylag rövid, bázispárt tartalmazó, azonos nukleotidszekvenciájú, nemkód funkciójú DNS-szakaszok, amelyek megtalálhatók több példányban a baktériumok kromoszómájában, az extrakromoszomális genetikai elemekben, de bakteriofágokban, egyéb vírusokban és eukaryota sejtekben is. Az IS-elemek a baktériumkromoszómába beépülve befolyásolják a génfunkció kifejeződését. A promoter- és terminátorszekvenciákat is tartalmazó IS-elemek orientációjuktól függően szerepet játszanak annak a génnek a ki- és bekapcsolásában, s ezáltal a génfunkció kifejeződésében, amely elé beépültek. Az E. coli laktóz operonjába beépített IS-elem megszüntette annak a génnek a funkcióját, amelybe beépítették, a mögötte helyeződő gének transzkripciója pedig ugyancsak megszűnt vagy jelentős gátlást szenvedett (poláris mutáció). Az IS-elemek beépülése a kromoszómába vagy a plazmidba különösen jelentős akkor, ha azok kód funkciójú DNS szakaszokat fognak közre. Az ilyen képződményeket nevezzük transzpozonoknak (lásd később).az ISelemek által közrefogott szakaszok könnyen kicserélődnek idegen gének analóg szakaszaival vagy helyeződnek át a genomban, nem igényelve a recipiens genom homológiáját vagy specifikus enzimeket. Az IS-elemeknek ily módon fontos szerepük van a prokaryoták genetikai anyagának rekombinációjában (lásd később) Extrakromoszomális genetikai elemek (plazmidok) Számos baktériumfaj a kromoszómában foglalt genetikai anyagon kívül különféle tulajdonságokat kódoló extrakromoszomális elemeket, plazmidokat is tartalmaz. A plazmidok a kromoszómához hasonlóan,kevés kivételtől eltekintve, hurok alakú, dupla szálú DNS-molekulák, molekulatömegük azonban csupán milliós nagyságrendű, szemben a kromoszóma milliárdos nagyságrendjével. A plazmidoka kromoszómától függetlenül replikálódnak, a baktériumsejtben önállók maradnakvagy integrálódnak a kromoszómába (episzóma). Az alacsony molekulatömegű, kis plazmidokból egy-egy baktériumsejt több tucatot is tartalmazhat, a nagyobb molekulatömegű, több tulajdonság kódját hordozó plazmidok száma baktériumsejtenként rendszerint nem több mint 1 4. Bár a plazmidok által kódolt sajátságok a baktériumsejt számára nem létfontosságúak, többnyire előnyt jelentenek a környezethez való alkalmazkodásban. A plazmidok egy része minden baktériumsejtben, mások csak bizonyos baktériumfajok sejtjeiben képesek szaporodni. Valamely plazmid jelenléte a baktériumsejtben megakadályozhatja homológ vagy heterológ (más tulajdonságokat kódoló) plazmidnak a sejtbe való bejutását, illetve szaporodását (plazmid-inkompatibilitás). A plazmidok a sejtből alkalmanként spontán eltűnnek, de különféle mesterséges beavatkozásokkal (UV sugárzással, akridinfestékekkel, egyes antibiotikumokkal stb.) is eltüntethetők (plazmidtörlés). A plazmidok egy része képessé teszi a baktériumsejteket arra, hogy konjugáció útján genetikai anyagot adjanak át más baktériumoknak. Ezeka konjugatív (transzferálható) plazmidok. Sok plazmid ismert, ígyaz F- (fertilitás-) plazmid, a gyógyszerrezisztenciáért felelős R-(rezisztencia-)plazmid, Col- (colicin termelését kódoló)plazmidok, egyes antigéneket, hemolizálóképességet, toxinképzést vagy bizonyos anyagok pl. toluol, xilol bontását végző enzimeket stb. kódoló plazmidok A baktériumok változékonysága Bár a baktériumok alaki, biokémiai stb. tulajdonságai az egyes fajokra jellemzőek és állandóak, mégis a baktériumok szaporodása folyamán a szülősejtektől eltérő tulajdonságú utódok is létrejönnek. A baktériumoknak ez a változékonysága érintheti a baktériumok genetikai anyagát (a genotípust) vagy csupán a küllemi tulajdonságokban (fenotípusban) jut kifejeződésre A genotípus változékonysága A mutáció 49

70 Bakteriológia A mutáció a genotípusban bekövetkezett változás, az ennek eredményeként létrejött, megváltozott tulajdonságú egyedek pedig a mutánsok. A mutáció öröklődő változás, amely az utódnemzedékben is kimutatható. A mutáció során bekövetkezett DNS-szekvencia-változás nem mindig tükröződik a fenotípusban. Ennek rendszerint az az oka, hogy a mutáció néha olyan DNS-szakaszokat érint, amelyeknek megváltozása nem vezet hibás fehérjék szintézisére, vagy a változás olyan kisfokú, hogy a fenotípusban csak finomabb módszerekkel mutatható ki. A mutációk kialakulhatnak spontán, de létrejöhetnek különféle mutagén ágensek hatására is. Az egy tulajdonságot érintő spontán mutációk gyakorisága baktériumnemzedékenként nagyságrendű. A mutagén ágensek által létrehozott mutációt nevezzük indukált mutációnak. Mutagén ágensként hat az ultraibolya sugárzás, az akridinfestékek, a metilálóanyagok, a purin-, a pirimidin-bázisanalógok stb. Az ultraibolya sugárzás a bázisok között dimerek képződéséhez vezet, az akridinszármazékok és a metilálóanyagok bázisokat távolítanak el a DNS-láncból, a bázisanalógok pedig a természetes bázisok helyett épülnek be, párképzésük azonban nem tökéletes, s ez másoláskor hibákhoz vezet. A mutáció alapja a DNS bázisszekvenciájának megváltozása egy vagy több bázis kicserélődése (szubsztitúció), beépülése (inzerció) vagy kiesése (deléció) következtében (pontmutációk). A mutáció kiterjedhet hosszabb, akár több gént magában foglaló DNS-szakaszokra is. Előfordul, hogy a DNS-szegmentum megcseréli irányultságát (inverzió), áthelyeződik a kromoszóma más helyére (transzlokáció) vagy akár megkettőződik (duplikáció). Báziscserével járó mutáció jelentheti eltérő aminosav beépülését az adott DNS- szakasz által kódolt fehérjébe vagy esetleg lánclezáró kód létrejöttéhez vezet. Az előbbiek a téves értelmű (misszensz), az utóbbiak az értelmetlen (nonszensz) mutációk. A misszensz mutáció során képződött fehérje, mivel benne csak egy aminosav cserélődött ki, rendszerint megtartja eredeti funkciójának egy részét. A nonszensz mutáció következtében, attól függően, hogy a gén melyik szakaszát érte, rövidebb vagy hosszabb, rendszerint funkcióképtelen polipeptidláncok szintetizálódnak. A polipeptidlánc hossza alapján a mutáció helye meghatározható. A nukleotidbeszúrás vagy -kimaradás a tripletek eltolódása miatt a mutáció mögötti összes kód értelmének a megváltozásával jár (fáziseltoló mutációk) s funkcióképtelen fehérjék szintézisét okozza. A mutációt szenvedett egyedek újabb mutációval visszanyerhetik eredeti genotípusukat. Ez a jelenség a reverzió. A reverzió viszonylag könnyen következik be pontmutációk után, egyéb esetekben sokkal ritkább. A reverzió lehet valódi vagy szuppresszió útján létrejövő. A valódi reverzió során az adott génszakasz újabb, ellenkező előjelű mutációt szenved, s az új mutációtól kezdődő szakaszon a kód értelme helyreáll. A szuppressziót előidéző mutáció a trns antikodonjának a megváltozásán keresztül érvényesül. A megváltozott antikodonú trns képes az eredeti mutáció során keletkezett és mrns-re átíródott nonszensz kódot értelmezni s valamelyik aminosavat a készülő peptidláncba beépíteni. Ily módon funkcióképes fehérje képződik, azaz a szuppresszió a fenotípus korrekcióját eredményezte. A baktériumcytoplasma tartalmaz olyan enzimeket, amelyek a saját nukleinsavakat pl. metilálással specifikusan megjelölik (metiltranszferázok, DNS modifikáció), továbbá endonukleázokat, amelyek az idegen DNS-eket meghatározott bázisszekvenciák között elhasítják, valamint olyan DNS-reparáló enzimeket is, amelyek képesek a másolási hibákat kijavítani, pl. az UV besugárzás után keletkezett timidin diméreket kihasítani, a beépült plusz bázispárokat a DNS láncból kivágni stb. A reparációs enzimek jelentős mértékben korrigálják a másolási hibákat, a restrikciós endonuklázok pedig elbontják a baktériumsejtbe jutott idegen DNS-t. Minden olyan anyag (gyógyszerek, vegyszerek stb.) vagy hatás, amely a DNS-t befolyásolja (potenciálisan) mutagén ágensnek tekinthető. Az egyes anyagok mutagén hatása baktériumtenyészetek segítségével (is) vizsgálható. A vizsgálathoz olyan többszörös mutáns (emiatt reverzióra igen kevéssé képes) baktériumokat, pl. hisztidint igénylő (auxotróf) S. typhimurium törzset használunk, amelyből a természetes DNS-reparáló enzimek hiányoznak és ezért a baktérium újabb mutációra nagy fokban hajlamos. A baktériumokat patkánymájból készített kivonatban szuszpendáljuk, majd olyan szintetikus, minimális táptalajra szélesztjük, amelyen a baktériumtörzs nem nő. Egy szűrőpapír korongot a vizsgálandó anyaggal átitatva a beoltott táptalaj közepére helyezünk. A májkivonat arra szolgál, hogy a benne lévő enzimek a vizsgálni kívánt anyagot különböző (esetleg mutagén) komponensekre bontsák éppen úgy, mint az élő szervezetben. Ha a vizsgált anyag vagy metabolitjai mutagének, a S. typhimurium törzs mutáció(ka)t szenved, közöttük olyanokat is, amelyek a hisztidinszintézis képességének a visszatérését jelenti, s ez esetben a korong körül baktériumtelepek fejlődnek. A S. typhimuriummal végzett próba (Ames-test) nagy biztonsággal jelzi a vizsgált anyagok mutagén hatását. A mutációk a genetikai anyag bármelyik szakaszát érinthetik. A mutánsok kiválogatása legtöbbször a megváltozott tulajdonság (szelektív bélyeg) alapján történik. Orvosi szempontból azok a mutációk a legfontosabbak, amelyek a baktériumok sejtszerkezetét, anyagcseréjét, gyógyszerekkel szembeni érzékenységét és a kórokozó baktériumok virulenciáját érintik (lásd később). 50

71 Bakteriológia A sejtszerkezetet érintő mutációk. A sejtszerkezetet érintő mutációk kifejeződésre juthatnak a baktériumtelepek megváltozott morfológiájában. A baktériumok a szilárd táptalajok felületén a fajra jellemző alakú, nagyságú, színű telepeket (kolóniákat) képeznek. Az éles határú, sima, fénylő, vajszerű vagy éppenséggel nyálkás S- (sima)telepeket képező baktériumok tenyészeteiben hosszabb ideig tartó állás vagy sorozatos továbboltás (passzálás) hatására olyan telepek is megjelennek, amelyeknek széle csipkés, felszíne matt, rögös (R-telepek). Az R-telepek kialakulása a Gram-negatív baktériumoknál a sejtfalban található lipopoliszacharidok felépítését kódoló gének több lépésben bekövetkező mutációjának a következménye. A típusspecifikus O- poliszacharid-oldallánc fokozatosan elvész. Az S R mutáció nemcsak a telepküllem megváltozásával jár, hanem mivel a poliszacharid-molekula szabja meg a Gram-negatív baktériumok O-antigénjének specificitását, a mutáción átesett törzsek antigénszerkezete is megváltozik. Az S R mutáció rendszerint együtt jár a virulencia részleges vagy teljes elvesztésével. Az ilyen törzsek autoagglutinábilisak, tenyészetükből nem képezhető stabil szuszpenzió, megváltozik a bakteriofágok iránti érzékenységük stb. A Gram-pozitív baktériumokban az S R mutáció rendszerint a buroktermelő képesség, és ezzel együtt a virulencia részleges vagy teljes elvesztésével jár együtt. A Streptococcus (Diplococcus) pneumoniae, a Bacillus anthracis, Pasteurella multocida, Haemophilus paragallinarum stb. törzsek burkos S-variánsai virulensek, burok nélküli R-variánsaik virulenciájukat részben vagy teljesen elvesztették. A sejtfal felépítését kódoló gének mutációja következtében a baktériumok elveszthetik sejtfalukat. Az ilyen mutánsok (L-formák) csak speciális viszonyok között tarthatók fenn. Mutációk következtében módosulhat a baktériumok csillóit felépítő fehérjék szerkezete, sőt csilló nélküli variánsok is létrejöhetnek. A csillókat érintő mutációk nem befolyásolják a baktériumok pathogenitását, a csillóantigének részleges vagy teljes hiánya azonban megnehezíti a baktériumok szerológiai identifikálását. A mutációk érinthetik a baktériumok fimbriáit is. A fimbriát kódoló plazmid vagy kromoszomális DNSszakaszok elvesztése kifejeződésre juthat a telepküllem megváltozásában, a hemagglutináló és a hámsejtekhez való tapadási képesség elvesztésében, ami rendszerint együtt jár a virulencia elvesztésével is (Escherichia coli, Bordetella bronchiseptica stb.). Az anyagcserét befolyásoló mutációk. A mutációk érinthetik a baktériumoknak azokat a génjeit is, amelyek az egyes anyagcsere-folyamatokat, egyes anyagok bontását vagy bizonyos metabolitok szintézisét végző enzimek termelését kódolják. Az E. coli laktóz génjét érintő mutációk a tejcukorbontó képesség elvesztését idézhetik elő azáltal, hogy a bontást végző béta-galaktozidáz enzim termelődése megszűnik. Hasonló mutáción más metabolitok felhasználását megszabó gének is áteshetnek. Az anyagcsere-változásokban kifejeződő mutációk egy másik típusa az, amikor a baktériumok a mutáció következtében képtelenek bizonyos anyagokat pl. egyes aminosavakat, purin-, pirimidinbázisokat vagy vitaminokat szintetizálni, s a továbbiakban csak akkor szaporodnak, ha ezeket az anyagokat a táptalajban készen kapják. Az ilyen, a szülősejtektől csupán bizonyos táplálkozási igényeiben különböző törzseket auxotróf mutánsoknak nevezzük. A teljes enzimgarnitúrájú (prototróf) E. coli törzsek ammóniumsót és glükózt tartalmazó minimális táptalajon is szaporíthatók. Az adenint előállítani képtelen mutánsok azonban ebben a minimális táptalajban csak akkor nőnek, ha ahhoz adenint is adunk. Az auxotrófia nemcsak egyféle anyagra, hanem egyszerre többre is kiterjedhet (poliauxotróf mutánsok). Az anyagcserét érintő mutációk közül különösen fontosak azok, amelyek a virulencia szolgálatában álló citotoxinok termelését befolyásolják. Sok baktérium termel különféle citotoxinokat. Az Actinobacillus pleuropneumoniae törzsek pl. különféle, a tüdő alveoláris macrophagjait, az Escherichia coli baktériumok a bélnyálkahártya hámsejtjeit károsító citotoxinokat termelnek. E toxinok képződését többnyire plazmidok kódolják. E plazmidok elvesztése, vagy a toxin termelését kódoló génszakaszok megváltozása a toxintermelés megszűnéséhez és ezáltal a virulencia csökkenéséhez vagy elvesztéséhez vezet. Egyes toxinok kódját (pl. Clostridium botulinum törzsek egyes toxinjait vagy a Corynebacterium diphtheriae törzsek által termelt diphtheria toxint) fágok képviselik. A fágok elvesztése vagy megváltozása ugyancsak a kórokozó képesség megszűnésével vagy csökkenésével jár. Antibakteriális szerekkel szemben rezisztens mutánsok. A baktériumok okozta betegségek gyógykezelése szempontjából különös jelentőségük van a mutáció útján keletkezett gyógyszerrezisztens törzseknek. Mutáció útján keletkezhet a baktériumokban pl. streptomicinrezisztencia. A streptomicinrezisztencia oka a riboszómaszerkezet megváltozása a riboszómák felépítését meghatározó gének mutációjának következtében. A streptomicinnel szemben rezisztens törzsek riboszómái streptomicin jelenlétében is képesek normális, funkcióképes fehérjéket szintetizálni. Mutáció következtében nem csupán streptomicinnel, hanem más antibiotikumokkal (klóramfenikollal, tetraciklinekkel stb.) szembeni rezisztencia is létrejöhet. A 51

72 Bakteriológia baktériumpopulációkban természetes viszonyok között, antibiotikumok jelenléte nélkül is keletkeznek rezisztens mutánsok. Az antibiotikumokkal való gyakori gyógykezelések azonban nagy mértékben hozzájárulnak a rezisztens mutánsok gyors szelekciójához, ezáltal ahhoz, hogy az adott egyedben és a környezetben dominánssá váljanak A baktériumok genetikai anyagának bővülése génátvitellel (rekombináció) A baktériumok bizonyos körülmények között képesek idegen (más egyedekből vagy fajokból) származó, hosszabb vagy rövidebb, új tulajdonságokat hordozó DNS szakaszok felvételére. A DNS-átvitel történhet transzformáció, transzdukció, fágkonverzió és konjugáció útján. E folyamatok során az egyik baktériumból (donorból) (vagy a fágkonverzió során vírusból) DNS jut át egy másik (recipiens) baktériumba. Az átjutott DNS lehet a kromoszóma egy-egy szakasza, vagy plazmid(ok). Az átjutott kromoszómaszakasz vagy plazmid beépül(het) a recipiens kromoszómájába vagy plazmidjába, miáltal új tulajdonságokat (rekombinálódott DNS-t, kromoszómát, plazmidot) hordozó baktériumok (rekombinánsok) jönnek (jöhetnek) létre. Transzformáció. A transzformáció genetikai információ átvitele a baktériumokat körülvevő tápfolyadékban levő, oldott, dupla szálú DNS felvételével. A transzformációt kiváltó DNS származhat más baktériumokból azok szétesése vagy a DNS kivonásának eredményeként, de eredhet más mikroorganizmusokból, vagy eukaryota sejtekből is. A transzformáció felfedezésére az S és R típusú Streptococcus pneumoniae törzsek kórtani sajátosságainak a vizsgálata vezetett. A burkos S. pneumoniae törzsek parenterálisan befecskendezve megölték a kísérleti egereket, a burok nélküli mutánsok viszont nem. Ha azonban a buroktalan törzsek tenyészetét virulens S teleptípusú, de elölt törzs lizátumával együtt fecskendezték be egerekbe, a kísérleti egerek elpusztultak, s belőlük S teleptípusú törzsek voltak izolálhatók. A későbbi vizsgálatok kiderítették, hogy az avirulens S. pneumoniae törzs a buroktermelést kódoló DNS-molekulák felvétele révén vált virulenssé. A transzformáció során tehát az egyik baktériumtörzs DNS-ének egy része átjutott egy másik, fogadó baktériumtörzsbe, miáltal az utóbbi törzs új (vagy korábban elvesztett) tulajdonságra tett szert. A recipiens baktériumsejtek növekedésüknek csupán egy bizonyos szakaszában válnak képessé (kompetenssé) új DNS molekulák felvételére. Transzformációra csak a 10 6 molekulatömeg feletti, dupla szálú DNS szakaszok alkalmasak. A DNS darabnak a recipiens sejt falán és cytoplasmamembránján való áthaladását specifikus fehérjék segítik elő. A felvett DNS molekula hossza változó, a transzformáció során egyszerre több gén is átjuthat a recipiensbe. Az átjutott DNS darab egyik szálának hosszabb vagy rövidebb szakasza beépül a recipiens kromoszómájának megfelelő szakaszába. Az integrálódott új DNS szakasz a recipiens genomjának részévé válik, s azzal együtt replikálódva megjelenik az utódgenerációkban. A transzformáció optimális viszonyok között is legfeljebb a recipiens sejtek néhány százalékát érinti. A transzformáción átesett baktériumok a szerzett új tulajdonság alapján elkülöníthetők. Transzformáció útján nem csupán a burokképzés, hanem más tulajdonságok, pl. antibiotikum-rezisztencia, különféle szénhidrátok fermentációjának kódjai stb. is átjuthatnak a recipiens baktériumokba. Transzformáció számos baktériumfajban előfordul, tisztított DNS-sel ez ideig S. pneumoniaeban, Haemophilus influenzaeben, Bacillus subtilisben és néhány más fajban sikerült mesterségesen létrehozni. Különféle manipulációkkal (a sejtek hidegben tartásával és kalciumionokkal való kezelésével, protoplasztok előállítása majd polietilénglikollal vagy egyéb módon kiváltott plazmidbejuttatás, a protoplasztok fúziója stb. útján) olyan transzformációk is kivitelezhetők, amelyek természetes úton nem jönnek létre. Transzformáció nem csupán ugyanazon faj egyedei, hanem különböző fajok pl. Staphylococcus aureus és Streptococcus pyogenes között is létrehozható. A heterológ transzformáció gyakorisága azonban lényegesen kisebb, mint az egy fajhoz tartozó egyedek közötti transzformáció. Ennek oka az, hogy a heterológ DNSfragmentum integrálódása a recipiens genomjába a DNS-molekulák finom kémiai különbségei, erősen eltérő bázisszekvenciái, továbbá a recipiens sejtek restrikciós endonukleáz enzimjeinek hatása miatt lényegesen nehezebb. Kompetens baktériumok nem csupán bakteriális DNS-t, hanem fágokból nyert DNS-t is képesek a transzformációhoz hasonló mechanizmussal felvenni (transzfekció). Transzdukció. Transzdukció alatt azt a folyamatot értjük, amikor a baktériumok DNS-ének valamely szakasza bakteriofágok segítségével jut át egyik baktériumból a másikba. Az átvitt bakteriális DNS hossza a fág nagyságától függ, rendszerint azonban igen rövid. A fággal együtt bejutott DNS fragmentumok kapcsolódnak a baktériumok kromoszómájához (parciális diploid kromoszómaszakaszok) vagy be is épülnek abba, s új tulajdonságok megjelenését eredményezhetik. Kb. minden bakteriofág-fertőzés eredményez egy sikeres transzdukciót. Egyes fágok csak bizonyos géneket (specifikus transzdukció), más fágok azonban a fágfertőzés következtében széteső bakteriális DNS bármely szakaszát (általános transzdukció) képesek a recipiens 52

73 Bakteriológia baktériumokba átvinni. A specifikuss transzdukció jellegzetes példája az E. coli lambda-fág által közvetített génátvitel. A lambda-fág a fertőzést követően az E. coli kromoszómája 17. percében helyeződő galaktózbontást és biotinszintézist kódoló gének közé épül be temperált fágként. A temperált fág (profág) spontán vagy indukció hatására aktívvá válik, kiszabadul a kromoszómából és megindul a replikációja. A fággenom kiszabadulása (excíziója) azonban nem mindig következik be pontosan. Előfordul, hogy a fággenom egy része lemarad, s helyette a fág galaktóz vagy biotin génszakaszt visz magával. Az ilyen defektív fágok a recipiens baktériumban általában nem replikálódnak, az átvitt tulajdonság azonban kifejeződésre juthat. Az általános transzdukció során a baktériumkromoszóma bármely szakasza inkorporálódhat a fágba. Az E. coli P1 fágjának transzdukciójakor a transzdukáló fágok többsége kizárólag bakteriális DNS-t tartalmaz. A fágok plazmid-dns-t is magukba építhetnek akár úgy, hogy a fág és a plazmid-dns rekombinációjának eredményeként infektív fág keletkezik (pl. klóramfenikol-rezisztenciát hordozó P1 fág) vagy úgy, hogy csupán plazmid-dns-t hordozó defektív fágok jönnek létre. Előfordulhat az is, hogy a bakteriális DNS egy része nem a fág-dns-hez kapcsolódik, hanem a fágfertőzést követően a széteső baktériumkromoszóma valamelyik része pl. a fág fehérjéhez kötődik és így kerül át a fággal a recipiens sejtbe. A transzdukció lehetőséget teremt a baktériumkromoszómában helyeződó gének sorrendjének és egymáshoz viszonyított távolságának a meghatározására. Fágkonverzió. A fágfertőzés eredményeként nemcsak más baktériumokból származó DNS juthat be recipiens egyedekbe, hanem alkalmanként a fág saját genomjának egy szakasza által kódolt sajátság is megjelenhet a fenotípusban. Ezt a jelenséget nevezzük fágkonverziónak. A bejutott fág temperált fággá alakul, s a kromoszómához asszociálódva vagy abba beépülve az utódnemzedékekben is megjelenik (lizogén baktériumok). Alkalmanként a fág aktiválódik, s valódi vírusreplikáció zajlik le, amelynek következtében a baktériumok feloldódnak. A fágkonverziók közül különösen fontosak a baktériumok toxintermelésének és antigénszerkezetének megváltozásával járók. Elsőként a Corynebacterium diphtheriaevel kapcsolatban igazolták, hogy diphthaeriatoxint csak azok a törzsek termelnek, amelyek béta-temperált fággal fertőzöttek. A diphthaeriatoxint, amely egy Da molekulatömegű fehérje, a fág genomjának egy szakasza kódolja. A bétafág toxintermelést kódoló génje bevihető volt E. coli baktériumba is, amely ezáltal diphthaeriatoxint termelt. Hasonlóan fág kódolja a Streptococcus pyogenes erythrogen toxinját, a Clostridium botulinum C és D törzsek toxinjait, az E. coli törzsek hőlabilis enterotoxinját stb. Az antigénszerkezet fágfertőzés hatására bekövetkező megváltozása előfordul a Salmonella és számos más (pl. Shigella, Pseudomonas) nemzetség baktériumaiban. Az E 1-alcsoportba tartozó salmonellák O-specifikus oldalláncai galaktóz-ramnóz-mannóz ismétlődő triszacharid egységekből állnak (3, 10 jelű antigének). Epszilon 15-ös fággal való fertőzés hatására a 10-es antigénkomponens represszálódik, s az alfa-acetil-galaktóz helyét béta-galaktóz foglalja el. A béta-galaktóz szintézisének kódját a fággenom egy szakasza hordozza. Az így módosított csoportra azután egy következő (epszilon 34) fág egy alfa-glükozil-csoportot helyez (3, 15, 34 jelű antigének) (24. ábra). 24. ábra - Fágkonverzió okozta antigénszerkezet-változás a Salmonella E-csoportban 53

74 Bakteriológia Konjugáció. A baktériumok közötti közvetlen kapcsolódással létrejövő génátadást konjugációnak nevezzük. A konjugációt poliauxotróf E. coli mutánsokon fedezték fel. Két poliauxotróf mutáns tenyészetét összekeverték, s megfelelő körülmények között tartva a keveréket, abból teljes enzimgarnitúrájú baktériumokat izoláltak. A prototróf baktériumok létrejötte csak úgy volt értelmezhető, ha feltételezték, hogy a két hiányos mutáns egyikének kromoszómáját a másik mutáns megfelelő kromoszómaszakasza kiegészítette. A mutánsok egyikében később egy plazmidot fedeztek fel, amelyről kiderült, hogy génátadásra teszi képessé a baktériumot s ezért fertilitási (F ) faktornak nevezték el. A konjugáció egyirányú génátadással jár. A konjugációt plazmidok irányítják. A folyamatban részt vevő donor és recipiens baktériumok között szexfimbriák létesítenek kapcsolatot vagy közvetlen plazmahíd alakul ki. A plazmahíd kialakulása után a donor baktérium kromoszómájának egyik szála, a plazmid által kódolt endonukleáz hatására, egy ponton felnyílik. Az ily módon lineárissá vált kromoszómaszál hosszabb vagy rövidebb szakasza a plazmid-rns által irányítva átjut a recipiens baktériumba. Az átjutott donor-dns szál kapcsolódik a recipiens DNS fonalainak egyikéhez, majd a megfelelő helyeken a recipiens fonal egyik szála felszakad, belőle a donornak megfelelő hosszúságú szakasz kivágódik, s ennek a helyére beépül a donor fragmentum. Ezt követi a komplementerszál bázispárjainak megfelelő átépülése a donorfragmentumnak megfelelően. Ily módon az átjutott kromoszómaszakaszban kódolt tulajdonságok a genom részévé válnak, s megjelenhetnek a recipiens egyedek fenotípusában is. A donor és a recipiens sejtek között létrejött közvetlen kapcsolat csupán időleges, a génátadás után a konjugációban részt vevő sejtek szétválnak. A konjugáció előfordulását az enterobacteriumokhoz tartozó valamennyi fajban és több más Gram-negatív baktériumcsoportban (pl. Pseudomonas, Vibrio, Pasteurella) is bizonyították. A konjugáció nem csupán homológ, hanem különböző pl. E. coli és Salmonella fajok között is létrehozható. A heterológ konjugáció segítségével speciális hibridek (pl. laktóz pozitív Salmonella törzsek) állíthatók elő. A heterológ rekombináció gyakorisága azonban lényegesen kisebb, mint a homológé. Az F-plazmid által irányított konjugációban részt vevő donor (F + ) és recipiens (F - ) sejtek kapcsolódását a plazmid által kódolt, a baktérium felületén jelen levő speciális (szex-) fimbriák segítik elő. F + és F variánsok konjugációjakor elsősorban a plazmid jut át a recipiens sejtekbe. Az F-plazmid felvétele a recipiens sejteket mindig donorrá teszi. Ritkán, eleinte kb gyakorisággal azonban a donor baktériumok kromoszómájából származó hosszabb-rövidebb szakaszok is átjutottak a recipiens baktériumokba és azok genomjával rekombinálódva az új sajátságok a recipiens fenotípusában is megjelentek. Később sikerült olyan F + -variánsokat is izolálni, amelyek lényegesen, a korábbinál ezerszer nagyobb gyakorisággal eredményeztek rekombinációt. Ezeket a törzseket nevezik Hfr- (high frequency) donor törzseknek. Az F + -törzsek akkor válnak Hfr-donorrá, ha a plazmában levő F + -plazmid szabad állapotát elvesztve beépül a kromoszómába. Az F-plazmid kromoszómába való beépülése IS-elemeken keresztül történik. Az F-plazmid integrációja a kromoszóma meghatározott, de különböző helyein történhet meg. Az F-plazmiddal együtt átadott tulajdonságok sorrendjét a plazmidintegráció helye (origó) és a kromoszómaszál átjutásának iránya szabja meg. 54

75 Bakteriológia A kromoszómaátvitel időarányos folyamat. A teljes kromoszóma átadása hosszú időt (E. coli baktériumokban mintegy 100 percet) vesz igénybe, s mivel a konjugálódó sejtek közvetlen kapcsolódása ilyen hosszú időn keresztül nem marad fenn, a teljes kromoszómaátadás ritka. A konjugálódott sejtek erőteljes rázással szétválaszthatók, így a konjugáció tetszőleges időben megszakítható. Több különböző, eltérő integrációs helyű Hfr-törzs segítségével feltérképezhető a gének lokalizációja a kromoszómán. A génnek a kromoszómán elfoglalt helyét az adott kromoszómaszakasz recipiensbe való belépésének idejével (vagy újabban bázispár egységekkel) jelölik. A konjugáció és más módszerek igénybevételével sikerült az E. coli, a Salmonella typhimurium és néhány más baktériumfaj génjeinek a baktériumkromoszómán elfoglalt helyét, sorrendjét és egymáshoz viszonyított távolságát meghatározni, s ennek alapján az adott faj géntérképét megszerkeszteni. E. coli baktériumokban, ez ideig 1403, a S. typhimuriumban pedig 1080 gén helye, emellett többségüknek nukleotidszekvenciája, a kódolt fehérje összetétele és funkciója is ismert. Ez az E. coli genetikai állományának kb. 1/3-a. Más baktériumok génjeinek a lokalizációját még kevésbé ismerjük. A plazmidoknak egy különösen fontos csoportját képviselik az R-plazmidok, amelyek révén a baktériumok különféle gyógyszerekkel (pl. szulfonamidokkal, antibiotikumokkal), nehézfémsókkal (pl. Hg, Ni, Co) szembeni rezisztenciát szerezhetnek. Az R-plazmidok egy része konjugatív, azaz a plazmid tartalmazza a gyógyszerrezisztenciát meghatározó egy vagy több gént (rezisztencia determinánsokat), a konjugációt létrehozó géneket (rezisztenciatranszfer-faktorokat), IS-elemeket stb. A rezisztenciát meghatározó gének rendszerint olyan enzimek kódjai, amelyek az egyes gyógyszereket elbontják, akadályozzák bejutásukat a baktériumsejtbe stb. A rezisztenciát kódoló gének esetenként transzpozonok. Ezek egy vagy több rezisztenciagént tartalmaznak a két végükön homológ, de invert orientációjú IS-elemekkel (25. ábra). Mivel az R-plazmid felvétele rendszerint képessé teszi a recipiens baktériumokat a plazmid konjugáció útján való továbbadására, az ily módon kialakult gyógyszer-rezisztenciát fertőző (infektív) rezisztenciának is nevezzük. Az infektív gyógyszer-rezisztenciát kimutatták az enterobacteriumokhoz tartozó valamennyi baktériumfajban, számos más Gram-negatív baktériumban, sőt Gram-pozitív baktériumokban pl. Staphylococcus törzsekben is. A Gram-pozitív baktériumokban előforduló (pl. penicillinrezisztenciát kódoló) plazmidok azonban nem konjugáció, hanem transzdukció útján jutnak át más baktériumokba. 25. ábra - Egy R-plazmid szerkezeti modellje Az A-E jelzi a plazmid transzferjében szerepet játszó gének, rezisztenciatranszfer-faktorok egy részét; Nm = neomicin, Km = kanamicin, Sm = streptomicin, Szu = szulfonamidok, Kl = kloramfenikol, Te = ISelemek segítségével a plazmidba épülő tetraciklin-rezisztencia, transzpozon 55

76 Bakteriológia Egyes baktériumfajok olyan antibakteriális anyagokat, bakteriocineket termelnek, amelyek ugyanazon faj más törzseinek és egyes rokontörzseknek a szaporodását gátolják. A bélbaktériumok termelte bakteriocineket colicineknek, a Pseudomonasaeruginosáét piocinnak, a Bacillus megateriumét megacinnek stb. nevezzük. Az enterobacteriumok termelte colicinek egy részének a termelését konjugatív Col-plazmidok irányítják. A Colplazmidok gyakran különféle R-plazmidokkal együtt jutnak át a recipiens sejtekbe. A Col-plazmidok egy része, hasonlóan az F-plazmidhoz, képes a kromoszómába integrálódni, vagy konjugáció során a donorsejt egyes kromoszómaszegmentjeit magával vinni. Az említetteken kívül számtalan más plazmidféleség ismert még.az Ent-plazmidok az E.coli baktériumok enterotoxin-termelését kódolják. Az enterotoxinoknak szerepe van a törzsek kórokozó képességében. A Hly (haemolysin) plazmidokat E. coli és Streptococcus fajokban mutatták ki. E plazmidok felelősek a törzsek egyikmásik hemolizinjének a termeléséért. Ugyancsak plazmidok kódolnak egyes felületi antigéneket, pl. az E. coli baktériumok K88-as, K99-es fimbria stb. antigénjeit. Ez utóbbiak szerepet játszanak a törzsek pathogenitásában A fenotípus változékonysága (modifikáció) A fenotípusos változások a környezet hatására létrejött, nem öröklődő, átmeneti, a baktériumpopuláció egy részét érintő változások. A fenotípusos változékonyság a baktériumok bármely tulajdonságát érintheti, gyakorlati szempontból azonban legfontosabb a baktériumok egyedi és telepmorfológiájában, az adaptív jellegű enzimképzésben és vegyszertűrésben kifejeződő változékonyság. A baktériumok alaki tulajdonságait befolyásolják a tenyésztés körülményei. Optimális közegben a baktériumok alakja a fajra jellemző, kedvezőtlen környezetben különféle involúciós alakok jönnek létre. Valamely azonos fajú baktériumpopuláció egyedei között kisebb-nagyobb különbségek lehetnek méretben, alakban. A Streptococcus törzsek láncokat csak folyékony táptalajon képeznek, szilárdon nem. Ugyanazon baktériumfaj telepei más és más méretűek, esetleg színűek a tenyésztésre használt táptalaj összetételétől függően. Egyes baktériumfajok (pl. a Listeria monocytogenes, egyes Yersinia fajok) szobahőmérsékleten csillósak, 37 C -on azonban csilló nélküliek. 56

77 Bakteriológia A baktériumok egyes kémiai anyagokkal, gyógyszerekkel (pl. antibiotikumokkal) szembeni rezisztenciája lehet csupán fenotípusos változás, adaptáció következménye. Az adaptív rezisztencia fokozatosan alakul ki a baktériumokban és rendszerint kisebb mértékű, mint a mutáció vagy a plazmid közvetítette rezisztencia. A környezeti hatások befolyásolják a baktériumok enzimtermelését is. A baktériumok számtalan enzimet képeznek, ezeknek egy része indukálható. Indukálható enzim pl. az E. coli laktózt bontó béta-galaktozidáz enzimje vagy egyes Staphylococcus aureus törzsekben a penicillint bontó béta-laktamáz (penicillináz) enzim stb A baktériumok genetikai anyagának a vizsgálata A guanin-citozin arány meghatározása. Mivel a baktériumok kromoszómájában a guanin-citozin és az adenintimin egymáshoz viszonyított aránya, éppen úgy, mint az eukaryota sejtekben, a fajra jellemző konstans érték, de nemzetségenként jelentősen változik, a guanin-citozin bázispárok arányának a meghatározását felhasználjuk az egyes baktériumfajok jellemzésére, más fajokhoz való rokonsági fokának a vizsgálatára és rendszertani besorolására. A DNS-ujjlenyomat vizsgálata. A kromoszomális és a plazmid-dns restrikciós endonukleázokkal való hasítása (enzimes emésztése), majd a kapott DNS fragmentumok elektroforézises képének, a DNS ujjlenyomatának (poliakrilamidgél-elektroforézissel szétválasztva, majd etidiumbromiddal festve, UV fényben vizsgálva) a vizsgálata és a különböző, szorosan vagy többé-kevésbé rokon vagy éppen idegen fajok DNS-képével való összehasonlítása ugyancsak alkalmas eljárás a bakteriális (és más mikrobákból, eukaryota sejtekből vagy vírusokból származó) DNS rokonsági fokának, azonosságának vagy különbségeinek a meghatározására, vagy éppen ugyanazon DNS esetleges genetikai változásának a nyomon követésére. Ha ugyanazon enzim vagy enzimek a különböző baktériumtörzsekből származó DNS-eket az elektroforézis során (standard körülmények között) ugyanolyan távolságra vándorló, azaz azonos nagyságú (molekulatömegű) fragmentumokra bontják, akkor igen nagy valószínűséggel a vizsgált DNS-ek egymással azonosak, míg ha a szakaszok hossza (azaz a vágások helye és száma) eltérő, más vagy megváltozott összetételű DNS-ről van szó. A DNS-ujjlenyomat vizsgálata alkalmas az egyes járványesetekből izolált baktérium- (és még inkább vírus-)törzsek nyomon követésére. A baktériumgenom és a plazmid-dns-ek relatív tiszta kinyerésére ma már több, viszonylag egyszerű, megfelelően felszerelt laboratóriumokban rutinszerűen elvégezhető biokémiai eljárás áll rendelkezésre, ezért a DNS-ujjlenyomat vizsgálata nem tartozik a ritkaságok közé. DNS-DNS hibridizáció.a baktériumok (vírusok, eukaryota sejtek) DNS-ét hevítve a kettős spirál két szála szétválik (a DNS denaturálódik), majd fokozatosan lehűtve a két, egymáshoz képest komplementer szál az eredeti dupla szálú DNS-sé egyesül. Ha a lehűlés előtt az egyik baktérium denaturált DNS-éhez rokon baktériumfajból származó, rövid, szimpla szálú, radioaktív szénnel, foszforral, nitrogénnel vagy egyéb módon jelölt DNS-t adunk, a reasszociáció a jelölt rokon-dns szakasszal is megtörténik, azaz rövid heteroduplex DNS-ek keletkeznek, mégpedig annál nagyobb számban, minél nagyobb a két baktérium DNS-ében a bázissorrend azonossága. A hosszú DNS-fonalakat az oldatból eltávolítva a képződött heteroduplexek aránya, és ezáltal a két baktérium (változat vagy faj) DNS-ének rokonsági foka meghatározható, ez pedig felhasználható az egyes baktériumfajok rendszertani besorolásában. A jelölt DNS szakaszok denaturált RNS-szálakkal is reagáltathatók, így a DNS és RNS közötti bázishomológia is vizsgálható. A DNS amplifikálása (polimeráz láncreakció). A polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction, PCR) lehetőséget ad valamely mintában (vérben, ondóban, köpetben, sejtekben stb.) igen kis mennyiségben jelen levő, keresett DNS-szekvenciák megsokszorozására (amplifikálására), ezáltal kimutatására és analízisére. A vizsgálandó mintát az első lépésben hevítjük, hogy a benne lévő dupla szálú DNS kicsavarodását, a két komplementerszál szétválását elérjük. Ezután két rövid, szimpla szálú, olyan szintetikus DNS-t (primert) adunk a mintához, amelyeknek nukleotid szekvenciája komplementer a keresett DNS-szál végeivel. A mintát ezután fokozatosan lehűtve a primerek kötődnek a keresett génszakaszhoz. Ezután a rendszerhez DNS-polimerázt adva az enzim további nukleotidokat köt a primérek mindkét végéhez, hosszú komplementer DNS-szálakat szintetizálva. Az első ciklus végén az eredeti keresett génszakaszból két kópia, a másodikban négy, majd nyolc stb. kópia képződik. A ciklusra több millió kópia keletkezik, a mintában eredetileg igen kis mennyiségben jelen volt, keresett DNS-szekvenciából. Az amplifikálódott DNS a továbbiakban már a szokásos DNS-vizsgálati módszerekkel kimutatható és elemezhető. A PCR-technikát ma már számos laboratóriumban használják rutin diagnosztikai célokra, speciális (egy-egy fajra specifikus) bakteriális, vírus (vagy eukaryota sejtekből származó) DNS kimutatására és ezáltal a minták adott kórokozóval való fertőzöttségének a közvetlen bizonyítására. A PCR, mivel csupán DNS-t mutat ki, akkor is eredményre vezet, amikor a tenyésztéses vagy egyéb direkt baktérium- (vírus-)kimutatási módszerekkel már nem boldogulunk. Mivel a DNS kémiailag nagymértékben stabil, a keresett DNS-szakaszok beszáradt, szétesett sejtekből is kimutathatók. 57

78 Bakteriológia A DNS- és RNS-bázissorrend meghatározása. A biokémiai módszerek fejlődésének eredményeként lehetővé vált a baktériumok kromoszómájában, a plazmidokban (vírusokban, eukaryota sejtekben stb.) található gének, egyéb DNS-szakaszok bázissorrendjének pontos meghatározása (szekvenálás), s ezáltal a kódolt információ elemzése, más-más szakaszokkal való összehasonlítása. A baktériumok tekintetében különösen fontossá vált a riboszóma RNS 16S alegységének a szekvenálása, mivel kiderült, hogy ez a riboszómaszakasz konstans, az évmilliók során alig változott, s a benne levő azonosságok és különbségek támpontot nyújtanak a baktériumok filogenetikai alapon való osztályozására A genetikai anyag megváltoztatásának lehetőségei a baktériumokban A baktériumok (a vírusok és az eukaryota sejtek) genetikai anyagának a közelebbi megismerése, a génátvitel módjainak, lehetőségeinek a tisztázódása, a restrikciós endonukleázok felfedezése, kereskedelmi méretekben való előállítása stb. lehetővé tette a baktériumok (vírusok és az eukaryota sejtek) genetikai anyagának és ezáltal működésének a befolyásolását, megváltoztatását (génmanipuláció, géntechnológia). Új tulajdonságokat hordozó baktériumok előállítása.egy bakteriális gén más baktériumba való átvitelének és ottani expresszálásának a lépései főbb vonalakban a következők. A megváltoztatni vagy más baktériumba átvinni kívánt gént rendszerint valamilyen donor baktériumból preparáljuk vagy esetleg szintetikus úton állítjuk elő nukleotidokból. A kívánt gén átvitelére alkalmas hordozó- (vektor-)plazmidot kell keresnünk és izolálnunk valamilyen baktériumból. A keresést megkönnyíti, hogy ma már nagyon sok vektorplazmid tisztított formában kereskedelmi forgalomban is beszerezhető. Mind a donor, mind a plazmid-dns-t ugyanazon restrikciós endonukleázzal emésztjük, amely a DNS-t meghatározott bázispárok között hasítja úgy, hogy a két DNS mindkét végén szimpla szálú, egymásra nézve komplementer ( ragadós ) végek válnak szabaddá. Ezeken a ragadós végeken keresztül képes a kiválasztott bakteriális-dns szakasz a plazmidba beépülni. Az így előállított, a kívánt tulajdonság(ok) génjét hordozó vektorplazmidot azután transzformáció útján vagy egyéb módon (pl. bakteriofággal) a recipiens baktériumba visszük, és vizsgáljuk, hogy az adott tulajdonság a recipiens baktériumban megjelenik-e. Rendszerint a recipiens baktériumnak csak elenyészően kis száma veszi fel a rekombináns plazmidot. Az új tulajdonságot hordozó DNS, ha az új sajátság kellően stabil, a rekombináns baktériumból a természetes osztódás során az utódnemzedékekbe is átjut. A vektorplazmid bejuttatását a recipiens baktériumba klónozásnak, az új tulajdonságokat hordozó baktériumokat pedig klónoknak nevezzük. A plazmidokba nemcsak baktériumokból, hanem más plazmidokból, továbbá vírusokból vagy eukaryota sejtekből származó DNS-szakaszok is beépíthetők. A rekombináns plazmidok felhasználhatók a kívánt sajátság nemcsak baktériumokba, hanem eukaryota, pl. gombasejtekbe vagy a magasabbrendű élőlények sejtjeibe való bevitelre is. Az eukaryota sejtekből származó génszakaszok azonban a baktériumokban rendszerint nem íródnak át mrns-ekre, az eukaryota és a baktériumsejtek transzkripciójának különbségei miatt. Ehelyett az eukaryota sejtek megfelelő sajátságát kódoló DNS-ről az eukaryota sejtekben képződött mrns-t írják át in vitro (reverz transzkriptáz segítségével) komplementer DNS-re (cdns-re), amelyet plazmidba víve, majd bejuttatva a baktériumba a kívánt sajátság (pl. bizonyos fehérjék szintézise) a baktériumban expresszálódik. Géntechnológiai úton lehetővé vált humán inzulin, interferon stb. termeltetése E. coli baktériumokkal. A ragadós száj- és körömfájás vírusának VP1-es fehérjéjét kódoló RNS, cdns-be való átírása, majd plazmid segítségével való bevitele E. coli baktériumokba lehetővé tette vakcina készítésére használható vírusproteinek előállítását. A rekombinációval létrehozhatók különféle baktériumhibridek, pl. C. botulinum toxint termelő E. coli törzsek, laktóz-pozitív salmonellák stb. A laktózbontásért felelős bakteriális géneket DNS-vírusokba átvíve a megjelölt vírustörzsek a szövettenyészetben a laktózbontás alapján felismerhetők voltak (pozitív markerű vírusmutánsok). A levegő molekuláris nitrogénjét megkötni képes Azotobacter és Rhizobium fajok nitrogénkötésért felelős génjeinek a kromoszómában való megsokszorozásával jelentősen növelhető volt e baktériumfajok nitrogénkötő képessége, amely nagy mennyiségű műtrágya alkalmazását teheti feleslegessé. A géntechnológiai eljárások előnyeik mellett bizonyos veszélyeket is rejtenek magukban (pl. antibiotikumrezisztenciát, toxinképzést, onkogenitást hordozó új mikrobák létrehozása, ezek esetleges kijutása a külvilágba), ezért a fejlett országok egy része az ilyen munkák végzésének a körülményeit szabályozta. 8. Pathogenitás és infectio 8.1. Pathogen és saprophyta mikroorganizmusok 58

79 Bakteriológia A magasabb rendű szervezetek és a baktériumok (valamint más mikroorganizmusok) egymáshoz való viszonya igen különböző. A mikroorganizmusok egy része képes megbetegíteni a magasabb rendű szervezeteket, ezek a pathogen mikrobák. A baktériumok kórokozó-képessége (pathogenitása) számos, baktériumfajonként eltérő és legtöbbször részleteiben nem is ismert sajátság függvénye. A pathogen baktériumfajok száma elenyészően csekély a saprophytákéhoz képest. A pathogenek a külvilágban hosszabb-rövidebb ideig életképesek maradnak ugyan, szaporodni azonban csupán egyes fajok (pl. salmonellák, vibriók, listeriák) képesek. A pathogen fajok szerencsére csak időről időre, más fertőzött egyedekből közvetlenül vagy a külvilág közvetítésével jutnak be (fertőzés, infectio) a magasabb rendű szervezetekbe. A magasabb rendű szervezetek testfelülete, a külvilággal közvetlen összeköttetésben levő szervek, szervrendszerek (a légutak, a bélcsatorna stb.) nagy mennyiségben tartalmaznak baktériumokat. Ezek a születést követően a külvilágból kerülnek be a szervezetbe és telepszenek ott meg, többségük ártalmatlan, saprophyta. Ezek a mikrobák adják a bőr, a légutak, a bélcsatorna, a nemi szervek természetes baktérium- (mikroba-)flóráját. Az ide tartozó baktériumok a szervezethez való viszonyukat tekintve kommenzalisták, azaz olyan mikroorganizmusok, amelyek a gazdaszervezettől szerzik tápanyagaikat, de nem károsítják azt (kommenzalizmus). A normál mikroflórához tartozó baktériumok között azonban vannak olyanok is (pl. az E.coli, az Erysipelothrix rhusiopathiae, a Haemophilus fajok), amelyek bár a nyálkahártya természetes lakói, a gazdaszervezet ellenálló képességének a csökkenése (megfázás, kimerültség, éhezés stb.) esetén betörnek a szövetek közé, s a gazdaszervezetet megbetegítik. Az ilyen baktériumokat nevezzük feltételesen kórokozó, fakultatív pathogen baktériumoknak. Végül vannak olyan baktériumfajok is (pl. a Rhizobium fajok a pillangósvirágúak gyökérzetén), amelyek úgy élnek együtt a gazdaszervezettel, hogy az mindkét fél számára hasznos, ekkor beszélünk szimbiózisról. A pathogenitás nem csupán a szervezetbe bejutó mikroorganizmusok sajátsága. A Clostridium botulinum pl. a külvilágban (főleg a talajban) élő saprophyta, az emésztőcsőbe jutva nem telepszik meg, onnan rövid idő alatt kiürül. Élelmiszerekbe kerülve azonban, anaerob viszonyok között, igen hatékony méreganyagokat termel, az ilyen élelmiszerek elfogyasztása után az emberben és az állatokban súlyos mérgezés (intoxicatio) alakulhat ki. A kórokozó mikroorganizmusok nem minden állatfajban képesek betegséget előidézni, azaz a pathogenitás fajhoz kötött fogalom. A kórokozók gazdaspektruma nem egyforma. Azokat a kórokozókat, amelyek különféle állatfajokat képesek megbetegíteni széles, (euryxeniás), azokat pedig, amelyek csupán egy vagy néhány fajra nézve pathogenek, szűk gazdaspektrumú (stenoxeniás) kórokozóknak nevezzük. A Salmonella typhi pl. megbetegíti az embert, de nem idéz elő betegséget az állatokban,a Bacillus anthracis viszont az összes emlőst, sőt ritkán még a madarakat is megbetegíti.az Erysipelothrix rhusiopathiae nemcsak a sertést, hanem a legkülönfélébb emlős- és madárfajokat is megbetegíti A virulencia A virulencia a kórokozó baktériumok támadóképességének a foka. Ahhoz, hogy betegség alakuljon ki, a kórokozónak többnyire be kell jutnia a szervezetbe, el kell ott szaporodnia és olyan anyagcsere-termékeket termelnie vagy egyéb károsító hatást kifejtenie, amely a szervezet működési zavarához, megbetegedéséhez vezet. A baktériumok okozta fertőzések (infectiók) egy részében inkább a kórokozók behatolási képessége, szövetek közötti erőteljes szaporodása és szóródása (invazivitás), más baktériumoknál viszont elsősorban méreganyag- (toxin-)termelő képességük dominál. A Clostridium tetani pl. csupán a szervezetbe jutás helyén, lokálisan szaporodik el, viszont igen erős méreganyagot (tetanusztoxint) termel. Más fajok kevésbé hatékony méreganyagokat termelnek, viszont korlátlan mértékben elszaporodnak a szervezetben. Ez utóbbiak közé tartoznak a vérfertőzést (septikaemiát) előidéző baktériumfajok, pl.a Bacillus anthracis. A virulencia tekintetében nem csupán az egyes baktériumfajok viselkednek eltérően, hanem fajon belül az egyes törzsek között is nagy különbségek vannak. Egy fajon belül a fajra jellemző támadóképesség birtokában levő (vadvirulens) törzsektől a csökkent virulenciájúakon keresztül a támadóképességüket teljesen elvesztett (avirulens) baktériumtörzsekig minden változat előfordulhat. A virulencia mérése. A virulencia kísérleti úton hozzávetőlegesenmeghatározható. Azt a legkisebb baktériummennyiséget, amely a beoltott valamennyi kísérleti állatot még megöli, minimális letalis dózisnak (MLD) nevezzük. A kísérleti állatok egyedi ellenálló képességének különbsége által okozott hiba kiküszöböléséhez azonban rendszerint nem az MLD-t, hanem azt a baktériummennyiséget határozzuk meg, amely még a kísérleti állatok 50%-át elpusztítja. Ez az 50%-os halálos adag az LD 50.A Bacillus anthracis LD 50- je fehér egerekre nézve csupán néhány baktérium, míg a különféle Salmonella fajokból ugyanezen érték több mint százmillió baktérium. Hasonlóképpen mérjük a baktériumok termelte toxinok LD 50-jét is. A virulencia meghatározása során kapott LD 50 - értékek csak arra az állatfajra vonatkoztathatók, amelyen a mérést végezték. 59

80 Bakteriológia Ugyanazon Pasteurella multocida törzs parenterálisan bevíve pl. kis dózisban elpusztítja a fehér egereket, de sokkal nagyobb dózis lehet szükséges a nyulak vagy csibék megöléséhez. A virulencia változása. A virulencia ugyanazon baktériumtörzs léte során is változik. Egy baktériumpopuláció virulenciája fokozódhat, ha a baktériumok fogékony állatokba jutva passzálódnak. A sorozatos passzálódás során a populáció legvirulensebb egyedei szelektálódnak, ami a populáció egészére nézve a virulencia növekedését jelenti. Az egyes baktériumegyedek virulenciája kísérleti körülmények között, mesterségesen, új genetikai anyag bevitelével (rekombináció útján) ugyancsak fokozható. A rekombináns egyedek szert tehetnek olyan virulenciafaktorokra, amelyekkel korábban nem rendelkeztek, és ezáltal saprophyta mikroorganizmusok is pathogenné tehetők. Szerencsére azonban az ilyen rekombinánsok természetes viszonyok között kevésbé stabilak, a szerzett tulajdonságot hamar elvesztik. A virulencia génátvitellel való fokozódására azonban természetes viszonyok között, legalábbis a baktériumoknál, egyelőre nincs bizonyíték. A baktériumok virulenciája természetes viszonyok között is, de még inkább laboratóriumban való hosszabb fenntartásuk során, rendszerint csökken. A virulencia csökkenése olyan mutációk következménye, amelyek a baktériumok pathogenitása szempontjából fontos tulajdonságokat kódoló géneket érintenek. A virulencia csökkenése létrejöhet spontán, de akkor is, ha a baktériumokat a laboratóriumban az optimálistól eltérő hőmérsékleten, tápanyagban szegény, antibiotikumokat vagy különféle egyéb gátló anyagokat (pl. festékeket stb.) tartalmazó táptalajon tenyésztjük. A virulenciájukban gyengült vagy avirulens törzseket gyakran használjuk oltóanyag-termelésre. Virulenciafaktorok. Mindazokat a sajátságokat, amelyek a pathogen baktériumokat képessé teszik a magasabb rendű szervezetek megbetegítésére, virulenciafaktoroknak nevezzük. Számtalan virulenciafaktor létezik, ezeknek azonban csupán egy része ismert. A virulenciafaktorok a baktériumok legkülönfélébb sajátságaival függhetnek össze (alak, mozgásképesség, sejtszerkezet, anyagcsere stb.), s csupán a véletlenen múlik, hogy a baktériumok egyébként normális fiziológiai sajátságai a gazdaszervezetet az adott esetben károsítják-e vagy sem. A virulenciafaktorok, jelentős egyszerűsítéssel, két csoportra oszthatók. Az egyik csoportot a virulenciát befolyásoló nem toxikus faktorok alkotják, míg a másik csoportot a baktériumok termelte méreganyagok (toxinok) képviselik. A kettő között többnyire nem lehet éles határt vonni A virulencia nem toxikus tényezői A virulencia nem toxikus tényezői közé tartoznak a baktériumok sejtfelületén található különféle faktorok és a baktériumok által termelt extracelluláris enzimek. Felületi faktorok. A virulenciafaktoroknak ebbe a csoportjába soroljuk az antiphagocyta hatású sejtfalkomponenseket, a sejtfalban, illetve a sejt felületén található egyes poliszacharid- és fehérjeantigéneket, a burokanyagokat és a fimbriákat. A Listeria monocytogenes sejtfala tartalmaz egy lipidkomplexet, amely egérben monocytosist okoz. A virulens Mycobacterium tuberculosis törzsek a köpetben, a szövetekben és tenyészeteikben is szerpentinszerű kötegekben láthatók (cordformáció). A cordformációért egy a baktériumok sejtfalában található mikolsavészter (trehalóz dimikolát) felelős. A cordfaktor toxikus a leukocytákra, phagocytákba jutva pedig tönkreteszi a mitochondriumokat, lehetővé teszi a mycobacteriumoknak a phagocyta sejtekben való túlélését. Az enteroinvazív Escherichia coli törzsek bélfalba való bejutását a külső membránban található, egyes fehérjeantigének segítik elő. A pathogen baktériumok burokanyaga általában virulenciafaktornak tekinthető. A virulens lépfenebacilusok glutaminsavból álló peptidburka gátolja a phagocytosist, elősegítve ezáltal a baktérium bejutását és elszaporodását. A polipeptidburok ellen a szervezet ellenanyagokat termel, ezeknek azonban nincs védő hatásuk. Egyes streptococcusok, pl. a S. equi, a Pasteurella multocida törzsek egy része, hialuronsavból álló tokot, burkot termel, amely ugyancsak phagocytosist gátló hatású. A phagocytosis elmaradása vagy legalábbis késleltetése elősegíti, hogy a szervezetbe jutott baktériumok elszaporodjanak és a szöveteket károsító anyagokat termeljenek. A burkos törzseket hialuronidázzal kezelve a virulencia jelentősen csökken vagy elvész. A virulenciával kapcsolatban álló, antigénhatású poliszacharidokból álló burok számos más (pl. E. coli, Haemophilus paragallinarum) baktériumfajban is megtalálható. 60

81 Bakteriológia Ugyancsak virulenciafaktoroknak tekinthető a fimbriák többsége, amelyek lehetővé teszik a baktériumoknak a gazdasejteihez való tapadását (adhezióját). Extracelluláris enzimek. A baktériumok virulenciájában különféle extracelluláris enzimek is szerepet játszanak. A pathogen Staphylococcus törzsek koagulázt termelnek, amely a fertőzés helyére áramló savót megalvasztja. Az enzim hatására képződött fibrinburok megvédi a baktériumokat a phagocytosistól. Egyes Streptococcus fajok fibrinolizint (sztreptokinázt) termelnek, amely a plazma egyik proteolitikus proenzimjét, a plazminogént aktiválja. Az aktivált enzim a fertőzés helyén kialakult fibrinalvadékot oldja, elősegítve ezáltal a baktériumok szóródását. Hialuronidázt termel a Staphylococcus, a Streptococcus és a Clostridium fajok egy része. Az enzim a sejtek közötti ragasztóanyagot, a hialuronsavat oldja, fellazítva ezáltal a fertőződés helyén a szövetek állományát, ami elősegíti a bejutott baktériumok szóródását. Sok Clostridium faj termel kollagenáz enzimet, amely a kollagén bontásával ugyancsak a kórokozók terjedését szolgálja. A Clostridium perfringens törzsek,a Bacillus anthracis és néhány más baktériumfaj lecitinázt termel. Az enzim a sejtek membránjában lévő lecitint bontva a fertőzés környékén súlyos szövetelhalást idéz elő. Az enzimek és a baktériumtoxinok közötti átmenetet képviselika leukocidinek, valamint a különféle hemolizinek (hemotoxinok). A pathogen Staphylococcus és egyes Streptococcus törzsek különböző felépítésű leukocidineket termelnek, amelyek a phagocytosist végző leukocytákat károsítják. A hemolizinek a baktériumsejthez kötött vagy a tápfolyadékban megjelenő olyan anyagok, amelyek egyéb hatásuk mellett a különféle fajú állatok vörösvérsejtjeit feloldják. Hemolitikus hatású anyagokat mind pathogen baktériumok (pl. Streptococcus, Staphylococcus, E. coli), mind saprophyta fajok (pl. egyes aerob spórás baktériumok) termelnek. Egyes hemolizineknek kifejezett toxikus hatásuk van vagy valódi exotoxinok (pl. a C. perfringens thétatoxinja) A baktériumok toxinjai A pathogen baktériumok egy része különféle toxinokat termel. A toxinok két csoportba, exo- és endotoxinokba oszthatók. Az exotoxinok rendszerint kiválasztódnak a baktériumsejtből és a tenyészet felülúszójában találhatók, míg az endotoxinok a Gram-negatív baktériumok sejtfalában levő lipopoliszaharid-komplexek. Az utóbbi években kiderült, hogy a klasszikus exotoxinokon kívül számos baktériumfaj képes ugyancsak az exotoxinok csoportjába sorolható, az esetek többségében lokális hatású, különféle, gyorsan elbomló citotoxinokat termelni. Ezeket a citotoxinokat az egyes baktériumfajok tárgyalásakor említjük. Exotoxinok. A leghatékonyabb exotoxinokat a Clostridium nemzetség tagjai termelik, de exotoxinokat termelnek más fajok is, így pl. a Corynebacterium, a Streptococcus, a Staphylococcus fajok, a Gram-negatívak közül pedig a Vibrio cholerae, egyes Shigella és E. coli törzsek. Az exotoxinok igen erős mérgek, hatékonyságuk sokszorosan felülmúlja a legerősebb kémiai mérgek hatékonyságát. A C. tetani levestenyészete pl. milliliterenként akár egér MLD-t tartalmazhat. Az exotoxinok kevés kivételtől eltekintve fehérjék, ennek következtében hőre, továbbá denaturálószerekre (alkohol, híg savak, formalin stb.) érzékenyek. A legtöbb exotoxin 70 C felett denaturálódik, de kivételek pl.a Staphylococcus aureus törzsek enterotoxinjai és az E. coli hőstabil enterotoxinja, amelyek viszonylag hőállók. Fehérje természetüknek megfelelően aminosavakból állnak, rendkívüli mérgezőképességük a molekulákat felépítő aminosavak sorrendjével és térbeli helyzetével függ össze. Az exotoxinok többségét a proteolitikus enzimek károsítják, vannak azonban kivételek is. A C. botulinum által termelt toxinok egy részének a hatékonysága tripszinkezelés hatására fokozódik, a nagy molekulájú toxinok tripszin hatására több, még aktív, kisebb molekulatömegű részre hasadnak. Az exotoxinok biológiai hatása specifikus, jellemző a toxinra. Az exotoxinok többsége csupán a kórosan elváltozott szövetekből felszívódva hatásos, a Staphylococcus fajok által termelt enterotoxinok vagy pl. a C. botulinum toxinjai azonban a bélcsőből is felszívódnak. A toxinok egy része pl. a Corynebacterium diphtheriae termelte diphteriatoxin, amely egyetlen, Da molekulatömegű polipeptidlánc, a szervezet valamennyi sejtjére nézve mérgező, a fehérjeszintézist gátolja. A C. tetani toxinja, a tetanospazmin, Da molekulatömegű fehérje, amely a gerincvelő elülső szarvának mozgatóidegsejtjeire és a myoneuralis kapcsolódásra fejti ki hatását. A toxin akadályozza az acetil-kolin-eszteráz enzim működését, amely az ingerület átadását szabályozó acetil-kolint elbontja. A toxin hatásának eredményeként a reflexingerlékenység fokozódik, végül az izmok görcsös összehúzódása miatt az állatok elhullanak. A C. botulinum által termelt toxinok különböző molekulatömegű fehérjék. A toxinoka synapsisokat és az idegvégkészülékeket bénítják, 61

82 Bakteriológia megakadályozva az acetil-kolin kiválasztódását. Hatásukra a kísérleti állatok fokozatosan elerőtlenednek, s az izmok petyhüdt bénulása mellett elhullanak. Az exotoxinok hosszabb-rövidebb inkubációs idő után hatnak. Az inkubációs idő alatt a toxinok a termelődés helyéről eljutnak a hatásuk iránt érzékeny sejtcsoportokhoz, s azokhoz kötődve fejtik ki hatásukat. Az exotoxinok általában jó antigének. A hatásukra termelődött ellenanyagok (antitoxinok) a toxinmolekulákat közömbösítik. A specifikus sejtcsoportokhoz már kötődött toxinmolekulák azonban antitoxikus savó parenterális bevitelével nem semlegesíthetők. Az exotoxinok hosszabb ideig tartó állás vagy denaturáló- szerek, pl. 0,4 0,5%-os formalin hatására toxicitásukat elvesztik, immunogén sajátságukat azonban jórészt megtartják. Az ily módon kezelt toxin az anatoxin vagy toxoid. A toxicitás elvesztése feltehetően a molekulák toxikus csoportjain keresztül létrejövő dimerképződés következménye. Az anatoxinokat oltóanyagként aktív immunitás létesítésére használjuk. Endotoxinok. Az endotoxinok a Gram-negatív baktériumok sejtfalában levő lipopoliszacharid-komplexek, azonosak a baktériumok O-antigénjeivel. A lipopoliszacharid-komplex toxicitásáért a molekula szénhidrátkomponenséhez szorosan kapcsolódó foszfolipoid- (lipid-a-)frakció a felelős, a molekula teljes toxicitásához azonban a lipopoliszacharid-komplex integritása is szükséges. A Gram-negatív baktériumfajok sejtfalából speciális eljárásokkal kivonható endotoxinok molekulatömege D között változik. Az endotoxinok csupán a baktériumok feloldódása, szétesése után válnak szabaddá. A lipopoliszacharid-komplexek hőállók, a proteolitikus enzimek hatásának ellenállnak, formalinos kezeléssel nem alakíthatók átanatoxinná. A molekulakomplex toxicitásának a megszűnése egyúttal az antigénhatás megszűnését is jelenti. Az endotoxinok gyenge antigének. Hatásukra a szervezet antibakteriális ellenanyagokat termel, az endotoxint neutralizáló ellenanyagok azonban csak kis mennyiségben képződnek. Az endotoxinok jóval kevésbé mérgezők, mint az exotoxinok. Az egyes állatfajok endotoxinok iránti érzékenysége különböző. E. coli baktériumokból előállított endotoxin LD 50-értéke egérre nézve mg/kg, borjakra azonban 0,025 mg/kg. A különböző Gram-negatív baktériumokból előállított endotoxinok antigenitása egymástól különbözik, biológiai hatásuk azonban lényegében azonos. Az endotoxinok per os adva hatástalanok, a fertőződés helyén és a keringésbe bekerült, elpusztult, szétesett baktériumokból származó endotoxinok azonban jellegzetes tüneteket váltanak ki. Az endotoxinok néhány mg-os mennyiségben, iv. kísérleti állatokba fecskendezve a befecskendezést követő rövid időn belül lázat, izomremegést, fokozott légzést és szívműködést, hányást, hasmenést, majd a keringés egyensúlyának felborulása következtében sokkot és rendszerint elhullást idéznek elő. A kórbonctani képet az oedema és a gastrointestinalis rendszer haemorrhagiás elváltozásai uralják. Az élő és elölt Gram-negatív baktériumok a kísérleti állatokat ugyanazon tünetek és kórbonctani elváltozások mellett pusztítják el, a Gram-negatív baktériumok okozta betegségekben az elhullás végső oka tehát endotoxin okozta sokk. Az endotoxinok lázkeltő (pyrogen) hatásúak. A pyrogen hatás oka az endotoxinhatásra széteső leukocytákból kikerülő, fehérje természetű anyag, amely izgatja a hőközpontot. Subletalis endotoxinadagok ismételt befecskendezése az endotoxin sokkeltő hatásával szembeni tűrőképesség növekedését váltja ki. A tűrőképesség növekedése nem specifikus folyamat, valószínűen a bejutott endotoxin gyorsabb kiküszöbölésével áll kapcsolatban. Az endotoxin kis mennyisége fokozza a fertőzésekkel szembeni ellenálló képességet, növeli a RHS-sejtek (lásd később) aktivitását. A sterilen világra hozott és nevelt, csíramentes (germ free) állatok endotoxintűrő képessége a hagyományos módon nevelt állatokénak a többszöröse. A csíramentes állatok a normál egyedek számára letalis endotoxinadagokat is károsodás nélkül elviselik. A normál bélflóra kialakulása, vagy Gram-negatív baktériumokból előállított (endotoxintartalmú) oltóanyag befecskendezése a toleranciát megszünteti. Az endotoxin befecskendezésére létrejött válaszreakció tehát az élet folyamán szerzett endotoxin-túlérzékenység következménye és legalábbis részben allergiás jelenség. A fertőzött szervezetek megbetegedésében a kórokozó baktériumok faja és virulenciája, a szervezetbe jutás módja, a bejutott baktériumok mennyisége mellett döntő szerepet játszik a szervezet egyedi ellenálló képessége. Ennek megtárgyalása azonban már részben az immunológia, részben pedig az általános járványtan tárgykörébe tartozik. 62

83 2. fejezet - Részletes bakteriológia 1. A baktériumok rendszertana A magasabb rendű eukaryota szervezeteket filogenetikai alapon rendszerezzük. A prokaryota baktériumok törzsfejlődését azonban nem vagy alig ismerjük, így filogenetikai, természetes rendszerezésük sem lehetséges. Az élővilág tagjait két nagy csoportba soroljuk. A baktériumok, az algák egy részével együtt a prokaryoták, míg az összes többi valódi sejtmaggal rendelkező szervezet az eukaryoták (eukaryota egysejtűek, gombák, növények, állatok) világába tartozik. Az utóbbi néhány évtized genetikai vizsgálatainak eredményei alapján a baktériumokat is két nagy csoportba, a legősibb (Archeobacteria) és a valódi baktériumok (Eubacteria) csoportjába osztjuk. A kórtani szempontból fontos valamennyi baktérium az eubacteriumokhoz tartozik. A baktériumokat fenotípusos és genetikai tulajdonságaik együttes figyelembevételével osztályozzuk és soroljuk különféle rendszertani egységekbe, így törzsekbe (divisio), osztályokba (classis), ezeken belül rendekbe (ordo), családokba (familia), nemzetségekbe (genus) és fajokba (species). Egyes fajokon belül további csoportok, alfajok (subspecies), biotípusok, szerotípusok, fágtípusok stb. léteznek. A baktériumok faji meghatározására (identifikálására), legalábbis a klinikai mikrobiológiai gyakorlatban, elegendő a tenyésztési, morfológiai, biokémiai, szerológiai (antigénszerkezeti) és a kórtani (pathogenitási) sajátságok vizsgálata, míg a taxonómiai célú vizsgálatok során igen nagyszámú (akár több száz) tulajdonságot vizsgálunk, amelyeket azután számítógéppel elemezve hasonlítunk össze más rokon vagy távolabbi rendszertani kategóriába tartozó baktériumok sajátságaival (numerikus taxonómia). Ahhoz, hogy egy klinikai anyagból származó izolátumot azonosítani tudjunk, az első lépés a kérdéses kórokozó színtenyészetben való kitenyésztése (izolálása). Ezt követően megvizsgáljuk az adott izolátum legalapvetőbb sajátságait (alak, Gram-festés, mozgásképesség, aerob vagy anaerob növekedés, kataláz- és oxidázpróba, és a szénhidrátbontás típusának a vizsgálata, OF-próba). Ezek a vizsgálatok (primer tesztek), kevés kivételtől eltekintve, lehetővé teszik legalább az adott baktérium nemzetségének a meghatározását, majd ha szükséges, a további biokémiai, szerológiai, kórtani stb. tulajdonságok alapján meg tudjuk határozni az adott kórokozó faját is. Az azonos vagy egymáshoz nagyon hasonló tulajdonságú baktériumok összességét tekintjük fajnak. Mivel az egyes baktériumok rokonsági foka a filogenezisre vonatkozó ismereteink hiányosságai miatt a fajok túlnyomó többségében csak a jelenleg élő változatok tulajdonságainak a vizsgálata alapján állapítható meg, a nemzetség és a faj az a két legmagasabb rendszertani kategória, amely a baktériumok feno- és genotípusának vizsgálata alapján még több-kevesebb pontossággal meghatározható. Minél magasabb rendszertani egységről van szó, az együvé tartozás kritériumai annál bizonytalanabbak. A baktériumok mai legáltalánosabban elfogadott osztályozását és nómenklatúráját a Bergey s Manual of Systematic Bacteriology 1984 és 1989 között megjelent négy kötete, továbbá a Bergey s Manual of Determinative Bacteriology 9. kiadása (1994) tartalmazza. A baktériumok rendszertanára és nómenklatúrájára vonatkozó legújabb eredmények pedig az International Journal of Systematic Bacteriology című szakfolyóiratban követhetők nyomon. A továbbiakban megelégszünk az állatorvosi szempontból fontos (pathogen) baktériumfajok ismertetésével. Az egyes fajok ismertetésekor elsősorban a klinikai mikrobiológia igényeit vettük figyelembe, a taxonómiai vonatkozásokból pedig csak annyit vettünk át, amennyit az érthetőség megkívánt Bacillus Pálcika alakú, Gram-pozitív, aerob spórás, a B. anthracistól eltekintve csillós baktériumok. Természetes előfordulási helyük, a B. anthracis kivételével, a talaj, de megtalálhatók a levegőben, a természetes vizekben, a növényzeten, valamint az ember és az állatok bőrén és bélcsatornájában is. A nemzetségbe számos faj tartozik, közülük legnagyobb jelentősége a B. anthracisnak van, amely a lépfene okozója. Néhány fajuk pathogen az ízeltlábúakra nézve, túlnyomó többségük azonban saprophyta. Az utóbbiak közül egyesek antibiotikumokat termelnek Bacillus anthracis Morfológia. Csilló nélküli, 4 5 µm hosszú,1 1,2 µm vastag pálcák, amelyek hosszabb-rövidebb, bambusznádra emlékeztető láncokat képeznek. Az állati testben vastag burok veszi körül (26. ábra). A kenetet karbolvizes toluidinkékkel megfestve a cytoplasma kék, a burok rózsaszínű (metakrómás festődés). Spórája ovális alakú, 63

84 Részletes bakteriológia centrálisan helyeződik. Az élő szervezetben spóra nem képződik, mivel a spórásodáshoz levegő, legalább 15 C hőmérséklet és nedvesség szükséges. 26. ábra - Bacillus anthracis egér lépében (tolridiukékkel festve, 1250 ) Tenyésztés. Közönséges agaron is jól szaporodik, legjobban testhőmérsékleten. Az állati testből kitenyésztett virulens törzsek, ha a tenyésztést levegőn végeztük, 2 3 mm átmérőjű, hajfonatszerű, száraz R-telepeket képeznek, 5 10% CO 2-ot is tartalmazó légtérben tenyésztve azonban a lépfenebacilusok burkosak, ennek megfelelően nyálkás, S-telepeket alkotnak. Véresagaron nem okoznak típusos hemolízist, de 2 3 napos telepeik alatt a táptalaj feltisztul, zöldessárga színű lesz. Közönséges levesben a virulens lépfenebacilusok vattaszerű üledéket képeznek. A lépfenebacilusok virulenciájukat mind természetes viszonyok között, mind tenyészeteikben mutáció útján elveszíthetik. A buroktermelő képességüket elvesztett, de egérben még toxikus oedemát okozó törzseket (pl. a Sterne-féle F32 törzset) oltóanyanyag előállítására használjuk. Biokémiai sajátságok. Hasonlóan a nemzetség saprophyta tagjainak többségéhez, a B. anthracis katalázpozitív, a nitrátokat nitritté redukálja, a zselatint és a kazeint elfolyósítja, lecitinázt termel, glükózból oxidatív úton savat képez. Antigénszerkezet. A lépfenebacilusok burokanyaga hőérzékeny glutaminsav polipeptid, amely megtalálható néhány saprophyta fajban (pl. a B. subtilisben, a B. megateriumban) is. Sejtfalukban található egy típusspecifikus poliszacharid (haptén), egyes törzsek azonban tartalmaznak egy további haptént, amely megtalálható a B. cereus törzsekben is. Vágóhídról származó vizsgálati anyagok, bőrök, erősen rothadt hullarészek lépfenével való fertőzöttségének kiderítésére szolgál az Ascoli-féle termoprecipitációs próba, amely a lépfenebacilusok poliszacharid hapténjének kimutatásán alapul. A lépfenebacilusok a pathogenitás szolgálatában álló, antigén hatású, oedemafaktornak, letalis faktornak és protektív antigénnek nevezett anyagokat (toxinokat) termelnek. Ez utóbbival szemben előállított hiperimmun vérsavóval a lépfenefertőzés kivédhető, a másik két faktorral szemben termelt ellenanyagoknak azonban védőhatása nincs. Ellenálló képesség. A nem spórás lépfenebacilusok kevésbé ellenállók. A felbontatlan hullában, rothadás következtében, 4 5 napon belül elpusztulnak. Hő hatására C-on 15 perc alatt tönkremennek, spóráik azonban igen ellenállók. Ha a hullában vagy kényszervágott állatokban levő bacilusoknak módjuk volt 64

85 Részletes bakteriológia spórásodni, a földbe került spórák évtizedekig megőrzik fertőzőképességüket. A spórák is elpusztíthatók azonban 5 10 perces forralással vagy 8 10%-os formalinban óra alatt. Pathogenitás. A lépfenebacilusok természetes viszonyok között megbetegítik a házi és vadon élő növényevőket, de fogékony irántuk a legtöbb emlős, így az ember is. A burkos lépfenebacilusok parenterális fertőzés után az egeret, a tengerimalacot és a nyulat 1 3 nap alatt septikaemiában elpusztítják. A buroktermelő képességüket elvesztett mutánsok egerek bőre alá oltva legfeljebb toxikus oedemát okoznak, vagy az egereket meg sem betegítik A Bacillus nemzetség gyakoribb saprophyta tagjai A természetben a Bacillus nemzetség saprophyta tagjai, így a B. subtilis, a B. megaterium, a B. cereus stb. igen elterjedtek. Különböznek a virulens lépfenebacilustól abban, hogy csillósak, így élénken mozognak, egyikmásik fajuk (pl. a B. subtilis, a B. megaterium) levegőn tenyésztve is képez burkot, véresagaron egyes fajok erős hemolízist okoznak (pl. a B. cereus), továbbá ellentétben a lépfenebacilusokkal a kísérleti állatokat nem pusztítják el. Bár a B. cereus saprophyta, egyes törzsei földdel szennyezett élelmiszerekben elszaporodva hányással és hasmenéssel járó ételmérgezést idézhetnek elő. Az ételmérgezés előidézésében a törzsek termelte hemolizin, egy letalisnak nevezett toxin, foszfolipáz enzim és valószínűleg egy fehérje természetű enterotoxin játszik szerepet. A B. thüringiensis, és a B. larvae biokémiai sajátságaikat tekintve közel állnak a B. cereushoz. A B. thüringiesist igénybe veszik az ízeltlábúak elleni biológiai védekezésben, míg a B. larvae a mézelő méh nyúlós (amerikai) költésrothadásának az okozója. A Bacillus nemzetség egyes tagjai különféle antibiotikumot is termelnek. A B. licheniformis termeli a bacitracinokat, a B. polymyxa törzsei pedig a polimixineket. A bacitracin gyűrűs hexapeptid, főleg a Grampozitív baktériumokra hat. A polimixinek ugyancsak ciklikus oligopeptidek. Ezek hatékonyak a legtöbb Gramnegatív baktériumfaj, köztük a Pseudomonas törzsekkel szemben Clostridium A Clostridium fajok Gram-pozitív, anaerob, pálcika alakú, spórás baktériumok. Természetes előfordulási helyük a talaj, de többségük megtelepszik az ember és az állatok bélcsatornájában is. Ez ideig mintegy 100 fajuk ismert. Nagyfokú biokémiai aktivitásuk folytán jelentős szerepük van a talajba került szerves anyagok lebontásában. Morfológia. Nagyméretű, vaskos pálcák, hosszúságuk elérheti a 7 10 µm-t, vastagságuk az 1 2 µm-t. A mikroszkópos kenetben általában egyesével vagy szabálytalan halmazokban láthatók, egyikük-másikuk azonban hosszú fonalakat is képez. Valamennyien spórások, a spórák átmérője meghaladja a baktériumtest harántátmérőjét. A spóraképzés optimális feltételei fajonként változnak. A C. perfringens csak enyhén lúgos közegben spórásodik, ezért ha a táptalaj szénhidrátokat is tartalmaz, a spórásodás rendszerint elmarad. Ha a spóra centrális helyeződésű, orsó alak (clostridium), ha pedig terminális vagy szubterminális helyeződésű, dobverő vagy evező alak (plectridium) jön létre. A spóra lehet gömb vagy ovális alakú. A spórák helyeződése és alakja támpontot ad az ide tartozó fajok identifikálásához. Az állatorvosi szempontból fontos fajok körülcsillósak, kivéve a C. perfringenst, amelynek csillója nincs, viszont a szövetek között szaporodva rendszerint burkot képez. Fiatal, 1 2 napos tenyészeteikben valamennyi Clostridium Gram-pozitív, megfesthetők azonban fukszinnal vagy más festékkel is. Tenyésztés. Anaerobok, tenyésztésükre tápanyagokban gazdag, kis (< 110 mv) redoxipotenciálú táptalajokat használunk. Más baktériumokkal szennyezett anyagokból a mintákat a kioltás előtt 10 percig 80 C-on hevítve szelektíven izolálhatók. Általában 37 C-on tenyésztjük őket, a C. perfringens szaporodásának optimális hőmérséklete azonban C, a saprophyta C. putrefaciens viszont hidegkedvelő, 30 C felett nem szaporodik. Jelentős különbségek vannak az egyes fajok oxigéntűrő képességében is. A C. novyi B típusa, továbbá a C. tetani már 0,05% oxigén jelenlétében sem indul szaporodásnak, a C. histolyticum viszont csökkentett oxigénnyomás mellett is szaporodik. Tenyésztésükre szilárd és folyékony táptalajok egyaránt alkalmasak. A folyékony táptalajok közül a főtt húst (Holman), a májdarabkákat (Tarozzi) vagy agypépet (Hibler) tartalmazó anaerob levesekben egyenletes zavarosodást okoznak, a táptalajban levő szénhidrátokból nagy mennyiségű gázt és különféle szerves savakat, 65

86 Részletes bakteriológia alkoholokat stb. képeznek. A proteolítikus enzimeket termelő fajok (pl. a C. histolyticum, a C. botulinum és a C. tetani) az agypépet megfeketítik, miközben igen bűzös anyagok keletkeznek. A szilárd táptalajok közül a fajok többségének tenyésztésére alkalmas a közönséges agar, sokkal jobban szaporodnak azonban glükózt is tartalmazó véresagaron. A pathogen fajok többsége véresagaron hemolízist okoz. Biokémiai sajátságok. Többségük biokémiailag igen aktív, kataláz-negatívak, szénhidrátbontásuk fermentatív. A pathogen fajok (a C. histolyticum és a C. tetani kivételével) glükózt és számos más szénhidrátot is elbontanak, többféle extracelluláris enzimet és igen erős hatású exotoxinokat termelnek, ezenkívül a fajok egy része proteolítikus hatású (1. táblázat). Ellenálló képesség. Spóráik igen ellenállóak. Természetes viszonyok között beszáradt váladékokban, szövetnedvekben évekig életképesek maradnak. A C. botulinum spórái pl. 3 4 órás forralást is elviselnek, a C. perfringens spórái azonban 5 10 perces forralás hatására rendszerint elpusztulnak. Hőlég-sterilizátorban vagy autoklávban való kezeléssel azonban a Clostridium spórák is elpusztíthatók. A fertőtlenítőszerek közül a spórák elpusztítására 8%-os formalin vehető igénybe legalább 2 órás behatási idővel. 1. táblázat - Egyes Clostridium fajok morfológiai és biokémiai sajátságai Megnevezés C. chauv oei C. spetic um C. nov yi A-B C. histolytic um C. perfring ens C. teta ni C. botulin um A-F C. colinu m Spóraalak O O O O O K O O Spórahelyeződé s ST ST ST ST ST T ST ST Mozgás Hemolízis / NO 3 NO 2 + k +/ Zselatinelfolyós ítás Lecitináz + + Lipáz +/ + Glükóz Laktóz Szacharóz + + /+ + O: ovális, ST: szubterminalis, K: kerek, T: terminalis Pathogenitás. Többségük természetes lakója az ember és az állatok bélcsatornájának, s betegséget csak akkor idéznek elő, ha a bélcsatornából vagy a talajból valamilyen okból (roncsolt, elhalt) szövetek közé jutnak, s ott elszaporodnak, vagy ha a bélcsatornából toxinjaiknak módjuk van felszívódni. 66

87 Részletes bakteriológia Az általuk okozott betegségek állatról állatra nem terjednek, rendszerint sebfertőzéshez társuló, gázoedemás betegségek (gázgangraena), enterotoxaemia vagy intoxicatio formájában zajlanak le. A gázoedemás betegségek esetén a toxicitást kiegészíti a kórokozók extracelluláris enzimjeinek és erős szénhidrátbontó képességének a lokális hatása. A fertőzött szövetek oedemássá válnak, elhalnak, s a szénhidrátokból és fehérjékből keletkező szerves savak és gázok miatt tapintásra sercegnek (gázoedema). A gázoedemát okozó baktériumok közül a háziállatok rosszindulatú vizenyőjének az előidézésében a C. septicum, a C. novyi és a C. histolyticum játszik elsősorban szerepet. A betegséget létrehozhatják azonban más, alkalomadtán a szövetekbe kerülő Clostridium fajok is (C. perfringens, C. sordellii stb.). A sercegő üszök okozója a C. chauvoei (C. feseri). A C. perfringens törzsek a háziállatokban enterotoxaemiákat okoznak. A C. colinum fürjben, csirkében okoz fekélyes bélgyulladást. A C. tetani a tetanus (merevgörcs), a C. botulinum pedig a botulismus (kolbászmérgezés) okozója. A saprophyta Clostridium fajok közül a C. putrefaciens a rothadásos folyamatokban való részvétele miatt érdemel figyelmet, más saprophytákat pedig ipari célra használnak (pl. C. butyricum). A saprophyták alkalmanként a kórokozó fajokkal együtt szennyező mikrobákként bejuthatnak a szövetek közé is Clostridium septicum Közönséges és véresagaron egyaránt nő. Telepei laposak, szabálytalan alakúak, szélük felrostozott. Nedves agar felületén a telepek hamar összefolynak. Leves táptalajban erőteljes gázfejlődést indít meg. Legalább négyféle toxint termel. Fő toxinja a letalis, necrotizáló és hemolizáló sajátságú alfa-toxin. További toxinjai közül kettő extracelluláris enzim (dezoxiribonukleáz és hialuronidáz), egy pedig hemolizin. A szövetek közé jutva az összes házi emlősállatot megbetegíti, a madarakban alkalmanként gangraenás dermatitist okoz. A laboratóriumi kísérleti állatok közül legfogékonyabb iránta a tengerimalac, amelyben a spóratartalmú anyag izomba történő fecskendezését követően óra alatt halálra vezető gázoedema fejlődik ki. A befecskendezés körül az izomzat és a kötőszövet savósan, véresen beivódik, az elváltozott szövetek avasvaj-szagúak, gázhólyagokat tartalmaznak. Az elhullott tengerimalacok hashártyájáról vett lenyomati készítményben a kórokozó gyakran hosszú fonalak formájában látható (27. ábra). 27. ábra - Clostridium septicum fonalai tengerimalac hashártyájáról készített kenetben (fukszinnal festve, 1250 ) 67

88 Részletes bakteriológia Clostridium novyi Morfológiailag hasonlít a C. septicumhoz, de annál valamivel vaskosabb, telepei zártabbak. Nehezen tenyészthető, az oxigénnyomok iránt is érzékeny. Tenyésztési optimuma 45 C. Levestenyészeteiben legalább nyolcféle (letális, necroticus, hemolitikus stb. hatású) toxint termel. A toxinok egy része extracelluláris enzim (lipáz, lecitináz). A toxinok antigenitása és biológiai hatása alapján a C. novyinak A, B és C típusa különböztethető meg. A C. novyi A azonosnak tekinthető a korábban C. oedematiensnek nevezett fajjal, a B típus pedig a C. gigasszal. A C típus toxinokat nem termel. Pathogenitásuk megegyezik a C. septicuméval, az A és B típus gázoedemás betegséget idéz elő, a B típus ezenkívül főleg juhokban fertőző elhalásos májgyulladást is okoz. Spóratartalmú anyagot tengerimalac bőre alá fecskendezve a kialakuló gázoedemás elváltozások azonosak a C. septicum által előidézettel, de nem véres, hanem csupán oedemás jellegűek, s kevés gázbuborékot tartalmaznak Clostridium haemolyticum Tulajdonságai megegyeznek a C. novyiéval, korábban az előbbi egyik (D) típusának tekintették. A szarvasmarha ún. bacilusos vérfestékvizelését idézi elő Clostridium histolyticum Véresagaron aerob, mikroaerofil viszonyok között is szaporítható, de ilyenkor spórát nem képez. Biokémiai tulajdonságaira jellemző, hogy a szénhidrátokat nem bontja, viszont igen erős proteolítikus hatású, levestenyészeteiben legalább ötféle toxint termel. Az alfa-toxin letalis és necrotizáló hatású, immunológiailag azonos a C. septicum alfa-toxinjával. A béta-, gamma- és delta-toxinok extracelluláris enzimek (kollagenáz, proteáz, elasztáz). Az epszilon-toxin oxigénre érzékeny hemolizin. Valamennyi házi emlősállatban előidézhet rosszindulatú vizenyőt. Tengerimalacba oltva az erős proteolítikus hatás miatt az oltás helyén a szövetek véresen beivódnak, elhalnak, majd elfolyósodnak (hisztolízis). 68

89 Részletes bakteriológia Clostridium chauvoei Morfológiai tulajdonságait illetően igen hasonló a C. septicuméhoz, fonalakat azonban nem képez. Közönséges agaron nem indul fejlődésnek, véresagaron erősebb hemolízist okoz, mint a C. septicum. Folyékony táptalajokban erős gázképződést okoz és többféle toxint termel. Az alfa-toxin letalis, necrotizáló és hemolitikus, antigenitás tekintetében rokon a C. septicum alfa-toxinjával. A béta-toxin dezoxiribonukleáz, a gamma-toxin hialuronidáz, a delta-toxin hemolizin. Levestenyészeteiben ezenkívül még hőlabilis protektív antigének is találhatók. A C. chauvoei főleg kérődzőkben okoz betegséget (sercegő üszök), megbetegíthet azonban egyéb állatfajokat is. A laboratóriumi kísérleti állatok közül a tengerimalac érzékeny, de ellentétben a C. septicummal, az egér, a patkány és a nyúl rezisztens a C. chauvoeivel szemben. Spóratartalmú anyagot tengerimalacba oltva ugyanolyan gázoedemás betegség alakul ki, mint C. septicum fertőzés hatására. A rosszindulatú vizenyő és a sercegő üszök megelőzésére a betegséget előidéző kórokozók formalinnal kezelt levestenyészeteinek szűrletét (anakultúrát) vagy tisztított toxoidokat tartalmazó vakcinákat használunk. A rosszindulatú vizenyő kórokozóinak elkülönítése. A rosszindulatú vizenyő kórokozóinak egymástól, a C. chauvoeitól, más pathogen és egyes társfertőzőként előforduló saprophyta fajoktól való megkülönböztetése meglehetősen nehéz. Az elkülönítésre felhasználhatók a fajokat jellemző mikroszkópos, tenyésztési és biokémiai sajátságok, továbbá az immunfluoreszcencia (IF) és a kísérletiállat-oltás. Bár a különböző Clostridium fajok sejtfalantigénjei és exotoxinjai gyakran szoros antigénszerkezeti rokonságot mutatnak s sejtfalantigénjeik alapján egy-egy faj is rendszerint több csoportra osztható, a fontosabb pathogen fajokkal szemben mégis olyan antibakteriális, kimerített IF-savók állíthatók elő, amelyek alapján az identifikálás megbízhatóan elvégezhető. Különböző fluoreszcens festékekkel jelzett savókkal a C. septicum, a C. chauvoei és más fajok, eltérő színű fluoreszkálásuk alapján, még kevert tenyészetben is elkülöníthetők egymástól. Specifikus, antitoxikus hiperimmun savókkal állatkísérletet is végezhetünk az identifikálás céljából. A homológ immunsavóval kezelt tengerimalacok a kísérleti fertőzést túlélik (toxinsemlegesítési próba) Clostridium perfringens A pathogen Clostridium fajok közül az egyetlen, amely nem csillós, az állati testben és néha tenyészeteiben is burkot képez. Közönséges agaron lapos, szürkésfehér, kerek vagy csipkézett szélű telepekben nő. Telepei véresagaron nagyobbak, körülöttük szennyesbarna színű, vérsejtoldódásos udvar keletkezik. Hőmérsékleti optimuma C között van, amit felhasználhatunk szelektív izolálására. Nehezen, csak szénhidrátoktól mentes táptalajokban spórásodik. Biokémiailag igen aktív, sokféle szénhidrátot bont, ennek megfelelően tenyészeteiben igen erős gázképződést okoz. Szulfitokat és vasat tartalmazó táptalajokban a szulfitok redukciója miatt feketít. Levestenyészeteiben különféle toxinokat termel. Legalább 12 féle toxinja ismert. Valamennyi toxin fehérje, többségük extracelluláris enzim. A főbb toxinok alapján a C. perfringens törzsek öt típusba sorolhatók (2. táblázat). A főtoxinok közül az alfa toxin foszfolipáz C, a sejtek membránját károsítja. A béta-toxin tripszinre érzékeny, kb Da molekulatömegű peptid, a vérerek átjárhatóságát fokozza, lokális gyulladást és elhalást okoz. Az epszilon- és a iota-toxinok inaktív prototoxinok formájában képződnek, amelyeket proteolítikus enzimek (tripszin) aktiválnak. Mindkét toxin a vérerek átjárhatóságát fokozza, oedemát okoz, amely végül elhaláshoz vezet. 2. táblázat - A C. perfringens fontosabb toxinjai és az okozott kórképek Fő toxinok Mellékes toxinok Típu s Kórkép Alfaletali s, necrotizál ó, lecitináz Bétaletali s, necrotizál ó Epszilonleta lis, necrotizáló Iotaletali s, necrotizá ló Gamm a- Deltaletali s, hemolitik us Théta- Kappa- Lambda - proteiná z Mű- hialuronid áz 69

90 Részletes bakteriológia letalis hemolitik us kollegen áz A Emberi gázgangraen a, B ételmérgezés Bárányvérha s Juh: struck, C D E necroticus enteritis malacban, csirkében, emberben Juh (szm, kecske): enterotoxaem ia Patogenitása nem bizonyított : minden törzs termeli ++: a törzsek többsége termeli +: csak egyes törzsek termelik -: egyetlen törzs sem termeli A típusok elkülönítése. A típusok toxinneutralizációs próbával különböztethetők meg egymástól. Fehér egerek a törzsek toxintartalmú levestenyészeteinek szűrletével iv. vagy hasüregbe oltva toxaemiában hamarosan elpusztulnak, de életben maradnak, ha előzetesen megfelelő antitoxintartalmú hiperimmun savóval összekeverve fél óráig 37 C-on tartjuk, és ezután fecskendezzük be. A C. perfringens törzsek parenteralisan kísérleti állatokba fecskendezve gázoedemás elváltozásokat idéznek elő. A C. perfringens A törzsek természetes előfordulási helye a talaj, a B, C, D és E törzsek viszont főleg a bélcsőben élnek, a talajban csak átmenetileg találhatók meg. A C. perfringens törzsek a háziállatokban enterotoxaemiákat idéznek elő (2. táblázat). 70

91 Részletes bakteriológia A C. perfringens A, de ritkán egyes C és D típusok is termelnek egy enterotoxint, amely a spórák bélcsatornában való kicsírázásakor képződik, s az emésztőcsatornában folyadékfelhalmozódást s ennek következményeként emberben hasmenéssel járó ételmérgezést idézhet elő. A C. perfringens okozta betegségek aktív immunizálással való megelőzésére a megfelelő típusból készült anakultúrát vagy az egyes tisztított toxinféleségeket anatoxin formájában tartalmazó vakcinákat használjuk Clostridium colinum Izolálása nehéz, erre a célra ló vérsavót is tartalmazó triptóz-foszfát-glükóz agar a legalkalmasabb. Nehezen spórásodik. Szemben a többi pathogen Clostridiummal a zselatint nem bontja el. Fürjben, csirkében a vastagbél kifekélyesedésével járó bélgyulladást okoz Clostridium tetani Szigorúan anaerob, spórája terminális helyeződésű, amely a baktériumtestet kidomborítja, teniszütő alakúvá teszi (28. ábra). Telepei igen finomak, laposak, jégvirágra emlékeztetnek, nedves agar felületén rajzanak. Véresagaron hemolízist okoznak. A szénhidrátokat nem bontja. Gyenge proteolítikus hatású, a levesben levő izomdarabkákat lassan emészti. Levestenyészeteiben egy hemolízist okozó és egy igen erős hatású neurotoxint (tetanustoxint) termel. A C. tetani iránt valamennyi emlősfaj fogékony, beleértve az embert is. A toxin a fertőzött sebekből felszívódva főleg a gerincvelő motoros sejtjeire hat. Formalinnal kezelve anatoxinná (toxoiddá) alakítható. A tetanusanatoxint oltóanyagként aktív immunitás létesítésére használjuk. 28. ábra - Clostridium tetani levestenyészetből, spórák és vegetatív alakok (Gram-festés, 1250 ) A toxintermelő törzsek levestenyészetének akár sokmilliószorosan hígított szűrletét bőr alá oltva az egerek merevgörcs tünetei között pusztulnak el. A toxicitás antitoxikus savó egyidejű adagolásával kivédhető. Spóratartalmú anyagoknak bőr alá fecskendezése néhány nap alatt ugyancsak az egerek pusztulására vezet Clostridium botulinum 71

92 Részletes bakteriológia Nagyméretű pálca, spórája többnyire az egyik pólus közelében helyeződik (29. ábra). Telepei szilárd táptalajokon szabálytalan kör alakúak, laposak, szélük egyenetlen, felületük szemcsés. Levestenyészetekben nagymennyiségű gázt és különféle toxinokat termelnek. 29. ábra - Clostridium botulinum levestenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Biokémiailag a törzsek nem egységesek, egy részük elbontja a fehérjéket, miközben igen bűzös gázok keletkeznek, a törzsek másik része azonban nem proteolítikus. A termelt toxinok alapján a törzsek hét (A, B, C, D, E, F, G) típusba sorolhatók. A C. botulinum különböző típusainak a toxinjai emberben, lóban, szarvasmarhában, tenyésztett prémesállatokban és különösen gyakran házi- és vadon élő vízimadarakban (főként vadkacsákban) idéznek elő betegséget. A C. botulinum talajlakó, az A, B, E és F típusok, toxinjai főként az embert betegítik meg. Nálunk emberben az E típus okozta botulismus a leggyakoribb. A C és D típus a talajon kívül megtalálható az állatok (főleg a madarak) bélcsövében is, állatokban csaknem kivétel nélkül ezek idéznek elő botulismust. A C. botulinum C és D típusaiban a toxinképzést fág kódolja. A G típus ugyancsak talajlakó, de toxint csak kis mennyiségben termel. A botulismust nem maga a baktérium, hanem a földdel szennyezett élelmiszerekben (kolbászban, disznósajtban, hús- és növényi konzervekben stb.), rosszul elkészített szilázsokban, rothadt tápokban, ízeltlábúak álcáiban, állatok hulláiban, kivételesen sebekben, anaerob viszonyok között elszaporodott baktériumok toxinjai hozzák létre. A C. botulinum-toxinok különböző molekulatömegű fehérjék. A toxinok antigénhatása különböző, biológiai hatásuk azonban azonos. Hőérzékenységük C között változik. Az A és F toxinokat a tripszin aktiválja. A toxinok a bélből felszívódnak, a myoneuralis synapsisokra hatnak. A C. botulinum-toxinok kimutathatók, ha a toxintartalmú levestenyészetekkel vagy a gyanús takarmányokból (élelmiszerekből) készített vizes kivonatokkal intraperitonealisan, nagyobb mennyiségű toxin esetén per os fehér egereket vagy tengerimalacokat oltunk. A kísérleti állatok a toxinok hatására elerőtlenednek és petyhüdt bénulás tünetei között elhullanak Clostridium piliforme 72

93 Részletes bakteriológia A C. piliforme (korábban Bacillus piliformis) intracellularisan, a fertőzött állatok vakbelének a hámsejtjeiben és a májsejtekben szaporodó, 5 10 µm hosszú, pálcika alakú, spórás, csillós baktérium. Szöveti metszetekben többnyire Gram-negatívan festődik. A bakteriológiában szokásos táptalajokon nem, egérfibroblast-, továbbá májsejt-tenyészetekben, valamint embrionált tojásban azonban szaporítható. A bélsárral ürülő spórái az alomban több mint egy évig életképesek maradnak. Monoklonális ellenanyagokkal a C. piliforme törzsek legalább hat, antigénszerkezetileg egymástól különböző csoportba oszthatók. A C. piliforme főleg rágcsálókban (egérben, patkányban, tengerimalacban, nyúlban stb.), továbbá kutyában, macskában, csikóban és néhány más állatfajban okoz vízszerű vagy véres hasmenéssel, gócos májelhalással és szívizomgyulladással járó (Tyzzer-féle) betegséget Staphylococcus A staphylococcusok Gram-pozitív, gömb alakú baktériumok. Megtalálhatók az ember és az állatok bőrén, a felső légutakban, a nemi szervek és húgyutak nyálkahártyáján, az emésztőcsatornában, bizonyos fajok előfordulnak a tejben, tejtermékekben, más élelmiszerekben, de a természetes vizekben, talajban és a növényzeten is. Morfológia. Átlagosan 1 µm átmérőjű, szabályos gömb vagy kissé ovális alakú baktériumok. A mikroszkópos képben gyakran szőlőfürtszerű (staphyli = szőlőfürt) halmazok formájában láthatók (30. ábra). Csillójuk, spórájuk nincs, burkot nem képeznek. 30. ábra - Staphylococcus aureus agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Tenyésztés. Igénytelen, aerob, fakultatív anaerob baktériumok. Közönséges agaron, 37 C-on tenyésztve, 1 3 mm átmérőjű, kerek, fénylő, domború, vaj konzisztenciájú telepeket képeznek. 37 C-on is, de még inkább szobahőn való néhány napos állás után a fajok egy része sárga, vörös vagy fehér karotinoid pigmenteket termel. Véresagaron a pathogen törzsek rendszerint erős hemolízist okoznak. A közönséges levest egyenletesen megzavarosítják. Szelektív tenyésztésükre, sótűrésük alapján, felhasználható a 10% konyhasót, mannitot és fenolvöröst tartalmazó agar. A mannitot bontó Staphylococcus törzsek körül a táptalaj megsárgul. A nátrium- 73

94 Részletes bakteriológia telluritot, glicint, piroszőlősavat és tojássárgáját tartalmazó táptalajon a Staphylococcus telepek a telluritredukció miatt feketék. Biokémiai sajátságok. Aerobok, fakultatív anaerobok, kataláz-pozitívak. Az előbbi tulajdonságaik alapján elkülöníthetők a Micrococcus, az utóbbi alapján a pedig a Streptococcus fajoktól. A Staphylococcus nemzetségbe ma már több mint 30 faj tartozik. Fajokba sorolásuk, szénhidrátbontásuk, hemolizáló képességük, extracelluláris enzimjeik vizsgálata és néhány egyéb sajátságuk alapján történik. A nagyszámú faj közül kórtani szempontból fontosak a koaguláz-pozitív fajok, így a S. aureus, a S. aureus subsp. anaerobius (korábban Micrococcus abscedens ovis), a S. intermedius és néhány egyéb újonnan leírt, de jelentőségét tekintve még alig ismert faj. A koaguláz-negatív fajok túlnyomó többsége saprophyta, egyes fajok azonban, így pl. a S. hyicus, a S. epidermidis, a S. gallinarum, a S. equinum, a S. haemolyticus, a S. felis bőrgyulladást, helyi gennyesedéseket stb. idézhetnek elő. A pathogen S. aureus törzsek, azonkívül, hogy koaguláz-pozitívok, véresagaron erős hemolízist okoznak, elbontják a mannitot és számos extracelluláris enzimet, így fibrinolizint, alkalikus foszfatázt és nukleázokat is termelnek (3. táblázat). A S. hyicus törzsek egy része képes koagulázt termelni. A S. aureus subsp. anaerobius elkülöníthető a S. aureustól, egyebek mellett azon az alapon, hogy anaerob, nem termel karotinoid pigmenteket, kataláz-negatív és nem redukálja a nitrátot. 3. táblázat - Az állatokban gyakran előforduló Staphylococcus fajok biokémiai sajátságai Fajok Hemolí zis Koagul áz Hialuroni dáz Foszfat áz Dezoxiribonuk leáz Aceto in Mann it Szachar óz Trehal óz S. aureus S. intermedi us S. hycius subsp. hyicus S. hyicus subsp. chromoge nes S. epidermid is S. saprophyti cus S. gallinaru m k k + + k k k + + k nv. + k + + k + nv k: különböző típusok nv.: nem vizsgált 74

95 Részletes bakteriológia A bizonyos gazdákon (ember, sertés és baromfi, szarvasmarha és juh, nyúl, valamint kutya és ló) élő S. aureus törzsek fágérzékenységük, koagulázuk típusa, kristályibolya-felvétele és néhány más tulajdonság alapján egymástól megkülönböztethetők és 5 biotípusba (A, B, C, D, E) sorolhatók. Bár az egyes biotípusok többnyire a nekik megfelelő gazdákból izolálhatók, az emberben előforduló törzsek okozhatnak mastitist szarvasmarhában, megtelepedhetnek lóban, kutyában stb., és az állatokban előforduló törzsek is alkalmanként megtelepedhetnek emberben is. A S. aureus törzsek pathogenitása extracelluláris enzimek és különféle toxinok termelésén alapul. A pathogen törzsek termelnek koagulázt, fibrinolizint, hialuronidázt, hőstabil dezoxiribonukleázt, ezenkívül lipázokat, zselatin- és kazeinbontó enzimeket is. Toxinjaik hemolizinek, leukocydinek és enterotoxinok. A hemolizinek (alfa, béta, gamma és delta) hőlabilis exotoxinok (citolizinek), amelyek a különféle állatok vörösvérsejtjeit feloldják. Az alfa-hemolizin Da molekulatömegű fehérje, feloldja a nyúl és a juh vörösvérsejtjeit, citotoxikus, dermonecroticus hatású, iv. befecskendezve a kísérleti állatokat megöli. Az alfa-toxin okozza elsősorban a fertőzés helyén kialakuló szövetkárosodást. A béta-hemolizin kb Da molekulatömegű fehérje, extracelluláris enzim, főleg a szarvasmarha és a juh vörösvérsejtjeit oldja, citotoxikus a leukocytákra és a macrophagokra. A delta-hemolizin ugyancsak fehérje, citotoxikus, a sejtek membránját teszi tönkre. A gammahemolizin két komponensből áll, citotoxikus, sok állatfaj vörösvérsejtjét oldja, főleg a S. epidermidis törzsek termelik. A különféle állatfajokból izolált Staphylococcus törzsek az egyes hemolizineket eltérő mennyiségben termelik. Az alfa- és béta-toxinokat toxoiddá alakítva és kísérleti állatoknak befecskendezve részleges védettség volt előidézhető a Staphylococcus okozta tőgygyulladásokkal szemben. A leukocydin két fehérjekomponensből összetevődő toxikus anyag, amely az ember és a nyúl leukocytáinak és macrophagjainak cytoplasmamembránját károsítja. Egyes humán eredetű Staphylococcus törzsek termelnek bőrelhalást okozó dermo- (exfoliatív) toxinokat is. Kétféle toxin ismert, mindkettő fehérje, molekulatömegük D körüli, a bőr stratum germinativumának a sejtjeit teszik tönkre. Enterotoxinokat főleg egyes humán eredetű, illetve élelmiszermintákból származó törzsek termelnek. Kis ( Da) molekulatömegű, hőstabil fehérjék, per os bejutva hányást, hasmenést okoznak. A toxinoknak ez ideig hat (A F) típusa ismert. A S. aureus törzsek csaknem mindegyike hordoz a felületén egy protein-a-nak nevezett fehérjét, amely virulenciafaktornak tekinthető. A protein-a képes az Fc komponensen keresztül immunglobulinokat megkötni. Emiatt a S. aureus törzseket gyakran használjuk koagglutinációs próbához. A staphylococcusokhoz kötött specifikus ellenanyagok antigénjeikkel találkozva reakcióba lépnek, amelyet a staphylococcusok agglutinációja jelez. Ellenálló képesség. A Staphylococcus fajok a nem spórás baktériumok között a legellenállóbbak közé tartoznak. Beszáradt váladékokban hónapokig életképesek maradnak. Hevítés hatására 60 C-on fél óra alatt rendszerint elpusztulnak. A fertőtlenítőszerek közül a formalin 3%-os oldata 30 perc alatt, a klórlúg 3%-os, a szervesjód-tartalmú fertőtlenítőszerek 0,5%-os oldata pedig 10 perc alatt öli el a Staphylococcus fajokat. Pathogenitás. A S. aureus törzsek állatokban különféle gennyesedéssel járó, rendszerint helyi folyamatokat, tályogképződést, bőrgyulladást, hallójárat-gyulladást stb., ezenkívül szarvasmarhában, juhban és kecskében, lóban, kutyában ritkábban egyéb állatfajokban tőgygyulladást, méhgyulladást, tyúkban és más madarakban septikaemiát, ízületgyulladást és bőrgyulladást idéznek elő. A S. aureus subsp. anaerobius törzsek idézik elő a juhok és a kecskék enzootiás jellegű, a testtájéki nyirokcsomók elgennyesedésével járó (Morel-féle) betegségét. A S. intermedius törzsek (amelyeket korábban a S. aureus E biotípusának tekintettek) zömmel húsevőkben (kutya, nyérc, róka) okoznak gennyesedéssel járó folyamatokat. A S. hyicus sertésben exsudatív bőrgyulladást okoz. Emberben a Staphylococcus fajok okozta fertőzések ugyancsak gyakoriak (tonsillitis, bronchitis, arthritis, dermatitis, endocarditis stb.). 75

96 Részletes bakteriológia Virulens S. aureus törzzsel fehéregereket iv. fertőzve az egerek 1 2 nap alatt septikaemiában elhullanak. A kevésbé virulens törzsek lassúbb lefolyású általános gennyesedést, gócos gennyes vesegyulladást vagy mindössze helyi folyamatokat idéznek elő. Nyulak a S. aureus alfa-hemolizinje iránt különösen érzékenyek, virulens törzzsel iv. fertőzve septikaemiában hullanak el Micrococcus A Micrococcus fajok megtalálhatók az ember és az állatok bőrén, a tejben, tejtermékekben, húsban, nyers húskészítményekben, különféle egyéb élelmiszerekben, de a természetes vizekben és a talajban is. Grampozitívak, a mikroszkópos képben egyesével, párokban, szabálytalan halmazokban, négyes vagy nyolcas kötegekben láthatók. Sárga, rózsaszín vagy narancsvörös pigmenteket termelnek. Közönséges agaron és levesben egyaránt könnyen tenyészthetők. Obligát aerobok, kataláz- és többnyire oxidáz-pozitívak, e tulajdonságaik alapján elkülöníthetők a morfológiailag hozzájuk hasonló Staphylococcus és Streptococcus fajoktól, kórtani jelentőségük nincs, saprophyták Streptococcus A Streptococcus nemzetségbe sorolt fajok széles körben elterjedtek, megtalálhatók az ember és az állatok szájüregében, az emésztőcsatornában, a légutakban, a húgy- és nemi utak nyálkahártyáin, a bőrön, de jelen vannak a tejben, tejtermékekben, egyéb állati és növényi eredetű élelmiszerekben, továbbá a szennyvizekben is. Morfológia. Szabályos gömb vagy kissé ovális alakú, 0,5 1 µm, ritkán ennél valamivel nagyobb átmérőjű baktériumok, amelyek rövidebb vagy hosszabb láncokat képeznek (streptos = gyöngyfüzér). A láncok hosszúsága függ a Streptococcus fajától és a tenyésztés körülményeitől. A kórokozó fajok többsége, különösen kóros anyagokban vagy glükóztartalmú levestenyészetekben, hosszú láncokat alkot (31. ábra), mások egyesével, párosával vagy kisebb, szabálytalan csoportokba rendeződve fordulnak elő. Néhány kivételtől eltekintve csilló nélküliek, egyes fajok (S. pyogenes, S. salivarus, S. sanguis) felületén fimbriák találhatók. A fajok egy része, pl. a S. equi, frissen izolált fiatal tenyészeteiben vékony burkot képez. A S. suis törzseknek poliszacharid burkuk van. A S. pneumoniaeben a coccusok párosával állnak (diplococcusok), egymással össze nem függő végük lándzsaszerűen kihegyesedik, a virulens törzseknek vastag poliszacharid burka van. A Streptococcus fajok Gram-pozitívak, megfesthetők azonban bármelyik egyszerű festési eljárással is. 31. ábra - Streptococcus equi subsp. zooepidemicus levestenyészetből (Gram-festés, 1250 ) 76

97 Részletes bakteriológia Tenyésztés. Az igényes baktériumok közé tartoznak, szaporodásukat vérsavó, élesztőkivonat és glükóz jelentősen serkenti. Aerobok, fakultatív anaerobok, utóbb azonban néhány obligát anaerob fajt is a streptococcusok közé soroltak. Néhány faj, pl. a S. pneumoniae, a tenyésztéskor 5% CO 2-ot is igényel, míg más fajok, bár nem igénylik, jobban nőnek ilyen körülmények között. Optimális tenyésztési hőmérsékletük 37 C, a saprophyták között azonban vannak olyanok, amelyek 5 10 C-on, sőt 45 C-on is jól szaporodnak. Közönséges agaron nehezen erednek meg, telepeik is igen aprók. Tenyésztésükhöz általában véresagart használunk. Telepeik véresagaron is aprók, 24 óra múlva 0,5 1 mm átmérőjűek, domborúak, éles szélűek, fénylők. A fajok egy része a vörösvérsejteket feloldja, részleges (alfa-) vagy teljes (béta-) hemolízist idéz elő. A többnapos telepek középső része gyakran emlőszerűen kiemelkedik. A streptococcusok szelektív izolálására kristályibolyát, tallium-szulfátot, nátrium-azidot, esetenként azonban antibiotikumokat is tartalmazó táptalajokat használunk. A Streptococcus fajok osztályozása. A streptococcusok hemolizáló képességük, biokémiai sajátságaik, sejtfalantigénjeik és néhány egyéb sajátság alapján több csoportba, így a gennykeltő (pyogen) streptococcusok, a szájüregben előfordulók (oralis streptococcusok), a lactis csoport, az anaerob streptococcusok és az egyebek csoportjába sorolhatók. Hemolízis. A pathogen fajok többsége véresagaron erős, a telepek körül gyűrű formában megjelenő hemolízist (béta-hemolízis) okoz. A S. pyogenes esetében a béta-hemolízist a törzsek által termelt, oxigénre nem érzékeny, kis molekulatömegű peptid (steptolizin-s) idézi elő. Egyes törzsek (így pl. a Lancefield-féle A, C és G csoportba tartozók) termelnek egy oxigénre érzékeny hemolizint (streptolizin O-t) is, amely protein természetű, antigénhatású, feloldja a vörösvérsejteket és citotoxikus a leukocytákra is. A Streptococcus fajok egy másik része véresagaron csupán részleges hemolízist okoz. Az alfa-hemolízis során a telepek alatt és közvetlenül körülöttük a vörösvérsejtekből kioldódó hemoglobin bomlása miatt a táptalaj zöldes színűvé válik. Végül a Streptococcus fajok egy további csoportja véresagaron egyáltalán nem okoz hemolízist. A hemolizáló képesség a fajokon belül törzsenként is változik. Biokémiai sajátságok. Kataláz- és oxidáz-negatívak, szénhidrátbontásuk fermentatív, gázképződés nélkül (4. táblázat). A szénhidrátokból főleg tejsavat termelnek. A pyogen streptococcusok jelentős része amellett, hogy többségük véresagaron hemolízist okoz, különféle extracelluláris enzimeket, így fibrinolizint (streptokinázt), 77

98 Részletes bakteriológia hialuronidázt, különféle nukleázokat és gyenge aktivitású proteázokat is termel, amelyek kórtani szempontból fontosak. 4. táblázat - A fontosabb Streptococcus fajok biokémiai sajátságai Fajok Szerocsoport Béta- hemolí zis Argini n- hidrolí zis Eszkul in- hidrolí zis Hippur át hidrolí zis Voges Proska uer Laktóz Mannit Ribóz Szalici n Szorbit Trehal óz S. agalactiae B k k + k + S. equi subsp. equi S. equi subsp. zooepidemi cus S. equi subsp. equisimilis S. dysgalactiae C + + k + + C + + k + k + + C + + k k + + C k k k + S. uberis (E) nv S. suis D k nv. + nv. + nv S. porcinus E, P, U, V k S. bovis D + nv. + k + k S. canis G k: különböző típusok nv.: nem vizsgált Antigénszerkezet. A sejtfalban levő csoportspecifikus, poliszacharid antigénjeik (hapténjeik) alapján a Streptococcus fajok több (ez ideig legalább 20) csoportba sorolhatók. A csoportokat az ábécé betűivel jelöljük A-tól H-ig és K-tól V-ig. Előfordulnak azonban olyan fajok is, amelyek nem tartalmaznak csoportspecifikus antigént, továbbá olyanok is, amelyeknél a törzsek egy része az egyik, másik része pedig egy másik csoportantigént hordoz. A csoportspecifikus antigének a sejtfalból autoklávozással, enzimes emésztéssel vagy más módon kivonhatók. A Streptococcus nemzetség csoportantigénjeit híg sósavas kivonással elsőként Lancefield állította elő és vizsgálta precipitációs próbában (Lancefield-féle antigének). A csoportspecifikus antigéneken kívül a kórtani szempontból fontos pyogen streptococcusok többsége tartalmaz különféle típusspecifikus, felületi fehérje- és szénhidrátantigéneket is. A S. suis törzsek poliszacharid burokantigénjeik alapján ez ideig legalább 30 szerotípusba sorolhatók. A S. pneumoniae törzsek nem sorolhatók be 78

99 Részletes bakteriológia sejtfalantigénjeik szerint, osztályozásuk a burok poliszacharid antigénjei alapján történik, ez ideig legalább 84 típus ismert. A pyogen streptococcusok burok-, tok- és felületi protein-antigénjei virulenciafaktorként szolgálnak. Ellenálló képesség. A streptococcusok ellenálló képessége nagy. A bőrön, nyálkahártyákon tartósan jelen vannak, kóros anyagokban, porban, levegőben hetekig életképesek maradnak. A gennykeltő streptococcusok 60 C-on percek alatt elpusztulnak. A fertőtlenítőszerekkel szembeni érzékenységük nagyjából megegyezik a Staphylococcus fajokéval. Pathogenitás. A streptococcusok fakultatív pathogenek. Az állatokban és az emberben egyaránt különféle gennyesedéssel járó helyi folyamatokat, ritkábban generalizált fertőzéseket idéznek elő. A háziállatokban leggyakrabban tőgygyulladást, méhgyulladást, ízületgyulladást okoznak, gyakoriak, azonban különösen lovakban, sertésekben, szarvasmarhában és madarakban, a septikaemiával járó streptococcus fertőzések is. A S. pyogenes human pathogen, emberekben heveny vagy idült lefolyású betegségeket (pharyngitist, tonsillitist, erysipelast, impetigót, gennyesedéseket, sepsist stb.) idéz elő. Egyes törzsei a vérerekre ható erythrogen toxint termelnek, amely a skarlát (vörheny) okozója. A S. pyogenes és alkalmanként más Streptococcus fajok az emberben létrehoznak különféle allergiás betegségeket (rheumás lázat, vesegyulladást, szívbelhártya-gyulladást) is. Az állatokban betegséget okozni képes Streptococcus fajok közül több megbetegítheti az embert is, egyebek között a S. agalactiae, a S. equi subsp. zooepidemicus fajokról tudott, hogy emberben septikaemiát okozhatnak. A S. agalactiae, a S. dysgalactiae és a S. uberis tehenekben, ritkábban egyéb állatfajokban tőgygyulladást idéz elő. A S. uberis törzseknek csak egy része tartozik az E csoportba, a többi számos más csoportba sorolható be. A S. equi subsp. zooepidemicus valamennyi háziállatfajban előfordulhat, tőgygyulladást, méhgyulladást, vetélést, ízületgyulladást, tályogképződést, továbbá lovakban, sertésekben, ritkábban egyéb fajokban septicaemiát idéz elő. A S. equi subsp. equi lovakban mirigykórt, ezenkívül gennyesedéssel járó helyi folyamatokat idéz elő. A S. equi subsp. equisimilis lovakban lymphadenitist, metritist, ritkán vetélést okoz, de megtelepedhet emberben és sertésekben is. A S. suis törzsek a sertés tonsilláinak a lakói, septikaemiát, arthritist, tüdőgyulladást, meningoencephalitist idézhetnek elő. A S. porcinus törzsek természetes viszonyok között megtalálhatók a sertés tonsilláiban, a fej nyirokcsomóinak eltályogosodásával járó betegséget okoznak, de izolálható lóból és macskából is. A S. canis törzsek kutyában, macskában lymphadenitist, metritist, puerperalis gennyesedéseket idéznek elő. A felsorolt streptococcusokon kívül számos egyéb, pl. a Lancefield-féle G, L, M, P, U, V és néhány más csoportba tartozó streptococcusok is idézhetnek elő alkalmanként betegséget emberben és állatokban. A S. bovis a szarvasmarha és más kérődzők, továbbá a galambok bélcsatornájának a természetes lakója, de jelen lehet a tejben, tejtermékekben, s időnként kitenyészthető a sertés, a madarak és az ember bélcsatornájából is. Emberben ritkán endocarditist, galambokban viszont jelentős számú elhullással járó septikaemiát idézhet elő. A szájüregben előforduló streptococcusok (S. salivarus, S. sanguis és mások) emberben és állatokban egyaránt megtalálhatók, kitenyészthetők a szájból, nyálból, bélsárból. A szájüreg sérülései során gennyesedést, ritkán emberben endocarditist okoznak. Egyes fajai (S. mutans) szerepet játszanak a fogszuvasodásban. A lactis csoportba tartozó streptococcusok (S. lactis) megtalálhatók a tejben, tejtermékekben, növényzeten, nyers élelmiszerekben. Saprophyták, a tejcukrot elbontják, abból tejsavat termelnek, a tejiparban használják őket más baktériumokkal együtt aludttejek, sajtok stb. előállításához. Az anaerob streptococcusok alkalmanként sebekből, tályogokból, a bélcsatorna vagy a nemiutak sérüléseit követő gennyesedésekből izolálhatók. A S. pneumoniae természetes lakója az ember felső légutainak, alkalmanként azonban megtalálható az állatok légutainak nyálkahártyáján is. Főként humán pathogen, tüdőgyulladást, sinusitist, otitist stb. idéz elő. Az állatok közül borjakban, csikókban bronchopneumoniát, septikaemiát, tehenekben esetenként tőgygyulladást, azonkívül laboratóriumi rágcsálókban (tengerimalacban, egérben stb.) tüdőgyulladást okoz. 79

100 Részletes bakteriológia Laboratóriumi rágcsálókban az állatpathogen Streptococcus fajok egy része (pl. a S. equi subsp. zooepidemicus, a S. equi subsp. equi) többnyire csupán a bőr alatti kötőszövetre és a nyirokcsomókra kiterjedő gennyesedést, esetleg gennyes áttéteket hoz létre, más részük azonban még ilyen elváltozásokat sem okoz. A S. pyogenes és a S. pneumoniae virulens törzsei azonban iv. fertőzve a fehér egereket és a nyulakat néhány nap alatt septikaemiában megölik Enterococcus Az enterococcusokat korábban a streptococcusokhoz soroltuk, így alaki, tenyésztési sajátságaik, továbbá biokémiai tulajdonságaik egy része megegyezik az ott leírtakkal. Az enterococcusok, közülük a S. faecalis, a S. faecium, a S. avium, a S. gallinarum és néhány további újonnan leírt faj a bélcsatorna lakója, emberben és a legkülönfélébb állatfajokban egyaránt megtalálhatók. Az enterococcusok biokémiai sajátságaik alapján jól elkülöníthetők a streptococcusoktól, mert egyaránt jól nőnek 10 C-on és 45 C-on, 9,6-os ph-jú, valamint 6,5% NaCl-t tartalmazó leves táptalajokban, továbbá túlélik a 60 C-on történő 30 perces hevítést. Bontják az eszkulint, ezért eszkulint is tartalmazó táptalajon telepeik feketék. Poliszacharid hapténjeik alapján a Lancefieldféle D csoportba tartoznak. Saprophytáknak tekinthetők, alkalmanként azonban okozhatnak emberben, állatokban egyaránt endocarditist, tályogképződést Anaerob coccusok Az állatok és az ember emésztőcsatornájában, a nemi szervek nyálkahártyáján és másutt fordulnak elő. Alakilag coccusok, Gram-pozitívak, amelyek egyesével helyeződnek el, hosszabb-rövidebb láncokat vagy tetrádokat képeznek, szigorúan anaerobok. Különböző nemzetségekbe tartoznak, egy részük, így pl. a Peptococcus és a Peptostreptococcus fajok, alkalmanként állatokban különféle putrid, gangraenás folyamatokat (méhgyulladást, tüdőgyulladást, ízületgyulladást, tályogképződést stb.) idéznek elő. Más részük a kérődzők bendőjének és a különféle állatfajok vakbelének lakói (Ruminococcus fajok), vagy a bőrön, a gyomorban, bélsárban előforduló saprophyták (Sarcina fajok) Lactobacillus Egyenes vagy kissé hajlott, vékony pálcika alakú, Gram-pozitív, spóra és csilló nélküli, aerob, fakultatív anaerob vagy mikroaerofil baktériumok. Előfordulnak az ember és az állatok szájüregében, az emésztőcsatorna és a hüvely nyálkahártyáján, de megtalálhatók a tejben, a tejtermékekben, a húskészítményekben, különböző növényeken, növényi nedvekben, erjesztett takarmányokban és a szennyvizekben is. Számtalan fajuk ismert, egy részük, pl. a L. acidophilus, L. salivarius, L. plantarum stb., az újszülött állatokban a születés után megtelepedve, más baktériumokkal együtt részt vesz a bélcsatorna természetes baktériumflórájának a kialakításában. Az ide tartozó fajok egy további csoportját, így a L. helveticust, L. delbrückii subsp. bulgaricust, a L. delbrückii subsp. lactist és néhány más fajt a tejiparban különféle aludttejek és sajtok előállítására veszik igénybe. Kórtani jelentőségük nincs, saprophyták Erysipelothrix rhusiopathiae Természetes viszonyok között megtalálható a sertés, szarvasmarha, juh, a házi- és vadon élő madarak emésztőcsatornájában, de előfordul a halakat és a puhatestűeket borító nyálkában, szennyvizekben, tavi iszapban is. Morfológia. Karcsú, enyhén hajlott, 1 3 µm hosszú pálcikák. Az R törzsek hosszú láncokat, fonalakat alkotnak. Csillója nincs, Gram-pozitívan festődnek. Tenyésztés. Aerob, fakultatív anaerob, bár közönséges agaron is nő, tenyésztésére célszerű glükózt és vérsavót tartalmazó agar táptalajt használni. Vérsavós agaron 37 C-on a virulens orbáncbaktériumok apró, harmatcseppszerű, fénylő S-telepeket képeznek (32. ábra). Az avirulens törzsek nagyobb, matt, egyenetlen szélű R-telepeket alkotnak. Az idült elváltozásokból kitenyésztett törzsek gyakran R-típusúak. A virulens orbáncbaktériumok közönséges levesben finom, egyenletes zavarosodást okoznak, az R törzsek viszont csak a leves alján szaporodnak, szemcsés vagy pelyhes üledék formájában. 32. ábra - Erysipelothrix rhusiquthiae telepek neomicint tartalmazó szűrőpapír körül 80

101 Részletes bakteriológia Erősen szennyezett vagy rothadt vizsgálati anyagokból az orbáncbaktérium nátrium-azidot és kristályibolyát vagy neomicint tartalmazó, szelektív táptalajon tenyészthető ki. Biokémiai sajátságok. Kataláz- és oxidáz-negatív, tioszulfát-tartalmú táptalajban H 2S-t képez. Gázképzés nélkül bontja a glükózt, a laktózt és a maltózt. A törzsek többsége hialuronidáz enzimet termel. Antigénszerkezet. A virulens orbáncbaktériumok tartalmaznak a fajra jellemző, a törzsek többségében meglevő, a baktériumok felületéről leoldható, kétféle hőlabilis fehérjeantigént, amellyel szemben védő ellenanyagok termelhetők. Szerológiai osztályozásuk azonban a sejtfalukban található, hőstabil, típusspecifikus poliszacharid-antigének alapján történik. Ez utóbbiak alapján, precipitációs próbával, a törzsek ez ideig 26 szerotípusba sorolhatók. Egyes szerotípusokon belül alcsoportok különíthetők el. A törzsek szerotípusát arab számokkal jelöljük. A sertés tonsilláiból izoláltak 7-es szerotípusba tartozó, egyébként sertésre és csirkére nézve avirulens, olyan sertésorbánctörzseket, amelyek a szokásos biokémiai próbákban nem, de DNS-hibridizációjuk alapján jelentősen különböztek a többi szerotípustól. E törzseket újabban önálló fajnak tekintik és E. tonsillarum névvel jelölik. Ellenálló képesség. Az orbáncbaktériumok ellenálló képessége viszonylag nagy. A talajban, fertőzött tavak vizében, iszapjában, rothadó hullákban, vágóhídi hulladékokban hónapokig életben maradnak. Sótűrő, húsokban a sózás, pácolás, füstölés sem pusztítja el, hő hatására azonban 60 C-on perceken belül elpusztul. A szokásos fertőtlenítőszerek ugyancsak perceken belül elölik. Pathogenitás. Fakultatív pathogen baktérium, leggyakrabban a sertést betegíti meg, de előfordulnak tömeges megbetegedések juhokban, házi- és vadon élő madarakban (főleg liba-, kacsa- és pulykaállományokban) is. Sertésállományainkban a septikaemiás esetek túlnyomó többségét az 1a, kivételesen egyéb szerotípusú, az idülten lezajló kórképeket pedig főleg a 2a szerotípusú törzsek idézik elő. Az egyéb szerotípusok, bár előfordulhatnak sertésekben is, főleg talajból, madarakból, halak felületéről izolálhatók. A sertésorbánc megelőzésére inaktivált, a 2-es vagy az 1-es és 2-es szerotípust egyaránt tartalmazó alumínium-hidroxid gélhez adszorbeált vakcinák vannak forgalomban. A hetes szerotípusba tartozó (E. tonsillarum) törzseket utóbb kutya endocarditis esetekből is izoláltak. 81

102 Részletes bakteriológia A sertések virulens orbáncbaktériumokkal per os csak ritkán betegíthetők meg, ugyanígy bizonytalan a parenterális fertőzés eredménye is. A természetessel egyező kórkép alakul azonban ki, ha a sertéseket skarifikálással bőrbe fertőzzük (Fortner-féle eljárás). Kis mennyiségű virulens orbáncbaktériumot parenterálisan egerekbe, nyulakba vagy galambokba fecskendezve a kísérleti állatok 2 5 nap alatt septikaemiában elpusztulnak. Boncoláskor lépduzzanat s testszerte vérzések láthatók. A lépből a baktériumok mikroszkópos vizsgálattal és tenyésztéssel egyaránt kimutathatók Listeria A listeriák rövid, pálcika alakú, csillós Gram-pozitív baktériumok. A nemzetségbe tartozó fajok közül kórtani szempontból a L. monocytogenesnek van jelentősége, esetenként azonban a L. ivanovii is okozhat betegséget háziállatokban Listeria monocytogenes Megtalálható a talajban, a természetes vizekben, a szennyvizekben, a növényzeten, földdel szennyezett, romlott szilázsokban, az egészséges emberek és állatok (szarvasmarha, juh, madarak stb.) bélcsatornájában, különféle élelmiszerekben, így pl. sertéshúsból készült nyers kolbászokban, nyers baromfihúsban, tejben. Valószínű, hogy fő tartózkodási helye a talaj, s földdel szennyezett élelmiszerekkel, takarmányokkal kerül az emberbe és az állatokba. Morfológia. Az orbáncbaktériumnál valamivel vaskosabb, 1 2 µm hosszú, pálcika (33. ábra), C -on tenyésztve csillós, jellegzetes bukfencező mozgást végez. 33. ábra - Listeria monocytogenes agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Tenyésztés. Aerob, fakultatív anaerob. Hőmérsékleti optimuma 37 C, de képes szaporodni 4 42 C között. Közönséges agaron apró, kerek, kékesfehér fényű telepeket képez. Virulens törzseinek telepeit juh-, szarvasmarha- vagy lóvért tartalmazó agaron keskeny, béta-hemolitikus udvar övezi. Az elváltozott szövetekből a listeriák kitenyésztését elősegíti, ha a vizsgálati anyagot finom szuszpenzióvá dörzsöljük szét, leves táptalajba tesszük, s több hétig 4 C-on tárolva időnként szilárd táptalajra oltunk belőle. A 4 C-on való tartás közben a listeriák kellően elszaporodnak. Erősen szennyezett anyagokból (szennyvízből, bélsárból, földből, szennyezett 82

103 Részletes bakteriológia váladékokból stb.) a listeriák szarvasmarha-vérsavót, tripaflavint és nalidixsavattartalmazó szelektív táptalajon izolálhatók. A közönséges levest egyenletesen megzavarosítja. Biokémiai sajátságok. Kataláz-pozitív, az eszkulint hidrolizálja, az arginint viszont nem, glükózból, maltózból, szalicinból és ramnózból savat képez, a mannitot és a xilózt azonban nem bontja. Kórokozó képessége a törzsek hemolizáló és lipolítikus sajátságával, továbbá a sejtfalban található, monocytosist okozó faktor, valamint a sejtfal lipoid anyagainak toxikus sajátságával áll kapcsolatban. A hemolízist kis molekulatömegű fehérje idézi elő. Antigénszerkezet. A listeriák a sejtfalban található poliszacharid és a csillókban levő fehérjeantigénjeik alapján, faji besorolásuktól függetlenül, agglutinációs próbával 16 szerotípusba (szerovariánsba) sorolhatók. Mind a sejtfal, mind pedig a csillóantigének több komponensből állnak (antigénmozaik), s az egyes antigénkomponensek a különböző szerotípusokban egymással variálódva fordulnak elő. A listeriosisban elhullott állatokból izolált L. monocytogenes törzsek többsége nálunk az 1/2-es, kisebb része pedig a 4-es szerotípusba tartozik. Az egyes szerotípusokon belül a törzsek fágtípusuk szerint tovább osztályozhatók. Ellenálló képesség. A talajban, szennyvizekben hónapokig életképes marad, sőt el is szaporodik. 60 C feletti hőmérsékleten és fertőtlenítőszerek hatására azonban perceken belül elpusztul. Pathogenitás. Fakultatív pathogen, fogékony iránta az ember, az összes házi- és vadon élő emlős és a madarak is. Főleg a fiatal állatokat, közülük is elsősorban a juhot, a szarvasmarhát, a nyulat, a csincsillát, alkalmanként azonban az egyéb prémesállatokat és a baromfifajokat is megbetegíti. A L. monocytogenes foetopathogen, szarvasmarhákban, juhokban, kecskékben, nyulakban és alkalmanként terhes asszonyokban is magzatkárosodást, vetélést okoz. Virulens tenyészet, tengerimalac vagy fiatal nyúl kötőhártyájára cseppentve, óra alatt gennyes szaru- és kötőhártya-gyulladást idéz elő (Anton-féle teszt). Egérben, tengerimalacban septikaemiát, vemhesekben vetélést idézhet elő. A házinyulakban nagyobb mennyiségű tenyészet iv. befecskendezése után myeloid típusú leukocytosis (monocytosis) fejlődik ki, az elhullott állatok májában, lépében, szívizomzatában apró elhalásos gócok láthatók Listeria ivanovii A L. ivanovii törzsek juh- vagy lóvért tartalmazó véresagaron tenyésztve széles, rendszerint kétszeres, háromszoros hemolitikus udvart hoznak létre. Biokémiai tulajdonságaik többsége megegyezik a L. monocytogenesével, megkülönböztethetők azonban tőle azáltal, hogy a Staphylococcus aureusszal végzett CAMP-próbában negatívak, viszont elbontják a xilózt, de nem a mannitot és a ramnózt. A L. ivanovii törzsek az 5-ös szerotípusba tartoznak. A L. ivonovii juhokban, kecskében, ritkábban tehenekben okoz vetélést, megbetegítheti azonban az embert is. Fehér egerekre nézve pathogen Renibacterium Gram-pozitív, 1 1,5 µm hosszú, gyakran párosával álló vagy rövid láncokat formáló baktérium, csillói nincsenek. Aerob, ciszteint és vérsavót vagy vért tartalmazó agartáptalajokon tenyészthető. Lassan szaporodik, legjobban C között, 37 C-on azonban nem. A beoltott táptalajokat tartalmazó edényt a táptalajok kiszáradásának a megelőzése érdekében légmentesen le kell zárni. A telepek aprók, sárgásfehérek. A primer izolálás során 3 5 hét, a táptalajhoz már hozzászoktatott törzsek egy hét alatt fejlődnek ki. Kataláz-pozitív, oxidáz-negatív, a cukrokat nem bontja. A nemzetségbe tartozó egyetlen faj, a Renibacterium salmoninarum, obligát, intracellularisan szaporodó, halpathogen baktérium. Tenyésztett lazacfélékben (különféle lazac- és pisztrángfajokban) okoz főleg a vesékben (innen ered a neve), de más szervekben is elhalással, tályogképződéssel járó betegséget. Nálunk ez ideig a betegséget nem észlelték Corynebacterium 83

104 Részletes bakteriológia A Corynebacterium nemzetségbe tartozó fajok egyenes vagy kissé hajlott pálcika alakú, Gram-pozitív baktériumok. Megtalálhatók az ember és a különféle állatok nyálkahártyáin, valamint a bőrön. A korábban ide sorolt fajok egy jelentős részéről kiderült, hogy valójában nem tekinthetők corynebacteriumoknak, ezeket a fajokat manapság a Rhodococcus, Actinomyces, az Eubacterium és néhány egyéb nemzetségbe soroljuk. Morfológia. A corynebacteriumokat alakilag a nagyfokú polimorfizmus jellemzi. A mikroszkópos képben rövid coccoid formák, hajlott pálcikák és megnyúlt fonalszerű alakok egyaránt láthatók. A pálcikák egyik vagy mindkét vége rendszerint duzzadt, emiatt a baktériumok gyakran bunkó vagy körte alakúak (coryne = bunkó). Spórát nem képeznek, csilló nélküliek. Egyenetlenül festődnek, idősebb tenyészetekben az alakok egy része Gram-negatív lehet, a cytoplasmában egy vagy több metakrómás szemcse található. E szemcsék miatt a hosszabb baktériumalakok gyakran coccusokból álló láncoknak tűnnek. Tenyésztés. Aerob, fakultatív anaerob baktériumok, többségük közönséges agaron is elszaporodik, de sokkal jobban növekednek vérsavót vagy vért tartalmazó táptalajokon. Egyes fajok növekedését a táptalajhoz kevert kevés detergens (pl. Tween 80) elősegíti. Biokémiai sajátságok. Kataláz-pozitívak, oxidáz-negatívak, szénhidrátbontásuk fermentatív. A Corynebacterium nemzetségbe tartozó fajokközül a C. diphtheriae az ember diphtheriájának az okozója. A garatban, gégében szaporodik el, pathogen törzsei erősen mérgező exotoxint termelnek. Állatorvosi szempontból jelentősége nincs. Az állatokban előforduló Corynebacterium fajok mindegyike fakultatív pathogen, közülük az alábbiak fontosak Corynebacterium pseudotuberculosis Hajlott, 1 3 µm hosszú, bunkós végű, egyenetlenül festődő pálcikák, felületükön fimbriák találhatók. Közönséges agaron, 37 C-on 48 óra múlva apró, kerek, fehér telepeket képez, amelyek néhány nap múlva megnagyobbodnak, sárgás színűekké válnak. Véresagaron a törzsek többsége béta-hemolízist okoz. Leves táptalajban elszaporodva a kémcső alján szemcsés üledék, a felületen pedig vékony hártya képződik. Glükózból, maltózból és néhány más szénhidrátból savat termel, ureáz- és metilvörös-pozitív, a kazeint nem bontja, a lovakból származó törzsek a nitrátot nitritté redukálják, míg a juhokból és kecskékből származó törzsek nem. Virulens törzsei hőlabilis exotoxint termelnek. A toxin Da molekulatömegű extracelluláris enzim, foszfolipáz-d, amely a sejthártya lipoprotein-komponenseit teszi tönkre. A toxikus törzsek levestenyészeteinek szűrletével bőr alá oltott tengerimalacok 1 2 nap alatt toxaemiában elhullanak. A beoltás helyén savós, gyakran véres beivódás keletkezik, az elhullott állatokban testszerte oedema és vérzések láthatók. Nagyjából hasonló kép fejlődik ki a toxin hatására juhokban is. A virulencia másik fontos tényezője a sejtfal toxikus lipidrétege, ez az oka a tályogképződésnek és ez teszi lehetővé a macrophagokban való túlélést. A C. pseudotuberculosis juhokban, kecskékben, elsajtosodással járó nyirokcsomó-gyulladást (pseudotuberculosist), lovakban fekélyes nyirokérgyulladást, a mellkas és a has bőr alatti kötőszövetében tályogosodást okoz, de a nyirokcsomók és a nyirokerek gyulladásával, beolvadásával járó idült folyamatokat előidézhet szarvasmarhában és szórványosan más állatfajokban is. A kísérleti állatok közül a hasüregbe fertőzött hím tengerimalacban hashártyagyulladás és fibrines gennyes heregyulladás alakul ki. Juhok parenterálisan fertőzve lesoványodnak, a tüdőben és másutt sajtos, elhalásos gócok keletkeznek. Bőrsérüléseken át fertőződött emberekben a testtájéki nyirokcsomók gennyes gyulladását idézi elő Corynebacterium renale Enyhén hajlott, 1 3 µm hosszú pálcikák, felületükön kis számban fimbriák találhatók. Közönséges agaron 2 3 nap alatt apró, krémszínű telepeket alkot, levesben szaporodva pedig a táptalaj felületén hártyát vagy finom porszerű üledéket képez. Glükózból és néhány más szénhidrátból savat termel, ureáz-pozitív, elbontja a kazeint, a metilvörös próbában negatív. A C. renale szarvasmarhában, de ritkán sertésben és lóban is gennyes hólyag- és vesemedence-gyulladást okoz. Levestenyészetét iv. kísérleti egerekbe vagy nyulakba fecskendezve bennük elhulláshoz vezető vesemedencegyulladás alakul ki Egyéb Corynebacterium fajok Az eddig felsoroltakon kívül még sok más Corynebacterium faj ismert. Közülük a C. pilosum és a C. cystitidis (korábban a C. renale II-es és III-as biotípusai) szarvasmarhában szórványosan húgyhólyag- és vesemedence- 84

105 Részletes bakteriológia gyulladást, kosokban, valamint kecskebakokban pedig tasakgyulladást okoz. A C. kutscheri (C. murium) egerekben, patkányokban, pockokban okoz elhalással, tályogképződéssel járó pneumoniát. A C. bovis saprophytaként a tehenek tőgyén és a tejben fordul elő, alkalmanként azonban tőgygyulladásokból és vetélt magzatokból is izolálható. A korábban a Corynebacterium nemzetségbe sorolt fajok közül a C. pyogenestmanapság Actinomyces pyogenesnek, a C. suist Actinomyces suisnak, a C. equitpedig Rhodococcus equinek nevezzük Actinomyces Az Actinomyces fajok az ember és a különféle állatfajok nyálkahártyáinak, főleg a száj- és garatüregnek a lakói. Hosszú, elágazódó fonalakat képező, Gram-pozitív baktériumok, a fonalak gyakran pálcika vagy egészen rövid coccoid alakokra töredeznek szét. A kóros váladékokban egyes fajok hosszú, duzzadt végű fonalai, jellegzetes sugár alakú csoportokba rendeződve láthatók, innen származik a nemzetség elnevezése (actinomyces = sugárgomba). Csillót, spórát nem képeznek, aerob, mikroaerofil és anaerob fajok egyaránt tartoznak ide. A nemzetségbe tartozó fajok közül az A. israelii az ember actinomycosisának az okozója. Az A. viscosum, az A. odontolyticus és néhány más faj, egyebek mellett a fogszuvasodásban, periodontitis kialakításában játszik szerepet. Az A. viscosum időnként megbetegíti a kutyát is. Állatorvosi szempontból az alábbi fajok fontosak Actinomyces bovis Megtalálható a szarvasmarha és az egyéb növényevők száj- és garatüregében és bélcsatornájában. Morfológia. Kissé hajlott, 3 4 µm hosszú, bunkós végű pálcikák. A kórosan elváltozott szövetekben hosszú, egyenetlen, elágazódó fonalak vagy ún. tőkék formájában láthatók. Ez utóbbiak egészen gombostűfej nagyságú, némelykor szabad szemmel is látható, szürkéssárga csomócskák, amelyek általában puhák, ha azonban mészsók rakódtak le bennük, kemények is lehetnek. A tőkék középső része sugár alakban rendeződött Gram-pozitív, elágazódó fonalakból áll, széli részükön a fonalak végei körteszerűen duzzadtak. Ez utóbbiak Gram-negatívak, jól megfesthetők azonban savanyú festékekkel, pl. eozinnal. Tenyésztés. Véresagaron, anaerob viszonyok között, 37 C-on viszonylag könnyen tenyészthető. Az elváltozások mélyéből vett vizsgálati anyagot felkenés előtt finoman dörzsöljük szét. A tenyészet rendszerint 2 4 nap alatt ered meg. Véresagaron 2 3 mm átmérőjű, fehér, szemcsés telepeket képez, amelyeket némelykor keskeny vérsejtoldódásos udvar vesz körül. A telepek erősen tapadnak a táptalajhoz. Primer tenyészetben a baktériumok fonalas szerkezetűek, többször átoltott tenyészetekben viszont hajlott, duzzadt végű pálcikák, igen hasonlítanak a corynebacteriumokhoz. Vérsavótartalmú levesben szemcsés üledéket képez, olykor azonban egyenletes zavarosodást okoz. Biokémiai sajátságok. Kataláz-negatív, glükózból, fruktózból, laktózból, maltózból, szacharózból savat képez, de az arabinózt és a raffinózt nem bontja. A glükózbontás során acetoin is képződik. Tioszulfátból kénhidrogént képez, a keményítőt hidrolizálja, a nitrátot nem redukálja. Pathogenitás. Szarvasmarhában, ritkán más állatfajokban az állcsontokban, a nyelvben, a fej és a nyak lágy részeiben, ritkábban egyéb helyeken okoz idült gyulladással és a szövetek beolvadásával járó kórfolyamatokat (sugárgomba-betegség, actinomycosis). Betegség csak akkor alakul ki, ha a baktériumoknak módjuk van sérüléseken át a szövetek közé jutni és ott anaerob viszonyok között elszaporodni Actinomyces suis Az A. suis elnevezése és rendszertani helye (korábban Corynebacterium suis, majd Eubacterium suis) máig bizonytalan. Korábban az Actinomyces bovis egyik biokémiai variánsának tartották. Különbözik tőle abban, hogy aerob viszonyok között is szaporodik, a nitrátot nitritté redukálja, a szénhidrátok közül pedig elbontja a trehalózt. Fakultatív pathogen, gyakran izolálható klinikailag egészséges sertéskanok vizeletéből. Sertésekben, főleg a tőgyben, a szarvasmarha actinomycosisához hasonló idült elváltozásokat okoz, de előidézhet emellett gennyes hólyag- és vesemedence-gyulladást, továbbá alkalmanként vetélést is Actinomyces pyogenes Egyenes vagy kissé hajlott 0,5 2 µm hosszú pálcikák (34. ábra). Aerob, közönséges agaron és levesben nem fejlődik, tenyésztéséhez natív fehérjét igényel. Véres agaron, 37 C-on, levegő jelenlétében 1 2 nap alatt apró, tűszúrásnyi telepeket képez, a telepek körül béta-hemolízis látható. Alvasztott vérsavón és tojástartalmú táptalajon tenyésztve 2 3 nap alatt pontszerű szürke telepeket alkot, miközben a táptalaj a telepek alatt és körül 85

106 Részletes bakteriológia a törzsek fehérjebontó képessége következtében elfolyósodik. Jól szaporodik a tejben is, a tejet megalvasztja, az alvadékot pedig elfolyósítja. Egyes törzsei a vörösvérsejtek feloldódását és a szövetek elhalását előidéző exotoxint termelnek. A toxin D molekulatömegű, valószínűleg fehérje, vele szemben nyúlban immunsavó termelhető. 34. ábra - Actinomyces pyogenes véresagarról (Gram-festés, 1250 ) Biokémiai tulajdonságok. Kataláz-negatív, a zselatint, kazeint és az alvasztott vérsavót elfolyósítja, nitrát- és ureáz-negatív, a glükózból, laktózból és számos más szénhidrátból savat termel. Ellenálló képessége nem nagy, beszáradt váladékokban ugyan hetekig életképes marad, C-on azonban perceken belül elpusztul. A klórlúg és a formalin 3%-os, valamint a szerves jódot tartalmazó szerek 0,5%-os oldata perceken belül elpusztítja. Pathogenitás. Az A. pyogenes a különféle állatfajok nyálkahártyáinak a természetes lakója, sertésben, szarvasmarhában, juhban, kecskében gennyesedéssel járó helyi folyamatokat (sebfertőzést, csülökbántalmakat, ízületgyulladást, köldökgyulladást, méhgyulladást, mellékhere- és heregyulladást stb.), gennyes, elhalásos, tályogképződéssel járó tüdőgyulladást, tőgygyulladást, esetenként septikaemiát, a magzatokba jutva pedig vetélést idéz elő. Alkalmanként azonban izolálható lovak, baromfi, ritkábban más állatfajok tályogosodással járó folyamataiból is. Ritkán ugyan, de megbetegítheti az embert is. A kísérleti állatok közül tengerimalacban és egérben a tenyészetnek a bőr alá oltásával legfeljebb helyi gennyesedés hozható létre. Nyulak az iv. fertőzés következtében rendszerint elhullanak vagy néhány hét alatt lesoványodnak és különböző szerveikben tályogok képződnek Mycobacterium Pálcika alakú, sav- és alkoholálló baktériumok. Idősebb tenyészeteikben néha hosszú, esetenként elágazó, a gombához hasonló fonalak képződnek, innen ered a nemzetség elnevezése. A Mycobacterium nemzetségbe tartozó nagyszámú faj között találhatók pathogenek, közöttük az ember és a különféle állatfajok gümőkórjának előidézői, így a M. tuberculosis, a M. africanum, a M. bovis, a M. microti és a M. avium, valamint a M. 86

107 Részletes bakteriológia paratuberculosis továbbá a M. lepraemurium és a M. leprae, míg az ide tartozó további fajok fakultatív pathogenek vagy saprophyták. A kórokozó fajok természetes viszonyok között csupán a fertőzött szervezetben szaporodnak. A saprophyta és a fakultatív pathogen fajok többsége azonban a külvilágban is széles körben elterjedt, megtalálhatók a talajban, a természetes vizekben, a növényzeten (pl. savanyú füveken, fűrészporban), a tejben, az állatok bőrén és bélsarában stb. Morfológia. Egyenes vagy kissé hajlott, 1,5 4 µm hosszú, 0,3 0,6 µm széles, csilló nélküli pálcikák. A M. tuberculosis általában hosszabb és karcsúbb, finoman hajlott, gyakran szakaszosan festődő, míg a M. bovis rövidebb, vaskosabb, inkább egyenes pálcikák formájában látható, többnyire egyneműen festődik (35. ábra). A M. aviumot a polimorfizmus jellemzi. Hol egészen rövid coccoid, hol pedig hosszú pálcika alakot ölt. A M. paratuberculosis rövid, rendszerint egyneműen festődő pálcika. A saprophyták a pathogenekhez viszonyítva rövidebbek és jóval vaskosabbak. 35. ábra - Mycobacterium bovis szarvasmarha nyirokcsomóban (Ziehl Neelsen-festés, 1250 ) 87

108 Részletes bakteriológia A szövetekből készített kenetekben a pathogen Mycobacterium fajok egyesével vagy szabálytalan halmazokban, gyakran macrophagokban phagocytáltan láthatók. A fészekszerű, halmazokba való elrendeződés különösen 88

109 Részletes bakteriológia jellemző a M. paratuberculosisra. A szövet közé jutott mycobacteriumok alkalmanként degenerálódnak, elvesztik sav- és alkoholállóságukat, s a pálcikák alakját utánzó, gyöngyfüzérhez hasonló elrendeződésű vagy esetenként elszórtan szabadon található, Gram-pozitív rögöcskék formájában láthatók. Levestenyészetből festve a M. bovis és a M. paratuberculosis, de néha más Mycobacterium fajok is szorosan egymáshoz tapadó baktériumokból álló kötegek (cord) formájában láthatók. A cordképződést kapcsolatban áll a törzsek virulenciájával. Festődés. Sav- és alkoholállók, Ziehl Neelsen szerint festhetők. Sav- és alkoholállóságukat a sejtfalban, különösen annak külső, fonalas szerkezetű rétegében található különféle lipoidoknak (mikolsavtartalmú glükolipideknek) és viaszoknak köszönhetik. A mikolsavszintézis gátlása pl. izonikotinsav-hidraziddal a gümőbaktériumok sav- és alkoholállóságát felfüggeszti. Az egyes Mycobacterium fajok sav- és alkoholállóságában lényeges különbségek vannak. Az erősen sav- és alkoholálló (pathogen) fajok Ziehl Neelsen szerint festve rubinpirosak, a saprophyták azonban az alkoholos kezelés hatására a festék egy részét leadják, ezért halványpirosak vagy rózsaszínűek. A Mycobacterium fajok szövetekben, váladékokban való kimutatására fluoreszcens festést is alkalmazhatunk. Az auraminnal kezelt kenetekben levő mycobacteriumok sárgászöld színben fluoreszkálnak. A fluoreszcens festés megkönnyíti a mycobacteriumoknak a vizsgálati anyagokban való felismerését. Tenyésztés. Obligát aerobok, a pathogenek számára a tenyésztés optimális hőmérséklete C. Táplálóanyag-szükségletük tekintetében nem igényesek. Szénforrásként különféle egyszerű vegyületek (piroszőlősav, egyszerű cukrok, glicerin, citrát stb.) szolgálnak, nitrogénszükségletüket pedig aminosavakon (pl. glutaminsavon, aszparaginsavon) kívül nitrátokból, sőt ammóniából is fedezni tudják. Tenyésztésükre a szilárd táptalajok közül a tojástartalmúakat (Dorset-, Petragnani-, Löwenstein Jensen-féle stb.) használjuk leggyakrabban. Elszaporíthatók azonban glükózzal dúsított alvasztott vérsavón, albumintartalmú agaron, sőt glicerines burgonya felületén is. A glicerin általában elősegíti a gümőbaktériumok szaporodását, a M. bovisfejlődését azonban gátolja. A tojás táptalajok egy része malachitzöldet is tartalmaz. A malachitzöld szelektívvé teszi a táptalajt, gátolja a mycobacteriumoknál gyorsabb növekedésű más baktériumfajok szaporodását. A folyékony táptalajok közül a mycobacteriumok tenyésztésére a szintetikus vagy félszintetikus leves táptalajokat (Henley-, Souton-, Sula-, Dubos-féle) használjuk. A mycobacteriumok színtenyészetben való izolálását elősegíti sav- és alkoholálló képességük. Az elváltozott szövetekből vett mintát szétdörzsölve kb. ötszörös mennyiségű, 6 térfogatszázalékos kénsavval (vagy NaOHdal) kezeljük percig. Centrifugálás, majd az üledék semlegesítése után a felkent anyagból rendszerint csak a sav- és alkoholálló mycobacteriumok tenyésznek ki. Szilárd táptalajokon az állati testből frissen kitenyésztett Mycobacterium fajok növekedése és telepmorfológiája között jellegzetes különbségek állapíthatók meg (36. ábra). A M. tuberculosis 3 6 hét alatt domború, száraz, szemecskés, karfiolra vagy kenyérmorzsára emlékeztető telepeket képez. A M. bovis telepei 4 8 hét alatt jelennek meg, nedvesen fénylenek, laposak, szürkésfehérek, idősebb tenyészetekben világossárgák. A M. avium telepei már az első hét vége felé felismerhetők nedves, fénylő kolóniák formájában, amelyek elég hamar sárga, kenőcsös bevonattá folyhatnak össze. A M. avium, szemben az emlősökben betegséget okozó fajokkal, jól szaporodik C-on is. 36. ábra - Mycobacterium bovis, M. tuberculosis és M. avium telepei Petragnani-féle tojás táptalajon 89

110 Részletes bakteriológia A szintetikus vagy félszintetikus leves táptalajokon a M. tuberculosis az egész leves felületét ellepő, sőt az edény falára is felkapaszkodó, vaskos, ráncos hártya formájában szaporodik (eugonikus növekedés). A M. bovis a leves felületét rendszerint nem lepi el teljesen, hanem málnaszemszerűen dudorzatos szigetek formájában szaporodik (dysgonikus növekedés). A M. avium szintetikus levesek felületén egyenletesen elterülő, finom, alig ráncolt hártyát, a tenyésztőedény alján pedig szemecskés üledéket képez. A gümőbaktériumok tenyésztésbeli sajátságai csak primer kultúrában jellegzetesek. Továbbtenyésztésük során a fajok közötti különbségek rendszerint elmosódnak. A Mycobacterium fajok szaporodása meggyorsítható, ha a tenyésztésükre szolgáló táptalajba bovin albumint és Tween-80-at teszünk. A Tween-80 (olajsav szorbittal alkotott észtere) felületaktív hatásánál fogva elősegíti a 90

111 Részletes bakteriológia hidrofób mycobacteriumok diszpergálódását. Az ilyen folyékony táptalajokban a M. tuberculosis és a M. bovis 4 8 nap, a M. avium pedig már 1 2 nap múlva is egyenletes zavarosodást okoz. A M. paratuberculosis csak olyan szilárd táptalajokon izolálható és tenyészthető, amelyek mycobacteriumokból (rendszerint M. phleiből) származó kivonatot (mycobactint) is tartalmaznak. Az ilyen táptalajokon, 37 C-on a M. paratuberculosis telepek legkorábban 6 8 hét elteltével válnak láthatóvá. Első izoláláskor a telepek aprók, szürkésfehérek, felületük sima, fénylő, többszöri átoltás után azonban már 2 3 hét elteltével nagy tömegben fejlődnek. Folyékony táptalajokhoz nehezen szoktatható hozzá. Mycobacteriumokból származó kivonatanyagokkal kiegészített félszintetikus leves táptalajok felületén finom, vékony hártyát képez. A fakultatív pathogen és saprophyta mycobacteriumok többsége, szemben a pathogen fajokkal, jól szaporodik szobahőmérsékleten is, tenyésztési idejük általában 1 3 hét, de vannak közöttük gyorsan szaporodó fajok is. Ez utóbbiak tojás táptalajokon, de közönséges agaron is 7 napon belül elszaporodnak. Egyes fajaik sárga, rózsaszín vagy vörös, karotinoid pigmenteket termelnek. A M. lepraemurium és a M. leprae fajokat eddig hagyományos táptalajokon nem sikerült tenyészteni. Biokémiai sajátságok. A mycobacteriumok faj szerinti meghatározásához a különböző hőmérsékleteken (25 45 C) való szaporodás, a telepek kifejlődésének ideje, a telepmorfológia, a pigmentképzés, a sav- és alkoholállóság, különböző kémiai anyagokkal (pl. hidroxil-aminnal, nitrobenzoesavval) szembeni rezisztencia vizsgálata mellett számos biokémiai próbát veszünk igénybe. Ez utóbbiak közül fontos, egyebek mellett, a nitrátredukció, a kataláz, ureáz, savanyú foszfatáz, arilszulfatáz, pirazinamidáz, béta-galaktozidáz enzimek kimutatása, a niacin-termelés, a Tween-80-hidrolízis és a különféle szénamidok (acetamid, izonikotinamid, benzamid stb.) bontásának a vizsgálata. A M. bovis törzsek megkülönböztethetők a M. tuberculosis törzsektől egyebek mellett azáltal, hogy az előbbiek a nitrátot nem redukálják, pirazin-amidáz enzimet és niacint nem termelnek, míg az utóbbiak a nitrátot redukálják, pirazin-amidáz enzimet és niacint termelnek. A M. avium törzsek az előbbi próbák közül csak a pirazin-amidáz-próbában pozitívak. Antigénszerkezet. A mycobacteriumok sejtfalában és a sejttestben is számos antigénhatású anyag található. A sejtfal antigénhatású anyagainak többsége glükolipid (a peptidoglükán vázhoz és a hosszú szénláncú mikolsavakhoz kapcsolódó arabinóz-galaktóz, arabinóz-mannóz stb. komplexek), kisebb része lipoprotein (szabad zsírsavakhoz, mikolsavakhoz, viaszokhoz stb. kapcsolódó polipeptidek, kis molekulatömegű fehérjék). A mycobacteriumok szoros antigénszerkezeti rokonságban állnak egymással. Immun-elektroforézises módszerekkel a M. tuberculosis kivonatában legalább 60, a M. bovis BCG-törzsében 48, a M. paratuberculosiséban pedig 44 antigénkomponens volt kimutatható. A M. bovis antigénszerkezetileg szorosan rokon a M. tuberculosisszal, attól csak nagyon érzékeny módszerekkel különböztethető meg. A M. paratuberculosisban talált antigének közül 24 kimutatható volt a M. bovis BCG-törzsében, 27 pedig a M. avium törzsekben is. A M. bovis antigénkomponensei közül 11 megtalálható volt a fakultatív pathogen M. scrofulaceumban, 5 pedig a saprophyta M. phleiben is. A M. avium és néhány más fakultatív pathogen Mycobacterium faj felületi antigénjeik alapján agglutinációs próbával szerocsoportokba sorolhatók. A szintetikus leves táptalajokban elszaporított Mycobacterium tenyészetek felfőzött szűrletéből állítják elő a tuberkulint, amely a mycobacteriumok különböző antigénjeit (hapténjeit) tartalmazza. A nyers tuberkulin triklórecetsavas, acetonos és éteres tisztításával nyerjük a PPD-tuberkulint (purified protein derivate). A PPD antigenitásáért a benne lévő alacsony molekulatömegű peptidek (tuberkulo-proteinek) felelősek. A humán, a bovin, az avian tuberkulin és a paratuberkulin a megfelelő Mycobacterium faj tenyészetéből készül. A mycobacteriumok osztályozása. A Mycobacterium nemzetségen belül jelenleg mintegy 80 fajt különböztetünk meg. Ezeknek egy része kórokozó, többségük pedig fakultatív pathogen vagy saprophyta. Kórokozó mycobacteriumok. Ide tartozik a M. tuberculosis, a M. africanum, a M. bovis, a M. microti, a M. avium, a M. paratuberculosis, a M. lepraemurium és a M. leprae. A M. aviumot human szempontból a fakultatív pathogenek közé sorolják. Újabban a M. aviumot, a M. paratuberculosist és egy M. silvaticumnak nevezett, örvös galambból izolált törzset egy fajnak tekintik és a M. aviumon belül, három alfajként különböztetik meg őket, M. avium subsp. avium, M. avium subsp. paratuberculosis stb. néven. Fakultatív pathogen (atípusos) és saprophyta mycobacteriumok. Pigmenttermelésük és szaporodásuk gyorsasága alapján további négy csoportra oszthatók. 91

112 Részletes bakteriológia I. Fotokromogének (fény jelenlétében pigmenteket termelnek): M. kansasii, M. marinum, M. simiae stb. II. Szkotokromogének (sötétben tenyésztve is termelnek pigmenteket): M. scrofulaceum, M. szulgai, M. farcinogenes, M. gordonae stb. III. Nem pigmenttermelők: M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri stb. IV. Gyorsan növekvők (telepeik 7 napon belül kifejlődnek): M. fortuitum, M. porcinum, M. flavescens, M. phlei, M. vaccae, M. smegmatis stb. Ellenálló képesség. A mycobacteriumok a nem spórás baktériumok között a legellenállóbbak. Nagy ellenálló képességüket a sejtfalban levő lipoidoknak köszönhetik. Beszáradt váladékokban, trágyában hónapokig életképesek maradnak. A tejben és a tejtermékekben ugyancsak hetekig, hónapokig megőrzik fertőzőképességüket. A tejben 80 C-on 20 perc, a forrás hőmérsékletén pedig már néhány perc alatt elpusztulnak. A fertőtlenítőszerek közül a klórlúg és a formalin 3 5%-os oldata 2 3 óra alatt, a szervesjód-tartalmú szerek 0,5 1%-os oldata pedig in vitro perc alatt elöli a mycobacteriumokat. Pathogenitás. A M. tuberculosis az ember gümőkórjának az okozója, megbetegíti azonban a sertést, a kutyát, a macskát, továbbá a szobai díszmadarak közül a kanárimadarat és a papagájt (kakadut) is. Szarvasmarhába jutva rendszerint csak rövid ideig tartó, gyógyulásra hajlamos produktív folyamatokat idéz elő. A M. africanum az ember gümőkórjának előidézésében játszik szerepet Afrikában. A M. bovis a szarvasmarha, más házi- és vadon élő kérődzők, a sertés, a kutya, a macska stb. gümókórjának az okozója. Megbetegíti az embert is. A M. bovis egyik törzsét epetartalmú talajon sorozatosan passzálva állították elő az attenuált BCG (Bacillus Calmette et Guérin) törzset, amely az ember védőoltására szolgál. A M. microti (vole bacilus) a pockok és más rágcsálók gümőkórját idézi elő. Antigénszerkezetileg gyakorlatilag azonos a M. tuberculosisszal. A M. avium a madarakban idéz elő gümőkórt, hosszabb-rövidebb ideig azonban megtelepedhet az emlős háziállatokban is. A M. paratuberculosis szarvasmarhában, ritkábban juhban, kecskében és vadon élő kérődzőkben idéz elő idült, proliferatív bélgyulladást (paratuberculosist). A M. lepaemurium az egér leprájának az előidézője, megbetígíti azonban a macskát is. A M. leprae az ember leprájának az okozója. A fakultatív pathogen mycobacteriumok egy része emberben és háziállatokban a gümókórhoz hasonló elváltozásokat idéz elő (innen ered az atípusos mycobacteriumok vagy nem tuberculosist okozó mycobacteriumok elnevezés), más részük azonban, bár a szövetek között alkalmilag megtelepedhet, gyakorlatilag saprophyta (M. phlei, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale stb.). A fakultatív pathogenek a háziállatok közül főként sertésben és szarvasmarhában idéznek elő rendszerint lokális, a bélre, bélfodorra, ritkábban nyirokcsomókra, szarvasmarhában esetenként a bőrre korlátozódó folyamatokat. A fakultatív pathogenekkel való fertőződés megnehezíti a gümőkór diagnosztizálásához használt allergiás próbák értékelését. Fakultatív pathogen mycobacteriumok idézhetnek elő generalizált gümőkórt állatkertben tartott madarakban is. A fakultatív pathogen mycobacteriumok egyes törzsei (pl. a M. fortuitum, a M. marinum) idézik elő a hidegvérű állatok (hal, béka, kígyó stb.) gümőkórját. A kísérleti állatoltás igénybe vehető a M. tuberculosis, a M. bovis és a M. avium kimutatására a tenyésztési eljárások helyett vagy azokkal párhuzamosan akkor is, ha valamely anyagban a mikroszkópos vizsgálattal nem tudtunk mycobacteriumokat kimutatni. Erre a célra rendszerint tengerimalacot, nyulat és csirkét használunk. A M. tuberculosis bőr alá oltva, 6 12 hét alatt, generalizált gümőkórban elpusztítja a tengerimalacot, de csupán helyi elváltozásokat idéz elő nyúlban, a tyúkot pedig nem betegíti meg. A M. bovis generalizált gümőkórt hoz létre mind a tengerimalacban, mind pedig a nyúlban, de nem betegíti meg a tyúkot. Végül a M. avium csak a tyúkot betegíti meg, a tengerimalacot egyáltalán nem, a nyúlban pedig legfeljebb helyi elváltozásokat idéz elő. A bőr alá vagy izomba fertőzött, fogékony kísérleti állatok megfelelő környéki nyirokcsomói 1 2 hét múlva megduzzadnak, majd 8 10 hét elteltével a kísérleti állatok elhullásakor vagy leölésekor a lépben, a májban és 92

113 Részletes bakteriológia más szervekben gyulladásos, elhalásos gócok, gümők találhatók. Az elhullott kísérleti állatokból a mycobacteriumok mikroszkópos vizsgálattal és tenyésztéssel egyaránt kimutathatók. M. paratuberculosis rágcsálók hasüregébe való befecskendezése után 1 2 hónap múlva a szervekben gyulladásos, elhalásos gócok alakulnak ki. A fakultatív pathogen mycobacteriumok a kísérleti állatokat nem betegítik meg Nocardia Főként a talajban élő, a gombákhoz hasonlóan elágazódó fonalakat képező, Gram-pozitív baktériumok. A fajok egy része a mycobacteriumokhoz hasonlóan a sejtfal mikolsavtartalma miatt saválló festődésű. A hosszú fonalak feltöredezésével szaporodnak. Obligát aerobok, agaron, véresagaron és leves táptalajok felületén 1 3 nap alatt lencsényi vagy nagyobb, bőrszerű, ráncos, szürkéssárga vagy pigmentált telepekben fejlődnek. A pigmenttermelő törzsek telepeinek a színe a világossárgától a vörösön át a barnáig változik, festékanyaguk vízben nem oldódó karotinoid. Kataláz-pozitívak, oxidáz-negatívak, a szénhidrátokat oxidatív módon bontják. A saválló Nocardia törzsek megkülönböztethetők a mycobacteriumoktól azáltal, hogy a nocardiák telepei néhány nap alatt kifejlődnek, a levegőbe és a táptalajba nyúló, elágazódó fonalakat képeznek. A levegőbe fölemelkedő fonalak Ziehl Neelsen szerint festve a savas-alkoholos kivonás során elszíntelenednek. A nocardiák anyagcseréje a mycobacteriumokénál élénkebb, a szénhidrátokat és a szénamidokat gyorsan és szobahőn is bontják, nitrofenol-oxidázt termelnek, de nem bontják a kazeint és nem képeznek arilszulfatázt. A törzsek zöme fakultatív pathogen vagy saprophyta, kórtani jelentősége csak néhány fajnak van Nocardia asteroides Morfológia. Hosszú, elágazódó, egyenetlen festődésű, mérsékelten saválló fonalak. A fonalak gyakran coccoid alakokká töredeznek szét. Tenyésztés. Közönséges és véresagaron 37 C-on, sárga vagy narancsvörös színű, szabálytalan, csillag alakú telepeket képez. Levegőbe fölemelkedő fonalak rendszerint egyáltalán nem vagy legfeljebb a telepek szélén képződnek. Szérumtartalmú leves felületén vékony hártya, alján pedig finom, pelyhes üledék képződik, a levestenyészet nem zavarosodik meg. Biokémiai sajátságok. Ureáz-pozitív, a nitrátokat nitritté redukálja, glükózból és glicerinből savat képez, de nem bontja a maltózt, a mannitot, az inozitot, ezenkívül a zselatint és a kazeint sem. Pathogenitás. Fakultatív pathogen, alkalmanként szarvasmarhában, ritkábban kutyában, macskában okoz idült gennyesedéssel, granulomatosissal járó folyamatokat a bőrben, a bőr alatti kötőszövetben, a tőgyben stb. A laboratóriumi állatok közül egérre nem pathogen, de a nyúlban és a tengerimalacban a fertőzés megered Rhodococcus A rhodococcusok Gram-pozitív, többségükben talajlakó baktériumok, közülük kórtani szempontból a Rhodococcus equi (korábbi nevén Corynebacterium equi) fontos Rhodococcus equi Coccoid, vagy rövid 1 3 µm hosszú pálcikák. Idősebb tenyészeteiben saválló alakok is előfordulnak. Aerob, közönséges agaron is jól szaporodik, óra alatt apró, áttetsző, cseppszerű, nyálkás telepeket alkotnak, amelyek néhány nap múlva megnagyobbodnak, sűrű tenyészetben gyakran össze is folynak, s pigmenttermelésük következtében rózsaszínűek (lazacszínűek). Levesbe oltva egyenletes zavarosodást okoznak. Kataláz-pozitív, a nitrátot redukálja, ureáz-pozitív, a szacharózt és a trehalózt elbontja. Nyálkás, nyúlós burkuk van, amely poliszacharid, ennek alapján agglutinációs próbával ez ideig 7 szerocsoportba sorolhatók. A nálunk csikókból izolált törzsek mindegyike az 1-es szerocsoportba tartozott. Természetes előfordulási helye a talaj, a növényevő állatok trágyája, alkalmanként a ló, szarvasmarha, juh, sertés emésztőcsatornája. Fiatal, 1 4 hónapos csikókban okoz tályogképződéssel járó bronchopneumoniát, 93

114 Részletes bakteriológia ritkábban a bélfal és a bélfodri nyirokcsomók gennyes gyulladását, de megbetegítheti a szarvasmarhát, a sertést és az immunszuppressziónak kitett embert is Dermatophilus congolensis A Dermatophilus nemzetség egyetlen faja. Gram-pozitív, hosszú, elágazódó fonalakat képző baktérium(37. ábra). A fonalak haránt irányban feltöredeznek, ezekből alakulnak ki a több sorban egymás mellett helyeződő coccoid, csillós zoospórák. 37. ábra - Dermatophilus congolensis agartenyészetből. Elágazódó, haránt feltöredezett fonalak (Gram-festés, 1250 ) Tenyésztés. Véresagaron, 10% CO 2-ot is tartalmazó légtérben tenyésztve a telepek a második napon jelennek meg, a 3 4 napos tenyészetekben 2 5 mm átmérőjűek, besüllyednek az agarba, felületük ráncolt, sárgás színűek. A telepek alatt és körül erős béta-hemolízises udvar alakul ki. Biokémiai tulajdonságok. Kataláz-pozitív, ureáz-pozitív, elfolyósítja a zselatint, az alvasztott vérsavót és a kazeint. Glükózból, fruktózból, maltózból savat termel. Ellenálló képesség. A zoospórák ellenálló képessége nagy, a bőrről levált pörkökben, gyapjúban hetekig életképesek maradnak, ezekkel történik a fertőződés. Pathogenitás. A D. congolensis juhokban, szarvasmarhában és számos más állatfajban savós, pörkképződéssel járó idült bőrgyulladást okoz. A kórokozó iránt fogékony az ember is Enterobacteriumok Az enterobacteriumok (bélbaktériumok) igen széles körben elterjedtek, többségük természetes lakója az ember és az állatok bélcsatornájának, főleg a vastagbeleknek, de megtalálhatók a talajban, a növényzeten, a felszíni vizekben, szennyvizekben, rothadó anyagokban is. Morfológia. Rendszerint körülcsillós, ritkán csillótlan, spórát nem képező, 1 6 µm hosszú, pálcika alakú, Gram-negatív baktériumok. Fukszinnal vagy bármely más, a bakteriológiában használt festékkel jól megfesthetők. 94

115 Részletes bakteriológia Tenyésztés. Aerob, fakultatív anaerob baktériumok, 37 C-on, de többségük C között is, a bakteriológiában használt legtöbb táptalajon gyorsan és jól elszaporítható. Közönséges agar felületén óra alatt 1 2 mm átmérőjű, enyhén domború vagy lapos, nagyjából egyforma telepeket képeznek. Vizsgálati anyagokból (bélsárból, vizeletből, hullarészekből, élelmiszermintákból) való kitenyésztésükre szelektív és differenciáló táptalajokat használunk. Sokféle ilyen táptalaj ismert. Közülük a laktózt elbontó fajok szelektív izolálására leggyakrabban a brómtimolkék-laktóz, a lakmusz-laktóz (Drigalski-agar), a neutrálvörös-laktóz és epesavas sót tartalmazó (Mac Conkey) agart vagy az eozin-metilénkék-laktóz agart használjuk. Az előbbi három táptalaj a Gram-pozitív fajok szaporodásának a visszaszorítására kevés kristályibolyát is tartalmaz. A laktózt elbontó fajok a laktózból savat termelnek, telepeik körül a táptalaj ph-ja és ezáltal színe is megváltozik, így megkülönböztethetők a laktózt nem bontó fajoktól. Ez utóbbiak szelektív izolálására szolgál a brillantzöldfenolvörös-laktóz, a bizmut-szulfit, a dezoxikolát-citrát és több más táptalaj. A brillantzöld és a bizmut-szultit agaron főleg a salmonellák nőnek. A shigellák az előbbi két táptalajon nem szaporodnak, izolálásukra dezoxikolát-citrát táptalajok használatosak. A differenciáló és szelektív táptalajokról izolált törzseket a biokémiai tulajdonságok vizsgálata céljából rendszerint több tulajdonság egyidejű vizsgálatára alkalmas politrop táptalajokba oltjuk. A politrop táptalajok egyik változata pl. a gáztermelés, a laktóz- és a glükózbontás, a kénhidrogén-termelés és a karbamidbontás együttes kimutatására alkalmas. Biokémiai sajátságok. Biokémiailag, kevés kivételtől eltekintve, igen aktívak. Kataláz-pozitívok, oxidáznegatívok, a nitrátokat nitritté redukálják, a glükózt mind aerob, mind anaerob viszonyok között elbontják, s belőle nemcsak savat, hanem rendszerint gázt is képeznek. Az enterobacteriumokhoz igen sok nemzetséget sorolunk. A nemzetségbe sorolás a biokémiai tulajdonságok, a nemzetségen belül a fajokba sorolás pedig a biokémiai és szerológiai sajátságok együttes figyelembevételével történik. Az egyes fajokba tartozó törzsek O-antigénjeik alapján szerocsoportokba, O-, K- (burok-) és H- (csilló- ) antigénjeik együttes ismerete alapján pedig szerotípusokba sorolhatók. Egyes szerotípusokon belül a törzsek fermentációs tulajdonságai alapján biotípusok, fágérzékenységük alapján fágtípusok stb. különíthetők el. Az enterobacteriumok szoros biokémiai és antigénszerkezeti rokonságban állnak egymással. Az orvosi, állatorvosi szempontból fontos enterobacterium nemzetségek megkülönböztetésére alkalmas főbb biokémiai tulajdonságokat az 5. táblázat tartalmazza. A táblázatban feltüntetett biokémiai sajátságok a nemzetségbe tartozó fajok többségét jellemzik, de gyakran előfordulnak kivételek, továbbá az egyes nemzetségek közötti átmenetet képviselő törzsek is. A laktózt bontó enterobacteriumokat (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter fajok), szemben a laktózt nem bontó (Shigella, Salmonella, Proteus) fajokkal összefoglalóan gyakran coliform baktériumok névvel is illetik. 5. táblázat - A fontosabb Enterobacterium nemzetségek biokémiai tulajdonságai Próba Escherichid ea Shigell a Edwardsiel la Salmonell a Citrobacte r Klebsiell a Enterobact er Serratia Proteu s Yersini a Indol + /+ +/ /+ +/ /+ Metilvörös + + +/ + + /+ + + Voges Proskauer Citrátfelhasznál ás / / H 2S-termelés +/ + +/ +/ Ureáz /+ + /+ /+ + + Növekedés KCN-talajon

116 Részletes bakteriológia Lizin- dekarboxiláz Zselatinelfolyó sítás +/ / + /+ /+ + +/ Mozgás +/ +/ C Fenilalanin- dezamináz + Laktóz + +/ + + Mannit + / /+ + Ellenálló képesség. Az enterobacteriumok ellenálló képessége nem nagy. Vízben, szennyvízben, bélsárban stb. hetekig, hónapokig életképesek ugyan, beszáradva azonban néhány nap alatt elpusztulnak, 60 C-os hő perc alatt, az 1%-os klórlúg vagy formalin pedig 5 10 perc alatt elöli őket. Pathogenitás. Az enterobacteriumok között vannak pathogen fajok, egy jelentős részük fakultatív pathogen, túlnyomó többségük pedig saprophyta. A továbbiakban csak azokat a nemzetségeket és fajokat említjük, amelyek állatorvosi vagy orvosi szempontból fontosak Escherichia Az ide tartozó fajok közül az E. colinak van jelentősége Escherichia coli Az ebbe a fajba tartozó baktériumok természetes viszonyok között megtalálhatók az ember és az állatok bélcsatornájában, ahol az aerob, fakultatív anaerob baktériumflóra részét képezik. A születéskor és az azt követő napokban szájon át jutnak be s telepszenek meg, elsősorban a vastagbelekben. Morfológia. Rendszerint körülcsillós, ritkán csilló nélküli, 2 3 µm hosszú pálcikák (38. ábra), a törzsek egy jelentős részének a felületén fimbriák (pilusok) is találhatók. A törzsek egy további része vékony tokot, vagy vastag burkot képez. 38. ábra - Escherichia coli telepek neutrálvörös-laktóz agaron 96

117 Részletes bakteriológia Tenyésztés. Közönséges agaron, aerob és anaerob viszonyok között egyaránt, 24 óra alatt 1 2 mm átmérőjű telepeket képez. (38. ábra) Laktóz-lakmusz agaron telepei a laktózbontás miatt pirosak, brómtimolkék-laktóz agaron pedig sárgák. A szopósborjakban hasmenést okozó törzsek zöme burkos, a táptalajokon nyálkás telepeket képez. Az E. coli okozta hasmenésben (lásd később) beteg vagy elhullott szopós- és választott malacokból izolált törzsek nagy többsége véresagaron béta-hemolízist okoz. A közönséges levest egyenletesen megzavarosítják. Biokémiai sajátságok. Triptofánból indolt termelnek, a metilvörös próbában pozitívak, laktózból savat és gázt is képeznek, de találhatók közöttük a laktózt csak lassan vagy egyáltalán nem bontó törzsek is (5. táblázat). Antigénszerkezet. Az E. coli baktériumok O-, K-, H- és F- (fimbria) antigénjeik alapján szerotípusokba sorolhatók. Az O-antigének a baktériumok sejtfalában található típusspecifikus lipopoliszacharidok. A K- antigének tok- vagy burokantigének, kémiailag (savanyú) poliszacharidok. Közülük azok, amelyek antigenitásukat és ellenanyagkötő képességüket 121 C-on 2 óráig történő autoklávozás során sem vesztik el, a K(A)-antigének. Az ilyen antigénű törzsek telepei nyálkásak, nyúlósak. A korábban K-antigének közé sorolt fimbria-antigéneket újabban önálló antigéncsoportként F betűvel jelölik. A fimbria-antigének egy vagy több komponensből álló fehérjék. Változó összeállításban agglutinálják az ember és a különféle állatfajok vörösvérsejtjeit, továbbá képessé teszik az E. coli baktériumokat a hámsejtekhez való tapadásra (adhézió), ezért többségük virulenciafaktorként (kolonizációs faktorok) szolgál. A H-antigének monofázisos, fehérje természetű csillóantigének. Ez ideig legalább 173 O-, 80 K-, 56 H- és 18 F-antigén ismert. Mivel az egyes antigének egymással szabadon kombinálódva fordulhatnak elő, igen nagyszámú E. coli-szerotípus létezik. Az egyes szerotípusokat antigénszerkezeti formulájukkal jelöljük pl. E. coli O101:K30(A), F5:H9. A fimbria-antigének közül az F 1-gyel jelölt, az ún. 1-es típusú vagy közönséges fimbria az E. coli törzsek túlnyomó többségének a felületén jelen van, az általa okozott hemagglutináció mannózzal gátolható. A többi fimbria által okozott hemagglutináció mannózzal nem gátolható (mannózrezisztens hemagglutináció). Ez utóbbi fimbriák adhéziós képessége bizonyos mértékű faji és szervi specificitást mutat. Közülük az F 2 és az F 3-as antigének az emberben hasmenést előidéző törzsek felületén találhatók (humán kolonizációs faktorok), az F4-es azonos a korábbi K88-as antigénnel, és zömmel a sertésben hasmenést előidéző törzsek hordozzák, az F5-ös azonos a korábbi K99-es antigénnel, a borjakat megbetegítő törzsek hordozzák, az F 6-os ugyancsak főleg a sertésekben enteritist okozó törzseken fordul elő, míg az F 7 F 16-ig számozott fimbriájú E. coli törzsek főleg emberben okoznak húgyúti fertőzéseket, ritkán septikaemiát. A szopósborjakból származó E. coli törzsekben találtak egy F 41-nek jelölt fimbriát is, amely többnyire a K 99-es (F 5-ös) antigénnel együtt fordul elő. Az F 17-es fimbriájú törzseket eredetileg E. coli-hasmenésben, illetve septikaemiában szenvedő borjakból izolálták, de előfordulnak bárányban és más állatfajokban is, míg az F 18-as fimbriát a sertés oedemabetegségét előidéző 97

118 Részletes bakteriológia törzsek hordozzák. A fentieken kívül az utóbbi években számos további fimbria vált ismertté, amelyek még besorolásra várnak. Egyes fimbria-antigéneken belül újabb alcsoportok különíthetők el (K 88 a, b, c stb.) A fimbriák ellen termelt típusspecifikus ellenanyagokkal az E. coli törzsek adhéziója (és ezáltal a kolonizáció) gátolható. In vitro tenyésztve a törzsek nem mindegyike képez fimbriákat, erre a célra speciális táptalajokat használunk. Pathogenitás. Az E. coli baktériumok fakultatív pathogenek, leggyakrabban fiatal állatokat betegítenek meg. Újszülött borjakban és malacokban hasmenéssel járó betegséget (coli-hasmenést), ritkán septikaemiát, választott malacokban ugyancsak hasmenéssel járó bélgyulladást vagy oedema betegséget idéznek elő. Gyakran okoznak tehenekben tőgygyulladást, kocákban tőgy- és méhgyulladást. Szopósbárányokban ugyanúgy mint szopósborjakban coli-hasmenést, ritkán septikaemiát idéznek elő. Megbetegíthetik a házinyulakat, amelyekben vízszerű hasmenést, illetve septikaemiát okoznak. Esetenként okozhatnak kutyában, ritkábban macskában újszülött korban septikaemiát, felnőttekben pedig húgyúti fertőzéseket, metritist. Gyakran okoznak betegséget baromfiállományokban is. Napos- és növendékcsibékben septikaemiát, felnőtt állatokban pedig többnyire egyegy szervre korlátozódó betegségeket (légzsákgyulladást, szívburokgyulladást, perihepatitist, coligranulomatosist stb.) okoznak. Alkalmanként azonban más állatfajokat is megbetegítenek. Az E. coli baktériumok bizonyos szerocsoportjai megbetegítik az embert is, újszülöttekben enteritist, septikaemiát, gyermekekben és felnőttekben enteritist és húgyúti fertőzéseket, ritkán egyéb kórképeket idéznek elő. A különféle betegségekből izolált E. coli törzsek pathogenitásának a megítélése meglehetősen nehéz. Bizonyos O szerocsoportokba tartozó törzsek főleg az embert, mások pedig az állatokat betegítik meg. Az E. coli törzsek többsége hasmenést okoz, másik része azonban hasmenéssel együtt vagy anélkül septikaemiát hoz létre, illetve egyes szervekre korlátozódó betegséget idéz elő. A pathogennek tekintett törzsek egy részénél ismerjük a virulenciafaktorokat, ezek az esetek többségében fimbriák és különféle citotoxinok. A burok, tok poliszacharid K-antigénjei antiphagocyta hatásúak, és megvédik a sejtfalat a komplement hatásától. A K-antigének jelenléte megakadályozza az élő baktériumok agglutinációját homológ O- immunsavókban. Az E. coli törzsek bizonyos szerocsoportjai hasmenést képesek előidézni anélkül, hogy ez a képességük különböző, legalábbis eddig ismert virulenciafaktorokhoz köthető lenne. Az ilyen törzsek is képesek a bélnyálkahártyához adszorbeálódni, a hámsejtek bolyhait tönkretenni és a hámsejtekben bizonyos szerkezeti és fiziológiai változásokat előidézni, amelyek a felszívódás romlásához és a bél üregébe történő folyadékkiáramláshoz vezetnek (enteropathogen E. coli törzsek). A törzsek egy másik része enterotoxinokat termel (enterotoxikus E. coli törzsek) és egyúttal a tapadást elősegítő, különféle fimbriákat is hordoz. Az enterotoxinok az E. coli törzsek tápfolyadékában és a baktériumtestben egyaránt kimutatható toxikus anyagok, exotoxinok. Ez ideig kétféle, egy hőstabil (ST) és egy hőlabilis (LT) toxin ismert. Az enterotoxikus E. coli törzsek vagy csupán ST-t vagy ST-t és LT-t egyaránt termelnek. Az LT Da molekulatömegű fehérje, toxoiddá alakítható, vele szemben nyulakban immunsavó termelhető, amellyel valamennyi E. coli törzs által termelt LT neutralizálható. Az LT szerkezetében és funkciójában rokon a Vibrio cholerae törzsek által termelt choleratoxinnal. Az ST kis molekulatömegű ( Da), gyenge antigénhatású peptid. Mindkét enterotoxin a bélnyálkahártya hámsejtjeinek adenil- (guanil-)cikláz rendszerét aktiválja, ami által jelentős folyadékkiválasztást idéz elő. Mindkét enterotoxint plazmid kódolja. Az E. coli törzsek enterotoxin-termelése kimutatható in vivo lekötött bélkacsszegmentekben, szopós egerekben, a sejttenyészetekre gyakorolt citotoxikus hatásuk alapján vagy újabban monoklonális ellenanyagokkal működő ELISA vagy a toxintermelést kódoló plazmidok specifikus DNS probe-okkal való vizsgálata alapján. Az enterotoxint termelő törzseknek a bélhámsejtekhez való kötődését a különböző fimbriák teszik lehetővé. Egyes E. coli törzsek termelnek Vero-sejtekre (majomvese eredetű sejtvonal) nézve toxikus anyagokat, citotoxinokat (Vero-toxinok), amelyek hatása a Shigella fajok által termelt Shiga-toxinhoz hasonló (SLT), a gazdasejtek riboszómáihoz kötődve gátolják a fehérjeszintézist. A verotoxinok (VT) vagy SLT toxinok is legalább kétfélék. Verotoxinokat termelő (pl. O157-es) E. coli törzsek idézik elő emberben a haemorrhagiás colitist (enterohaemorrhagiás E. coli) és a hemolitikus uraemiás szindrómát. Ugyanezek a törzsek borjakban is okozhatnak haemorrhagiás colitist. Verotoxinokat termelő törzsek jelen lehetnek a különféle állatfajok, szarvasmarha, juh, kecske, ló, kutya emésztőcsatornájában klinikai tünetek nélkül is. 98

119 Részletes bakteriológia A sertésben oedemabetegséget előidéző E. coli törzsek termelik az egyik vero-toxint (VT 2-t), amelyik a bélből felszívódva (E. coli enterotoxaemia) a vérerek falának endothelsejtjeit károsítva oedemát idéz elő. Egyes, emberben, borjakban, bárányokban és malacokban előforduló, haemorrhagias enterocolitist előidéző törzsek, amelyek igen különféle szerocsoportokba tartozhatnak, termelnek citotoxikus necrotizáló faktornak (CNF) nevezett toxinokat. A toxinok legalább kétfélék (CNF 1 és CNF 2), molekulatömegük és Da. Ezek a toxinok hőlabilisak, toxikusak Vero- és HeLa-sejtekre, letalisak egérre, csirkére és borjakra, nyúlbőrbe oltva pedig helyileg necrosist és testszerte vérzéseket okoznak. Az E. coli törzsek egy része képes bejutni a vastagbél nyálkahártyájába és az okozott hámelhalás következtében hasmenést előidézni (enteroinvasiv E. coli törzsek). E törzsek pathogenitása a sejtfal külső rétegében található különféle alacsony molekulatömegű fehérjékkel áll összefüggésben. A septikaemiát okozó törzsek enterotoxinokat nem termelnek, kórhatásukat egyebek mellett a bejutott baktériumok szétesésekor felszabaduló endotoxinoknak köszönhetik. Egyelőre azonban nem tudjuk, hogy pontosan melyek azok a faktorok, amelyek a törzseket képessé teszik arra, hogy a keringésbe bejussanak. A septikaemiát előidéző törzsek között gyakran szerepelnek az O78:K80, továbbá a különböző O-antigénű, K1 burokantigénű törzsek. Az egyes állatfajokban betegséget előidéző E. coli törzsek rendszerint csupán néhány OK szerocsoportba vagy szerotípusba tartoznak, s az egyes szerotípusok előfordulási gyakorisága területenként és időszakonként is változhat. Szopós malacokban nálunk leggyakrabban az O149:K91, 88, az O147:K89, 88, az O8, az O138:K85, 88, O141, O157 és néhány más törzs, szopós borjakban az O101:K28(A), 99, az O101:K30(A), 99, továbbá az O20, O21, O8, O9 és O78-as törzsek, csirkében és tyúkban az O1:K1, O2:K2, O78:K80 és még néhány más törzs, házinyulakban pedig rendszerint az O132, O14, O128 és néhány más törzs idéz elő leggyakrabban betegséget. A malacok választáskori hasmenését rendszerint ugyanazok az O szerocsoportú E. coli törzsek okozzák, mint a szopóskori hasmenést, a felületükön azonban rendszerint a szopósmalacokban előforduló törzsekétől eltérő, eddig csak részben ismert fimbriák vannak jelen. Az oedemabetegséget rendszerint O138, O139:K12: :F18, vagy O141:K85-ös törzsek idézik elő. A szopós malacok coli-hasmenését okozó törzsek mintegy háromnegyede hordozza a K 88 (F 4) fimbria antigént, de előfordulnak F 6-os és ritkán más fimbria-antigénű törzsek is. A szopós borjakat megbetegítő törzsek mintegy felében pedig a K 99 (F 5-ös), továbbá a F 41-es antigén van jelen. A borjak coli-hasmenését előidéző törzsek csak ST-t termelnek. A csirkében septikaemiát előidéző törzsek gyakran hordozzák az F 1-es fimbriát. Az ember E. coli fertőzéseit rendszerint más szerocsoportú törzsek idézik elő, mint amelyek az állatokat megbetegítik, egyes háziállatokban, pl. a szarvasmarha bélcsatornájában és esetenként a tejben is előforduló verotoxinokat termelő (pl. O157-es) törzsek azonban emberbe bejutva haemorrhagiás enterocolitist idézhetnek elő. Bár az E. coli baktériumok fakultatív pathogenek, újszülött (főleg colostrumot nem kapott) malacok és borjak azonban per os fertőzve életük első órájában többnyire sikerrel megbetegíthetők, amikor is a természetes betegséggel egyező kórkép alakul ki. A laboratóriumi állatok közül a fehér egerek iv. fertőzve legfeljebb nagy adagok hatására pusztulnak el Klebsiella A klebsiellák közül a K. pneumoniae megtalálható az ember és az állatok emésztőcsatornájában, továbbá gyakran a légutak és a nemi szervek váladékaiban, a genusba tartozó további fajok a talajban vagy a természetes vizekben élő saprophyták Klebsiella pneumoniae Morfológia. Rövid, csilló nélküli pálcikák, vaskos poliszacharid burkuk van. Tenyésztés. Közönséges agaron és az enterobacteriumok tenyésztésére használt szelektív és differenciáló táptalajokon is, a törzstől és a táptalaj szénhidráttartalmától függően erősen domború, átlátszatlan, nyúlós, nyálkás telepeket képez. A leves táptalajokban egyenletes, sűrű zavarosodást okoz. 99

120 Részletes bakteriológia Biokémiai sajátságok. A K. pneumoniaen belül három alfajt különböztetünk meg. A többi bélbaktériumtól egyebek mellett megkülönböztethető azon az alapon, hogy nem mozog, a Voges Proskauer próbában pozitív, ureáz enzimet termel, a laktózt elbontja (5. táblázat). Antigénszerkezet. A klebsiellákat a burokantigénjeik alapján soroljuk csoportokba, ezideig legalább 82 buroktípusuk ismert. Pathogenitás. A K. pneumoniae a bélcsatorna természetes lakója, bár jóval kisebb számban fordul ott elő, mint pl. az E. coli. Saprophyta, illetve fakultatív pathogen, alkalmanként azonban emberben légúti fertőzéseket, tüdőgyulladást, húgyúti fertőzéseket, az állatok közül pedig szarvasmarhában tőgygyulladást, lóban pedig metritist okoz. Gyakran kitenyészthetők klinikailag egészséges mének ondójából is Enterobacter Az ide tartozó fajok (E. cloacae, E. aerogenes stb.) megtalálhatók az ember és az állatok bélcsatornájában, a természetes vizekben, a talajban, élelmiszerekben stb. Biokémiailag igen aktívak, élénken mozognak, a Voges Proskauer próbában pozitívak, a laktózt elbontják (5. táblázat). Saprophyták, esetenként azonban emberben légúti és húgyúti fertőzéseket, kivételesen septikaemiát okozhatnak. A K. pneumoniaevel együtt gyakran kitenyészthetők kancák hüvelyváladékából, illetve a mének ondójából Edwardsiella Rövid pálcikák, a fajok egy része csillós. Tenyésztésükhöz aminosavakat és vitaminokat igényelnek, telepeik 24 óra elteltével kisebbek, mint a többi enterobacterium telepei. Biokémiailag igen heterogének (5. táblázat). Kórtani jelentőségüket csak kevéssé ismerjük. Fakultatív pathogenek, illetve saprophyták. Főleg hidegvérű állatokból (gyíkokból, békákból, halakból stb.) és természetes vizekből izolálhatók. Az ide tartozó fajok közül az E. tarda izolálható különféle állatfajok (háziállatok, madarak, gyíkok, halak stb.), de alkalmanként az ember bélcsatornájából is. Emberben ritkán hasmenést, sebfertőzést okozhat, de megbetegítheti az angolnákat és egyéb halfajokat is. Az E. ictaluri nehezen tenyészthető, a szokásos biokémiai próbák többségében negatív eredményt ad, tenyésztett csatornaharcsákban (Ictalurus punctatus), ritkán egyéb halfajokban idéz elő tömeges elhullással járó septikaemiát Shigella A Shigella nemzetség tagjai (a S. dysenteriae, a S. flexneri, a S. boydii és a S. sonnei) 2 3 µm hosszú, csilló nélküli pálcikák. Az emberi vérhas (lázzal, nyálkás, véres hasmenéssel járó vastagbélgyulladás) okozói. A háziállatokban nem fordulnak elő, endémiás jelleggel azonban vérhast idézhetnek elő állatkertekben tartott majmokban és egyéb főemlősökben Salmonella A salmonellák előfordulnak az ember és az állatok bélcsatornájában, de gyakran megtalálhatók felszíni vizekben, szennyvizekben, állati eredetű takarmányokban (húslisztben, hallisztben stb.), élelmiszerekben is. Morfológia. A salmonellák 2 5 µm hosszú, a S. gallinarum és a S. pullorum kivételével, csillós pálcikák. Tenyésztés. Egyszerű táptalajokon is jól szaporodnak és a többi enterobacteriumhoz hasonló telepeket képeznek. Egyes szerotípusok (pl. S. paratyphi B, S. enteritidis) telepei körül, ha tenyészeteiket szobahőn állni hagyjuk, nyálkás sánc fejlődik ki. Brómtimolkék-laktóz- és lakmusz-laktóz- tartalmú agar táptalajokon telepeik kék színűek. Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-agaron tenyésztve telepeik alatt a táptalaj meglúgosodik, piros színű. Bizmut-szulfit táptalajon a fémes bizmut kiválása miatt a Salmonella telepek centruma fekete (39. ábra). A salmonellák a vizsgálati anyagokban (pl. élelmiszerekben, takarmányokban, bélsárban stb.) esetenként olyan kis számban vannak jelen, hogy közvetlen kitenyésztésük nem sikerül. Ilyen esetekben a vizsgálati anyag egy részét, homogenizálás után, dúsító táptalajokba oltjuk, majd órás tenyésztés után ezekből szélesztünk táptalajokra. A dúsító leves táptalajok olyan anyagokat (pl. nátrium-tetrationátot, epesavas sókat, nátriumszelenitet és ciszteint) tartalmaznak, amelyek a salmonellák elszaporodását elősegítik, más fajokét azonban gátolják. Leves táptalajokban a salmonellák egyenletes, sűrű zavarosodást okoznak. 39. ábra - Salmonella typhimurium telepek bizmut-szulfit-agaron 100

121 Részletes bakteriológia Biokémiai sajátságok. A salmonellák indol- és ureáz-negatívak, kevés kivételtől (S. typhisuis, egyes S. gallinarum, S. berta stb. törzsektől) eltekintve, H 2S-t képeznek (5. táblázat). Az antigénszerkezetileg azonos törzsek, pl. S. choleraesuis és a S. typhisuis, szénhidrátbontásuk alapján különhöztethetők meg egymástól. Az előbbi az arabinózt és a dulcitot nem, a mannitot viszont elbontja, az utóbbi szénhidrátbontása ennek éppen a fordítottja. A S. pullorum a S. gallinarum biokémiai variánsa. A genetikai vizsgálatok eredményei alapján manapság az összes Salmonellát egy fajnak (S. enterica) tekintjük, s a fajon belül ez ideig hét alfajt, az alfajokon belül pedig szerovariánsokat (szerotípusokat) különböztetünk meg. A kórtanilag fontos szerotípusok többsége az I-es alfajba tartozik (pl. S. enterica subsp. enterica serovar.typhimurium stb.). Antigénszerkezet. A salmonellák O-antigénjeik alapján (az ábécé nagybetűivel, majd a Z betű után arab számokkal jelölt) szerocsoportokba, ezeken belül pedig az H-antigénjeik alapján szerotípusokba sorolhatók (6. táblázat). A S. typhi és néhány más szerotípus hőlabilis K-antigént is tartalmaz. Ezt az antigént Vi-antigénnek nevezik, mert a törzsek virulenciájával áll kapcsolatban. Az O-antigének általában több, ritkábban egy faktorból állnak. Ha több faktorból állnak (antigénmozaik), akkor a csoportra jellemző, csoportspecifikus antigén vagy antigének mellett az egyes csoportok közötti keresztagglutinációra vezető mellékantigének is megtalálhatók. Egyes O-antigének jelenléte (pl. Ol, O14, O15) fágfertőzés (fágkonverzió) következménye. 6. táblázat - Egyes Salmonella szerotípusok antigénjei (Kauffmann White-séma) Antigének Csoport Szerotípus 0 1. fázis H 2. fázis A S. paratyphi A 1, 2, a 101

122 Részletes bakteriológia 12 S. paratyphi B 1, 4, (5) b 1,2 S. typhimurium 1, 4, (5), 12 i 1,2 B S. abortusbovis 4, 12 c 1,6 S. abortusbovis 1, 4, 12, 27 b e, n, x S. abortusequi 4, 12 e, n, x S. paratyphi C 6, 7 (Vi) c 1,5 s. choleraesuis 6, 7 (c) 1,5 C 1 S. typhisuis 6, 7 (c) 1,5 S. thompson 6, 7 k 1,5 S. infantis 6, 7 r 1,5 C 2 S. hadar 6, 8 z 10 e, n, x S. typhi 9, 12, (Vi) d D 1 S. enteritidis 1, 9, 12 g, m S. berta 1, 9, 12 f, g. t S. gallinarum 1, 9, 12 S. anatum 3, 10 e, h 1,6 E 1 S. meleagridis 3, 10 e, h 1, w A zárójelbe tett antigének esetenként hiányoznak 102

123 Részletes bakteriológia A csilló- (H-)antigének kétfélék. Első fázisú (specifikus) és második fázisú (nem specifikus) antigének. Specifikusak azok, amelyek önmagukban vagy az adott kombinációban a vizsgált szerotípust meghatározzák, ezeket latin kisbetűkkel jelöljük. A Salmonella szerotípusok egy részének (pl. S. paratyphi A, S. enteritidis) csillói csupán specifikus antigéneket tartalmaznak (monofázisos típusok), többségüknek csillóiban azonban a specifikus H-antigének mellett nem specifikus H-antigének is megtalálhatók (difázisos típusok). Ez utóbbi antigéneket arab számokkal jelöljük. A difázisos típusok tenyészeteiben vannak olyan baktériumok, amelyeknek csillóiban csak első vagy második fázisú antigének találhatók. Az egyik fázisú csillóantigéneket tartalmazó törzsek tiszta tenyészetét továbboltva az utódok között kb gyakorisággal olyan példányok is megjelennek, amelyekben a másik fázisú csillóantigének vannak jelen. Ez a jelenség a fázisváltás. A salmonellák antigénjeit agglutinációs próbával határozzuk meg. Mivel a Salmonella szerotípusok többségének O- és H-antigénjei több komponensből állnak, s ezeknek egyike-másika más Salmonella szerotípusokban is előfordul, az antigének szerológiai vizsgálatához rendszerint kimerített, csupán egy antigénkomponenssel szembeni ellenanyagot tartalmazó, ún. faktorsavókat használunk. Alkalmanként előfordul, hogy a törzsek egyikmásik antigénkomponense hiányzik. A szerológiai osztályozás megkönnyítése végett a salmonellák fontosabb antigénjeit antigénszerkezeti sémában foglalták össze (Kauffmann White-séma). A salmonellák szerológiai identifikálása a nagyszámú szerotípus, a törzsek közötti számtalan keresztreakció, egyes antigénkomponensek esetleges hiánya, a fázisváltás jelensége stb. miatt nem tartozik az egyszerű feladatok közé, ezért a vizsgálatokat erre a célra berendezett, speciális (referencia) laboratóriumok végzik. A salmonellák identifikálására, biokémiai és szerológiai sajátságaikon túl felhasználjuk fágok iránti érzékenységüket (különféle fágtípusok), plazmidjaik elemzését (milyen molekulatömegű plazmidokat hordoznak), továbbá a DNS-ük restrikciós endonukleázokkal való emésztése után végzett analízisét (DNSujjlenyomat). Ez utóbbi vizsgálatok szerencsés esetben lehetőséget adnak az azonos szerotípusba tartozó, de különböző forrásokból származó salmonellák egymástól való megkülönböztetésére és ezáltal eredetük felderítésére. A Salmonella szerotípusok elnevezése általában az általuk okozott kórképpel vagy az izolálás helyével áll kapcsolatban. Manapság már csak az I-es alfajba tartozó salmonellák kapnak binominális nevet, a többieket csupán az alfaj és az antigénszerkezeti formula feltüntetésével jelöljük. Pathogenitás. A salmonellák pathogen vagy fakultatív pathogen baktériumok. Egyes szerotípusok kizárólag emberi kórokozók, többségük azonban egyaránt megbetegítheti az embert és az állatot is, végül van néhány szerotípus, amely gyakorlatilag csak az állatokat betegíti meg. Az állatokban betegséget okozó salmonellák túlnyomó többsége a B, C, D és E csoportok valamelyikébe tartozik. a) A human pathogenek közül a S. typhi az ember typhusát, a S. paratyphi A, B és C és a S. sendai pedig a typhushoz hasonló kórképet (paratyphust) idéz elő. b) A salmonellák néhány szerotípusa csupán állatokat betegít meg, ezek emberben általában nem telepszenek meg. A S. typhisuis a sertéstyphusnak, míg a S. gallinarum, S. pullorum a baromfityphusnak az okozója. c) A salmonellák túlnyomó többsége fakultatív pathogen. Ezek állatokban paratyphust vagy csupán az emésztőrendszerre korlátozódó tünetmentes fertőzöttséget (Salmonella-hordozást), emberben pedig septikaemiával járó kórképeket vagy gyomor-bél gyulladást (ételfertőzést) idéznek elő. Bár a háziállatokban Salmonella fertőzést bármelyik fakultatív pathogen szerotípus létrehozhat, mégis leggyakrabban a S. enteritidis, S. typhimurium, a S. choleraesuis, a S. thompson, a S. infantis, S. anatum és még néhány más szerotípus okoz betegséget. A háziállatokban vetéléssel járó kórformákból rendszerint S. abortusequi, S. abortusbovis, S. abortusovis törzsek vagy ritkábban más szerotípus izolálható. Paratyphusban megbetegedhetnek a madarak, közöttük gyakran a tyúkfélék, a víziszárnyasok és a galambok. A laboratóriumi állatok közül egérben és más rágcsálókban a S. typhimurium lázas általános állapottal járó kórképet idéz elő, amely rendszerint elhullásra vezet. Ilyenkor a májban és az egyéb szervekben apró, gyulladásos, elhalásos gócok láthatók. Egyéb szerotípusok csak nagyobb mennyiségű tenyészet parenteralis befecskendezése után betegítik meg az egeret Citrobacter 103

124 Részletes bakteriológia Az emlősök és a madarak bélcsatornájának természetes lakói, de megtalálhatók a természetes vizekben, szennyvizekben és élelmiszerekben is. Biokémiailag igen aktívak. A salmonelláktól megkülönböztethetők azon az alapon, hogy KCN-tartalmú táptalajon is növekednek, a lizint nem dekarboxilálják (5. táblázat). Állatorvosi szempontból kórtani jelentőségük nincs, saprophyták Serratia Az ide tartozó fajok megtalálhatók a talajban, a vízben, a szennyvizekben, ritkábban az ember és az állatok bélcsatornájában. Főleg 30 C alatt vízben nem oldódó, vörös vagy vízben oldódó, ezért a környezetet is elszínező rózsaszínű pigmenteket termelnek. A Voges Proskauer-próbában pozitívak, a laktózt nem vagy csak késve bontják, számos extracelluláris enzimet, így dezoxiribonukleázt, lipázt, lecitinázt, továbbá proteázokat, közöttük a zselatint és a kazeint bontó enzimeket termelnek (5. táblázat). Tenyészeteikben a halra, illetve vizeletre emlékeztető szaganyagok is képződnek. Saprophyták, közülük a Serratia marcescens és néhány más faj gyakran megtalálható élelmiszerekben (sajtokban és más tejtermékekben stb.). Alacsony (4 5 C) hőmérsékleten is képesek szaporodni, ezért hűtőszekrényben tárolt élelmiszerek megromlását idézhetik elő Proteus Az ember és az állatok bélcsatornájának természetes lakói (a Providentia és a Retgerella fajokkal együtt), megtalálhatók azonban szennyvízben, rothadó anyagokban is. Az aerob rothasztók fő képviselői. A proteusok, közöttük a P. vulgaris és a P. mirabilis körülcsillósak, élénken rajzanak, a nedves táptalajok felületét leheletszerű, vékony rétegben benövik. A nem egészen friss állati szervekben és váladékokban elszaporodva megakadályozhatják az azokban levő kórokozók kitenyésztését. A rajzás nátrium-azidnak, felületaktív anyagoknak stb. a táptalajokhoz való hozzáadásával gátolható. A többi enterobacteriumtól elkülöníthetők azon az alapon, hogy valamennyi ide tartozó faj fenilalanindezamináz- és ureáz-pozitív, a triptofánból (a P. mirabilis kivételével) indolt, kéntartalmú aminosavakból pedig kénhidrogént termelnek, a zselatint elbontják (5. táblázat). A Proteus nemzetség tagjai saprophyták, kórfolyamatokban ritkán, akkor is csupán másodlagosan vesznek részt Yersinia Az ide tartozó fajok közül a Y. pestis (Pasteurella pestis) az emberi pestis okozója. Állatorvosi szempontból a nemzetségbe sorolt további fajok közül a Y. pseudotuberculosis, a Y. enterocolitica és a Y. ruckeri tart érdeklődésre számot Yersinia pseudotuberculosis Morfológia. A Y. pseudotuberculosis (Bacterium pseudotuberculosis rodentium) a pasteurellákhoz hasonló coccoid vagy rövid, 1 3 µm hosszú, pálcika alakú baktérium. Gram-negatív, a kórosan elváltozott szövetekből kikent készítményekben gyakran, a pasteurellákhoz hasonlóan, bipolárisan festődik. Nincsen burka, spórát nem képez. Testhőmérsékleten csillótlan, 22 C-on tenyésztve azonban csillókat képez, s többé-kevésbé élénken mozog. Tenyésztés. Aerob, fakultatív anaerob, 4 42 C között képes szaporodni, optimális tenyésztési hőmérséklete 30 C. Közönséges agaron 24 óra alatt valamennyi más enterobacteriuménál kisebb, kb. 1 mm átmérőjű kerek, szemcsés felületű, sárgásszürke telepeket formál. Az enterobacteriumok izolálására használt brómtimolkéklaktóz-agaron kék, az epesavas sókat, neutrálvöröst és laktózt tartalmazó agaron pedig színtelen telepeket képez. Brillantzöld és bizmut-szulfit-agaron nem vagy alig ered meg. Leves táptalajban finom zavarosodás, a tenyészet alján pedig pelyhes üledék képződik C-on, a több napos levestenyészetek felületén finom nyálkás hártya, alján pedig bőséges, nehezen felrázható üledék képződik. Biokémiai sajátságok. Az enterobacteriumokhoz hasonlóan kataláz-pozitív, oxidáz-negatív, a széhhidrátbontás fermentatív. A glükózból és a mannitból savat termel, nem bontja a laktózt (5. táblázat). 104

125 Részletes bakteriológia Antigénszerkezet. Hőstabil sejtfalantigénjei alapján legalább 6 szerocsoportba sorolhatók (I-től-VI-ig), ezenkívül legalább 5 különféle hőlabilis csillóantigénjük is van (a-tól e-ig). Sejtfalantigénjeik rokonságban állnak a salmonellák és egyes E. coli-szerotípusok sejtfalantigénjeivel. Pathogenitás. Fakultatív pathogen baktérium, megbetegíti a vadon élő és tenyésztett rágcsálókat (mezei és házinyulat, tengerimalacot, nutriát, csincsillát, stb.) bennük rendszerint idült, a gümőkórhoz hasonló elváltozásokat okoz (rodentiosis). A rágcsálókon kívül azonban okozhat septikaemiát és tályogképződéssel járó folyamatokat házi és vadon élő madarakban (pulykában, fácánban, fogolyban stb.), vetélést szarvasmarhában, juhban, sertésben, továbbá állatkertekben és vadasparkokban tartott kérődzőkben. Szórványosan számos más állatfajt is megbetegíthet. Fogékony iránta az ember is, emberben többnyire lymphadenitist, enteritist, septikaemiát idéz elő. A laboratóriumi állatok közül a mesterséges fertőzés iránt fogékony a tengerimalac, a nyúl, a patkány, az egér, de megbetegíthető a macska, a tyúk és a galamb is. Leginkább fogékony a tengerimalac. A parenterálisan fertőzött tengerimalacokban rendszerint idült, két-három hét alatt elhullásra vezető elváltozások alakulnak ki. A fertőzés környékén levő nyirokcsomók megduzzadnak, bennük, továbbá a lépben, a májban, a tüdőben stb. a gümőkórra emlékeztető, sajtos elhalásos gócok jönnek létre. A fertőzés per os is megered, ilyenkor a bélfalban és a bélfodri nyirokcsomókban alakulnak ki elsősorban az elváltozások Yersinia enterocolitica Morfológiai és tenyésztésbeli tulajdonságait illetően hasonlít a Y. pseudotuberculosisra. Váladékokból nátriumoxalátot és epesavas sókat tartalmazó szelektív táptalajon izolálható. Szobahőmérsékleten (22 C) jobban szaporodik, mint 37 C-on. Biokémiai sajátságaiban (5. táblázat) különbözik a Y. pseudotuberculosistól egyebek mellett abban, hogy elbontja a szacharózt és a szorbitot, viszont nem hidrolizálja az eszkulint. A Y. enterocolitica törzsekben eddig legalább 34 O-antigént és több mint 20 H-antigént azonosítottak, ezek alapján a törzsek szerotípusokba sorolhatók. Az O-antigének közül a 9-es szoros rokonságban áll a Brucella fajok antigénjeivel, ami a brucellosissal kapcsolatos szerológiai próbák értékelését megzavarhatja. A Y. enterocolitica természetes viszonyok között megtalálható a legkülönfélébb állatfajok (nyúl, kutya, macska, szarvasmarha, sertés, vadon élő állatok stb.) és az ember bélcsatornájában, de felszíni vizekben és szennyvizekben is. Emberben gyomor- és bélrendszeri tüneteket, bélfodri tályogokat stb., sertésben és nyúlban, alkalmanként más állatfajokban, a bélre, a bélfodri nyirokcsomókra kiterjedő, idült, a gümőkórhoz hasonló elváltozásokat idéz elő. Szemben a Y. pseudotuberculosisszal a laboratóriumi rágcsálókat nem betegíti meg Yersinia ruckeri Rövid, 2 3 µm hosszúságú, pálcika alakú baktérium, idősebb tenyészeteiben fonal alakok is képződnek. Tenyésztési és biokémiai tulajdonságaiban nagy fokban hasonlít a Y. pseudotuberculosishoz, biokémiailag azonban meglehetősen inaktív. Egyedüli szénforrásként hasznosítani tudja a citrátot, ureáz-negatív, glükózból, mannitból savat termel. Pisztrángfélékben idéz elő vesekárosodással járó septikaemiát Anaerob, Gram-negatív, pálcika alakú baktériumok Az anaerob, pálcika alakú, Gram-negatív baktériumok csoportjába igen sok nemzetség és baktériumfaj tartozik. Közülük kórtani szempontból a Fusobacterium és a Bacteroides nemzetségbe sorolt fajok fontosak. Ezek megtalálhatók az ember és a különféle állatfajok nyálkahártyáin, így az orr- és szájüregben, az emésztőcsatornában, különösen a bendőben, a növényevők vakbelében és a vastagbél egyéb szakaszaiban, a nemi szervek nyálkahártyáin stb. Az ide tartozó fajok a bélcső természetes lakói, az anaerob bélflóra tagjai. Fakultatív pathogenek, rendszerint sérülések következtében jutnak a szövetek közé. Az általuk okozott fertőzésekre jellemző, hogy általában a nyálkahártyák felületére lokalizálódnak, a megtámadott szövetek elhalásával járnak, s az elhalt szövetek a baktériumok proteolítikus hatása miatt bűzösek. Az elváltozásokból gyakran más fakultatív anaerob baktériumokkal együtt tenyészthetők ki Fusobacterium Morfológia. Polimorfok, rövid coccoid alakok, hosszabb, középen duzzadt, kihegyezett végű, 5 10 µm hosszú pálcák és hosszú fonalak egyaránt előfordulnak. A coccoid formák főként idősebb tenyészetekben láthatók. A fajok többsége csilló nélküli, egyesek azonban csillósak. Spórát nem képeznek, Gram-negatívok, egyenetlenül festődnek. 105

126 Részletes bakteriológia Tenyésztés. Szigorúan anaerobok, az oxigént legfeljebb csak nyomokban tűrik el. Tápanyagok szempontjából igényesek. Fehérje, élesztőkivonat és 5 10% CO 2 növekedésüket serkenti. Szelektív izolálásukra a kristályibolyát, a brillantzöldet vagy vankomicint tartalmazó táptalajok használatosak. Telepeik 37 C-on 1 3 nap alatt fejlődnek ki. Biokémiai sajátságok. Biokémiailag kevéssé aktívak, osztályozásuk meglehetősen nehéz és bizonytalan. Szénhidrátbontó képességük gyenge, a törzsek egy jelentős része a cukrokat egyáltalán nem bontja. A szénhidrátokból és peptonból főleg vajsavat, gyakran még ecetsavat, tejsavat, kisebb mértékben pedig propionsavat és hangyasavat is képeznek. Egyes fajok indolt termelnek, hidrolizálják az eszkulint és a keményítőt, elbontják a zselatint, emésztik a kazeint. Pathogenitás. Számtalan fajuk ismert (F. necrophorum, F. nucleatum, F.varium stb.), a szájüreg, az emésztőcső, a felső légutak és a nemi szervek nyálkahártyáit borító nyálkarétegben élnek. Fakultatív pathogenek, az emberből szájüregi necrosisokból, anaerob sebekből, légúti, nemi szervi és emésztőszervi tályogokból, gangraenás, putrid folyamatokból izolálhatók. A Fusobacterium fajok fiatal kérődzőkben (borjúban, bárányban, kecskegidában), malacokban és nyulakban nyálkahártya- bőr- és májelhalással járó necrobacillosist, hízómarhákban májtályogokat, tehenekben ritkán tőgygyulladást okoznak, de gyakran izolálhatók kutya, macska méhgyulladásából, hashártyagyulladásából és fertőzött sebeiből is. A fusobacteriumok elősegítik, illetve súlyosbítják a juhok (és ritkán más kérődzők) Bacteroides nodosus által okozott panaritiumának ( büdös sántaságának ) a kialakulását és lefolyását Fusobacterium necrophorum Csilló nélküli, Gram-negatív pálcika, amely mind tenyészeteiben, mind a szövetekben hosszú láncokat, fonalakat képez (40. ábra). A rövid pálcikák egyenletesen festődnek, a fonalakban azonban szabályos egymásutánban megfestett és festetlen részek látszanak. Véresagaron, szigorúan anaerob viszonyok között tenyészthető. Telepei körül a vörösvérsejtek feloldódnak. A szénhidrátokat rendszerint nem bontja, legfeljebb glükózból, fruktózból termel kevés vajsavat és propionsavat. Indol-pozitív, többségük számos extracelluláris enzimet, alkalikus foszfatázt, lipázt, dezoxiribonukleázt, hialuronidázt stb. is termel. 40. ábra - Fusobacterium necrophorum fonalak elhalt szövetekben (fukszinnal festve, 1250 ) 106

127 Részletes bakteriológia Újabban a törzseket két alfajba sorolják. Virulens törzsei (F. necrophorum subsp. necrophorum) véresagaron tenyésztve erős hemolízist okoznak, agglutinálják a csirke vörösvérsejtjeit, adszorbeálódnak a különféle emlőssejtekhez, leukotoxint és dezoxiribonukleáz enzimet termelnek. Ezek a törzsek idézik elő a háziállatok necrobacillosisát és a B. nodosusszal együtt a juhok büdös sántaságát. A virulens törzsek, intraperitonealis fertőzést követően, a kísérleti egereket elpusztítják. A kevésbé virulens törzsek (F. necrophorum subsp. funduliforme) vaskosabbak, gyengébb hemolízist okoznak, kórfolyamatokban nem vagy csak ritkán vesznek részt Bacteroides Morfológia. Vaskos, 3 5 µm nagyságú pálcikák, Gram-negatívak, gyakran egyenetlenül festődnek. Többségük csillót nem képez, néhány faj azonban csillós. Egyes fajok felületén fimbriák találhatók. Tenyésztés. A fusobacteriumokhoz hasonlóan igényesek, szigorúan anaerobok, véresagaron tenyészthetők. Biokémiai sajátságok. Szénhidrátbontásuk tekintetében aktívabbak, mint a fusobacteriumok, többségük bontja a glükózt és számos más szénhidrátot is. A szénhidrátokból és aminosavakból a fusobacteriumoktól eltérően elsősorban nem vajsavat, hanem főleg borostyánkősavat és propionsavat képeznek. A fajok egy része a zselatint és a húsdarabkákat elfolyósítja. Pathogenitás. Több mint húsz fajuk s ezeken belül számos változatuk ismert. Megtalálhatók a bélsárban, a kérődzők előgyomraiban, a nyúl és a baromfifajok vakbelében, de a légutak és a nemi szervek nyálkahártyáján, sőt egy részük természetes vizekben, szennyvizekben is. Fakultatív pathogenek, a nyálkahártyák és a bőr elhalásával és tályogosodással járó folyamatokból izolálhatók emberből és háziállatokból egyaránt. A B. fragilis az anaerob bélflóra tagja, gyakran izolálható human kórfolyamatokból (appendicitis, a bélcsatorna, a húgy- és nemi utak tályogosodással járó folyamatai, anaerob sebek stb.). A B. melaninogenicus fekete pigmenteket és proteolítikus enzimeket termel, gyakran izolálható kutya, macska tályogjaiból, putrid folyamatokból. A B. ureolyticus nemi szervi váladékokból izolálható, kórtani szerepe bizonytalan. A B. nodosus (újabb nevén Dichelobacter nodosus) felületén fimbriák találhatók. Szigorúan anaerob viszonyok között, 10% CO 2-ot is tartalmazó légtérben, legcélszerűbben porított szarut is tartalmazó táptalajokon tenyészthető. Hemolízist nem okoz, elfolyósítja a zselatint, elemészti a húst, és elbontja a szarut is. A felületén levő fimbriák alapján, agglutinációs próbával a törzsek eddig 8 szerocsoportba (A H) sorolhatók. A szerocsoportok gyakorisága földrajzi régiónként változik. A juh, kecske, szarvasmarha, ritkán egyéb kérődzők büdös sántaságát idézi elő Pasteurella A pasteurellák a nyálkahártyák, főleg a felső légutak és a szájüreg természetes lakói emlősökben és madarakban egyaránt. Morfológia. Apró, 0,5 2 µm átmérőjű, coccoid alakú baktériumok vagy rövid pálcák. Csillóik nincsenek, spórát nem képeznek. Gram-negatívak, fukszinnal vagy bármely más, a bakteriológiában használatos festékkel jól megfesthetők. A virulens P. multocida és a P. haemolytica törzseknek poliszacharid burkuk van. Váladékokból, szövetekből vagy friss tenyészetekből festve egyes példányoknak gyakran csupán a két vége festődik meg (bipoláris festődés). Tenyésztés. Aerob, fakultatív anaerob baktériumok, a táptalajok iránt igényesek, váladékokból, szervekből való kitenyésztésükre élesztőkivonatot, vérsavót vagy vért is tartalmazó táptalajokat veszünk igénybe. Érzékenyek a táptalajok ph-ja iránt is, a neutrális vagy enyhén lúgos táptalajokat kedvelik, folyékony táptalajokban, ha annak ph-ja a szénhidrátbontás miatt savassá válik, néhány nap alatt kihalnak. A tenyésztés optimális hőmérséklete 37 C. Telepeik általában már 24 óra alatt kinőnek, gombostűfej nagyságúak, sima szélűek, fénylenek, szürkésfehérek. A Pasteurella nemzetségbe igen sok baktériumfaj tartozik, közülük kórtani szempontból a P. multocida és a P. haemolytica a legfontosabbak. A P. multocida véresagaron nem okoz hemolízist, az emlősökből kitenyésztett virulens P. multocida törzsek egy része azonban erősen nyálkás, nyúlós (mukoid) telepeket képez. Közönséges levesben az S és a mukoid törzsek egyenletes zavarosodást okoznak, majd néhány nap alatt a tenyészet alján nyálkás, nyúlós, felrázással nehezen 107

128 Részletes bakteriológia eloszlatható üledék képződik. Az R törzsek burok nélküliek, a levestenyészetek alján szemecskés üledéket képeznek. A P. haemolytica törzsek véresagaron béta-hemolízist okoznak. Biokémiai sajátságok. A pasteurellák kataláz- és oxidáz-pozitívak, a nitrátot nitritté redukálják, a szénhidrátokat fermentatívan, kevés kivételtől eltekintve gázképződés nélkül bontják. Az egymástól való elkülönítésükre alkalmas, fontosabb biokémiai tulajdonságokat a 7. táblázat mutatja. A különböző állatfajokból izolált P. multocida törzsek között egyes szénhidrátok bontásában különbségek vannak, ezen az alapon a fajon belül három alfajt különböztetnek meg. A P. haemolytica törzsekben két biotípus (A és T) különböztethető meg. Az A biotípus kataláz-pozitív, az arabinózt és a xilózt elbontja, a trehalózt viszont nem. A T biotípus kataláz-negatív, elbontja a trehalózt, de nem az arabinózt és a xilózt. A T biotípust újabban P. trehalosi néven önálló fajnak tekintik. 7. táblázat - A fontosabb Pasteurella fajok biokémiai sajátságai P. P. P. P. P. Próba multocid a pneumotropic a haemolytic a aerogene s anatipestife r Hemolízi s + Indol + + H 2S + + +/ + Ureáz NO 3 NO Glükóz Laktóz +/ +/ Mannit + + +/ Maltóz A D buroktípusú P. multocida törzsek egy része a sertés orrnyálkahártyáját károsító hőlabilis citotoxinokat termel. A P. haemolytica törzsek is termelnek a tüdő macrophagjait károsító citotoxint. Antigénszerkezet. A P. multocida törzsek a sejtfalban levő O- és a burokban található poliszacharid antigénjeik alapján agglutinációs próbákkal szerotípusokba sorolhatók. A P. multocida törzsek O-antigénjeik alapján 11 típusba (Namioka), a poliszacharid burokantigénjeik alapján pedig A, B, D, E és F típusokba (Carter) sorolhatók. Az A típusú törzsekben a burok hialuronsavból áll, ezek a törzsek mukoid telepekben nőnek. Az O- antigének több komponensből állnak, amelyek egymással számos keresztagglutinációt adnak. Az agglutinációs próba okozta nehézségek elkerülése végett kialakítottak egy másik tipizálási rendszert is, amely az egyes izolátumok kivonatantigénjeit agargél-precipitációs próbával vizsgálja. Ez utóbbi rendszer szerint a P. multocida törzsek ez ideig legalább 16 szerotípusba sorolhatók (Heddleston-típusok). A két tipizálási rendszer egymással nem hasonlítható össze. A P. haemolytica törzsek passzív hemagglutinációs próbával felületi poliszacharid antigénjeik alapján ez ideig 17 szerotípusba sorolhatók. Közülük a szarvasmarhát rendszerint az 1-es és a 2-es típusú törzsek betegítik meg, juhokban azonban valamennyi egyéb szerotípus előfordulhat. 108

129 Részletes bakteriológia Ellenálló képesség. A kevéssé ellenálló baktériumok közé tartoznak. Beszáradva 2 3 nap alatt elpusztulnak, a vérben és a bélsárban sem maradnak 10 napnál hosszabb ideig életben. 60 C-on percek alatt elpusztulnak, a formalin vagy a klórlúg 1 3%-os oldata ugyancsak percek alatt elöli őket. Pathogenitás. A pasteurellák fakultatív pathogenek, a törzsek virulenciája azonban tág határok között változik. A virulens P. multocida törzsek, főleg az A, kisebb részben a D buroktípusba tartoznak, szarvasmarhában, juhban, kecskében, ritkán állatkerti és vadon élő kérődzőkben bronchopneumoniát, esetenként septikaemiát, mastitist stb., sertésben szórványosan pneumoniát, nyulakban náthával, orrfolyással járó tüneteket, bronchopneumoniát, tüdőgyulladást, septikaemiát, a baromfifajokban (főleg kacsában, libában, pulykában) pedig heveny septikaemiával járó baromficholerát idéznek elő. Sertésben citotoxinokat termelő, D buroktípusú törzsek idézik elő a torzító orrgyulladást. A P. multocida gyakran másodlagos kórokozóként társul különféle légúti vírusos betegségekhez. Trópusi területeken a P. multocida B (Ázsiában) és E (Afrikában) típusú törzsei okozzák a szarvasmarha és a bivaly, továbbá számos házi és vadon élő kérődző vérzéses septikaemiáját (bivalyvész). A P. haemolytica A biotípusú törzsei szarvasmarhában, juhban, kecskében és egyéb kérődzőkben okoznak tüdőés mellhártyagyulladást, tőgy- és ízületgyulladást, alkalmanként septikaemiát. A P. haemolytica T biotípusú törzsei idézik elő a növendék juhok ún. heveny szisztémás pasteurellosisát, tüdőgyulladásos esetekből viszont ritkán izolálhatók. A kísérleti állatok közül az egér, a nyúl, a tyúk és a galambok virulens P. multocida törzs tenyészetével parenteralisan fertőzve 1 3 nap alatt vérfertőzésben elhullanak. A virulenciájukban csökkent törzsek a kísérleti állatokat egyáltalán nem betegítik meg, vagy csupán enyhe lefolyású betegséget okoznak. A P. haemolytica törzsekkel a fehéregerek nem betegíthetők meg Egyéb pasteurella fajok A P. pneumotropica véresagaron hemolízist nem okoz, a P. multocidától egyebek mellett különbözik abban, hogy ureáz-pozitív. Természetes viszonyok között előfordul a rágcsálók, továbbá a kutya és a macska száj- és garatüregében. Esetenként rágcsálókban pneumoniát, továbbá harapások következtében emberben, állatban egyaránt sebfertőzést, tályogképződést okozhat. A P. aerogenes ugyancsak ureáz-pozitív, emellett glükózból kevés gázt is termel. Megtalálható a sertés szájüregében és az emésztőcsatornában, esetenként tüdőgyulladást, ritkán vetélést okoz sertésben, továbbá harapások következtében sebfertőzést, tályogképződést emberben. A P. canis, a P. dagmatis, a P. stomatis néven leírt fajok, a kutya, a macska, ritkán az ember szájüregének természetes lakói, saprophyták, az előbbi két faj esetenként kutya-, macskaharapást követő sebekből tenyészthető ki emberből. A P. caballi lovakban okozhat légúti fertőzéseket. A P. avium és a P. gallinarum fajok természetes lakói a csirke, a pulyka és más baromfifajok légutainak, saprophyták. Pasteurella (Riemerella) anatipestifer. A pasteurellákhoz hasonló, rövid, coccoid pálcika alakú, csilló nélküli baktérium. Legjobban főtt vért tartalmazó agaron (csokoládéagar), 10% szén-dioxidot is tartalmazó légtérben, 37 C-on tenyészthető. Kataláz- és oxidáz-pozitív, a nitrátot azonban nem redukálja, ureáz-pozitív. A szénhidrátok egy részét lassan és gyengén bontja, számos extracelluláris enzimet termel, elfolyósítja a zselatint, az alvasztott vérsavót és a tojástartalmú táptalajokat. Agglutinációs próbával, felületi antigénjeik alapján a különböző madárfajokból és földrajzi régiókból izolált törzsek ez ideig legalább 19 szerotípusba sorolhatók. A korábban leírt típusokat egy ideig az ábécé nagybetűivel jelölték. Fakultatív pathogen baktérium, természetes viszonyok között is megtalálható a kacsafélék légutainak nyálkahártyáján, fiatal kacsákban, libákban, hattyúban, ritkán más házi- és vadon élő madárfajokban okoz lázas általános tünetekkel, savós-fibrines hashártya-, légzsák- és szívburokgyulladással járó septikaemiát. 109

130 Részletes bakteriológia Ornithobacterium rhinotracheale Morfológia. Gram-negatív, rövid pálcika alakú, csilló nélküli baktérium. A tenyészetekből készített kenetben 1 3 µm-es, a pasteurellákhoz hasonlóan gyakran bipolárisan fertőző pálcikák és hosszabb fonalak is láthatók. Tenyésztés. Tápanyagban gazdag táptalajokat igényel. Mikroaerofil, 10% CO 2-ot is tartalmazó légtérben, véresagaron tenyésztve telepei 48 óra múltán jelennek meg, aprók, fénylők, kerekek, szürkésfehérek, vajszerűen kenhetők. Közönséges levesben nem ered meg, triptont, élesztőkivonatot és vérsavót tartalmazó levesben viszont finom, egyenletes zavarosodást okoz. Biokémiai tulajdonságok. Kataláz-negatív, oxidáz-pozitív, indolt nem termel, a nitrátot nem redukálja, viszont ureáz- és Voges Proskauer-pozitív. A szénhidrátbontás fermentatív, a szénhidrátokat savtermeléssel bontja. Extracellularis hialuronidázt termel. Ellenálló képessége kicsi. Beszáradva a környezetben néhány nap alatt elpusztul, 4 C-on azonban legalább 11 napig életképes marad. Pathogenitás. Természetes viszonyok között megtalálható a pulyka, a csirke és néhány más madárfaj (fogoly, varjú) orrüregében és felső légutaiban. Fakultatív pathogen, fiatal pulykában, csirkében okoz a légcső mélyebb részének gyulladásával, nehezített légzéssel és jelentős elhullással járó betegséget Actinobacillus Pleomorf baktériumok, a mikroszkópos képben coccoid alakok, rövid pálcikák és hosszabb fonalak egyaránt láthatók. Gram-negatívok, csilló és spóra nélküliek, aerobok, fakultatív anaerobok. Természetes viszonyok között megtalálhatók a különféle állatfajok szájüregében, az emésztőcsatornában, a légutak és a nemi szervek nyálkahártyáin, fakultatív pathogenek. Az utóbbi évtizedben számos, korábban a Pasteurella vagy a Haemophilus nemzetségbe tartozó fajt soroltak ide Actinobacillus lignieresii Természetes viszonyok között megtalálható a szarvasmarha és a juh szájüregében, valamint a bendőben. Morfológia. Fiatal tenyészeteiben apró, 1 1,2 µm hosszú pálcikák. A fertőzött, ellágyult szövetekben az apró coccobacilusok mellett az actinomycosishoz hasonló tőkék is láthatók, amelyek rozettaszerűen rendeződött, megnyúlt Gram-negatív baktériumokból állnak. Megfesthetők azonban pl. eozinnal. Tenyésztés. Levegőn, 37 C-on könnyen tenyészthető. Közönséges agaron óra alatt apró, domború, kékesfehéren fénylő telepek fejlődnek, amelyek erősen tapadnak a táptalajhoz. Hasonló, de valamivel dúsabb tenyészeteket kapunk véresagaron. Közönséges levesben pelyhes üledék képződik, ritkábban az egész leves egyenletesen megzavarosodik. Biokémiai sajátságok. Kataláz- és oxidáz-pozitív, szénhidrátbontása fermentatív. A nitrátokat nitritté redukálja, ureáz-pozitív, H 2S-t termel, a glükózt, a laktózt, a szacharózt és még néhány más szénhidrátot savképzéssel elbontja. Ellenálló képesség. Igen érzékeny, tenyészetei is néhány nap múltán kipusztulnak. Pathogenitás. Sérülések, fogváltás stb. következtében jut a szövetek közé. Szarvasmarhában és juhban, ritkán egyéb állatfajokban okoz idült, a szövetek beolvadásával és kötőszövet-szaporodással járó gyulladást (actinobacillosist), a nyelvben, a szájüregben, a légutakban, a tőgyben, ritkábban egyéb szövetekben. A laboratóriumi kísérleti állatokat nem betegíti meg. Nagy mennyiségű tenyészetet hím tengerimalac hasüregébe fecskendezve azonban hashártya-, here- és hereborék-gyulladás alakul ki Actinobacillus equuli Megtalálható az egészséges lovak szájüregében, tonsilláiban és bélcsatornájában, de alkalmanként kitenyészthető sertésekből is. Morfológia. Polimorf, rövid, 1 2 µm hosszú pálcikák mellett hosszabb fonalak is láthatók a mikroszkópos képben. 110

131 Részletes bakteriológia Tenyésztés. Közönséges agaron, 37 C-on 1 2 nap alatt viszonylag nagy, 2 3 mm átmérőjű, domború, kerek vagy csillagszerűen lebenyezett, feltűnően nyúlós telepek (Bacterium pyosepticum viscosum) alakulnak ki. Közönséges levesben tenyésztve nyúlós üledék képződik. Biokémiai sajátságok. Főbb biokémiai sajátságai megegyeznek az A. lignieresiiével, különbözik azonban tőle abban, hogy elbontja a raffinózt és a trehalózt, a zselatint pedig többnyire elfolyósítja. Pathogenitás. Újszülött csikókban köldökgyulladást, septikaemiát, gennyes ízületgyulladást, vesegyulladást, felnőtt lovakban pedig, a belső szervekben tályogképződéssel járó septikaemiát (ún. pyoseptikaemiát) okoz. A csikókhoz hasonlóan megbetegítheti a malacokat, ritkán egyéb állatfajokat is Actinobacillus suis Megtalálható a sertések felső légutaiban, a tonsillákban, alkalmanként a nemi szervek nyálkahártyáin. Közönséges agaron alig szaporodik, véresagaron 24 óra alatt 1 2 mm átmérőjű, domború, szürkésfehér, bétahemolízist okozó telepeket képez, amelyek nem tapadnak a táptalajhoz. Kataláz- és oxidáz-pozitívok, ureázpozitívok, indolt nem termelnek, a törzsek egy része H 2S-pozitív. Glükózból, szacharózból, laktózból és sok más szénhidrátból savat képeznek. A kóros anyagokból gyakran izolálhatók a típustól eltérő biokémiai viselkedésű törzsek, ezek egy részét ma már önálló fajnak tekintik (A. rossii, Pasteurella mairii). Felnőtt sertésekben szórványosan septikaemiát, metritist, vetélést, újszülött és szopós malacokban septikaemiát idéz elő Actinobacillus seminis Természetes előfordulási helye a kosok genitális nyálkahártyái, jelen lehet tünetmentes kosok ondójában is. Véresagaron, 10% CO 2-dal dúsított légtérben óra alatt gombostűfejnyi, enyhén domború, szürkésfehér, vajszerűen kenhető telepeket képez, nem okoz hemolízist. Kataláz-, oxidáz-pozitív, a nitrátot nitritté redukálja, H 2S-pozitív, de ureáz- és indol-negatív. Glükózból és néhány más szénhidrátból savat termel. Különböző biotípusai léteznek. Fakultatív pathogen, kosokban a járulékos nemi mirigyek gyulladásával, ritkábban mellékhere-gyulladással járó betegséget, anyajuhokban pedig vetélést okozhat. Elvétve izolálható növendék juhok pyelonephritiséből is Actinobacillus (Pasteurella) ureae Szórványosan előfordul az ember légúti nyálkahártyáin. Szemben az A. suiszszal véresagaron nem okoz hemolízist, kataláz- és oxidáz-pozitív, ureáz-pozitív, glükózból, mannitból és néhány más szénhidrátból savat termel. Emberben okoz ritkán légúti tüneteket. Hogy valójában állatokban előfordul-e és okoz-e betegséget, nem tudjuk Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae Morfológia. Coccoid, rövid pálcikák, vékony poliszacharid burkuk van. A törzsek egy részének a felületén fimbriák vannak. Tenyésztés. Igényes baktériumok, tenyésztésükhöz élesztő- és szójakivonatot tartalmazó agar táptalajokat, véresagart vagy csokoládéagart használunk. Telepeik csokoládéagaron 48 óra múlva 1 2 mm átmérőjűek, szürkésfehérek, véresagaron erős béta-hemolízist okoznak. Élesztőkivonatot is tartalmazó leves táptalajokban finom, egyenletes zavarosodást okoznak. Az A. pleuropneumoniae törzseknek két biotípusa van. Az 1-es biotípusba tartozó törzsek tenyésztésükhöz NAD-ot (V-faktort) igényelnek, ezek csak élesztőkivonatot is tartalmazó táptalajokon vagy a haemophilusokhoz hasonlóan Staphylococcus dajkatelepek mellett tenyészthetők, amikor is jellegzetes dependencia figyelhető meg (41. ábra). A 2-es biotípusú törzsek NAD-ot nem igényelnek, ezért NAD nélkül is jól szaporodnak, telepeik valamivel nagyobbak, mint az 1-es biotípusú törzseké, véresagaron erőteljesebb béta-hemolízist okoznak, s levestenyészetekben jobban szaporodnak. 41. ábra - Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae agar táptalajon Staphylococcus dajkatelepek mellett 111

132 Részletes bakteriológia Biokémiai tulajdonságok. Kataláz-negatívok, oxidáz-pozitívok, szénhidrátbontásuk fermentatív, a nitrátot nitritté redukálják, ureáz-pozitívok. Glükózból, laktózból, mannitból és számos más szénhidrátból savat képeznek. Az A. pleuropneumoniae törzsek legalább háromféle, hemolitikus és toxikus hatású citotoxint (Apx I II III) termelnek. A citotoxinok virulenciafaktorok. Egyes törzsek csak az egyik, mások kétféle vagy akár mind a háromféle toxint termelik. A citotoxinokkal szemben immunsavók állíthatók elő, amelyek a megfelelő citotoxint neutralizálják függetlenül attól, hogy azt milyen típusú törzs termelte. A citotoxinokat újabban vakcinák készítésére is felhasználják. Antigénszerkezet. Az A. pleuropneumoniae 1-es biotípusú törzsei felületi poliszacharid antigénjeik alapján, agglutinációs próbával, passzív hemagglutinációval, immunfluorescenciás próbákkal és koagglutinációs próbával ez ideig 12 szerotípusba, a 2-es biotípusba tartozó törzsek pedig eddig 3 szerotípusba sorolhatók. A megbetegedések túlnyomó többségét az 1-es biotípusú törzsek okozzák, ezen belül nálunk a 2-es és az 1-es szerotípusok fordulnak elő leggyakrabban. Ellenálló képesség. Az A. pleuropneumoniae ellenálló képessége csekély. A beszáradás néhány nap alatt, 60 C, továbbá a szokásos fertőtlenítőszerek pedig percek alatt elpusztítják. Pathogenitás. Az A. pleuropneumoniae sertésekben okoz heveny vérzéses, elhalásos tüdő- és mellhártyagyulladást (pleuropneumoniát), ritkábban más kórformákat (septikaemiát, endocarditist) Haemophilus Az ide tartozó fajok az ember és az állatok nyálkahártyáin, főleg a felső légutakban, egyes fajok pedig a nemi szervek nyálkahártyáin találhatók meg, a külvilágban nem fordulnak elő. Valamennyiüket jellemzi, hogy növekedésükhöz kiegészítő anyagokat igényelnek. Morfológia. A baktériumok megjelenési formája fajonként és a tenyésztés körülményeitől függően változik. Kóros váladékokban rendszerint rövid, 0,5 2 µm hosszú coccobacillusok, idősebb tenyészetekben gyakoriak a 112

133 Részletes bakteriológia hosszabb-rövidebb fonalak is. Csillóik nincsenek, egyik-másik faj azonban frissen kitenyésztve burkot képez. Egyes fajok felületén fimbriák találhatók. Gram-negatívak, jól megfesthetők fukszinnal. Tenyésztés. Igen kényes baktériumok, a szokásos egyszerű táptalajokon nem szaporodnak. Növekedésükhöz kétféle kiegészítő anyagot, vastartalmú hemet (X- faktort) és nikotinsav-adenin-dinukleotidot (V-faktort) igényelnek. A fajok egy része növekedéséhez mindkét faktort igényli, más része azonban csak az egyiket vagy csak a másikat. Az X-faktor hőstabil, a V-faktor hőérzékeny. A haemophilusok X-faktor-igénye kielégíthető a táptalajhoz 80 C-on hozzákevert vérrel (csokoládéagar), a V-faktort pedig, mivel azt az élesztő bőven tartalmazza, élesztőkivonat formájában adjuk a táptalajhoz vagy a tenyésztést ún. dajkatelepek segítségével végezzük. A V-faktort ugyanis egyes baktériumfajok (Staphylococcus, Micrococcus stb.) növekedésük során önmaguk előállítják, ezért ha a haemophilusok tenyésztésére szolgáló, a vizsgálati anyaggal már beoltott csokoládéagar felületére egy-két csíkban megfelelő dajkatörzset oltunk, a haemophilusok a dajkatelepekből kidiffundáló V-faktor hatására csak e telepek közelében fejlődnek ki (42. ábra). A haemophilusok, ugyancsak dajkatörzs felhasználásával, jól elszaporíthatók a mycoplasmák (1ásd. később) tenyésztésére szolgáló agar táptalajokon is. 42. ábra - Haemophilus paragallinarum telepek főtt vért tartalmazó agartáptalajon, Staphylococcus dajkatenyészet mellett Aerobok, fakultatív anaerobok, a fajok egy része azonban növekedéséhez legalább 10% CO 2-ot is tartalmazó légteret igényel, tenyésztésük optimális hőmérséklete 37 C. Csokoládéagaron 1 2 nap alatt valamennyi Haemophilus faj apró, enyhén domború, cseppszerű, fénylő telepeket formál. A V-faktort igénylő telepek csupán a dajkatelepek körül, míg az X-faktort igénylők másutt is képeznek telepeket. Véresagaron a haemophilusok lényegesen nehezebben szaporodnak, kolóniáik a dajkatelepek szomszédságában is aprók. Egyik-másik faj a vörös vértesteket feloldja. Leves táptalajokban csak akkor erednek meg, ha azok a szükséges kiegészítő anyagokat is tartalmazzák, a szaporodás azonban ilyenkor is gyér. Biokémiai sajátságok. Vizsgálatuk meglehetősen nehéz. A nitrátokat nitritté redukálják, fermentatívan elbontják a glükózt és még néhány más szénhidrátot. Fajokba sorolásuk eredetük, növekedésbeli igényeik, biokémiai sajátságaik stb. együttes figyelembevételével történik. 113

134 Részletes bakteriológia Antigénszerkezet. A haemophilusok sejtfalantigénjeik, illetve poliszacharid burokantigénjeik alapján szerocsoportokba, szerotípusokba sorolhatók. Ellenálló képesség. Ellenálló képességük igen kicsi, tenyészeteikben is kipusztulnak 3 7 nap alatt. Pathogenitás. Fakultatív pathogenek, számos fajuk ismert. Az emberben előforduló fajok közül a H. influenzae légúti fertőzéseket okoz, a b-poliszacharid burokantigénű törzsek pedig, főleg gyermekekben, meningitist idéznek elő. Az állatokban előforduló fajok közül az alábbiak fontosak Haemophilus parasuis Csokoládéagaron, 5 10% CO 2-ot is tartalmazó levegő jelenlétében tenyészthető, csupán NAD-ot igényel. A korábban H. suisnak tekintett törzsekről kiderült, hogy ezek is csupán NAD-ot igényelnek tenyésztésükhöz, ezért ezek is valójában H. parasuis baktériumok. Kataláz-pozitív, glükózból, galaktózból, mannózból savat termel. Sejtfalkivonataikat gélprecipitációs próbával vizsgálva, hőstabil antigénjeik alapján a törzsek eddig legalább 15 szerotípusba sorolhatók. A sertésben betegséget okozó törzsek szerotípusai földrajzi régiónként jelentősen különböznek egymástól. Fakultatív pathogen, megtalálható az egészséges sertések orrüregében. Fiatal, 2 6 hetes malacokban a savóshártyák, az ízületek és esetenként az agyburok gyulladásával járó (Glässer-féle) betegséget idéz elő Haemophilus paragallinarum Csokoládéagaron 10% CO 2-ot is tartalmazó légtérben tenyészthető, kiegészítőanyagként csak NAD-ot igényel. Kataláz- és oxidáz-negatív. A virulens törzseknek vékony burkuk van. Felületi antigénjeik alapján legalább három szerotípusba sorolhatók. Pathogenitás. Fakultatív pathogen, természetes körülmények között megtalálhatók a tenyésztett és vadon élő madarak orrüregében és a felső légutak nyálkahártyáin. Növendék és fiatal tojótyúk állományokban idéz elő a felső légutakra és a fejre korlátozódó, lázas általános tünetekkel járó betegséget (haemophilus nátha) Haemophilus somnus Bár a tápanyagok iránt igényes, sem X-, sem pedig V-faktort nem igényel. Véresagaron is, de még jobban csokoládéagaron, 10% CO 2-ot is tartalmazó légtérben tenyészthető. Telepei 48 óra múltán is aprók, sárgás színűek. Kataláz-negatív, oxidáz-pozitív, indolt termel. A törzsek antigénszerkezetileg heterogének. A sejtfal külső rétegéből készített antigénkivonatokat ELISA-ban vizsgálva a H. somnus törzsek ez ideig legalább 11 szerotípusba (csoportba) sorolhatók. Természetes viszonyok között előfordul a szarvasmarha urogenitalis nyálkahártyáin, bikákban főként a tasak nyálkahártyáján, nőivarúakban a hüvelyben, de alkalmanként a légutakban is. Megtalálható ezenkívül juhokban is. A juhokból izolált Histophilus ovis és Haemophilus agni néven leírt fajok azonosnak tekinthetők a Haemophilus somnusszal. A H. somnus fakultatív pathogen, növendék és felnőtt szarvasmarhában tromboemboliás meningoencephalitist, légúti fertőzéseket, ízületgyulladást, a nemi szervekbe beszaporodva reprodukciós zavarokat, borjakban elhúzódó tüdő- és ízületgyulladást idéz elő. Juhok közül kosokban mellékhere- és heregyulladást, anyajuhokban szórványosan vetélést, tőgygyulladást, bárányokban pedig septikaemiát és ízületgyulladást okozhat Taylorella equigenitalis Apró, Gram-negatív, a haemophilusokhoz hasonló coccobacillus (korábbi nevén Haemophilus equigenitalis), alkalmanként azonban hosszabb fonalakat is képez, csillói nincsenek. Mikroaerofil, lóvérrel készült csokoládéagaron, 10% CO 2-ot is tartalmazó levegőn tenyészthető 37 C-on. Telepei 2 3 nap múlva válnak láthatóvá, aprók, szürkésfehérek, vajszerű konzisztenciájúak. Szaporodásához sem X-, sem V-faktort nem igényel. Véresagaron növekedése igen gyenge, az egyéb, szokásosan használt táptalajokban nem ered meg. A törzsek szelektív izolálására streptomicint is tartalmazó csokoládéagar használható, utóbb azonban streptomicinre érzékeny törzseket is találtak. Az anyagcsere típusa oxidatív, kataláz- és oxidáz-pozitív, alkalikus foszfatáz enzimet termel, az egyéb szokásos biokémiai próbákban viszont negatív. 114

135 Részletes bakteriológia Ellenálló képessége igen kicsi, a külvilágban nem marad életben. Megtalálható a klinikailag tünetmentes tenyészmének külső nemi szerveinek nyálkahártyáján, ezek tartják fenn a kórokozót, de hónapokig jelen lehet a fertőzött kancák külső nemi szerveinek nyálkahártyaredői között is. A mének tünetmentesek maradnak, a fedeztetés útján, frissen fertőződött kancákban viszont, gyorsan terjedő heveny metritist okoz (a ló ragályos méhgyulladása). A laboratóriumi kísérleti állatok a kórokozó iránt nem fogékonyak Francisella tularensis Coccoid, 0,5 2 µm hosszú, Gram-negatív, csilló nélküli baktérium, a pasteurellákhoz hasonlóan gyakran bipolárisan festődik. A virulens törzseknek vékony burkuk van. Tenyésztés. Obligát aerob, közönséges és véresagaron nem ered meg, tenyésztéséhez ciszteint vagy cisztint igényel. Tenyészthető glükózt, nyúlsavót és ciszteint tartalmazó (Francis-féle) véresagaron, továbbá glükóz- és ciszteintartalmú alvasztott tojássárgáján. Ezeken a táptalajokon, 37 C-on, 3 4 nap alatt, 2 3 mm átmérőjű félgömbszerűen fölemelkedő, fénylő, kissé nyálkás konzisztenciájú telepek képződnek. Hemolízist nem okoz. A primer tenyészeteket továbboltva a telepek rendszerint már 24 óra alatt kialakulnak, főleg, ha bőséges mennyiségű tenyészetet oltottunk tovább. Folyékony táptalajokban cisztein jelenlétében sem szaporodik el. Biokémiai sajátságok. Kataláz-pozitív, oxidáz-negatív, a ciszteinből H 2S-t termel. Glükózból és néhány más szénhidrátból gázképződés nélkül kismennyiségű savat termel. Egyes szénhidrátok bontása és néhány más biokémiai tulajdonság alapján legalább két biotípus (egyesek szerint alfaj; A biotípus, F. tularensis var. tularensis és B biotípus, F. tularensis var. palaearctica vagy ez utóbbi újabban F.tularensis var. holarctica) különböztethető meg. A törzsek antigénszerkezetileg egységesek, szerológiailag rokon a brucellákkal és a Yersinia pestisel. Az agglutinációs próbát felhasználjuk a kitenyésztett törzsek azonosítására. Ellenálló képesség. Ellenálló képessége kisfokú. Tenyészetei hűtőszekrényben 2 hónapig életképesek, 60 C-on és fertőtlenítőszerek hatására azonban perceken belül elpusztulnak. Pathogenitás. A F. tularensis az északi félteke országaiban mindenütt előfordul. Az A biotípus, úgy látszik, csak Észak-Amerikában, a B típus viszont Észak-Amerikán kívül Európában és egész Ázsiában is honos, emellett az A típus pathogenitása nagyobb, mint a B típusé. A F. tularensis megbetegítőképessége igen széles körű. Természetes gazdái a vadon élő rágcsálók, főleg a pocok, a vízipatkány, a pézsmapatkány és a hód, de megtelepszik madarakban is. Nagyon fogékony iránta a pocok, az egér, a hörcsög, a mókus és számos más vadon élő rágcsáló, ezek, ha fertőződnek, rendszerint kivétel nélkül el is pusztulnak. Megbetegíti a mezei nyulat, a legtöbb háziállatfajt és az embert is. Ezekben a fajokban septikaemiát, a nyirokcsomók gyulladásával és a parenchymás szervekben elhalásos gócok képződésével járó betegséget (tularaemiát) okoz. Hullából származó vizsgálati anyagnak vagy tenyészetnek parenterális befecskendezésével a laboratóriumi rágcsálók (egér, tengerimalac), valamint a vadon élő kis rágcsálók könnyen megbetegíthetők, ezek rendszerint 4 10 nap alatt vérfertőzésben elpusztulnak. A fertőzés per os is megered. Az elhullott állatokban lépduzzanat, a lépben és a májban apró elhalásos gócok láthatók. A házinyúl és a patkány a parenterális fertőzésnek is ellenáll, vérükben azonban ellenanyagok jelennek meg Brucella Coccoid, rövid pálcika alakú baktériumok, kivétel nélkül pathogenek, természetes viszonyok között csupán a fertőzött szervezetekben képesek szaporodni. Morfológia. A brucellák 0,6 1,5 µm hosszú pálcikák. Csillóik nincsenek, burkot nem képeznek. Gramnegatívok, szelektív festésükre viszonylagos savállóságuk alapján a Köster-féle festés használatos. A láng felett fixált kenetet 3%-os vizes szafranin-oldattal 3 5 percig festjük úgy, hogy közben a festékoldatot gőzölésig melegítjük. A festéket leöntve a kenetet néhány másodpercig 0,5%-os kénsavval kivonjuk, majd alapos vízöblítés után vizes metilénkékkel kontrasztfestést végzünk. A készítményben a brucellák pirosak, minden egyéb baktérium és sejtes elem pedig kék színű. A magzatburkokról vett lenyomati készítményekben a brucellák egy része rendszerint intracellulárisan, phagocytákba foglaltan látható (43. ábra). 43. ábra - Brucella abortus vetélt szarvasmarhamagzat burkában, intracellulárisan (Köster-féle festés, 1250 ) 115

136 Részletes bakteriológia Tenyésztés. A brucellák obligát aerobok, testhőmérsékleten szaporíthatók. A szervekből, váladékokból való kitenyésztésükhöz a B. abortus törzsek többsége és a B. ovis 5 10% CO 2-ot tartalmazó légkört igényel. Többszöri átoltás után a törzsek CO 2-igényüket elveszthetik (kivétel a B. ovis). A táptalajok iránt igényesek, növekedésükhöz vitaminokra (tiaminra, nikotinsav-amidra, biotinra és pantoténsavra) is szükségük van. A brucellákat triptont, glükózt és élesztőkivonatot tartalmazó véresagaron izoláljuk, többségük elszaporítható azonban közönséges agaron és levesben is. A szervekből, váladékokból kitenyésztett B. melitensis, B. abortus és B. suis törzsek primer tenyészeteikben rendszerint S típusú telepeket képeznek. A B. ovis és a B. canis törzsek viszont primer tenyészeteikben is R-telepeket formálnak. Triptontartalmú véresagaron a brucellák 48 óra alatt igen apró, domború, átlátszó, sárgás színű telepeket képeznek. A telepek a további tenyésztés során megnagyobbodnak, átlátszóságukat elvesztik. Erősen szennyezett vizsgálati anyagokból (magzatburkokból, vetélt magzatokból) való kitenyésztésükhöz antibiotikumokat (polimixint, bacitracint) és ciklo-heximidet is tartalmazó táptalajokat veszünk igénybe. Szükség esetén a vizsgálati anyagból kísérleti állatokat (tengerimalacot) oltunk. Biokémiai sajátságok. A brucellák kataláz-pozitívak, az oxidáz-próbában a B. ovis és a B. neotomae kivételével ugyancsak pozitív reakciót adnak. A karbamidot változó mértékben hidrolizálják, a nitrátokat nitritté redukálják, indolt nem képeznek. A glükóz kivételével a bakteriológiában használatos szénhidrátok többségét nem vagy alig bontják, szénhidrátbontásuk oxidatív. A brucellák osztályozása. A brucellák fajokba sorolását fágérzékenységük (pl. Tbiliszi-fág), oxidatív metabolizmusuk (az egyes aminosavakat és szénhidrátokat mekkora oxigénfogyasztás mellett metabolizálják), továbbá természetes gazdáik szerint végezzük. Egyes fajok CO 2- igényük, kénhidrogén-termelésük, bázikus fukszin- és tionintűrésük, továbbá kimerített immunsavókban való agglutinációjuk alapján biotípusokba sorolhatók (8. táblázat). 8. táblázat - A Brucella fajok és biotípusok tulajdonságai Faj Biotípu s TBfágérzékenység CO 2- H 2S- Növekedés * Agglutináció Természete s 116

137 Részletes bakteriológia igény termelé s fukszin - tionin- kimerített savókban gazda RTD 10 4 RTD agaron agaron A M B Juh, kecske meliten tis B. abortus / / + _ / / / Szarvasmar ha B. suis Sertés, Sertés és mezeinyúl Sertés, Rénszarvas B. neotom ae + + Patkány B. ovis + +/ + Juh B. canis /+ +/ Kutya TB: Tbiliszi RTD: routine test dilution (rutinhigítás) *: a festék koncentrációja 1 :

138 Részletes bakteriológia Antigénszerkezet. A brucellák szoros antigénszerkezeti rokonságban állnak egymással. A B. abortus vagy a B. suis törzzsel termelt immunsavóban valamennyi S-telepeket képező Brucella faj agglutinálódik. Az S- teleptípusú törzsek a sejtfalban található (A és M betűvel jelölt) lipopoliszacharid-antigének alapján, megfelelő standard, kimerített immunsavókkal biotípusokba sorolhatók (lásd később). A csupán R-telepekben szaporodó B. ovis és B. canis antigénszerkezetileg is különbözik az előbb említett fajoktól. Az R-telepű B. ovisszal készített immunsavóban azonban mindkét faj agglutinálódik. A B. ovisból kivont szolubilis antigének a komplementkötési és a precipitációs próbában a homológ immunsavókkal pozitív, az összes többi Brucella fajjal előállított immunsavókkal negatív eredményt adnak. Szerológiailag (és biológiailag) aktív antigénkivonatok más Brucella fajokból is előállíthatók. Ellenálló képesség. A brucellák ellenálló képessége közepes. Magzatburokban, bélsárban stb. hónapokig életképesek ugyan, beszáradva azonban rendszerint napok alatt elpusztulnak. A tejben ugyancsak hónapokig megőrizhetik fertőzőképességüket, a tej savanyodása azonban 1 2 hét alatt elpusztítja őket. 60 C-on percek alatt elpusztulnak, így a pasztőrözött tejben is biztosan tönkremennek. A szokásos fertőtlenítőszerekkel ugyancsak könnyen elpusztíthatók. Pathogenitás. Idült gyulladásos folyamatokat okoznak, főleg a nemi szervekben, hímekben a mellékhere- és heregyulladás, nőivarúakban a vetélés a legfőbb tünet (brucellosis). A B. melitensis a juh és a kecske brucellosisának az okozója, de megtelepszik szarvasmarhában is, nálunk eddig nem fordult elő. A B. abortus a szarvasmarha, a B. suis pedig a sertés brucellosisának az okozója. Közülük a B. suis 2-es biotípusa megbetegítheti a mezeinyulat is. A B. suis biotípusai megtelepedhetnek más vadon élő rágcsáló- és ragadozófajokban is. A B. abortus és a B. suis a szarvasmarha- és a sertésbrucellosis felszámolásának eredményeként nálunk már nem fordul elő. A B. abortus egy virulenciájában gyengült B 19 jelű törzsét élő és az ugyancsak B. abortus, de R típusú 45/20 jelű törzsét pedig elölt állapotban, korábban szarvasmarhák védőoltására vettük igénybe. A B. ovis a kosok fertőző mellékhere- és heregyulladását, ritkán vemhes juhok vetélését idézi elő. A B. canis kutyában okoz idült fertőzést, magzatkárosodást, nálunk ez ideig nem izolálták. A B. neotomaeteddig kizárólag Észak-Amerikában izolálták, sivatagi patkányból. B. abortusszal, vagy B. suisszal hasüregbe vagy bőr alá fertőzött tengerimalacok néhány hét múlva megbetegszenek, a lépük megduzzad, a szervekben gyulladásos, elhalásos gócok keletkeznek. A vemhes tengerimalacok rendszerint elvetélnek. Az elhullott vagy leölt állatok szerveiből a brucellák mikroszkópos vizsgálattal és tenyésztéssel egyaránt kimutathatók. Néhány hét múlva azonban a fertőzött tengerimalacok vérét is megvizsgálhatjuk agglutinációs próbával brucellák elleni ellenanyagokra. A B. abortusszal vagy B. suisszal fertőzött egerekben vérfertőzés alakul ki, mely rendszerint 1 hét alatt az egerek elhullásához vezet Bordetella Rövid, pálcika alakú, Gram-negatív, obligát aerob baktériumok. Megtalálhatók a különféle emlősfajok és a madarak légutainak a nyálkahártyáin. Az ide tartozó fajok közül a B. pertussis és a B. parapertussis emberben fordul elő, a szamárköhögés okozói. Az utóbbi faj ritkán állatok orrüregéből is izolálható. Az állatokban két fajuk, a B. bronchiseptica és a B. avium fordul elő, ez a két utóbbi faj, szemben az előbbiekkel, körülcsillós. Valamennyien kataláz- és oxidáz-pozitívak, a szénhidrátokat nem bontják. Az állatokban előforduló mindkét faj könnyen tenyészthető közönséges és véresagaron egyaránt Bordetella bronchiseptica Rövid, 2 3 µm hosszú pálcikák (44. ábra). A virulens törzsek burkosak, és felületükön a csillókon kívül fimbriák is találhatók. 44. ábra - Bordetella bronchiseptica agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) 118

139 Részletes bakteriológia Tenyésztés. Közönséges agaron, 48 óra alatt, a virulens törzsek apró, domború, kerek, fénylő telepeket (I-es fázis) formálnak. A telepek néhány nap alatt megnagyobbodnak, szürkésfehér vagy porcelánfehér színűek lesznek. Továbboltva a törzsek fimbriáikat, burkukat könnyen elvesztik, eközben telepküllemük is megváltozik (IV. fázisú, R-telepek). Szelektív izolálására alkalmas a kristályibolyát, epesavas sókat, laktózt, neutrálvöröst, penicillint és nitrofurantoint tartalmazó agar táptalaj, ezen a bordetellák színtelen telepekben fejlődnek. Közönséges levesben egyenletes zavarosodást okoz, kevés szemcsés vagy nyúlós üledékkel. A levest meglúgosítja. Biokémiai sajátságok. A nitrátot nitritté redukálja, ureáz-pozitív. Szénhidrátforrásként csupán citrátot tartalmazó táptalajban is képes szaporodni. A virulens törzsek különféle citotoxinokat termelnek, képesek vörösvérsejteket agglutinálni, a fimbriák jelenléte pedig elősegíti a törzseknek az orr és a légutak nyálkahártya-hámsejtjeihez való tapadását. A citotoxinok egyike dermonecroticus hatású, tengerimalac bőrébe oltva elhalást okoz. Antigénszerkezet. A B. bronchiseptica törzsek több komponensből álló O-antigéneket, a frissen kitenyésztett, virulens törzsek emellett ugyancsak több komponensből álló burok- és fimbriaantigéneket is tartalmaznak. A burokantigének egy része a nemzetség valamennyi tagjában megtalálható, mások csak az egyes fajokban. Ellenálló képesség. Ellenálló képessége csekély, légúti váladékokban beszáradva néhány nap alatt, 60 C-on egy-két perc alatt elpusztul. Ugyancsak percek alatt elpusztul a szokásos fertőtlenítőszerek hatására is. Pathogenitás. Fakultatív pathogen. Természetes viszonyok között megtalálható a sertés, a kutya, a macska, a ló, a nyúl, a különféle egyéb rágcsálók és számos más faj orrüregében, ritkábban felső légúti nyálkahártyáin. Sertésben rhinitist, a P. multocida törzsekkel együtt torzító orrgyulladást, esetenként tüdőgyulladást, kutyában, macskában önállóan vagy különféle vírusok okozta betegségekhez társulva, ezenkívül házinyúl-állományokban náthás tüneteket, bronchitist, bronchopneumoniát okozhat. A B. bronchiseptica átmenetileg megtelepedhet az ember orrüregében is. Laboratóriumi kísérleti állatokban a fertőzés rendszerint nem okoz betegséget Bordetella avium 119

140 Részletes bakteriológia A B. bronchisepticához hasonló méretű, körülcsillós, virulens törzsei burkosak, és a felületükön fimbriák vannak. A tenyésztés iránt igénytelen, közönséges agaron 24 óra alatt apró, kerek, gyöngyszerűen fénylő telepeket képez. A nitrátot nem redukálja, ureáz-negatív. A virulens törzsek különféle, a légúti nyálkahártya hámsejtjeit károsító citotoxinokat, dermonecroticus toxint termelnek, s agglutinálják egyes állatfajok vörösvérsejtjeit. Pathogenitás. Fakultatív pathogen, természetes viszonyok között is jelen van, a pulyka, csirke és más madárfajok légutainak nyálkahártyáin. Növendék pulykában, valószínűen légúti fertőzéseket okozó vírusokhoz társulva, idéz elő a tyúkok haemophilus náthájához hasonló légúti tüneteket Moraxella Rövid, vaskos, Gram-negatív, csilló nélküli, kettesével álló pálcikák (Moraxella subgenus) vagy coccusok (Branhamella subgenus). Aerobok, a szénhidrátokat nem bontják. Természetes viszonyok között ember és a különféle állatfajok nyálkahártyáin, főleg az orr- és a garatüregben, a kötőhártyán, a nemi szervek nyálkahártyáin élnek. Az ide tartozó fajok közül a M. lacunata az emberben okoz kötőhártya- és szaruhártya-gyulladást, időnként azonban izolálható egészséges tengerimalacok kötőhártyájáról és más állatfajokból is. Állatorvosi szempontból a M. bovis és a M. (Branhamella) ovis fontos Moraxella bovis Morfológia. Rövid, 1 3 µm hosszú, vaskos, kettesével álló pálcikák (diplobacilusok). A törzsek egy részének a felületén fimbriák találhatók. Tenyésztés. Közönséges agaron nem vagy alig ered meg, tenyésztéséhez vért vagy vérsavót tartalmazó táptalajok szükségesek. Véresagaron, 37 C-on tenyésztve 24 óra alatt apró tűszúrásnyi, 48 óra alatt azonban nagyobb, 2 3 mm átmérőjű, domború, kerek, fénylő, szürkéssárga telepeket képez. Béta-hemolízist okoz. Alvasztottvérsavó-tartalmú agaron a vérsavó oldása következtében a telepek a táptalajba besüllyednek. Biokémiai sajátságok. Kataláz- és oxidáz-pozitív, a nitrátot nem redukálja. Többféle extracelluláris enzimet, így zselatinázt, hialuronidázt, fibrinolizint, kazeint bontó proteázt stb. termel. Ellenálló képesség. Ellenálló képessége gyenge, a külvilágban igen hamar elpusztul. Tenyészeteiben is csak akkor ered meg, ha a váladékokat néhány órán belül táptalajokra oltjuk. Antigénszerkezet. Fimbriái alapján, agglutinációs próbával a M. bovis törzsek legalább 7 szerocsoportba sorolhatók. A fimbriák teszik képessé a törzseket a szaruhártya hámsejtjeihez való tapadásra, az ilyen törzsek egyúttal agglutinálják a juh- és a sertés-vörösvérsejteket. A fimbriák ellen termelt immunsavókkal az adhézió típusspecifikus módon gátolható. Pathogenitás. Fakultatív pathogen, szarvasmarhában, ritkán bivalyban okoz fertőző kötő- és szaruhártyagyulladást. A béta-hemolízist okozó, fimbriás törzsek kötőhártyára cseppentve megbetegítik az egeret is. Időnként ló kötőhártya-gyulladásából is izolálhatók a M. bovisnak tekintett törzsek Moraxella ovis Lapos felületükkel egymáshoz tapadt zsemlére emlékeztető, párosával előforduló coccusok. A törzsek egy részének a felületén fimbriák találhatók. Tenyésztési tulajdonságaiban nem különbözik a M. bovistól. Kataláz- és oxidáz-pozitív, a nitrátot nitritté redukálja, de nem folyósítja el sem a zselatint, sem pedig a kazeint. A juhból származó törzsek agglutinálják a csirke-vörösvérsejteket. Fakultatív pathogen, természetes viszonyok között megtalálható mind a juh, mind a szarvasmarha kötőhártyáján és orrüregében. Juhokban és kecskékben (gyakran mycoplasmákkal együtt), ezenkívül fiatal borjakban okoz enyhe tünetekkel járó keratoconjunctivitist Pseudomonas 120

141 Részletes bakteriológia Gram-negatív, 1,5 5 µm hosszú, pálcika alakú, többségükben egy vagy néhány polárisan helyeződő csillóval rendelkező baktériumok. Obligát aerobok, számos fajuk pigmenteket termel. Igénytelenek, könnyen tenyészthetők, többségük egyetlen szerves vegyületet tartalmazó közegben is képes szaporodni. A Pseudomonas mallei kivételével a természetben igen széles körben elterjedtek, megtalálhatók a felszíni vizekben, a talajban, a növényzeten stb. Néhány fajuk pathogen vagy fakultatív pathogen, túlnyomó többségük azonban saprophyta. Vannak közöttük növénypathogen fajok is. A saprophyták közül egyesek (P. fluorescens, P. maltophilia stb.) megtelepedhetnek az állati eredetű élelmiszerekben (tojás, tej, hal, darált hús stb.) romlást, élelmiszerhibákat idézve elő. Az állatorvosi szempontból fontos fajok a következők Pseudomonas mallei Morfológia. A többi pseudomonastól eltérőeni nincsenek csilló. Vizes festékoldatokkal nehezen, karbolsavtartalmú (pl. Ziehl-fukszin) vagy lúgos festékoldatokkal azonban jól megfesthető. Mind tenyészetekből, mind a kóros termékekből kikenve egyenetlenül, szakaszosan festődik. Tenyésztés. Közönséges agaron, 37 C-on, levegő jelenlétében, 24 óra alatt apró, sima szélű, szürkésfehér, áttetsző telepek keletkeznek. A telepek néhány nap alatt jelentősen megnagyobbodnak. A növekedést elősegíti az agarhoz adott glicerin. Levestenyészeteiben egyenletes zavarosodást okoz, később pedig a kémcső alján nyúlós üledék képződik. Pigmentet nem képez. Biokémiai sajátságok. Kataláz- és oxidáz-pozitív. Glükózból és számos más szénhidrátból is savat termel, a zselatint elfolyósítja. Ellenálló képesség. Ellenálló képessége kicsi, beszáradt váladékokban néhány nap alatt tönkremegy, nedves állapotban azonban akár 4 hétig is életben marad. Perceken belül elpusztul azonban C-on és fertőtlenítőoldatok hatására. Pathogenitás. Obligát pathogen, a szabad természetben nem fordul elő. Az egypatásokban idéz elő takonykórt (malleust), megbetegíti azonban a macskát, ideértve az állatkerti nagymacskákat is, és a kutyát, de fogékony iránta az ember és néhány más faj is. Európában a malleus évtizedek óta nem fordul elő. A laboratóriumi állatok közül a hörcsög és a tengerimalac a leginkább fogékony, a nyulak ellenállnak a fertőzésnek. P. malleit tartalmazó vizsgálati anyagot hím tengerimalac hasüregébe fecskendezve 2 4 nap alatt hashártyagyulladás, továbbá fájdalmas here- és hereborék-duzzanat fejlődik ki. A here burkai között felhalmozódott fibrines, gennyes váladékból a baktériumok mikroszkópos vizsgálattal és tenyésztéssel egyaránt kimutathatók. A kitenyésztett baktériumokat szerológiai (agglutinációs, komplementkötési) próbával azonosítjuk, mert a takonykórra emlékeztető hashártya- és heregyulladást a vizsgálati anyagban esetleg jelenlevő más baktériumok, pl. C. pseudotuberculosis,pseudomonas aeruginosa, létrehozhatják Pseudomonas pseudomallei Hasonlít a takonykór baktériumához, de csillós, egyes törzsei narancsvörös színű, vízben nem oldódó pigmenteket termelnek. Glicerintartalmú agaron ráncolt telepekben nő, a levestenyészetek tetején pedig szemölcsös hártyát képez Nedves, trópusi területeken, főként Délkelet-Ázsiában megtalálható a talajban és a természetes vizekben, ezek képezik a fertőzés forrását. Fakultatív pathogen, a fajok igen széles köre fogékony iránta. A takonykórhoz hasonló, testszerte gennyes beolvadásokkal járó betegséget (melioidosist) idézhet elő szarvasmarhában, juhban, kecskében, sertésben, kutyában, macskában, majmokban és az emberben is Pseudomonas aeruginosa Igen széles körben elterjedt baktérium, megtalálható a természetes vizekben, szennyvizekben, a talajban, a növényzeten, alacsony számban az emlősök és a madarak bélcsatornájában, alkalmanként a bőrön is. Morfológia. Egyetlen, poláris helyeződésű csillója van, amellyel élénken mozog. A csilló mellett ugyancsak polárisan helyeződő fimbriái is vannak. Fukszinnal vagy genciánaibolyával egyenletesen festődik. Tenyésztés. Levegő jelenlétében bármely táptalajon, 5 42 C között, de legjobban 37 C-on, gyorsan és bőségesen elszaporodik, nedves lapos, sima szélű telepeket képez. Véresagaron béta-hemolízist okoz. 121

142 Részletes bakteriológia Tenyészeteiben kétféle festéket termel: a kloroformban is oldódó, kék színű piocianint és az abban nem oldódó, sárga színű fluoreszceint. A festékek a táptalajba diffundálnak, ezért a baktériumok telepeinek környéke is zöldre festődik. A tenyészetek zöld színe idővel a festékek oxidációja miatt barnásba megy át, innen ered a baktérium elnevezése is (aerugo: rozsda). A P. aeruginosa tenyészeteinek jellegzetes, aromás szaga van. Levestenyészetben egyenletes, sűrű zavarosodást okoz, a táptalaj felső, levegővel érintkező része itt is zöld színűre festődik. Biokémiai sajátságok. Kataláz-, oxidáz- és ureáz-pozitív, a nitrátokat nitritté redukálja. A glükózt, a mannitot és még néhány más szénhidrátot savtermeléssel elbont, ezenkívül hidrolizálja a zselatint és a kazeint. Antigénszerkezet. A sejtfalban található főbb hőstabil antigének alapján agglutinációs próbával a P. aeruginosa törzsek ez ideig legalább 17 szerocsoportba sorolhatók. Az egyes csoportokon belül több alcsoport különíthető el, s számos keresztreakció létezik az egyes csoportok között is. Az egyes szerocsoporton belül a törzsek egymástól való további megkülönböztetésére felhasználható a piocintermelés és a fágtipizálás. Ellenálló képesség. Ellenálló képessége nem nagy, beszáradva néhány nap alatt, 60 C-on pedig perceken belül elpusztul. A fertőtlenítőszerek 1 2%-os oldatai ugyancsak perceken belül elölik, de szokatlanul rezisztensek pl. a kvaterner ammóniumsókat tartalmazó fertőtlenítőszerekkel szemben, sőt egyes amfoter, felületaktív anyagokat tartalmazó fertőtlenítőszerek híg oldataiban, éppen igénytelenségük miatt, szaporodni is képesek. Gyakran eleve rezisztensek, vagy gyorsan rezisztenciát szereznek több, a gyakorlatban használatos antibiotikummal szemben is. Pathogenitás. Fakultatív pathogen, megbetegítheti valamennyi állatfajt és az embert is. Emberben bőrsérülésekhez, égéshez társuló fertőzéseket, conjunctivitist, közép- és belsőfülgyulladást, csecsemőkben enteritist, septikaemiát okoz. Az állatok közül szarvasmarhában metritist, mastitist, meleg, nedves éghajlati viszonyok között tartott juhokban gyapjúrothadással járó bőrgyulladást, valamennyi állatfajban sebfertőzéseket, kutyában conjunctivitist, fülgyulladást, madarakban septikaemiát, a prémes állatok közül nyércben, csincsillában pneumoniát, septikaemiát okoz. A fertőzött sebekben rendszerint csupán a kék színű piocianint termeli, innen ered a baktérium korábbi elnevezése: Bacterium pyocyaneum (kék gennybaktérium). Az egészséges laboratóriumi állatokat csak nagy mennyiségű tenyészet parenteralis befecskendezésével lehet megbetegíteni Pseudomonas anguilliseptica Rövid, pálcika alakú, csillós baktérium. Kataláz- és oxidáz-pozitív, elfolyósítja a zselatint, szénhidrátokat azonban nem bont. Halpathogen baktérium, amely elsősorban tenyésztett lazacfélékben, angolnákban és dévérkeszegekben vérzéses vérfertőzéssel és szaruhártya-gyulladással járó tömeges megbetegedést és elhullást okoz Aeromonas Gram-negatív, 1 4 µm hosszú, pálcika alakú baktériumok, megtalálhatók a természetes vizekben, szennyvizekben, alkalmanként azonban az állatok bélcsatornájában is. Néhány kivételtől eltekintve csillósak, többnyire egyetlen poláris csillójuk van. Kataláz- és oxidáz-pozitívak, a nitrátokat nitritté redukálják. Az alakilag és biokémiailag is hozzájuk sokban hasonló pseudomonasoktól megkülönböztethetők azon az alapon, hogy aerobok, fakultatív anaerobok, szénhidrátbontásuk fermentatív. A nemzetségbe tartozó fajok közül az alábbiaknak van kórtani jelentősége Aeromonas hydrophila Könnyen tenyészthető, tenyésztési optimuma 28 C, de nő 37 C-on is. Telepei közönséges és véresagaron egyaránt nagyok, sárgásfehérek, véresagaron béta-hemolízist okoz. Közönséges levesben egyenletes sűrű zavarosodást okoz. Indol-pozitív, a metilvörös- és a Voges Proskauer-próbában egyaránt pozitív, kéntartalmú sókból és aminosavakból H 2S-t termel, elfolyósítja a zselatint. Glükózból és számos más szénhidrátból savat és gázt egyaránt termel. Fakultatív pathogen. Főleg a hidegvérűeket, békát, kígyót stb., alkalmanként halakat betegít meg, de szórványosan megtelepedhet a háziállatokban is Aeromonas salmonicida 122

143 Részletes bakteriológia Rövid, coccobacilus, csillója nincs, tenyésztési optimuma C, 37 C-on nem indul fejlődésnek. Tenyészeteiben rendszerint sötétbarna színű, a táptalajba diffundáló pigmentet képez, előfordulnak azonban pigmentet nem termelő törzsek is. A zselatint elfolyósítják. Egyéb biokémiai sajátságaik alapján a törzsek legalább 3 alfajba sorolhatók. Fakultatív pathogen, a velük fertőzött halakon él, de nem a természetes vizekben. Tengeri és édesvízi halakban (lazacfélékben, ritkán pontyokban stb.) okoz septikaemiával, továbbá testszerte tályogképződéssel és bőrfekélyekkel járó betegséget (furunculosist) Vibrio Kissé hajlott, a vesszőhöz hasonló, 1,5 3 µm hosszú, pálcika alakú, Gram-negatív baktériumok. Többségüknek egyetlen, egyes fajoknak azonban több, polárisan helyeződő csillójuk van. Burkot nem képeznek. Tenyésztés. Aerobok, fakultatív anaerobok. Igénytelenek, a legegyszerűbb táptalajokon is gyorsan elszaporodnak. Valamennyi faj tenyészthető 20 C-on, de többségük 37 C-on is. Szaporodásukat NaCl jelenléte elősegíti. Szelektív izolálásukra alkalmasak az erősen lúgos (ph 8,6) táptalajok, savas közegben viszont hamar tönkremennek. Leves táptalajok felületén finom hártyát képeznek. Biokémiai sajátságok. Kataláz- és néhány kivétellel oxidáz-pozitívak, az orvosi, állatorvosi szempontból fontos fajok többsége triptofánból indolt termel, a nitrátot nitritté redukálják, elfolyósítják a zselatint, H 2S-t viszont nem termelnek. Szénhidrátbontásuk fermentatív, a glükózból, mannitból és számos más szénhidrátból gáztermelés nélkül savat képeznek. Pathogenitás. Többségük a tengerek vízében él, ezek megtalálhatók a tengeri élőlények emésztőcsatornájában és felületükön is, egyes fajok viszont az édesvizek lakói. Többségükben saprophyták, vannak azonban közöttük pathogenek és fakultatív pathogenek is Vibrio cholerae Oxidáz-pozitív, indol-pozitív, a nitrátot nitritté redukálja. Az ember cholerájának az okozója. Két biotípusa van (a klasszikus és az El Tor) mindkettő az O 1-es szerocsoportba tartozik. Az utóbbi években az emberben cholerát okozó V. cholerae törzseknek egy újabb változata bukkant fel, amely, szemben az eddigiekkel, a sejtfal lipopoliszacharid antigénje alapján az O 139-es szerocsoportba tartozott (V. cholerae Bengal), és ugyanúgy, mint az O 1-es csoportba tartozó két korábbi biotípus, choleratoxint (amely Da molekulatömegű fehérje) termelt. Az emberi cholera Európában, kivételes esetektől eltekintve, nem fordul elő. A nem cholerát okozó V. cholerae törzsek O-antigénjeik alapján számos szerocsoportba sorolhatók. Közülük egyesek emberben choleraszerű hasmenést idézhetnek elő, de alkalmanként izolálhatók természetes édesvizekből, városi szennyvizekből, édesvízi halakból, továbbá tünetmentes vagy hasmenésben szenvedő madarakból (pl. vadkacsából, vadlibából) is Vibrio metchnikovii Alaki, tenyésztési és biokémiai sajátságait illetően megegyezik a genus egészére leírtakkal, a V. cholerae törzsektől azonban egyebek mellett abban különbözik, hogy oxidáz-negatív, nem termel indolt és nem redukálja a nitrátot sem. Megtalálható a természetes édesvizekben, a szennyvizekben, kagylókban, csigákban, rákokban, halakban. Szórványosan madarakban (főleg libákban) okozhat hasmenéssel járó vérzéses bélgyulladást, septikaemiát, az embert csak kivételesen betegíti meg. A laboratóriumi kísérleti állatok közül a tengerimalacot bőr alá oltva elpusztítja, és ugyancsak halálosan szoktak megbetegedni a galambok, mellizomba való fertőzésük után Vibrio parahaemolyticus Biokémiai tulajdonságaiban nagyban hasonlít a V. choleraera. Természetes előfordulási helye a tengervíz, továbbá a tengeri halak, puhatestűek stb. Emberben okoz tengeri eredetű kagyló, csiga, rák stb. fogyasztását követően, gastroenteritissel, ritkán septikaemiával járó ételfertőzést Vibrio (Listonella) anguillarum 123

144 Részletes bakteriológia Kataláz- és oxidáz-pozitív, további biokémiai sajátságaik alapján a törzsek több biotípusba, sejtfalantigénjeik alapján pedig ez ideig legalább 10 szerocsoportba sorolhatók. Tengervízben él, fiatal lazacfélékben és angolnákban okozhat tömeges elhullást Campylobacter Hajlott pálcika, vessző vagy S alakú (campylo = hajlott) baktériumok, mikroaerofilek, utóbb azonban a genetikai rokonság okán néhány anaerob fajt is ebbe a nemzetségbe soroltak. Az ide tartozó fajokat korábban mikroaerofil vibriókként tartották számon. Megtalálhatók a szarvasmarha, a juh, de alkalomadtán más kérődzők nemi szerveinek a nyálkahártyáin, továbbá a különféle állatfajok és az ember szájüregében és emésztőcsatornájában. Morfológia. Vessző alakú, 2 5 µm hosszú baktériumok. Ha a többször osztódott pálcikák egymáshoz tapadva maradnak, S alakok és hosszú, spirális fonalak is láthatók (45. ábra). Többször átoltott vagy idősebb tenyészetekben elvesztik jellegzetes alakjukat, rövid, egyenes pálcák, coccoidok lesznek. Egyik vagy mindkét végükön egyetlen poláris csillójuk van, friss tenyészetben élénken mozognak. Gram-negatívok, jól megfesthetők karbolvizes fukszinnal. 45. ábra - Campylobacter fetus subsp. venerealis agartenyészetből (Gram-festés, 1250 ) Tenyésztés. Közönséges levegőn tenyészeteik nem erednek meg. Mikroaerofilek, növekedésük akkor a legjobb, ha 37 C-on 6% O 2-t és 10% CO 2-ot tartalmazó gázkeverékben tenyésztjük. Egyes törzsek többszöri passzázs után hozzászoktathatók a levegőn való növekedéshez is. Véresagaron tenyésztve óra alatt kb. l 3 mm átmérőjű, kerek, domború, fénylő telepek képződnek. Esetenként a friss tenyészetekben is, de a többszöri átoltás során mindenképpen, sárgásszürke, nyúlós, mukoid és szemcsés R-telepek is kialakulnak. A C. jejuni és a C. coli törzsek frissen kitenyésztve, nedves véresagar felületén rajzanak, a telepek laposak, nedvesek, összefolynak. Piroszőlősavnak a táptalajhoz adása jelentősen segíti szaporodásukat. Közönséges agaron rendszerint nem erednek meg. Erősen szennyezett anyagokból (vetélt magzatból, bélsárból stb.) való szelektív izolálásukra antibiotikumokat (pl. vankomicint, polimixint és trimetoprimet) tartalmazó véresagar használatos. Közönséges levesben nem erednek meg, de aminosavakat bőven tartalmazó, félfolyékony táptalajba oltva a felszín alatt 0,5 1 cm vastag rétegben jól elszaporodnak, diffúz zavarosodást okozva. 124

145 Részletes bakteriológia Biokémiai sajátságok. Oxidáz-pozitívok, a szénhidrátokat nem bontják, energiájukat főként aminosavakból és különféle szerves savakból (piroszőlősavból stb.) fedezik. Anyagcseréjük típusa oxidatív. A kataláz-próba, 25 és 42 C-on való növekedés, glicin- és konyhasótűrés, nalidixinsav iránti érzékenység stb. alapján fajokba, ezen belül alfajokba, változatokba sorolhatók (9. táblázat). 9. táblázat - A fontosabb Campylobacter fajok biokémiai tulajdonságai Növekedés Érzékeny H 2S Fajok Katalá z 25 C 42 C 1% glicin 3,5% NaCl 30µg 30µg nalidix sav cephalo tin Nitrátreduk ció Ólom- acetát TSI Hippur át- hidrolíz is Indoxil - acetát hidrolí zis C. fetus sp. venerealis sp. fetus C.jejuni sp. jejuni _ sp. doylei nv. k + C. coli C. lari C. mucosalis C. sputorum var. sputorum var. bubulus var. fecalis C. hyointestin alis k: különböző típusok nv.: nem vizsgált Antigénszerkezet. A C. fetus két alfaja a sejtfalban levő O-antigének alapján, agglutinációs próbával két szerocsoportba, O1 (vagy A) és O2 (vagy B) sorolható. Mindkét szerocsoportú törzs előfordul mindkét alfajban. A baktériumsejt felületén található hőlabilis és a csillóantigének legalább 7 félék, ezek az egyes törzsekben különböző kombinációkban fordulnak elő. 125

146 Részletes bakteriológia A C. jejuni és C. coli törzsek a sejtfalból kivont hőstabil antigénjeik alapján, passzív hemagglutinációs próbával, ez ideig legalább 66 szerocsoportba sorolhatók. Kidolgoztak egy a hőlabilis antigéneket is figyelembe vevő szerológiai osztályozást, e szerint a rendszer szerint több mint 120 szerotípus ismert. A két tipizálási rendszer egymással nem kompatibilis. Ellenálló képesség. Ellenálló képességük csekély. Kitenyésztésük is csak akkor sikerül, ha a vizsgálati anyagokat a mintavétel után rövid időn belül táptalajra oltjuk. Beszáradva néhány óra alatt, 60 C-on pedig perceken belül elpusztulnak. Pathogenitás. Az ide sorolt fajok többsége saprophyta, egy részük azonban fakultatív pathogen. A C. fetus subsp. venerealis (korábban Vibrio fetus) megtalálható a bikák tasaknyálkahártyáján és alkalmanként a húgycső disztális részében is. A bikák tünetmentesek, mesterséges termékenyítés vagy még inkább természetes fedeztetés útján üszőkbe, tehenekbe jutva, azokban hüvely- és méhgyulladást, gyakori visszaivarzást, esetenként vetélést, következményes meddőséget okoz. A C. fetus subsp. venerealis a szarvasmarhán kívül más fajban nem telepszik meg. A C. fetus subsp. fetus (korábban C. fetus subsp. intestinalis) előfordul szarvasmarhában, juhban és valószínűleg más kérődzőkben is a nemi szervek nyálkahártyáin, de alacsony számban megtalálható a különféle állatfajok és az ember bélcsatornájában is. Juhban tömeges, szarvasmarhában szórványos vetélést okozhat. Ritkán megbetegíti az embert is, septikaemiát, vetélést okoz. A C. jejuni és a C. coli a madarak és a legtöbb emlősállat bélcsatornájának természetes lakói. Szarvasmarhában, juhban, kecskében szórványosan vetélést, mastitist, újszülöttekben ritkán enteritist okozhatnak. Fiatal kutyában, macskában hasmenéssel járó enteritist idéznek elő, a tojásrakás kezdetén levő tyúkállományokban pedig a bélcsatornából beszaporodva hasmenést és hepatitist okozhatnak. Jelen lehetnek a tejben, továbbá gyakran a konyhakész, friss, vágott baromfi felületén is. Emberben (főleg gyermekekben) enyhe tünetekkel járó hasmenést okozhatnak. A C. lari főleg vadon élő madarak bélcsatornájában honos, megbetegítőképessége ugyanolyan, mint a C. jejuni és a C. coli törzseké. A C. mucosalis, a C. hyointestinalis és a C. hyoilei a sertések vékonybelének lakói. Korábban összefüggésbe hozták ezeket a baktériumokat a sertések proliferatív enteropathiájával (intestinalis adenomatosis, necroticus enteritis, proliferatív haemorrhagiás enteropathia stb.), utóbb azonban kiderült, hogy ezeket a betegségeket egy önálló, alakilag a campylobacterekhez hasonló, a sertések bélnyálkahártya-hámsejtjeinek cytoplasmájában szaporodó, a bakteriológiában használt táptalajokon nem, de patkány enterocytákban tenyészthető baktériumfaj, a Lawsonia intracellularis idézi elő. A C. sputorum változatai közül a C. sputorum var. sputorum az ember szájüregében, a C. sputorum var. bubulus a szarvasmarha nemi szerveinek a nyálkahártyáin, a C. sputorum var. fecalis pedig a juhok bélcsatornájában található meg. Az utóbbi években leírt egyéb Campylobacter fajok kórtani szerepét még nem ismerjük kellően Helicobacter Az ide tartozó baktériumfajokat alaki hasonlóságuk miatt korábban a campylobacterekhez sorolták. Közülük a kórtanilag fontos fajok természetes viszonyok között megtalálhatók az ember és az együregű gyomrú (monogastricus) emlős állatfajok (főként a húsevők) gyomor- és nyombél-nyálkahártyáján. Morfológia. Hajlott, vessző, S vagy U alakú, ritkábban egyenes, csavart, 1,5 5 µm hosszú pálcikák, amelyek egy vagy több polárisan helyeződő csillóval rendelkeznek. A táptalajon többször átoltott tenyészetekből készített kenetekben zömmel polimorf coccobacillusokként jelennek meg. Tenyésztés. A campylobacterekhez hasonlóan mikroaerofilek. A táptalajok iránt igényesek. Aminosavakat, (ló-) vérsavót vagy vért és növekedést serkentő anyagokat (pl. IsoVitalex) is tartalmazó agar táptalajokon szaporíthatók. A táptalajok szelektívvé tételére antibiotikumokat használunk. A gyomorból vett váladék- és biopsziás szövetmintákat célszerű rögtön táptalajra széleszteni vagy ha erre nincs mód transzport táptalajba oltva szobahőn tárolni. A helicobacterek C-on primer tenyészeteikben 3 7 nap alatt (a továbboltott tenyészeteikben 2 4 nap alatt) apró, kb. 1 mm átmérőjű, áttetsző, enyhén domború, fénylő, kerek, zárt szélű telepeket képeznek. Biokémiai tulajdonságok. Kataláz- és oxidáz-pozitívak. Többségük alkalikus foszfatáz- és ureázaktivitással is rendelkezik. A szénhidrátokat nem bontják. Ez ideig mintegy húsz fajuk ismert. 126

147 Részletes bakteriológia A virulens H. pylori és H. mustelae törzsek az ember és néhány emlősállatfaj vörösvérsejtjeit agglutinálják. A H. pylori törzsek ezenkívül hámsejtkárosító toxint (citotoxint) is termelnek. A baktériumok nyálkahártyához való tapadása és azon (abban) való elszaporodása feltehetően összefügg a törzsek hemagglutinációs képességével. Ellenálló képesség. A helicobacterek ellenálló képessége kicsi, fertőzött váladékokban a külvilágon rövid idő alatt elpusztulnak, a kórtanilag fontos fajok csupán a gazdafaj gyomor- és nyombél-nyálkahártyáján életképesek. Pathogenitás. A nemzetségbe tartozó fajok közül a H. pylori emberben idült gyomorgyulladást és következményes gyomor- vagy nyombélfekélyt, a H. felis macskában és a H. canisszal együtt kutyában, a H. mustelae menyétfélékben, a H. acinonyx pedig gepárdokban okoz a lymphoid tüszők hyperplasiájával járó idült gyomorgyulladást. Ezenkívül fogságban tartott, idült gyomorgyulladásban szenvedő tigrisekből és oroszlánokból is izoláltak eddig be nem sorolt Helicobacter törzseket. A H. heilmannii kórokozó szerepét pedig a sertések oesophagealis gyomorfekélyének kialakulásában valószínűsítik Arcobacter A campylobacterek között korábban leírtak olyan fajokat is, amelyek alaki és tenyésztési sajátságaikban hasonlóak voltak a campylobacterekhez, de különböztek tőlük egyebek mellett abban, hogy bár növekedésük mikroaerofil viszonyok között optimális, az izolálást követően normál légtérben is képesek szaporodni. Ezeket az aerotoleráns, 1 3 µm hosszú, hajlott pálcika alakú, egyetlen, poláris helyeződésű csillóval rendelkező baktériumokat újabban önálló, Arcobacter nemzetségbe sorolják. Az Arcobacter fajok tenyésztésére alkalmasak a leptospirák izolálására szolgáló, félfolyékony táptalajok, továbbá a campylobacterek tenyésztésére használt tioglikolát és tioltáptalajok. A szelektivitás biztosítása érdekében az előbbiekhez 5-fluoruracilt, az utóbbiakhoz pedig antibiotikumokat (bacitracint, novobiocint stb.) keverünk. A telepek hasonlítanak a campylobacterekéire. Fenotípusos tulajdonságaik alapján a campylobacterektől nehezen különböztethetők meg, kataláz- és oxidáz-pozitívak, a nitrátot csak egy részük redukálja. Az ide tartozó fajok közül az A. cryaerophilust szarvasmarha és sertés vetéléseiből, tőgygyulladásban beteg tehenek tejéből, ezenkívül bélsárból is izolálták. A további fajok közül az A. skirowii természetes viszonyok között megtalálható a bikák preputiumában, de alkalmanként vetélt szarvasmarha-, juh- és sertésmagzatokból és e fajok bélsarából is izolálható. Az A. butzlerit hasmenésben szenvedő emberek és majmok bélsarából izolálják Spirochaeták Hosszú, vékony, a dugóhúzó alakjára emlékeztető, hajlékony mikroorganizmusok. Bár a spirochaeták baktériumok, szerkezetük kissé eltér a többi baktériumfajétól. A spirochaetákat legkívül egy vékony, főleg lipoproteinből álló, elasztikus membrán veszi körül. Ez alatt találhatók a hosszú, esetenként a sejtvégeken is túlnyúló, a csillóhoz hasonló szerkezetű, proteinből álló tengelyfonalak (axiális fibrillumok). Alattuk helyeződik el egy ugyancsak igen vékony mukopeptid réteg, majd a cytoplasmahártya s ezen belül a cytoplasma. A spirochaeták életképessége a külső elasztikus membrán sértetlenségétől függ. Savas közegben, epesavas sók hatására, beszáradás stb. következtében a membrán megsérül, a spirochaeták feloldódnak és elpusztulnak. Az elasztikus membrán tartalmazza ezenkívül azokat a lipoprotein-antigéneket, amelyek alapján a spirochaeták egy része (pl. a leptospirák) szerológiailag csoportosítható. A membrán alatt helyeződő tengelyfonalak felelősek a spirochaeták mozgásáért, és ezek határozzák meg alakjukat is. A spirochaeták közül a kórtani szempontból fontos fajok a Borrelia, a Serpulina, a Treponema és a Leptospira nemzetségbe tartoznak. Morfológia. A borreliák, a serpulinák, a treponemák és a leptospirák hosszú, igen vékony, csavart, fonal alakú képletek, amelyek annyiban különböznek egymástól, hogy a borreliák, a serpulinák és a treponemák csavarulatai tágak, s így hullámos alakjuk mikroszkóp alatt jól felismerhető, a leptospirák csavarulatai viszont annyira szorosak, hogy csak elektronmikroszkópos vizsgálat során tűnnek elő. A borreliák, a serpulinák és a treponemák mindkét vége hegyes, a leptospiráké ellenben egyik vagy mindkét végén horogszerűen görbült. Csillóik nincsenek, de csillók hiányában is élénk, dugóhúzószerű vagy csapkodó mozgást végeznek. Festődés. A fajok egy része (pl. a borreliák és a serpulinák) a bakteriológiában szokásosan használt festékekkel, pl. karbolvizes fukszinnal is jól megfestődik, legtöbbjük azonban csak előzetes pácolás után (erősebb festékoldatokkal) vagy Giemsa szerint festhető meg. Gram-negatívok. A nehezen festődő fajok feltüntetésére jól 127

148 Részletes bakteriológia használható a Vágó-féle festési eljárás is. Szöveti metszetekben a spirochaeták kimutathatók a Levaditi-féle ezüstimpregnációs eljárással. Jól felismerhetők natív készítményekben, élő állapotban sötét látóteres vagy fáziskontraszt-mikroszkópos vizsgálattal. Frissen vett vizsgálati anyagban mozgásuk is megfigyelhető. A spirochaeták vizsgálatára jól felhasználhatók az immunfluoreszcenciás eljárások. Megfelelő specifikus (kimerített) immunsavókat vagy monoklonális ellenanyagokat használva az azonos morfológiájú fajok egymástól el is különíthetők. AGiemsa-féle festésnek több változata van. Az ún. gyors eljárást a következőképpen végezzük. A vékonyan felkent, megszáradt készítményt 3 percig metil-alkohollal fixáljuk. A festést egy térfogatrész Giemsa-oldat (metilénkék és eozin keveréke) és két térfogatrész semleges kémhatású desztillált víz (vagy célszerűbben 1/15 mólos Sörensen-féle puffer) keverékével végezzük 5 percig. A megfestett kenetet desztillált vízben tartjuk 1/2 1 percig, majd megszárítjuk és immerziós lencsével vizsgáljuk. A spirochaeták piros vagy kékes színűek. A Giemsa-féle festés alkalmas nemcsak a treponemák, hanem más mikroorganizmusok, pl. a rickettsiák (lásd később) feltüntetésére is. A Vágó-féle festési eljárás során a megszáradt, de nem fixált kenetet tömény vizes merkurokrómoldattal (dibróm-hidroximerkuri-fluoreszceinnel), majd vízzel való öblítés után tömény vizes pioktaninoldattal kezeljük néhány percig. Újra öblítjük, majd szárítás után immerziós lencsével vizsgáljuk. A leptospirák kékesfeketére festődnek. Tenyésztés. A spirochaeták közül csupán a serpulinákat és a leptospirákat tudjuk következetesen tenyészteni. A pathogen borreliákat és treponemákat (pl. a Treponema pallidumot és a Treponema paraluiscuniculit) elszaporításuk céljából megfelelő kísérleti állatokba oltjuk, és a kórosan elváltozott szerveket fagyasztott állapotban tároljuk. A fertőzött szervekből egy keveset kísérleti állatokba oltva a törzsek újra életre kelthetők Borrelia A borreliák 3 20 µm hosszúak, csavarulataik tágak, egyenetlenek. Viszonylag sok, axiális fibrillumuk van. Giemsa-féle festéssel jól megfesthetők. A borreliák széles körben elterjedtek. Obligát paraziták, csak a velük fertőzött gazdákban és ízeltlábú vektoraikban élnek. Természetes gazdáik vadon élő apró rágcsálók (egér, patkány, mókus, hód stb.), egyes fajok esetében azonban a szarvasmarha és a ló (B. theileri), a madarak (B. anserina) és az ember is. Vektoraik különféle kullancsok, az ember visszatérő lázát okozó B. recurrentis esetén azonban a ruhatetű. Az ízeltlábúak a fajok túlnyomó többségénél valódi vektorok, bennük a borreliák elszaporodnak és átjutnak az utódokba is. A borreliák okozta fertőzések természeti gócfertőzések formájában léteznek, földrajzi elterjedtségük igen változatos, többségük a melegégövi területeken fordul elő. A borreliák fajokba sorolása ízeltlábú vektoraik és fő gazdáik szerint történik. A borreliák közül számos faj, így a B. recurrentis, a B. caucasica, a B. hispanica stb. az emberben okoz ismétlődő lázas tünetekkel járó betegséget (visszatérő lázat). Állatorvosi szempontból az alábbi fajoknak van jelentősége Borrelia anserina Hullámos lefutású, 8 30 µm hosszú spirochaeta. Megfestődik karbolvizes fukszinoldattal is, de különösen szépen Giemsa szerint. Festetlen állapotban is jól felismerhető tuskészítményben vagy sötét látóteres és fáziskontraszt-mikroszkópban. Natív fehérjét és különféle, növekedést serkentő anyagokat (pl. hemoglobint és aszkorbinsavat) is tartalmazó leves táptalajokba oltva a B. anserina törzsek hosszabb-rövidebb ideig fenntarthatók, jól elszaporodnak azonban mesterségesen fertőzött tyúkokban. A törzsek többsége elszaporítható napos embrionált tyúktojásban is. Ellenálló képességük csekély, a hullákban gyorsan elpusztulnak, kivételesen azonban 1 3 napos hullákban is akadhatunk élő borreliákra. A beteg állatok defibrinált vérében 4 C-on akár 2 hónapig is életben maradhatnak, szobahőmérsékleten, valamint beszáradva azonban gyorsan elpusztulnak. A B. anserina világszerte előfordul. Libában, kacsában, tyúkban, pulykában, fácánban, kanáriban és néhány vadon élő madárfajban idéz elő lázas általános tünetekkel, aluszékonysággal járó betegséget (baromfispirochaetosis, borreliosis). A betegség terjesztésében a kullancsoknak és az atkáknak, nálunk főleg az óvantagoknak és más vérszívó ízeltlábúaknak van szerepük. Az emlősöket nem betegíti meg. 128

149 Részletes bakteriológia Kísérleti állatként fiatal madarak (liba, kacsa, tyúk, galamb stb.) használhatók. Beteg állatokból származó vérrel vagy tenyészettel parenterálisan fertőzve bennük a természetesnél rendszerint enyhébb betegség alakul ki Borrelia theileri Laza csavarulatokat mutató, µm hosszú borrelia. Vektorai kullancsok. A szarvasmarha, ló, ritkán a juh borreliosisát idézi elő, főként Dél-Afrikában és Ausztráliában Borrelia burgdorferi µm hosszú, sötét látóteres vagy fáziskontraszt-mikroszkópban natívan, továbbá Giemsa-szerint festve vagy immunfluoreszcenciás eljárással vizsgálható. Speciális tápfolyadékokban, nehezen ugyan, de tenyészthető. Vektorai kullancsok, Európában főleg az Ixodes ricinus. A kullancsokban szaporodik és az utódokba is átjut. Természetes gazdái a kullancsokon kívül vadon élő rágcsálók (főleg egérfélék), az apró emlősök, egyes vadon élő kérődzőfajok, de megtelepszik vadon élő madarakban is. Főleg az embert betegíti meg, lázas általános tüneteket, vándorló bőrpírt, ízület- és szívizomgyulladást okoz (Lyme borreliosis). A háziállatok közül megbetegíti a kutyát, a lovat, de ritkábban szarvasmarhában és egyéb fajokban is okozhat klinikai tünetekkel járó fertőzést. A Lyme borreliosis okozója Európában és Észak-Amerikában a B. burgdorferi. Japánban és más délkelet-ázsiai országokban azonban a Lyme borreliosist más, kullancsokból, apró rágcsálókból és madarakból egyaránt izolálható borreliák, így a B. garinii, B. afzelii és egyéb, eddig be nem sorolt borreliák idézik elő Serpulina A serpulinák (korábban Treponema hyodysenteriae és rokonai) néhány, tág csavarulatot mutató, 7 9 µm hosszú, 0,3 0,4 µm vastag spirochaeták. Karbolvizes fukszinnal és Giemsa szerint egyaránt megfesthetők. Szigorúan anaerobok, triptont, szójafehérje hidrolizátumot, élesztőkivonatot, valamint vért vagy vérsavót is tartalmazó agar táptalajokon és tápfolyadékokban, C között jól tenyészthetők. A nemzetségbe ma már számos faj tartozik, többségüket az utóbbi néhány évben írták le. Természetes előfordulási helyük a sertés vastagbelének nyálkahártyája, fakultatív pathogenek vagy saprophyták Serpulina hyodysenteriae A S. (Treponema) hyodysenteriae alaki, festődési, tenyésztésbeli tulajdonságai megegyeznek a nemzetség egészére jellemzőkkel (46. ábra). Az elektronmikroszkópos képen jól láthatók a tengelyfonalak (47. ábra). 46. ábra - Serpulina hyodysenteriae agartenyészetből (fukszinnal festve, 1250 ) 129

150 Részletes bakteriológia 47. ábra - Serpulina hyodysenteriae elektronmikroszkópos képe (8000 ) Tenyésztés. Frissen kiöntött véresagaron, anaerob viszonyok között, szén-dioxidot és hidrogént vagy egyéb gázt tartalmazó légtérben 37 C-on tenyésztve 5 8 nap alatt inkább az agarban, mint a felületén, apró, bétahemolízist okozó telepeket képez. Jól növekszik 42 C-on is. A táptalajhoz adott RNS-kivonat a növekedést elősegíti. Speciális anaerob, folyékony táptalajokban is elszaporítható, mégpedig 42 C-on jobban, mint 37 C- 130

151 Részletes bakteriológia on. Szennyezett anyagokból (bélsárból, bélnyálkahártya-kaparékból) való kitenyésztésére spektinomicint, illetve egyéb antibiotikumokat is tartalmazó szelektív táptalajokat használunk. Biokémiai sajátságok. A tenyészetek felületére helyezett szűrőpapírral végzett indolpróbában pozitív, ezenkívül termel alkalikus foszfatázt, lipázt és néhány más enzimet is. Antigénszerkezet. A sejtfalból kivont lipopoliszacharid antigének alapján gélprecipitációs próbával a S. hyodysenteriae törzsek ez ideig legalább 9 szerocsoportba (A I) sorolhatók. Az azonos csoportba tartozó törzsek között is vannak további finomabb antigénszerkezeti különbségek. Az egyes földrajzi régiókban a különböző szerocsoportba tartozó törzsek más és más gyakorisággal fordulnak elő. A betegség kiállása típusspecifikus védettséget ad. Ellenálló képessége csekély, a beszáradás, a hő és a fertőtlenítőszerek gyorsan elpusztítják, nyálkás, véres bélsárban azonban kb. 1 hétig a külvilágban is életképes marad. Pathogenitás. A S. hyodysenteriae fakultatív pathogen. Természetes gazdája, a sertés, a vastagbél nyálkahártyájának a felületén él. A virulens törzsek erős béta-hemolízist okoznak, a nem hemolizáló törzsek avirulensnek tekinthetők. A virulens törzsek sertésben idéznek elő a vastagbél nyálkahártyájának gyulladásával, korpaszerű elhalásával, nyálkás, majd véres, csokoládébarna színű bélsár ürítésével járó hasmenést (sertésdysenteria), ritkán megbetegíthetik azonban a nutriát is és átmenetileg, tünetek okozása nélkül megtelepedhetnek a fertőzött sertéstelepeken élő rágcsálók, főleg egerek és patkányok vastagbelében is. Virulens S. hyodysenteriae törzzsel fogékony süldőket fertőzve rendszerint a természetessel azonos kórkép idézhető elő Egyéb Serpulina fajok A sertés vastagbelében még számos egyéb, a S. hyodysenteriaehoz hasonló Serpulina él. Közülük a S. innocens megkülönböztethető az előbbi fajtól azáltal, hogy véresagaron nem hemolizál vagy csupán gyenge hemolízist okoz, ezenkívül indol-negatív, kórtani jelentősége nincs, saprophyta. A S. pilosicoli ugyancsak gyenge hemolízist okoz, a S. innocenshez hasonlóan indol-negatív, viszont szemben a S. hyodysenteriaevel és a S. innocenssel a hippurátot elbontja. Fakultatív pathogen, választott malacokban és süldőkben enyhe, vízszerű hasmenést (a sertés intestinalis spirochaetosisa) és fejlődésben való visszamaradást idéz elő. A S. pilosicoli a sertésen kívül megtalálható számos faj, így a madarak, a kutya, a majom és az ember vastagbelének a nyálkahártyáin is. Úgy látszik, ez a faj emberben is képes vízszerű hasmenést előidézni. A S. intermedia ugyancsak enyhe béta-hemolízist okoz, a colonban okoz vízszerű hasmenéssel járó gyulladást (spirochaeta okozta colitis) Treponema A treponemák 5 20 µm hosszú, szabálytalan csavarulatokat mutató spirochaeták. A kórtanilag fontos fajok nem tenyészthetők. Csak a velük fertőzött gazdaszervezetekben találhatók meg, a szájüregben, emésztőcsatornában és a nemi szervek nyálkahártyáin, fajoktól függően emberben és állatokban egyaránt. A T. pallidum az ember syphilisének az okozója. A T. paraluiscuniculi a nyulakban okoz a nemi szervek gyulladásával járó, a syphilishez hasonló betegséget. A T. denticola és a T. vincenti számos más treponemával együtt az ember szájüregének a lakója, saprophyták Leptospira Morfológia. Egyik vagy mindkét végükön horogszerűen visszahajló, 6 20 µm hosszú, igen vékony (0,1 µm) mikrobák (48. ábra), csavarulataik annyira sűrűek, hogy hullámos lefutásuk fénymikroszkópban alig látható. Általában sötét látóteres vagy fáziskontraszt-mikroszkópban vizsgáljuk őket, friss tenyészeteikben élénken mozognak. Festésükre a Vágó-féle festési eljárás alkalmas, szövettani metszetekben pedig a Levaditi-féle ezüstimpregnációs eljárással tüntethetők fel. 48. ábra - Leptospira pomona elektronmikroszkópos képe (8000 ) 131

152 Részletes bakteriológia Tenyésztés. A leptospirák tápigénye viszonylag szerény, de a vizsgálati anyagokban rendszerint jelen levő különböző baktériumok és a viszonylag hosszú tenyésztési idő miatt váladékokból, szövetekből való izolálásuk nem tartozik az egyszerű feladatok közé. A leptospirák tenyésztésükhöz aminosavakon és különféle sókon kívül hosszú szénláncú zsírsavakat, ezenkívül B 1- és B 12 -vitamint is igényelnek. Tenyésztésükre folyékony vagy kevés agart is tartalmazó félfolyékony táptalajokat, leggyakrabban az EMJH és a Korthof-féle táptalajt használjuk. Az előbbi tápfolyadék alkalmas a legkényesebb leptospirák izolálásra is, a tápanyagokon kívül bovin-szérumalbumint is tartalmaz, a hosszú szénláncú zsírsavak és az oxidációjukból keletkező toxikus anyagcseretermékek megkötésére. A Korthof-féle táptalaj különféle puffer sókat, kevés peptont és 8 10% steril nyúlsavót tartalmaz. A táptalajok ph-ja gyengén lúgos, ph 7,4 körüli kell, hogy legyen. A kész Korthof-féle táptalajt a nyúlsavó inaktiválása végett a felhasználás előtt 1/2 1 óráig 56 C-on tartjuk. A leptospirák aerobok, a beoltott táptalajokat C-on keltetjük. Ha primer izolálás a cél, a váladékokat lehetőleg sterilen kell vennünk vagy a vizsgálati anyagot előbb fogékony kísérleti állatokba oltjuk, és a lázas szakaszban a vérből vagy később a sterilen kivett vesékből próbáljuk meg az izolálást. Szennyezett vizsgálati anyagokból történő szelektív izolálás érdekében a tápfolyadékhoz kevés fluoruracilt, illetve neomicint keverhetünk. A szöveteket is tartalmazó mintából a beoltás előtt hígítási sorozatot készítünk, s ezekkel oltjuk be a tápfolyadékokat a szövetekben levő enzimek leptospirákra gyakorolt lítikus hatásának az elkerülése érdekében. Az izolálás a többnyire erős kontamináció miatt csak ritkán sikeres. A primer izolálások megeredésére rendszerint 6 16 hetet várni kell. Ha tiszta tenyészetet oltunk tovább, a tenyészetek néhány nap alatt megerednek, kb. 1 hetes tenyésztés után érik el maximális sűrűségüket, ilyenkor a levestenyészetben finom, füstszerű zavarosodás látható. A leptospirák tiszta tenyészetei a folyékony táptalajok összetételével azonos agar táptalajokon is elszaporíthatók. Embrionált tyúktojásba oltva a leptospirák ugyancsak elszaporodnak. Biokémiai sajátságok. A leptospirák energiájukat főleg hosszú szénláncú, telítetlen zsírsavakból nyerik, nitrogénforrásul pedig különféle ammóniumsókat vesznek igénybe. A cukrokat, a cukorszerű alkoholokat nem bontják. Egyes szerotípusok (L. pomona, L. canicola, L. grippotyphosa stb.) extracelluláris lipázt termelnek, ezek feloldják a kérődzők vörösvérsejtjeit, intravasalis hemolízist okozva. Ellenálló képesség. A leptospirák ellenálló képessége kicsi. A beszáradás, a savas közeg órák alatt, a 60 C-on való kezelés és a szokásosan használt fertőtlenítőszerek pedig perceken belül elpusztítják őket. A külvilágban csak akkor maradnak életben, ha a rendszerint a vizelettel ürülő leptospiráknak módjuk van természetes vizekbe jutni és ezáltal a vizeletnek felhígulni. Fertőzött tavakban, kisebb vízfolyásokban és nedves talajokban nyári, meleg időszakban néhány hétig életképesek maradnak. A fagyás elpusztítja őket. 132

153 Részletes bakteriológia Osztályozás. A leptospirákat a felületüket borító elasztikus membránban és a sejtfalban található antigének alapján mikroagglutinációs próbával szerotípusokba (szerovariánsokba) soroljuk, az egymással rokon szerotípusokat pedig szerocsoportokba vonjuk össze. Megkülönböztetjük a pathogenek (L. interrogans) és a szaprofiták (L. biflexa) csoportját. Az utóbbi években a DNS-hibridizációs vizsgálatok eredményei alapján a pathogen leptospirákat hét fajba sorolták. A pathogenek a velük fertőzött gazdafajokban (vadon élő rágcsálókban, sertésben, szarvasmarhában stb.), főleg a vesék kanyarulatos csatornácskáiban élnek és a vizelettel ürülnek. A saprophyta fajok a természetben szabadon élnek, alacsony hőmérsékleten is képesek szaporodni, megtalálhatók a természetes vizekben és a nedves talajokban. Néhány fajuk halofil, ezek a tengerek vizének a lakói. A L. interrogans csoportban ez ideig kb. 230 szerovariáns ismert, amelyeket a kb. 23 szerocsoportba sorolunk. Pathogenitás. A L. interrogans csoportba sorolt szerotípusok egyaránt megbetegíthetik az embert és a különféle háziállatfajokat. Nedves trópusi területeken az előforduló szerotípusok száma sokkal nagyobb, mint a mérsékelt égöv országaiban. A nálunk is előforduló fontosabb Leptospira- szerotípusokat, ezek fő gazdafajait és az általuk okozott betegségeket a 10. táblázat mutatja. Az ugyanazon Leptospira-szerotípus által okozott megbetegedés klinikai képe állatfajonként jelentős különbségeket mutathat. A L. pomona sertésben rendszerint tömeges vetélést okoz egyéb tünetek nélkül, míg fiatal borjakban és bárányokban lázas általános tünetekkel, sárgasággal, vérfestékvizeléssel járó betegséget (heveny leptospirosist) idéz elő. Az ember mindegyik Leptospira-szerotípus iránt fogékony. 10. táblázat - A háziállatokban előforduló fontosabb Leptospira-szerotípusok és az okozott kórképek Szerotípus Fő fenntartó gazda Okozott betegség Másodlagos gazdák L. icterohaemorrhagiae Patkány Fiatal állatokban lázas általános tünetek, sárgaság Ritkán kutya, ló, egyéb állatfajok Egérfélék, pocok, Lázas általános tünetek, Szarvasmarha, Egyéb rágcsálók sárgaság, ritkán egyéb L. grippotyphosa L. hardjo Szarvasmarha vérfestékvizelés, meningitis, mastitis, ritkábban vetélés Vetélés, juhban tünetmentes háziállatfajok is Szarvasmarha, juh L. pomona Sertés Vetélés Sertés, szarvasmarha és egyéb fajok is L. tarassovi Sertés Vetélés Sertés L. canicola Kutya Fiatalokban láz, sárgaság, idősebbekben vese- Kutya, ritkán egyéb 133

154 Részletes bakteriológia elégtelenség háziállatfaj A leptospirák fertőzött anyagokból való izolálására a laboratóriumi rágcsálók közül a tengerimalacot és aranyhörcsögöt vehetjük igénybe. A leptospirák szerotípusuktól függően mind a tengerimalacot, mind pedig az aranyhörcsögöt hol gyorsabban, hol lassabban megölik vagy legalább átmeneti lázas állapotot hoznak létre bennük. A L. icterohaemorrhagiaeval fertőzött tengerimalacok a fertőzés után néhány nap múlva lázassá válnak, majd sárgaságban betegszenek meg és 5 14 nap alatt elhullanak. Boncoláskor a legkülönfélébb szervekben, főleg a tüdőben, vérzések, a májban pedig esetleg elhalások láthatók. A L. pomona, a L. tarassovi, a L. sejroe stb. fertőzés hatására tengerimalacokban rendszerint mindössze átmeneti lázas állapot alakul ki. A leptospirák azonban ilyenkor is kimutathatók a lázas szakaszban vett vér mikroszkópos vizsgálatával vagy folyékony táptalajba oltva kitenyészthetők, a leölt vagy elhullott állatok szöveteiben pedig ezüstimpregnációs eljárással is kimutathatók. A kísérleti fertőzést túlélő állatok vérében pedig 2 3 hét múlva az adott szerotípusra nézve specifikus ellenanyagok jelennek meg, amelyek agglutinációs próbával kimutathatók Chlamydiák A chlamydiák rövid, coccoid 0,2 0,4 µm hosszú, intracellularisan, a fertőzött gazda sejtjeinek vacuolumaiban szaporodó mikroorganizmusok. Szaporodásuk jellegzetes szakaszosságot mutat. A sejtbe jutott chlamydiák (kis chlamydiasejtek, elemi testek) megnagyobbodnak, belső szerkezetük fellazul, ún. hálózatos sejtekké alakulnak, majd többszörösen osztódnak. Az osztódás bizonyos idő (kb óra) után leáll, és az osztódott sejtek zsugorodva, ismét 0,2 0,4 µm nagyságú, fertőzőképes, kis chlamydia sejtekké alakulnak. A chlamydiák tömege a sejteken belül, hártyával körülvett (chlamys: köpönyeg, palást), kisebb-nagyobb halmazok (zárványok) formájában látható (49. ábra). A chlamydiákat körülvevő hártya a gazdasejt cytoplasmamembránjából származik, az elemi testek a sejtbe való bejutáskor viszik magukkal. 49. ábra - Chlamydia psittaci vetélt juhmagzatban (30 000, az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) Festődés. A chlamydiák Gram-negatívok, megfestésükre a Stamp-, Giemsa-, vagy a Castaneda-féle eljárást használjuk. Közülük leggyakrabban a Stamp-félefestést és annak különféle módosított változatait vesszük igénybe. A láng felett fixált készítményt Stamp-féle fukszinnal (30 ml karbolvizes fukszin 120 ml desztillált vízben) 5 8 percig festjük, 1%-os ecetsavval kivonjuk, majd vízzel öblítjük, ezután 3%-os vizes malachitzöld 134

155 Részletes bakteriológia oldattal 1/2 1 percig festjük, újra öblítjük, szárítjuk és immerziós lencsével vizsgáljuk. A chlamydiák piros, a készítményben levő sejtes elemek pedig zöld színűek. A fertőzött szövetekben a chlamydiák kimutathatók immunfluoreszcenciával és elektronmikroszkópos vizsgálattal is. Tenyésztés. A chlamydiák obligát sejtparaziták, csak élő sejtekben képesek szaporodni. Rendelkeznek saját DNS-sel, RNS-sel és különféle enzimekkel, amelyekkel saját testanyagaikat felépítik, a nagy energiájú vegyületeket és a különböző alacsony molekulatömegű intermedier anyagokat azonban a gazdasejttől szerzik. A chlamydiák elszaporíthatók egyrétegű sejttenyészetekben (McCoy, HeLa stb.), továbbá 5 7 napos embrionált tyúktojások szikzsákjába oltva és kísérleti állatokban (egérben, tengerimalacban) is. A legáltalánosabban használt McCoy sejtvonalat a vizsgálati anyaggal való beoltás előtt vagy közvetlenül azután citosztatikumokkal (pl. jód-dezoxi-uridinnel) kezelik, a sejt saját makromolekulaszintézisének a gátlása érdekében, a vizsgálati anyagot pedig alacsony fordulatszámmal rácentrifugálják a sejttenyészetre. A fertőzött sejteket 37 C-on tenyésztve, 2 3 nap múlva a cytoplasmában a chlamydiák zárványok formájában felismerhetők. A chlamydiák a csirkeembriókat 3 4 nap alatt elpusztítják vagy legalábbis károsítják. Az izolálásukhoz, mind a sejttenyészetekben, mind az embrionált tojásokban gyakran több vakpasszázs szükséges. A chlamydiák szaporodását a tetraciklinek, az eritromicin és néhány más antibiotikum gátolja. Antigénszerkezet. A nemzetségbe tartozó valamennyi fajnak van egy közös hőstabil lipopoliszacharid sejtfalantigénje, amely komplementkötési próbával kimutatható. Emellett a chlamydiák tartalmaznak még számos további, zömmel hőlabilis antigént is, amelyek alapján az egyes fajok szerotípusokba sorolhatók. A chlamydiák fajai. A chlamydiákat természetes gazdáik, az elemi testeknek a fertőzött sejtekben való elhelyeződése, finomabb szerkezete és festődése, továbbá néhány egyéb tulajdonság alapján soroljuk fajokba. A nemzetségbe tartozó fajok közül a C. trachomatis és a C. pneumoniae orvosi szempontból fontos. A C. trachomatisnak három biovariánsa van, ezek egyike idézi elő az ember trachomáját (idült, gennyes conjunctivitis), az inclusiós conjunctivitist és számos más kórképet, a másik variánsa az inguinalis és az anorectalis nyirokcsomók gyulladásával járó, szexuális úton terjedő, lymphogranuloma venereum elnevezésű betegséget okozza, a harmadik variáns pedig az egerekben telepszik meg, a tüdőben szaporodik, pneumoniát okoz, a fertőzés azonban gyakran tünetmentes marad. A C. pneumoniae az emberben okoz pneumoniát, bronchitist és más légúti tüneteket. A C. psittaci (psittakos: papagáj) az embert és az állatokat egyaránt megbetegíti Chlamydia psittaci Igen széles körben elterjedt mikroorganizmus. Természetes viszonyok között megtalálható a legkülönfélébb madárfajok, továbbá a házi és vadon élő emlősök bélcsatornájának nyálkahártya-hámsejtjeiben, ahonnan a bélsárral nagy mennyiségben ürül. Morfológiai és tenyésztési tulajdonságai megegyeznek a nemzetség egészére mondottakkal. Antigénszerkezet. A törzsek antigénszerkezetileg meglehetősen heterogének. A valamennyi törzsben jelenlevő közös lipopoliszacharid antigén-mellett a madarakból származó C. psittaci izolátumok monoklonális ellenanyagokkal működő immunfluorescenciás próbával ez ideig legalább 5 szerovariánsba (szerotípusba: A E), az emlősökből kitenyésztett C. psittaci-izolátumok pedig legalább 8 szerovariánsba sorolhatók. Közülük a szarvasmarhában és juhban polyarthritist, encephalomyelitist, pneumoniát és enteritist előidéző, szerológiailag három variánst képviselő törzseket, a C. psittacitól való DNS-homológiabeli és szerológiai eltéréseik alapján önálló fajnak tekintik és C. pecorum névvel illetik. Ellenálló képesség. A chlamydiák ellenálló képessége hővel és fertőtlenítő- szerekkel szemben nem nagy, 65 C-ra hevítve vagy 1 3%-os klórtartalmú fertőtlenítőszert tartalmazó oldatokkal kezelve perceken belül elpusztulnak. Bélsárban, hörgőváladékban, magzatburkokban, továbbá beszáradva a porban is azonban kb. 3 hétig életképesek maradnak. Pathogenitás. A C. psittaci gazdaspektruma igen széles, a legkülönbözőbb madár- és emlősfajokat megbetegítheti. Fakultatív pathogen. Az esetek egy részében septikaemia alakul ki, a tünetek azonban korlátozódhatnak egy vagy néhány szervre, de gyakori a tünetmentes fertőzés is. Klinikai tünetekben is megnyilvánuló betegséget főként papagájfélékben, galambokban, pulykában, kacsában, ritkábban más madarakban, az emlősök közül pedig szarvasmarhában, juhban, kecskében, macskában, lóban és az emberben okoz. Madarakban náthás tünetek, orrfolyás, könnyezés, hasmenés, olykor meningitis, encephalitis alakul ki. A kérődzőkben vetélés, bronchopneumonia, ízületgyulladások, enteritis, encephalomyelitis a fő tünetek. Lóban kötőhártya-gyulladás, légúti hurutos tünetek, macskában conjunctivitis alakul ki. Az ember többnyire 135

156 Részletes bakteriológia papagájoktól (papagájkór, psittacosis) vagy más madaraktól (ornithosis), ritkán kérődző állatoktól fertőződik, amelynek a következményeként lázas általános tünetek, atípusos pneumonia, esetenként ízületgyulladás stb. alakul ki Rickettsiák A rickettsiák obligát sejtparaziták, természetes viszonyok között megtalálhatók különféle ízeltlábúakban (kullancsban, tetűben, bolhában, atkában), továbbá a velük fertőzött gerincesekben. Az ízeltlábúak a rickettsiák valódi gazdái vagy csupán vektorai. Az ember és a háziállatok, kevés kivételtől eltekintve, az arthropoda vektorok vérszívása útján fertőződnek. A rickettsiák okozta fertőzések többsége természeti gócfertőzés formájában létezik, az ember és a háziállatok többnyire csak alkalmi gazdák. E kórokozók egy része az arthropoda vektor elterjedtségének megfelelő, korlátozott területen, más részük azonban világszerte (pl. Q-láz) előfordul. Morfológia. Coccoid 0,3 0,8 µm, ritkán hosszabb, pálcika alakú mikroorganizmusok. A festéket nehezen veszik fel, Gram-negatívak, megfesthetők, azonban különféle speciális festési eljárásokkal (Gimenez, Giemsa, Romanowsky stb.), de jól feltüntethetők immunfluoreszcenciás eljárással is. A fertőzött sejtek cytoplasmájában egyenként vagy halmazokban, cytoplasmazárványok formájában láthatók. Tenyésztés. Kevés kivételtől eltekintve csupán élő sejtekben, intracellulárisan szaporodnak. Jól elszaporíthatók embrionált tojásban, egyrétegű sejttenyészetekben és laboratóriumi kísérleti állatokban. Legáltalánosabban az embrionált tyúktojást használjuk, 5 6 napos tojások szikzsákjába oltva a rickettsiák nap alatt elszaporodnak, miközben az embriót elpusztítják. A tetraciklinek és kisebb mértékben más széles terápiás skálájú antibiotikumok a rickettsiák szaporodását gátolják. A rickettsiák osztályozása. A rickettsiák aszerint, hogy a velük fertőzött gerincesek milyen sejtjeiben (különféle szöveti sejtekben, leukocytákban, vörösvérsejtekben stb.) szaporodnak elsősorban, extra- vagy intracellulárisan helyeződnek, természetes gazdáik ízeltlábúak vagy azok csupán vektorok stb., több családba s ezeken belül számos nemzetségbe sorolhatók. A kórtanilag fontos fajokat magukba foglaló nemzetségek közül a Rickettsia és a Coxiella nemzetségbe tartozó fajok a velük fertőzött gerincesek gyakorlatilag minden sejtféleségében szaporodnak. Az Ehrlichia és a Cowdria fajok főként a fertőzött gazdák lymphoid sejtjeiben és az ereket bélelő endothelsejtekben szaporodnak, ezért ezeket a fertőzéseket kiterjedt oedemák kísérik, míg a vörösvérsejtekben vagy azok felületén szaporodó, Anaplasma, Eperythrozoon és Haemobartonella fajok okozta fertőzések során a vörösvérsejtek szétesése, anaemia és sárgaság a jellemző tünetek Rickettsia Rövid, 0,8 2 µm hosszú, 0,2 0,4 µm vastag intracellularisan helyeződő pálcikák. Embrionált tojásban és egyrétegű sejttenyészetekben egyaránt jól elszaporíthatók. Ellenálló képességük kicsi, 56 C-on gyorsan elpusztulnak. Az ide tartozó fajok fő rezervoárjai az apró rágcsálók, továbbá ízeltlábúak. A R. prowazekii az ember kiütéses typhusának az okozója. A kórokozó természetes vektora a ruhatetű. A csoportba még számos humán pathogen faj tartozik, így a R. rickettsii, amely az amerikai kontinensen előforduló sziklás-hegységi foltos láz okozója, kullancsok viszik tovább a fertőzést. A R. sibirica Oroszország keleti és délkeleti területein fordul elő, ugyancsak kullancsok közvetítik, a R. conorii, amely a mediterrán területeken, Afrikában és Ázsiában honos, természetes gazdái kullancsok, továbbá a kutya, a patkány- és egérfélék. Ezek a fertőzések Európában már nem vagy csak kivételes körülmények között fordulnak elő Coxiella A nemzetség ez ideig egyetlen faja a Coxiella burnetii. Biológiai sajátságait illetően hasonlít a Rickettsia nemzetségbe sorolt fajokra, de egyebek mellett különbözik tőlük abban, hogy kisebb, 0,4 1 µm hosszú, a fertőzött gazdasejtek vacuolumaiban szaporodik, ellenálló képessége pedig igen nagy. A C. burnetii embrionált tojás szikzsákjába oltva tenyészthető. Beszáradt váladékokban, gyapjún stb. akár egy évig is életben marad, a 60 C-on való hevítést fél óráig elviseli. Világszerte, így nálunk is előfordul. Gazdaspektruma igen széles. Természetes gazdái és vektorai kullancsok, amelyekben a kórokozó az utódokba is átjut, de a kórokozó továbbvitelében, mechanikus úton, számos más 136

157 Részletes bakteriológia ízeltlábú (légy, bolha, tetű, szúnyog stb.) is szerepet játszik. Szemben más rickettsiákkal, a fertőzött állatok váladékaival ürülve, vektorok közvetítése nélkül, közvetlenül is átjut egyik állatról a másikba. A kórokozó iránt a madarak és az emlősök széles köre fogékony, klinikai tünetekkel járó betegséget leggyakrabban kérődzőkben okoz. A C. burnetii az emberben, szarvasmarhában, juhban, kecskében, ritkán egyéb állatfajokban idéz elő, lázas általános tünetekkel, tüdőgyulladással, kérődzőkben leggyakrabban vetéléssel járó betegséget (Q-láz). A laboratóriumi állatok közül a C. burnetii iránt a hörcsög, a tengerimalac, az egér és a nyúl egyaránt fogékony. Tengerimalacok fertőzésük után 4 8 nap múlva lázas tünetek között megbetegszenek, 2 3 hét múlva pedig elhullanak. Boncoláskor lépduzzanat látható, a lépből a kórokozók izolálhatók Ehrlichia Coccoid, 0,5 µm átmérőjű, intracellulárisan helyeződő mikrobák, a fertőzött sejtekben membránnal körülvett halmazok formájában láthatók. Közülük az E. canis tenyészthető kutyából származó monocyta sejttenyészetekben, egyes további fajok egyéb sejtvonalakban is, embrionált tojásban azonban nem. Vektoraik, ahol ismertek, zömmel kullancsok. Számtalan fajuk van, közülük a E. canis a kutyában okoz lázas általános tünetekkel, vérzésekkel járó betegséget. Klinikai tünetekkel járó formájában főleg meleg égövi területeken észlelhető (a kutya trópusi pancytopeniája). Az E. phagocytophila juhban, kecskében, szarvasmarhában és szarvasban okoz lázas tüneteket ( kullancsláz ), Északnyugat-Európában is előfordul. Az E. equi lóban okoz lázas tünetekkel, oedemákkal, lymphodenopathiával és thrombocytopeniával járó betegséget. Az E. risticii ugyancsak a lovat betegíti meg, lázas általános tüneteket, leukopeniát, hasmenést, alkalmanként vetélést okozva (Potomac horse fever). Az Ehrlichia-fertőzések hazai előfordulásáról ez ideig nincs tudomásunk Cowdria Coccoid 0,2 0,5 µm nagyságú mikrobák, metilénkékkel és más bázikus festékekkel is megfesthetők, intracellularisan helyeződő halmazok formájában láthatók. Eddig egyetlen fajuk, a Cowdria ruminantium ismert. A kérődzők vérereinek endothel sejtjeiben és a különféle fehérvérsejtekben szaporodik, vektorai kullancsok, de a kullancsokban az utódokba nem jut át. Főleg Afrika déli részén fordul elő, a kérődzőkben okoz lázas általános tünetekkel, kiterjedt oedemákkal, szívburokvizenyővel járó betegséget (heartwater) Anaplasma Kerekded, 0,3 1 µm nagyságú, vékony membránnal körülvett képletek formájában láthatók a fertőzött gazdák vörösvérsejtjeiben. Összetett festési eljárásokkal, pl. Giemsa-szerint megfesthetők. Nem tenyészthetők. Világszerte előfordulnak. Természetes gazdái kullancsok, továbbá a házi- és vadon élő kérődzők. Az ide tartozó fajok közül az A. marginale és az A. centrale szarvasmarhában, bivalyban és a vadon élő kérődzők széles körében, az A. ovis pedig juhban, kecskében okoz lázas általános tünetekkel, anaemiával járó betegséget (anaplasmosis). A szarvasmarha anaplasmosisát nálunk is megállapították Eperythrozoon Coccoid vagy kiflire emlékeztető, 0,4 1,5 µm hosszú pálcikák vagy gyűrűk, amelyek a vörösvérsejtek felületén élnek, de szabadon a vérplazmában is megtalálhatók. Giemsa vagy Romanowsky szerint megfesthetők. Többségük nem tenyészthető, egyes fajaik azonban embrionált tojásba oltva elszaporodnak. A különböző gerincesekben, főleg a rágcsálókban, a kérődzőkben és a sertésekben élő, obligát paraziták. Világszerte előfordulnak. Ahol ismert, vektoraik arthropodák. Az ide tartozó fajok közül az E. suis sertésben okoz sárgasággal és anaemiával járó betegséget (icteroanaemia), nálunk is megállapították. Az E. ovis juhban fordul elő, a fertőzés többnyire tünetmentes, de anaemia, lesoványodás és elhullás is lehet a következménye Haemobartonella Coccoid vagy rövid, kiflire emlékeztető pálcikák, a vörösvérsejtek felületén találhatók. Jól feltűntethetők Romanowsky-féle festéssel. Nem tenyészthetők. Világszerte előfordulnak. Vektoraik, ahol vannak és ismerjük, arthropodák. 137

158 Részletes bakteriológia Az ide tartozó fajok közül a H. felis macskában, a H. canis pedig kutyában idéz elő anaemiával járó betegséget. E fajoknál nem tudjuk, hogy a fertőzés továbbvitelében szerepet játszanak-e a vektorok. A H. felis-fertőzést nálunk is megállapították. A macskában előfordul egy további rickettsia, a Bartonella (Rochalimea) henselae, amely a fertőzött macska vörösvérsejtek lizátumából speciális táptalajokon kitenyészthető. A kórokozó a macska vörösvérsejtjeiben szaporodik. A macskák tünetmentesek, de a kórokozó karmolással, harapással, nyállal emberbe jutva helyi gyulladással, hólyagképződéssel, továbbá a regionális nyirokcsomók hosszan tartó gyulladásával, ritkán septicaemiával járó betegséget idéz elő (macskakarmolási betegség) Mycoplasmák A mycoplasmák, tágabb értelemben ideértve a Mycoplasmatales rendbe tartozó valamennyi nemzetséget és fajt, sejtfal nélküli prokaryoták, a cytoplasmát vékony, háromrétegű membrán veszi körül. Morfológia. Alakjuk, szilárd vázat adó sejtfal híján, a tenyésztés körülményeitől, a tenyészet korától és phjától, valamint a környezet ozmotikus viszonyaitól függően igen változatos (50. ábra). Hol coccoid, ellipszis vagy csillag alakúak, ilyenkor általában 0,2 0,8 µm közötti nagyságúak, hol pedig néhány µm-től akár 150 µm hosszú, a gombákra emlékeztető, elágazódó fonalakat képeznek, amelyek gyöngyfüzérszerű coccoid alakokká töredeznek szét. Néhány fajra (pl. M. pneumoniaera, M. gallisepticumra) jellemző a sejtek körte alakja. A spiroplasmák helikális alakúak. A mycoplasmák alaki tulajdonságaikat illetően hasonlítanak a baktériumok L (sejtfalukat vesztett) formáira, de sohasem revertálódnak baktériummá. Csillóik nincsenek, Gram-negatívok. Vizsgálatukra gyakran az immunfluoreszcenciás eljárást vesszük igénybe. 50. ábra - Mycoplasma bovis elektronmikroszkópos képe ( , az Országos Állategészségügyi Intézet felvétele) Tenyésztés. A mycoplasmák a legkisebb szabadon élő mikrobák. Sejtmentes, mesterséges táptalajokban szaporíthatók, többnyire fakultatív aerobok, microaerophilek, egy nemzetségük azonban anaerob. Igényes mikróbák, tenyésztésükre olyan tápanyagokban gazdag folyékony és szilárd táptalajokat használunk, amelyek kiegészítésképpen vérsavót (koleszterint), élesztőkivonatot, azonkívül DNS-t is tartalmaznak. Egyes fajok speciális igényeinek a kielégítésére alkalmanként a táptalajhoz egyéb anyagot (laktalbumin-hidrolizátumot, 138

159 Részletes bakteriológia nikotin-adenin-dinukleotidot, ciszteint stb.) is adunk. Mivel sejtfaluk nincs a penicillin szaporodásukat nem gátolja. Telepeik szilárd táptalajokon a tenyészet korától és a tenyésztés körülményeitől függően 0,1 1 mm átmérőjűek. A fajok többsége szilárd táptalajok felületén a középen vastagabb, a táptalajba is belenövő, szélük felé ellaposodó (tükörtojáshoz hasonló kinézetű) telepeket képez. Folyékony táptalajokban, kevés kivételtől eltekintve nem okoznak látható zavarosodást, az egyes fajok elszaporodásáról a különféle szubsztrátok (glükóz, arginin, ureum) bontása vagy szilárd táptalajokra való kioltásuk alapján győződünk meg. Osztályozás. A mycoplasmákat a genom mérete, koleszterinigényük és morfológiájuk alapján családokba, ezeken belül pedig optimális tenyésztési hőmérsékletük, ph-igényük, a glükóz-, arginin-, ureum- és eszkulinbontás, foszfatáz- aktivitás, továbbá a trifenil-tetrazóliumklorid-redukció alapján a Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma és Spiroplasma nemzetségekbe soroljuk. Az Anaeroplasma nemzetség tagjai az előbbiektől egyebek mellett különböznek abban, hogy anaerobok. A mycoplasmák széles körben elterjedtek, a légutak, a nemi szervek és az emésztőcsatorna nyálkahártyáin élnek emlősökben és madarakban egyaránt (Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma), de tartoznak ide olyanok is, amelyek ízeltlábúakban, növényeken (Spiroplasma) vagy a természetben szabadon élnek. Vannak közöttük pathogen fajok is, többségük azonban fakultatív pathogen vagy saprophyta. Közülük állatorvosi szempontból a Mycoplasma, Ureaplasma és az Acholeplasma nemzetségbe sorolt fajok fontosak. Az egyebek, közöttük az Anaeroplasma fajok, természetes előfordulási helye kérődzők bendője, saprophyták. A Spiroplasma nemzetségbe tartozó fajok pedig különböző ízeltlábúakból (kullancsokból, méhekből, szúnyogokból, muslicákból stb.) és növényekből izolálhatók, egyik-másik fajuk növénypathogen Mycoplasma Alaki és tenyésztési tulajdonságaikat illetően megegyeznek a mycoplasmákra általában mondottakkal. Fakultatív anaerobok, mikroaerofilek, tenyésztésüket a valamelyest csökkentett O 2-nyomás és néhány % CO 2 jelenléte elősegíti. Tenyésztésükhöz koleszterint (vérsavót) igényelnek. Szilárd táptalajokon, 37 C-on, lassan, 2 10 nap alatt alakulnak ki a telepek, amelyek igen aprók, általában csak telep mikroszkóppal láthatók, egyes fajok több napos telepei azonban szabad szemmel is észlelhetők. A telepek rendszerint tükörtojásra emlékeztetnek (51. ábra). Szervekből, szövetekből való izolálásukra olyan, folyékony táptalajokat veszünk igénybe, amelyek a Gram-pozitív baktériumok visszaszorítására penicillint, a Gram-negatív fajok szaporodásának a gátlására pedig tallium-acetátot is tartalmaznak. 51. ábra - Mycoplasma arginini telepei agaron (Stipkovits László anyagából) 139

160 Részletes bakteriológia Biokémiai tulajdonságok. A fajok egy része elbontja a glükózt, másik része az arginint vagy mindkét szubsztrátumot. Előfordulnak azonban olyan fajok is, amelyek egyiket sem képesek elbontani. A glükózt bontó fajok a glükózból savat termelnek, ezek megsavanyítják a tápfolyadékot. Közülük egyesek elbontják a mannózt és néhány más szénhidrátot is. Az arginint elbontó fajok az arginin hidrolízise következtében ammóniát termelnek, a táptalajt meglúgosítják. Egyes Mycoplasma fajok foszfatáz és lipáz enzimeket is termelnek, redukálják a tetrazóliumsókat, elfolyósítják a zselatint, adszorbeálódnak a vörösvérsejteken és feloldják azokat. Ellenálló képesség. A mycoplasmák ellenálló képessége kicsi. A beszáradás, az C és a szokásosan használt fertőtlenítőszerek egyaránt perceken belül elpusztítják őket, fehérjében dús váladékokban azonban napokon keresztül életben maradnak. Osztályozás. A Mycoplasma (Ureaplasma, Acholeplasma) fajok tenyésztési, biokémiai és szerológiai sajátságaik együttes figyelembevételével határozhatók meg. Szerológiai besorolásukra a növekedés- és anyagcseregátlási próba, továbbá az immunfluoreszcenciás eljárás használatos. A beoltott táptalajra helyezett, immunsavót tartalmazó papírkorong vagy a folyékony táptalajba kevert immunsavó megakadályozza a homológ fajok korongok közelében való növekedését (növekedésgátlási próba) vagy levestenyészetekben az egyes anyagok (glükóz, arginin, tetrazólium sók, ureum stb) metabolizálását (anyagcseregátlási próba). Az immunfluorescens eljárás a telepek fénylése alapján alkalmas szilárd táptalajokon a kevert tenyészetek felismerésére is. A Mycoplasma nemzetségen belül ez ideig több mint 90 faj ismert. Pathogenitás. A mycoplasmák között vannak pathogen, fakultatív pathogen és saprophyta fajok egyaránt. Az utóbbiak gyakran megtalálhatók a klinikailag egészséges állatok nyálkahártyáin, sőt egyes fajok előfordulnak a különféle szervekből készített sejttenyészetekben is. A M. pneumoniae az emberben okoz légúti tüneteket, pneumoniát. Az állatokban előforduló fontosabb fajokat és általuk előidézett kórképeket a 11. táblázat mutatja. 11. táblázat - Az állatokban előforduló fontosabb Mycoplasma fajok és az általuk okozott kórképek Mycoplasma faj Gazda Kórkép M. mycoides subsp. mycoides Szarvasmarha Ragadós tüdőlob 140

161 Részletes bakteriológia (kis telep) Mastitis, gentitális fertőzések, M. bovis vetélés, borjakban pneumonia, artritis M. bovigenitalium hüvely- és méhgyulladás, mastitis M. dispar Tüdőgyulladás borjakban M. californicum Mastitis M. canadense Mastitis M. bovoculi Fertőző keratoconjunctivitis M. mycoides subsp. mycoides (nagy telep) M. mycoides, subsp. capri M. capricolum subsp. Kecske Ragadós tüdőlob caprineumoniae M. capricolum subsp. capricolum Kecske Polyarthritis, pneumonia, mastitis M. agalactiae Juh, kecske Fertőző elapasztás M. ovipneumoniae Juh Tüdőgyulladás M. conjunctivae Juh, kecske Keratoconjunctivitis M. hyopneumoniae Sertés Pneumonia M. hyorhinis Arthritis, polyserositis M. hyosynoviae Arthritis M. equifetale Ló Légzőszervi tünetek M. felis Légzőszervi tünetek lóban és conjunctivitis macskában M. cynos Kutya Köhögés, légúti hurut 141

162 Részletes bakteriológia M. gallisepticum Madarak Idült légzőszervi betegség, CRD (csirke, pulyka) M. synoviae Synovitis (csirke, pulyka) M. meleagridis M. iowae Lábgyengeség, mozgászavar, légzsákgyulladás (pulyka) Légzsákgyulladás, satnyaság (pulyka) M. anatis Sinusitis (kacsa) M. anseris Légzsákgyulladás (lúd) Ureaplasma A Mycoplasma nemzetség fajaihoz hasonlóan fakultatív anaerobok, mikroaerofilek. Tenyésztésükhöz koleszterint igényelnek, az enyhén savas, ph 6,0-os táptalajokat kedvelik, telepeik a mycoplasmákéinál is apróbbak. Energiaforrásul karbamidot használnak, belőle ammóniát termelnek, viszont nem bontják el a szénhidrátokat és az arginint. Az ureaplasmák osztályozása tenyésztési, biokémiai sajátságai mellett gazdafajaik és szerológiai tulajdonságaik (növekedés-, illetve anyagcsere-gátlási próbák) alapján történik. Mind az emberből, mind a szarvasmarhából, kutyából izolált ureaplasmák több szerocsoportba, szerotípusba oszthatók. Természetes előfordulási helyük a szájüreg, a légutak és a nemi utak nyálkahártyái az emberben és a különféle állatfajokban. Fakultatív pathogenek vagy saprophyták. Az emberben előforduló faj az U. urealyticum, a nemi utakban hurutot, gyulladást idézhet elő, terméketlenséget stb. okozhat. Az U. diversum a szarvasmarha nyálkahártyáin fordul elő, a nemi utak hurutját, az ondótermelés zavarát, következményes meddőséget, borjakban pneumoniát okozhat. Az U. canigenitalium kutyában fordul elő és reproduktív zavarokat okozhat, az U. felinum és a U. cati törzseket a macska szájüregéből tenyésztették ki, feltehetően saprophyták. Az U. gallorale fajt csirke orrüregéből izolálták Acholeplasma Fakultatív anaerobok, mikroaerofilek, tenyésztésükhöz koleszterint nem igényelnek. Telepeik általában nagyobbak, mint a mycoplasmákéi. Folyékony táptalajokban szaporodva látható zavarosodást okoznak, 25 Con is növekednek. Kevés kivételtől eltekintve bontják a glükózt és az arginint, az ureumot azonban nem. Megtalálhatók a különféle állatfajok nyálkahártyáin, de szabadon élve a szennyvizekben és a talajban is. Saprophyták, egyes fajok (A. axanthum, A. laidlawii) gyakran előfordulnak klinikai vizsgálati anyagokban, az A. oculi pedig fakultatív pathogen, juhban, kecskében conjunctivitist idézhet elő Gombák A gombák (Fungi, Myceteae) valódi sejtmagvú, klorofill nélküli, egy- vagy többsejtű szervezetek, amelyeket korábban a növényvilágba soroltak, manapság azonban önálló csoportnak tekintenek. Elnevezésük a baktériumokhoz és a magasabb rendű szervezetekhez hasonlóan a Linné-féle binominális nómenklatúra szabályai szerint történik. A gombáknak több mint faja van. A természetben igen elterjedtek, megtalálhatók a talajban, a levegőben, a természetes vizekben, a növényeken, az ember és az állatok bőrén, nyálkahártyáin, a bélsárban stb. Túlnyomó többségük saprophyta, általában elhalt növényi és állati anyagokon élnek, egy részük azonban élő növényeken és ritkán állatokon is megtelepszik. 142

163 Részletes bakteriológia A gombák heterotróf szervezetek, energiájukat különféle szerves anyagok bontásából nyerik, ezáltal közreműködnek a természet anyagkörforgalmának a fenntartásában. A gombák vizsgálatával a mikológia foglalkozik, amely nem tartozik szorosan a mikrobiológiához. A gombák ismerete azonban több szempontból mégis fontos. Egyes gombafajok anyagcsere-tevékenységét felhasználjuk különféle ipari és mezőgazdasági célokra (penicillintermelésre, szerves savak, alkoholok előállítására, bor, sör erjesztésére, élesztőgombák használata a sütőiparban stb.). Más fajokat azért kell ismernünk, mert jelentős károkat okoznak (pl. növénypathogen gombák, faanyagok gombásodása). Végül néhány fajuk ismerete állatorvosi szempontból is fontos, mert különféle élelmiszerekben és takarmányokban elszaporodva azok megromlását idézik elő vagy éppenséggel olyan mérgező anyagcsere-termékeket (mikotoxinokat) termelnek, amelyek később a takarmánnyal együtt az állati szervezetbe jutva mérgezést (mycotoxicosist) idéznek elő, vagy más mikroorganizmusokhoz hasonlóan maguk idéznek elő betegséget (mycosist). Az emberben és az állatokban betegséget előidéző gombafajok száma a saprophyták nagy számához képest elenyészően csekély. A valódi gombák (Eumycetes) ivaros szaporodásuk módjai, morfológiai és anyagcsere-sajátságaik stb. alapján négy osztályba sorolhatók: Zygomycetes (járomspórás gombák), Ascomycetes (tömlős gombák), Basidiomycetes (bazídiumos gombák), Deuteromycetes (konídiumos gombák). Morfológia. A gombák egy- vagy többsejtű szervezetek, a sejtek nagysága néhány µm és 100 µm között változik. Valódi sejtmagjuk és a növényi sejtekre jellemző sejtorganellumaik vannak. Sejtfaluk anyaga főként kitin (acetil-glükózamin-polimer), hemicellulóz vagy cellulóz (különböző szerkezetű glükózpolimerek), de előfordulnak benne glükoproteinek, proteinek, lipidek, esetenként festékanyagok stb. is. A gombák szerkezeti felépítésük alapján kétfélék: fonalas vagy élesztőszerű gombák. A fonalas gombák egy vagy több megnyúlt sejtből álló, hosszabb vagy rövidebb fonalakat, hifákat képeznek. A hifák végén levő csúcssejtek megnyúlásával és osztódásával növekednek. Gyakran a csúcssejt alatti sejtek is osztódnak, ennek következtében elágazódó fonalak jönnek létre. A hifák egy része a tápanyagok felszívására és a gombatelep rögzítésére szolgál (vegetatív hifák), más részük a szaporodás szolgálatában áll (reproduktív hifák). Ez utóbbiakon képződnek a gombák szaporodását szolgáló spórák. Az elágazódó hifák szövedéke a vattaszerű gombatelep, a micélium. Az ilyen telepekben fejlődő gombákat nevezik penészgombáknak. Az élesztőszerű gombák rendszerint sarjadzással szaporodnak. Kerek vagy ovális alakúak, nagyságuk általában 5 10 µm, de valódi és pszeudomicéliumokat is képezhetnek, telepeik hasonlítanak a baktériumok telepeire. A dimorf gombák olyan, többsejtű fonalas gombák, amelyek 26 C-on a penészgombákéra, 37 C-on azonban a sarjadzó gombákéra jellemző telepeket képeznek. A gombák ivartalan (aszexuális) vagy ivaros (szexuális) módon szaporodnak. Az ivartalan és az ivaros szaporodási forma ugyanazon gombafaj szaporodási ciklusában gyakran egyidejűleg is folyik vagy váltogatja egymást. Mind a fonalas, mind az élesztőszerű gombák szaporodhatnak ivartalan és ivaros úton is. Az ivaros szaporodáskor két gombasejt összeolvadásából keletkeznek a spórák. Az ivaros szaporodás fő spóraalakjai a zigospórák (a járomspórás gombákon) az aszkospórák (a tömlős gombákon) vagy a bazidiospórák (a bazídiumos gombákon). Az ivartalan szaporodáskor a spórák megtermékenyítés nélkül keletkeznek. A spórák létrejöhetnek a hifán belül vagy azon kívül. A hifán belül oly módon keletkeznek, hogy a hifa csúcssejtje vagy más szakasza megduzzad és spórává alakul (klamidospóra), vagy úgy, hogy a hifa feltöredezik és spórákká esik szét (artrospóra). A hifán kívül képződő spórák (konidiospórák, konídiumok) vagy közvetlenül a hifán helyezkednek el, vagy egy kocsány (konídiumtartó) segítségével kapcsolódnak hozzá egyesével vagy füzérszerű elrendeződésben. Az élesztőszerű gombák ivartalan szaporodásakor rendszerint bimbózással jönnek létre az új sejtek (blasztospórák). A gombák morfológiáját többnyire festetlen, natív preparátumokban, kis nagyítású lencsékkel, normál fényvagy fáziskontraszt-mikroszkópban vizsgáljuk. A gombák megfesthetők a bakteriológiában használt festékekkel 143

164 Részletes bakteriológia és Gram szerint is. Festésükre azonban gyakran speciális, összetett festési eljárásokat veszünk igénybe (pl. perjódsavas Schiff-féle festés). Tenyésztés. A gombák viszonylag igénytelen, aerob, heterotróf organizmusok. Nitrogénforrásként a legtöbb gomba szerves és szervetlen nitrogénvegyületeket (fehérjéket, peptideket, aminosavakat, nitrátokat, ammóniát) egyaránt fel tud használni, egyes fajok azonban kizárólag szerves nitrogént képesek hasznosítani. A gombák tenyésztésére használt táptalajokban a nitrogénforrás általában pepton vagy nitrátsók. Szénszükségletüket kivétel nélkül szerves anyagok, főként szénhidrátok (egyszerű cukrok, cukoralkoholok, szerves savak, cellulóz, kitin stb.) bontásából nyerik. Laboratóriumi tenyésztésükre leggyakrabban a Sabouraud-féle, peptont és glükózt tartalmazó agart, valamint maláta-, melasz- vagy kukoricaliszt-tartalmú táptalajokat használunk. A szintetikus táptalajok közül mind folyékony, mind szilárd formában használjuk a Czapek-féle, szacharózt, nitrátot és különféle sókat tartalmazó táptalajt. A táptalajok optimális ph-ja enyhén savanyú, 5 7 között van. A savanyú ph önmagában is gátolja a baktériumok szaporodását. A neutrális ph-t igénylő, hosszú tenyészidejű gombafajok (pl. a dermatophytonok) kitenyésztésére a baktériumok szaporodásának gátlására antibiotikumokat (pl. penicillint, streptomicint), a penészgombák gátlására pedig esetleg ciklo-heximidet is tartalmazó táptalajokat használunk. A gombákat általában addig tenyésztjük, amíg a telepeken spórák, konídiumok képződnek. Ezek képződésének módja, alakja, nagysága, színe az identifikálás alapja. A tenyésztés optimális hőmérséklete a gomba fajától függően C között változik. Az identifikáláshoz szükséges morfológiai bélyegek általában 5 7 nap alatt alakulnak ki, esetenként azonban a spóraképződést serkentő táptalajokra és sokkal hosszabb tenyésztési időre van szükség. Ellenálló képesség. A gombák ellenálló képessége nagyobb, mint a vegetatív baktériumoké. Beszáradva akár évekig is életképesek maradnak, C-on azonban perceken belül elpusztulnak. A fertőtlenítőszerek a gombák elölésére rendszerint ugyanolyan koncentrációban használhatók, mint a mycobacteriumok elpusztítására. Speciálisan a gombák elpusztítására a pentaklórfenol-nátrium, valamint a merfen és a mertiolát használhatók. A gombák szaporodása számos kemoterapeutikummal gátolható, a mycosisok gyógykezelésére egyéb szerek mellett néhány antibiotikum (nystatin, amfotericin B, griseofulvin stb.) is rendelkezésre áll. Pathogenitás. Az állatorvost érdeklő gombák legnagyobb része fakultatív kórokozó, amelyek szabadon a talajban vagy szerves anyagokon, esetleg a növényeken élnek és onnan kerülnek az állati szervezetbe. A gombák egy része az emberben és az állatokban mycosist, mások mycotoxicosist okoznak. A mycosisok általános (szisztémás) vagy csupán helyi mycosisok (pl. dermatomycosis). A következőkben az egyes osztályokba tartozó, igen nagyszámú gombafaj közül csak azokat ismertetjük, amelyeknek állatorvosi vagy egyéb szempontok miatt jelentőségük van Zygomycetes Az ide tartozó gombák közül a Mucor, a Rhizopus és az Absidia nemzetségbe sorolt fajok gyakran előforduló penészgombák. Ivarosan két megduzzadt hifasejt összeolvadásából keletkező zigospórával szaporodnak. A gyakoribb ivartalan szaporodási formánál a reproduktív hifák végein gömb alakú, sporangiumnak nevezett spóraképző szerv alakul ki. A sporagiumban számtalan spóra (sporangiospóra) képződik. A gömb alakú sporangiumok miatt az ide tartozó fajokat nevezik fejespenészeknek (52. ábra) is. Az egyes genusokba tartozó fajok a szaporítószervek alaki sajátságai, továbbá tenyésztési sajátságaik alapján különböztethetők meg. 52. ábra - Rhizopus sp. sporangiumának felépítése (fukszinfestés, 1250 ) 144

165 Részletes bakteriológia Az említett nemzetségbe tartozó fajok (pl. a Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Rhizopus orizae, Absidia corymbifera) igen elterjedtek, gyakran megtalálhatók nedves, penészes alomban, takarmányokban, romlott élelmiszerekben (pl. penészes kenyérben, konzervekben). Szórványosan vetélést is előidézhetnek szarvasmarhában és egyéb állatfajokban Ascomycetes Fonalas és élesztőszerű gombák egyaránt tartoznak ide. Ivarosan aszkospórákkal, ivartalanul pedig egyéb spóraképzéssel szaporodnak. A fonalas gombák közül ide tartozik az anyarozs (Claviceps purpurea), de ismert penészgombák (Penicillium, Aspergillus, Fusarium stb.), dermatophytonok (Microsporum, Trichophyton) egyes fajainak perfekt (ivaros) alakjai ugyancsak tömlős gombák. A gyakoribb ivartalan szaporodási alak miatt azonban a Deuteromycetes csoportban tárgyaljuk őket. A tömlős gombák közé tartozó számos élesztőgombafaj ivartalan szaporodása sarjadzással vagy egyszerű harántosztódással történik, osztódásuk után együtt maradva, hosszabb-rövidebb láncot képeznek. Az élesztőgombák egy részét ipari célokra is felhasználjuk, közülük a közönséges élesztő, a (Saccharomyces cerevisiae) a legismertebb. Élesztőgombákat használunk a sütőiparban (tésztafélék kelesztése), bor-, sör-, alkoholgyártásban stb. Az élesztőgombák fakultatív anaerobok, anaerob viszonyok között a szénhidrátokból szén-dioxidot és etil-alkoholt képeznek. Nagy mennyiségben szintetizálnak különféle B-vitaminokat, tenyészeteik ezért értékes vitaminforrások. Élelmiszerekbe (takarmányba) kerülve azok megromlását (erjedését) idézhetik elő, megfelelő technológiával azonban felhasználhatók a takarmányok tápanyagainak a feltárására is Basidiomycetes Ivarosan a módosult tartósejteken (bazídiumokon) képződő, szabadon álló bazidiospórákkal szaporodnak. Ide tartoznak, számos egyéb faj mellett a növényparazita üszöggombák (pl. Ustilago zeae), a gabonafélék rozsdagombái (pl. Puccinia graminis), valamint az ehető és mérgező kalaposgombák többsége. A Cryptococcus neoformans nevű imperfekt élesztőgomba ivaros formája ugyancsak bazídiumos gomba (Filobasidiella neoformans) Deuteromycetes Ebbe az osztályba azokat a gombákat soroljuk, amelyeknek ivaros szaporodási formája nincs, vagy amelyeknél ezt a szaporodási formát a gombafaj leírása idején nem ismerték. Nevezik ezért az ide tartozó fajokat befejezetlen vagy nem teljesen ismert szaporodású gombáknak (Fungi imperfecti) is. Számos fajukról azonban utólag kiderült, hogy tömlős, esetleg bazídiumos gombák ivartalan (imperfekt) alakjai. 145

166 Részletes bakteriológia Ivartalanul konídiumokkal szaporodnak, amelyeknek keletkezési módja, alakja és színe igen változatos. Az ivartalanul szaporodó (imperfekt) és az ivarosan szaporodó (perfekt) formák alakilag olyannyira eltérnek egymástól, hogy a kétféle formát önálló fajoknak tekintették és külön névvel illették. A Fungi imperfecti osztályba számos, kórtani szempontból fontos gombafaj tartozik, közülük az állatorvosi szempontból fontosabbakat az alábbiakban ismertetjük Imperfekt fonalas gombák Aspergillus A konídiumokat képző hifák feji, duzzadt részén vannak a konídiumok (53. ábra). Az aspergillusoknak számos faja ismert, közülük több kórtanilag is fontos. Az A. fumigatus (ritkábban más aspergillusok) nedves alomban elszaporodva csibékben, kacsákban, pulykákban tüdőpenészesedést okoz. A szennyezett alomról gyakran bejut a víziszárnyasok (főleg kacsa, liba) tojásaiba, s a keltetés során elszaporodva a tojások gombás rothadását idézi elő. Szarvasmarhákban alkalmanként a méhlepényben elszaporodva vetélést okoz. Az A. flavus meleg, nedves viszonyok között tárolt takarmányokban elszaporodva toxint (aflatoxint) termel, naposkacsák és pulykapipék a legérzékenyebbek iránta. A toxin több komponensből áll, karcinogén hatású, elsősorban a májsejteket károsítja. Rosszul tárolt, penészes takarmányokból gyakran más toxintermelő Aspergillus fajok is izolálhatók, pl. az A. ochraceus, A. niger, A. candidus. Az A. ochraceus és egyes Penicillium fajok által termelt ochratoxin főleg a vese kanyarulatos csatornácskáinak hámját károsítja (nephropathia). 53. ábra - Aspergillus fumigatus tenyészet Sabouraud-agaron Penicillium A hifákon kifejlődő konídiumtartók ecsetszerűen elágazódnak (ecsetpenész), rajtuk képződnek a lánc alakban egymással összefüggésben maradó konidiospórák (54. ábra). A P. notatum, a P. chrysogenum és néhány más faj termeli a penicillint. Egyes fajok pl. a P. viridicatum, P. cyclopium, P. rubrum és számos más faj gyakran megtalálható penészes takarmányokban, ahol különféle toxinokat (citrinint, patulint, rubratoxint, ochratoxint stb.) termelhetnek. A toxinok főleg sertésben és baromfifélékben étvágytalanságot, vesekárosodást, vérzéses bélgyulladást stb. idéznek elő. 146

167 Részletes bakteriológia 54. ábra - Penicillum sp. spóratartó képletei (fukszinfestés, 1250 ) Fusarium Növényparaziták, főleg a gabonanövényeket betegítik meg. Megnyúlt, kifli alakú makrokonídiumokkal, mikrokonídiumokkal szaporodnak. Egyes fajok takarmánynövényeken és tenyészeteikben is piros színű pigmenteket termelnek. A F. graminearum (perfekt alakja Gibberella zeae), a F. culmorum, a F. sporotrichioides, a F. moniliforme és számos más faj nagy nedvességtartalmú kukoricán, búzán vagy egyéb takarmányban elszaporodva toxinokat (F 2-t, T 2-t, fumonizint stb.) termel. Az F 2 toxin (zearalenon) sertésekben álivarzást és termékenységi zavarokat okoz, de megbetegíthet más állatfajokat (szarvasmarhát, juhot, ludat stb.) is. A T 2 toxin és más trichothecének lóban, szarvasmarhában, sertésben és más állatfajokban étvágytalanságot, hányást, szövetelhalással és érfalkárosodással járó gyomor-, bélgyulladást okoznak. A toxinok súlyosan károsítják az immunrendszert is, ezáltal immunszuppresszív hatásúak Stachybotrys Az ide tartozó fajok közül a S. atra (S. alternans) mindenütt megtalálható, erőteljes cellulózbontó képességű penészgomba. Szalmán, szénán, alkalomadtán gabonamagvakon vagy egyéb cellulóztartalmú anyagokon elszaporodva fekete színű telepeket képez. Viszonylag nagy, citrom alakú, sima felületű, fekete színű konídiumai a konídiumtartók oldalán helyezkednek el. Egyes törzsei toxinokat termelnek (stachybotryotoxinok), amelyek lovakban, szopós malacokban és borjakban, ritkán egyéb állatfajokban a bőr és a nyálkahártyák elhalásával, vérzésekkel járó kórképeket okoznak. A toxinhatáshoz gyakran baktériumfertőzések társulnak (pl. lovak pyoseptikaemiája) Dermatophytonok Különféle állatfajokban (szarvasmarhában, lóban, húsevőkben, nyúlban, baromfiban stb.) és az emberben a bőr hámrétegét és a szőrt (tollat) betegítik meg, gombás bőrbetegséget (tarlósömört) okoznak. A bőr a gombákkal fertőzött helyeken megduzzad, hámlik, a szőrszálak letöredeznek. Háziállatokban a tarlósömör előidézésében a Trichophyton (perfekt formája Arthroderma) és a Microsporum (Nanizzia) fajoknak van szerepe. A kórokozók a beteg bőrfelületről vett kaparékban, szőrszálakban, a szöveti sejtek, illetve a keratin meleg kálium-hidroxidos feloldása után fonalak vagy azok feltöredezésével keletkezett artrokonídiumok formájában mutathatók ki. 147

168 Részletes bakteriológia Tenyésztésükre többnyire glükózt és peptont tartalmazó, antibiotikumokkal és ciklo-heximiddel kiegészített Sabouraud-féle táptalajt használunk. A tenyészetek 1 3 hét alatt fejlődnek ki, a gombatelepek kevés kivételtől eltekintve fehér vagy piszkosfehér színűek, porszerű, szőrös vagy bolyhos felületűek. A Trichophyton fajok közül a T. equinum a ló, a T. mentagrophytes a ló, a kutya, a macska, a nyúl és az ember, a T. verrucosum pedig a szarvasmarha és ritkán az ember tarlósömörének az okozója. A Microsporum fajok közül a M. gypseum elsősorban a lovat, ritkán más háziállatokat és az embert, a M. canis pedig a kutyát, a macskát és az embert betegíti meg. A M. (Trichophyton) gallinae tyúkban idézi elő a favusnak (kosznak) nevezett bőrgombásodást Imperfect élesztőgombák A Fungi imperfecti csoportba sorolt élesztőszerű gombák között több olyan faj van, amelyek az emberben és az állatokban egyaránt helyi vagy szisztémás mycosist idéznek elő. Az ide tartozó fajok identifikálására a morfológiai sajátságokon túl figyelembe veszik a biokémiai sajátságokat (különféle szénhidrátok fermentálását, szénhidrátok és nitrátok beépítését stb.), továbbá az utóbbi években az általuk okozott szisztémás mycosisok diagnosztizálására egyes szerológiai (komplementkötési, agglutinációs, immundiffúziós) próbákat, valamint az immunfluoreszcenciát is. Az ide tartozó fajok közül állatorvosi szempontból a következők fontosak. A Candidafajok mindegyike képez pszeudohifát a sarjadzás mellett, de egyeseknél valódi fonal is van. A leggyakoribb kórokozó a C. albicans (55. ábra), de előfordul néhány más faj, így a C. tropicalis, a C. krusei, a C. guillermondii stb. is. A C. albicans kukoricaliszt agarba oltva jellegzetes klamidospórákat képez. A C. albicans, ritkán más fajok is emberben, szopós malacban, borjúban, madárban stb. idéz elő a nyálkahártyákon (főleg a szájban), a légutakban, a húgy- és ivarszervekben gombásodást. Alkalmanként izolálhatók szarvasmarha és egyéb állatfajok vetéléseiből, bikák ondójából stb. 55. ábra - Candida albicans Sabouraud-agarról (fukszinfestés, 1250 ) A Cryptococcus fajok közül a C. neoformans szarvasmarhában, kecskében tőgygyulladást okozhat, de előidézhet emberen, kutyában, macskában és egyéb állatfajokban szisztémás mycosist is. A Malassezia pachydermatis zoopathogen élesztőgomba, amely különböző állatfajok korpázó pikkelyező bőrgyulladásaiból, leggyakrabban azonban a kutya és a macska külső hallójárat-gyulladásaiból izolálható. 148

169 Részletes bakteriológia Dimorf gombák A dimorf gombák közül a Histoplasma farciminosum az egypatások járványos nyirokérgyulladásának az okozója. A közeli rokon H. capsulatum pedig emberben, azonkívül kutyában, macskában idéz elő szisztémás mycosist. A Sporothrix schenkii által előidézett sporotrichosis lovakban, kutyákban jelentkezik leggyakrabban bőr alatti granulomatosis formájában. A Coccidioides immitis emberben, szarvasmarhában, juhban és kutyában okoz főleg a tüdő, ritkábban egyéb szervek granulomatosisával járó mycosist. A Blastomyces dermatitidis főként az emberen és a kutyában idéz elő mycosist. 149

170 3. fejezet - Virológia 1. Általános virológia 1.1. A vírus fogalma A vírusok a mikroorganizmusok sajátos csoportját alkotják. Felépítésük, szaporodásmódjuk alapvetően eltér a többi élőlényétől. Általában kisebbek, mint a többi mikroorganizmusok, méretük vírustípustól függően nanométer (nm) között van. Mivel nagyságuk a fénymikroszkóp feloldóképességének határa alatt van, csak elektronmikroszkóppal láthatók. Nevüket is egy tudományos tévedésnek köszönhetik: mivel kicsiny méretükből adódóan áthatolnak a baktérium-visszatartó szűrőkön, kezdetben toxinnak vélték őket (virus: méreg lat.); korpuszkuláris természetük csak később igazolódott. Manapság a szűrhetőség már nem tekinthető a vírusok jellemző tulajdonságának, egyrészt mivel kiderült, hogy vannak baktériumok is, amelyek a baktériumszűrőkön átjutnak (pl. a mycoplasmák), másrészt mivel napjainkban már olyan kis pórusméretű szűrők is előállíthatók, amelyeken a vírusok is fennakadnak. A vírusok jellemzése a fertőzőképes víruspartikula, a virion tulajdonságai alapján történik. A vírus (virion) a magasabbrendű, sejtes élőlényektől az alábbi tulajdonságokban tér el: csak egyféle nukleinsavat (RNS-t vagy DNS-t) tartalmaz. Ezek víruscsaládtól függően szimpla szálú vagy dupla szálú formában egyaránt előfordulhatnak. A genetikai információ hordozója tehát a vírusok esetében egyés kétszálú DNS, illetve egy- és kétszálú RNS lehet, szemben a magasabb rendű élőlényekkel, amelyekben az információ mindig kétszálú DNS formájában tárolódik. Megsokszorozódással szaporodik, növekedni és osztódni nem képes. A vírusoknak ugyanis nincs saját energiaszolgáltató és fehérjeszintetizáló enzimrendszerük, sőt többnyire a nukleinsav replikálódásához szükséges enzimkészletük is hiányos. Ezért a vírusok obligát sejtparaziták: élő sejtekbe jutva a fertőzött sejt enzimrendszerét használják saját szaporodásukhoz, gyakran a sejt saját anyagcseréjének a rovására. A fertőzött sejtek által termelt extracelluláris virion sem növekedésre, sem osztódásra nem képes. A fentiekből következik, hogy a vírusoknak két megjelenési formája van: az egyik, amikor génparazitaként a gazdasejt biokémiai folyamataiba beavatkoznak (ebben az állapotban vegetatív vírusnak nevezzük őket), a másik pedig az e folyamatok révén létrejött, a gazdasejttől független fertőző részecske a virion. Egyetlen virion utódvirion előállítását is indukálhatja egy sejten belül, ezt a szaporodási módot ezért megsokszorozódásnak (vírusmultiplikációnak) is nevezzük. A vírusok igen széles körben elterjedtek: izoláltak már vírusokat baktériumokból, gombákból, protozoonokból, növényekből és az állatvilág minden csoportjából a puhatestűektől az ízeltlábúakon át a gerincesekig. Állatorvosi szempontból a halakat, madarakat és emlősöket megbetegítő vírusok a legfontosabbak (ilyenek pl. a pontyok tavaszi hasvízkórjának, a baromfipestisnek, a ragadós száj- és körömfájásnak, a veszettségnek a vírusa stb.). Ugyanakkor azt is tudnunk kell, hogy a vírusok többsége nem okoz betegséget (ezek az ún. orphan vírusok) csakúgy, mint ahogy a baktériumok túlnyomó többsége is apathogen. Jelen tudásunk szerint azonban hasznos vírusok nincsenek (szemben pl. az élelmiszeriparban használt baktériumokkal vagy az emésztésben fontos szerepet betöltő bélbaktériumokkal) A vírusok eredete A vírusok eredete jelenleg még tisztázatlan, de valószínű, hogy a vírusok többféle módon alakultak ki. A bonyolultabb felépítésű vírusok (pl. poxvirusok) a sejt degradációja révén alakulhattak ki: a parazita sejt annyira leegyszerűsödött, hogy elveszítette önállóságát. Élettelen környezetben nem képes szaporodni: információt tárol, de annak átadására csak élő sejtbe jutva képes. Az egyszerűbb vírusok a sejt valamelyik, genetikai utasítást hordozó részéből alakulhattak ki, így pl. az RNS tartalmú vírusok egy része mrns molekulákból, az egyszerűbb DNS-vírusok kromoszómatöredékekből stb. Ez az elmélet nem magyarázza a szimpla szálú DNS-t, a dupla szálú RNS-t és a negatív irányítottságú szimpla szálú RNS-t tartalmazó vírusok eredetét, mivel ilyen nukleinsav- formációk a sejtben nem fordulnak elő. (Ez a vírus szempontjából nagy előny, hiszen így a fertőzött sejt megfelelő enzimek híján nem tudja a vírust 150

171 Virológia lebontani.) Feltételezik, hogy ezek más vírusok nukleinsav-replikációs folyamatának köztes termékei, vagy ma már nem létező élőlények sejtjeiből származnak. A gazdasejtek és az azokat fertőző vírusok nukleinsavának szerkezete (riboszómakötő helyek száma, egyes génszakaszok bázissorrendje stb.) között felismerhető hasonlóság is támogatja a fenti elképzelést, vagyis azt, hogy a vírusok különböző módon, de a szaporodásukat segítő sejtekből származnak A vírusok szaporítása A vírusok okozta fertőző betegségek kórjelzéséhez (vírusdiagnosztika), a vírusok tulajdonságainak vizsgálatához (vírusanalitika) és az oltóanyag-termeléshez stb. szükség van a vírusok mesterséges elszaporítására. Mivel e kórokozók obligát sejtparaziták, a vírusszaporítás csak élő sejtekben történhet. Erre a célra mesterségesen fertőzött kísérleti állatok, embrionált tojások és in vitro sejttenyészetek használhatók Vírusok szaporítása kísérleti állatokban Napjainkban elsősorban állatvédelmi, de gazdaságossági és szakmai szempontok miatt is ez a módszer szinte teljesen kiszorult a vírusok szaporításának eljárásai közül. Kísérleti, diagnosztikai és oltóanyag-ellenőrzési célból jelenleg is rendszeresen végeznek kísérleti állatoltásokat, de ezekben az esetekben a vírus elszaporítása nem cél, hanem csak eszköz a szükséges eredmények elérése érdekében. Jelenleg Magyarországon vírustermelés céljából csak két, más módszerrel még nem szaporítható vírust, a nyulak haemorrhagiás betegségének vírusát és a sertéspestis elleni immunizálásra használt vakcinavírus-törzset szaporítják ily módon (mindkettőt nyulakban) Vírusok szaporítása embrionált tyúktojásban Embrionált tyúktojásokat (56. ábra) főleg korábban, a szövettenyészetek széleskörű elterjedése előtt alkalmaztak vírusszaporítás céljából, de ez a technika még ma is rendszeresen használatos a virológiai munkálatok során bizonyos vírusok izolálása és vakcinatermelés céljából egyaránt. 56. ábra - Vírusok szaporítása embrionált tyúktojásban. Az embrionált tyúktojás szerkezetének és a choroallatois hártyára történő oltásnak a sematikus rajza A szikhólyag fala, a chorioallantois- és az amnionhártya, valamint maga a csirkeembrió olyan szövetekből épül fel, amelyek egyes vírusok elszaporítására alkalmasak. Tojásban való vírusszaporításhoz lehetőleg SPF (Specific Pathogen Free-specifikus kórokozóktól mentes) állományból származó, fehér héjú, jól átvilágítható tojásokat célszerű alkalmazni. A tojásoltás munkafázisai a következők: lámpázással meggyőződünk arról, hogy az embrió él-e, megfelelő fejlettségi stádiumban van-e, és megközelítő helyeződéséről is tájékozódunk; ez segítséget nyújt az oltás irányának és mélységének helyes megválasztásához, mivel a tojáshéj mikroorganizmusokkal szennyezett lehet, a tojás héját az oltás területén fertőtleníteni kell (pl. jódtinktúrával). 151

172 Virológia A tojáshéj átfúrása oltólándzsával vagy vastag injekciós tűvel történik. Amennyiben nagyobb héjdarab eltávolítása szükséges, akkor fogászati fúróval vágjuk körül a megfelelő nagyságú területet. A tojás oltása többféleképpen történhet, mivel a különféle vírusok az embrionált tyúktojás különböző részeiben találják meg a szaporodásukhoz legjobban megfelelő környezetet. A különböző oltásokhoz eltérő ideig keltetett tojásokat használunk: Chorioallantois-hártyára történő oltáshoz napos tojás alkalmas. Ez a módszer alkalmazható pl. poxvirusok vagy herpesvirusok szaporítására. A vírus elszaporodását a membránon jelentkező diffúz homály vagy göb (pock) jelzi. A göbök morfológiája (a pock nagysága, esetleges gyulladásos kísérőtünetek, vérzéses vagy elhalásos jellege stb.) egyes vírusok esetében jellemző eltéréseket mutat (pl. a tehénhimlő vírusa vérzéses, a tyúkhimlő vírusa kezdetben proliferatív, majd necrotisaló pockokat képez). Allantoisüregbe és amnionüregbe történő oltáshoz 9 12 napig keltetett tojásokat használunk. Ily módon szaporíthatók pl. az influenzavirusok, a baromfipestis, és a fertőző bronchitis vírusa. A vírus először az üreget határoló membrán sejtjeiben szaporodik, később bejut az embrióba is. Az allantois- vagy amnionfolyadékba kiszabaduló, hemagglutináló tulajdonságú vírusok jelenléte hemagglutinációs próbával bizonyítható. Szikzsákba történő oltásra az 5 7 napig keltetett tojások alkalmasak, így szaporítható pl. a csirkék fertőző agyés gerincvelő-gyulladásának vírusa. (Ezzel a módszerrel chlamydiák, rickettsiák is tenyészthetők.) Viszonylag ritkán alkalmazzák (pl. a bluetongue vírusának szaporítására) az intravénás tojásoltást, ilyenkor a tojáshéj alatt futó nagy erek valamelyikébe juttatjuk a vizsgálati anyagot. A tojáshéjon ejtett nyílást, a fertőződés elkerülése érdekében, általában olvasztott paraffinnal lezárjuk. Ezután az oltott tojásokat inkubáljuk, vagyis visszahelyezzük a keltetőgépbe, és tovább keltetjük. A továbbiakban az embriókat naponta lámpázással ellenőrizzük. Ha jelentkeznek az egyes vírusokra jellemző elváltozások vagy az embrió elpusztul, akkor a tojásokat felbontjuk és a kialakult tünetek (pl. törpenövés, torzfejlődés), vagy a tojásfolyadékok hemagglutinációja alapján győződhetünk meg a vírusszaporítás eredményességéről. (Ha az oltást követő első napon belül pusztulnak el az embriók, az mechanikai sérülés vagy szennyeződés következményének tekinthető.) Vírusok szaporítása sejt- és szövettenyészetekben A virológia fejlődésében fordulópontot jelentett az in vitro sejttenyésztési technika kidolgozása. Szövettenyészeteket vagy sejtkultúrákat akkor kapunk, ha a szervezetből frissen kivett szervek apró darabkáit vagy azok különálló sejtjeit in vitro körülmények között életben tartjuk és szaporítjuk. A szövettenyésztési technika rutinszerű alkalmazása akkor vált lehetővé, amikor az antibiotikumok és a gombaellenes szerek már rendelkezésre álltak a baktériumok, valamint a gombák elszaporodásának megakadályozására. A kezdeti kultúrák éles ollóval vagy szikével apróra vágott túlélő szervdarabok voltak (pl. Carrel-féle explantált tenyészet). Ezeket embriókivonat és tyúkplazma keverékével az üvegedény felületére ragasztották, tápfolyadékkal fedték és így tartották életben. Túlélő szervdarabkákat vakcinatermelésre is használtak. Így pl. a ragadós száj- és körömfájás elleni vakcina készítésére használják az ún. Frenkel-módszert. Ehhez nagyméretű keverőtartályokban szarvasmarha-nyelvhám darabkákat tartanak életben tápfolyadék segítségével, és ezekben szaporítják a vírust. A virológiai technikában jelenleg legkiterjedtebben az egyrétegű sejttenyészet használatos. A módszer lényege, hogy sterilen kivett szervek apróra vágott darabjait híg tripszinoldatban emésztjük (57. ábra). Ha az enzimkezelés kíméletes, akkor a sejtek elválnak egymástól anélkül, hogy károsodnának. Így az emésztés során sejtszuszpenziót kapunk, amelyet a tripszinhatás felfüggesztése céljából jéggel hűtött edényben gyűjtünk, majd kíméletesen centrifugálunk. A tripszinoldatot leöntjük, és a leülepedett sejteket előzetes sejtszámolás után tápfolyadékban reszuszpendáljuk, amely a szaporodásukhoz szükséges anyagokat tartalmazza. A tenyésztésre szánt sejtszuszpenzió sűrűségét általában sejt/ml értékre állítjuk be. A tápfolyadék különféle sók (szükség esetén aminosavakkal gazdagított) pufferolt oldatából áll (pl. Hank s MEM, RPMI 1640), amely fehérjeforrásként 5 15% borjúsavót is tartalmaz. A baktériumok és gombák szaporodásának megakadályozása érdekében a tápfolyadékot antibiotikumokkal és antimycotikumokkal egészítjük ki. A sejtszuszpenziót különféle steril edényekbe (Roux-palackba, kémcsőbe, Petri-csészébe stb.) adagoljuk, és a tenyészeteket 37 C-os termosztátban inkubáljuk. Néhány órán belül a sejtek az üvegre tapadnak és megkezdődik szaporodásuk. A szomszédos sejtek hártyájának érintkezése kiváltja az ún. kontakt gátlást, és a sejtszaporodás leáll, ezért az ép, 152

173 Virológia egészséges sejtek a felületen egyetlen rétegben szaporodnak addig, míg egymással összeérnek. Így egyrétegű sejttenyészetet kapunk, amely egyenletesen bevonja az üvegedény falát, és így a sejtek állapota kis nagyítású mikroszkóppal ellenőrizhető. Ekkor a tápfolyadékot ún. fenntartó folyadékra (pl. Earle s MEM) cseréljük, amely tápanyagokban szegényebb, csupán a sejtek életben tartását szolgálja. 57. ábra - Egyrétegű sejttenyészet készítése Az állati szervdarabkákból ily módon közvetlenül előállított tenyészeteket nevezzük elsődleges vagy primer kultúráknak. Primer tenyészetek szinte minden faj számos szervéből készíthetők, de legalkalmasabbak a hámsejtekben gazdag szervek (vese, here, pajzsmirigy stb.). Minden vírus esetében ismernünk kell annak sejtspektrumát, vagyis azokat a sejttenyészet-féleségeket, amelyekben az adott vírus szaporodni képes. Ekkor nem csupán az állat faját, hanem a szervet is figyelembe kell venni, amelyből a tenyészetet készítjük. Általánosságban azok a szervek a legalkalmasabbak egy adott vírus szaporítására, amelyekben az in vivo körülmények között is szaporodik. Sikerrel használhatunk azonban más szerveket is, pl. sok faj vesetenyészete egész sor vírus szaporítására alkalmas. Vírusizoláláskor (lásd később) mindenképpen ajánlatos különböző tenyészetek párhuzamos oltása, mivel egy adott faj különböző szerveiből származó sejteknek a fogékonysága eltérő lehet (pl. az I. és II. alcsoportba tartozó bovin adenovirusok szaporíthatósága borjúvese-, illetve borjúhere-tenyészetekben). Ugyancsak a vírusizolálás esélyeit növeli az ún. kokultúrák alkalmazása is. Ilyenkor a fertőzésre gyanús állatból származó szerv darabkáit egészséges állatból származó szervdarabkákkal együtt emésztjük tripszinoldattal, így olyan sejttenyészetet kapunk, amely vírussal fertőzött és egészséges sejteket egyaránt tartalmaz. Más esetekben a fertőzött állatból származó szervdarabokat vagy perifériás fehérvérsejtek szuszpenzióját adják a sejttenyészethez. Az eljárás lényege az, hogy a fertőzött sejtekben termelődő víruspartikulák elszaporodására a közvetlen környezetben fogékony sejtek állnak rendelkezésre. A primer kultúrákat vagy közvetlenül felhasználjuk, tehát vírussal oltjuk, vagy másodlagos kultúrákat (szubkultúrákat) készíthetünk belőlük. Az utóbbi esetben a primer kultúra sejtjeit az üveg faláról tripszinnel leemésztjük, centrifugáljuk, majd újabb tápfolyadékban reszuszpendálva újabb üvegedényekbe adagoljuk, melyek falán a sejtek pár nap alatt ismét egyrétegű tenyészetet alkotnak. A másodlagos tenyészetnek számos előnye van, pl. az, hogy ily módon egy szervből kiindulva a sejtek ismételt leemésztésével és szaporításával (további szubkultúrázásokkal ) heteken át friss sejttenyészetek birtokába jutunk. Ezáltal egyrészt a tenyészetek mennyiségét növelhetjük, másrészt a szubkultúrák általában minőségileg is jobbak, simább, egyöntetűbb réteget alkotnak. A primer (és szekunder) sejttenyészetek előnye, hogy általában fogékonyabbak a vírusfertőzésre, mint a többszörösen passzált sejtek, hátrányuk viszont az lehet, hogy eleve fertőzve lehetnek valamilyen vírussal vagy mycoplasmával, amellyel a szervet szolgáltató állat fertőzve volt. Ezért igényesebb munkák céljára csíramentes (gnotobiotikus) vagy legalább SPF állatok szerveit használják szövettenyészetek készítésére. A sejttenyészet fentiekben ismertetett, ismételt átoltásával (passzálásával), szaporításával permanens tenyészetek 153

174 Virológia vagy sejtvonalak nyerhetők. A feladat azonban általában nem ilyen egyszerű. A tenyészetek zöme ugyanis néhány átoltás után elveszti eredeti jellegét, pl. a fibroblast jellegű sejtek előbb-utóbb túlnövik a hám jellegűeket. A vírusok zömének ez nem kedvez, a tenyészet egyre kevésbé alkalmas a vírusok szaporítására. Ezért permanens sejtvonalakat általában sejtklónozással állítanak elő. Ehhez egyetlen sejt utódait igyekeznek izolálni. Sikeres izolálás esetén így genetikailag homogén sejtpopulációt nyernek (58. ábra). E sejtek utódai nem csupán egyöntetűek, hanem szaporodóképességük is megfelelő. Ma már a virológiában nagyon sok permanens sejtvonalat használunk. Közülük számos állati eredetű. Ilyenek pl. a PK l5 (sertésvese-) és az MDBK (borjúvese-) sejtvonalak. 58. ábra - Sejtklónozás A sejtvonalak használata lényegesen kényelmesebb, mint a primer és szekunder kultúráké, mert nem kell állandóan friss szervekről gondoskodni és azokat feldolgozni. Ezért a vakcinakészítéshez szükséges vírusszuszpenzió egy részét is sejtvonalakon készítik. Számos előnyük mellett a sejtvonalaknak több hátrányos tulajdonságuk is lehet, pl. kevésbé fogékonyak bizonyos vírusfertőzésekre és így kevésbé alkalmasak a vírusok izolálására, másrészt eredetileg fertőzöttek lehetnek valamilyen, esetleg onkogén vírussal. (Permanens tenyészetek ugyanis viszonylag egyszerűen állíthatók elő daganatos szövetekből, ilyen többek között a méhszájdaganatból előállított HeLa sejtvonal vagy a hörcsögvesetumorból származó BHK 21 sejtvonal.) Mindez egyrészt közvetlenül veszélyes lehet (élővírusos vakcinák készítéskor), másrészt pedig tovább ronthatja a sejtvonal érzékenységét a szaporításra szánt vírussal szemben. A sejtvonalak használatát megkönnyíti, hogy azok mélyhűtve tárolhatók, vagyis a sejtek folyékony nitrogénben akár évekig is megőrzik életképességüket. A nagy szaporodóképességű sejtvonalak lehetővé teszik, hogy ma tömegtermelés céljára az ún. szuszpenziós tenyészeteket használjuk. Ennek lényege, hogy a sejteket nem hagyjuk letapadni az edény falára, hanem állandó keveréssel szuszpenzióban tartjuk azokat. Így lényegesen több sejtet tudunk adott méretű tankokban fenntartani, anyag-, energia- és helytakarékossággal erőteljesen növelhetjük a vírustermelés gazdaságosságát. A módszert üzemi méretekben többek között a ragadós száj- és körömfájás vakcinájának készítésére használják. Előfordulhat, hogy olyan sejteket kell nagy tömegben elszaporítanunk, amelyek csak szilárd felületre tapadva képesek osztódni és életben maradni. Ilyenkor alkalmazzuk az ún. mikrokarrier tenyészetet, amelynek lényege 154

175 Virológia az, hogy a sejteket apró műanyag golyócskák (pl. Cytodex) felületére hagyjuk tapadni, majd ezeket a golyócskákat tartjuk szuszpenzióban, állandó keveréssel A vírusok tisztítása és koncentrálása A vírusok szerkezetének és molekuláris összetevőinek vizsgálata legtöbbször a különböző vírusszaporítási eljárásokkal nagy mennyiségben előállított, majd megfelelő módszerekkel tisztított és koncentrált vírusszuszpenzió felhasználásával történik. A vírusanalitikai vizsgálatoknak mindig mikrobiológiailag tiszta, más vírusokkal vagy baktériumokkal nem szennyezett vírusszuszpenzióból kell kiindulniuk, szemben a víruskimutatás céljára történő vizsgálatokkal (lásd később). Az alkalmazható tisztítási és koncentrálási eljárásokat alapvetően a kérdéses vírus kémiai és fizikai ellenálló képessége határozza meg. Az első lépés rendszerint a sejtekben lévő virionok kiszabadítása a szuszpenzió ismételt lefagyasztása majd felolvasztása útján, mechanikai homogenizálással, ultrahangos kezeléssel vagy kémiai anyagok (pl. detergensek) segítségével. A szuszpenziót ezután alacsony fordulatszámon ( g) centrifugáljuk. Ilyen nehézségi erő mellett a sejttörmelék leülepszik, a virionok pedig a felülúszóban maradnak, és így elkülöníthetők az üledéktől. A vírustartalmú folyadék tovább is tisztítható szűrők segítségével, amelyekkel a visszamaradt és a kérdéses vírusnál nagyobb részecskék kiszűrhetők. Az előbbiek szerint előkészített vírusszuszpenzió általában túl híg, ezért a továbbiakban a víruskoncentrálás valamelyik módszerét kell alkalmaznunk. A legegyszerűbb, de a legkevésbé kíméletes eljárás az, ha a virionokat a szuszpenzióból alkohollal vagy ammónium-szulfáttal kicsapatjuk, majd kisebb mennyiségű pufferoldatban reszuszpendáljuk. Ugyancsak célravezető lehet, ha a virionokat valamely felülethez adszorbeáltatjuk, majd kisebb térfogatban eluáljuk. Erre legalkalmasabb az affinitás kromatográfiás eljárás: az adott virionra specifikus ellenanyagokkal konjugált műanyag gél oszlopokon átbocsátjuk a vírusszuszpenziót, amelyből a szilárd fázishoz kötött ellenanyagok megkötik a virionokat. Megfelelő pufferoldat alkalmazásával az antigén-ellenanyag kötődés bontható, ily módon a virionok az oszlopról leoldhatók (59. ábra). Az alumínium-hidroxidgél vagy a kalciumfoszfát szemcsék spontán módon is megkötik a virionokat (ez a kötődés azonban nem specifikus, mint az affinitás kromatográfiás eljárásnál), majd megfelelő ph-érték mellett azok kisebb térfogatú oldatban eluálhatók. A vörösvérsejtekhez spontán kötődő (hemagglutináló) vírusokat e tulajdonságukat felhasználva is koncentrálhatjuk. Az elúció ez esetben enzim hatására jön létre. 59. ábra - Vírustisztítás és -koncentrálás affinitás kromatográfiás eljárással 155

176 Virológia Ultraszűrők alkalmazása esetén a vírustartalmú folyadék olyan csőrendszerben kering, melynek falán meghatározott átmérőjű (a koncentrálni kívánt vírusnál kisebb) pórusok vannak. A csövecskékben nagy nyomás alatt cirkuláló vírusfolyadékból a kisebb molekulák (víz, ionok, kisméretű szerves molekulák) a csövek falán át elhagyják a rendszert, a vírus pedig kis térfogatra besűrűsödve a rendszer belsejében marad. Elvében hasonló, de a túlnyomás helyett az ozmotikus nyomáskülönbséget használja fel a dializálás, amikor is a koncentrálni kívánt vírusszuszpenziót féligáteresztő falú (semipermeabilis) zsákba tesszük, amelyet valamilyen hidrofil anyag (pl. polietilénglikol) hiperozmotikus oldatába helyezzük. A víz és a kis molekulájú anyagok a zsák pórusain át távoznak, a víruspartikulák és a nagy molekulájú anyagok a zsákban koncentrálódnak. A vírustisztítás és -koncentrálás leggyakrabban alkalmazott, legcélravezetőbb és legkíméletesebb módszere az ultracentrifugálás. E művelet során nagy fordulatszámú, ezer g előállítására alkalmas ultracentrifugákat használunk. A legegyszerűbb ultracentrifugálási művelet a pelletizálás, amikor a vírusszuszpenzióból a részecskéket a centrifugacső aljára ülepítjük. Az eljárás során a szuszpenzióban levő korpuszkuláris szennyező elemek (mitochondriumok, lysosomák, chromosomák stb.) is leülepszenek, ezért ez az eljárás az igényesebb vizsgálatokhoz szükséges tiszta víruspopuláció előállítására nem alkalmas. Az ún. gradiens ultracentrifugálás esetén a centrifugacsőbe, a vírus úszósűrűsége alapján meghatározott sűrűségű szacharóz- vagy sóoldatot (Cs 2SO 4, CsCl) mérünk, és erre rétegezzük a vírusszuszpenziót. A centrifugális erő hatására a cukor- vagy sóoldatban koncentrációgradiens alakul ki, vagyis a csőben felül hígabb, lefelé egyre sűrűbb oldatot kapunk. A virionok az úszósűrűségüknek megfelelő rétegben helyezkednek el. Ez az 156

177 Virológia egyensúlyi állapot csak hosszabb ideig tartó centrifugálás eredményeképpen alakul ki, de ez az idő preformált gradiens alkalmazása esetén rövidíthető. Ilyenkor a centrifugálás előtt a centrifugacsőbe változó töménységű (alulra töményebb, majd egyre hígabb) cukor- vagy sóoldatot rétegezünk, és így meggyorsítjuk a koncentrációgradiens kialakulását. A vírusok a gradiens ultracentrifugálás végén opaleszkáló zónák formájában különülnek el a centrifugacsőben. Ha a vírusszuszpenzió centrifugálása során több csík jelenik meg, akkor ez vagy azt jelenti, hogy többféle vírust tartalmazott a szuszpenzió (hiszen minden vírus a rá jellemző sűrűségű rétegben alkot csíkot), vagy ugyanannak a vírusnak komplett és inkomplett partikulái (lásd később) alkotnak több csíkot. Ez utóbbi esetben az inkomplett virionok alkotják a felső, kisebb úszósűrűségű csíkot, mert belőlük a virion legnehezebb alkotórésze, a nukleinsav részben vagy egészen hiányzik (60. ábra). 60. ábra - Vírustisztítás és -koncentrálás gradiens ultracentrifugálással (inkomplett és komplett virionok) A gradiens ultracentrifugálás végén a centrifugacső alját megfúrjuk, és a lassan kicsöpögő szuszpenziót rétegek szerint kémcsövekbe gyűjtjük (frakcionáljuk), vagy a csövek oldalát megfúrva leszívjuk a megfelelő réteget. Az opaleszkáló csíkokat tartalmazó frakciókat elkülönítve koncentrált, tiszta és egységes víruspopulációkat nyerünk. Ezeket a sótól vagy cukortól dializálással megtisztítjuk, majd analitikai módszerekkel vizsgáljuk A vírusok morfológiája Vírusmorfológiai vizsgáló módszerek A víruspartikula morfológiai sajátosságai csak az elektronmikroszkóp felfedezése után váltak vizsgálhatóvá, noha azt, hogy a vírusok részecske természetűek (nem pedig toxinmolekulák) és e részecskék megközelítő méretét már a különböző pórusméretű szűrőkkel végzett tanulmányok bebizonyították. Az azóta eltelt idő alatt az elektronmikroszkópos technikák fejlődésével számos olyan módszert dolgoztak ki, amelyek alkalmazhatók a virológiai vizsgálatok során is: részben a morfológiai tulajdonságok tanulmányozására, részben diagnosztikai célból. 157

178 Virológia A vírusmorfológiai vizsgálatok során leggyakrabban a negatívkontraszt- technikát alkalmazzák (61. ábra), melynek lényege, hogy a vírusszuszpenziót foszforvolfrámsav, uranil-acetát vagy más kontrasztanyag oldatával kezeljük, és a mintát elektronmikroszkóp mintafelfogó rácsára (grid) szárítjuk. Ezek az anyagok a fehérjékhez nem kötődnek, ezért száradás közben a részecskék kidomborodó felszíni képleteiről lefolynak, a mélyedéseket pedig kiöntik. Az üres (inkomplett) virionokba is behatolnak, és kitöltik annak belsejét. Az üregeket, mélyedéseket kitöltő kontrasztanyag, vastagságától függően, eltérő módon szórja, illetve nyeli el az elektronsugarakat, így a vírusok felületéről negatív kontraszt kép nyerhető. E módszerrel a vírusok felszíni struktúrája részletesen tanulmányozható, de ez a módszer használható a tisztított, koncentrált vírusszuszpenziók tisztaságának ellenőrzésére is, a további biokémiai, vírusanalitikai vizsgálatok előtt. 61. ábra - Negatívkontraszt-EM technika Az elektronmikroszkópos vizsgálatok egy másik, igen gyakran alkalmazott módja az ultravékony metszetek készítése. A sejteket fixáljuk, speciálisan beágyazzuk, majd ultravékony metszeteket készítünk, és ezeket elektronelnyelő festékekkel (volfrám- vagy urániumsókkal) kezeljük, majd elektronmikroszkóppal vizsgáljuk. E metszetekben a vírusok keresztmetszeti képét és a sejtben a vírusszaporodás során jelentkező változásokat tanulmányozhatjuk. A vírusárnyékolás módszere ma már ritkábban használatos, de korábban a vírusok (főleg az ún. ikozahedrális virionok) alakjának pontos meghatározása során fontos szerepet játszott (62.ábra). Az eljárás lényege, hogy az elektronmikroszkópos membrán felületén levő mintára oldalirányból, légüres térben, meghatározott szögben arany-, palládium- vagy platinapárát juttatunk elektromos tér segítségével. Ezt különböző szögekből megismételhetjük. Az elektronmikroszkópos készítményen ezután nemcsak a részecske felülnézeti képe, hanem az árnyék révén oldalnézeti vetülete is tanulmányozható, ezáltal segítve a részecske alakjának pontosabb megismerését. 62. ábra - Vírusárnyékolás 158

179 Virológia 159

180 Virológia Vírusmorfológia A virionok alakja és nagysága rendkívül változatos, de ennek ellenére felépítésükben közös vonások is megfigyelhetők. A virionpartikula belsejében található a nukleinsav mag (core), melyet az ún. pleomorf vírusok kivételével fehérjékből álló tok (kapszid) vesz körül (63. ábra). A kapszid homológ fehérje építőkövekből, morfológiai egységekből épül fel. Egyes vírusok esetében ezek szorosan kapcsolódnak a nukleinsavszálhoz, ebben az esetben nukleokapszidról beszélünk. Néhány víruscsalád esetében a kapszidot sejt eredetű, lipid természetű, de a vírusgenom által kódolt fehérjeelemeket is tartalmazó burok (peplon, envelop) veszi körül, melyen felületi képletek, nyúlványok (peplomerek) lehetnek. 63. ábra - A virionpartikula (adenovirus) szerkezete. A római számok az egyes struktúrpolipeptidek sorrendjére utalnak a poliakvilamid gélben végzett elektroforézist követően Egyes vírusok (pl. a dohánymozaik-vírus) fehérje egységei spontán épülnek össze; ehhez a vírusnak nem kell külön genetikai információt szállítania. A vírusok zömében azonban a virion-összeépülés igen komplikált, számos vírusgén által szabályozott folyamat. A bonyolult összetételű farkos bakteriofágoknál pl. legalább 30 gén irányítja az összeépülést. A nukleokapszid változatos formákat ölthet, az eltérő alakoknak megfelelően beszélünk a virion szimmetriaviszonyairól. Ennek alapján a következő alapformákat különíthetjük el: A helikális szimmetria szerint felépülő virionok (64.ábra) kapszidja olyan, mint egy belül üres cső, amelyet spirális vonalban (helikálisan) futó nukleinsavszál mentén rendeződő identikus, protein vagy glükoprotein természetű szerkezeti egységek alkotnak. Ha az egységek közötti kötések azonos erősségűek, akkor a kapszid merev, egyenes (pl. a dohánymozaik betegség virionjában), ha eltérő erősségűek, akkor a kapszid hajlított (orthomyxo-, paramyxo-, rhabdovirusok). E vírusok esetében a hajlékony nukleokapszid felcsavarodik vagy szabálytalan gombolyagot képez és a korábban említett lipid természetű burokkal körülvéve, megközelítőleg 160

181 Virológia gömbölyű képletet alkot. A klasszifikációs érték tehát a nukleokapszidszál átmérője, de a látszólagos vírusméret szemléltetése érdekében általában a burokba zárt víruspartikula átmérőjét szoktuk vírusméretként megadni. 64. ábra - Helikális szimmetriájú virion Az ikozahedrális (kubikális, köbös) szerkezetű vírusok ikozahedron (ikozaéder) alakúak. Ezt a téridomot húsz egyenlő oldalú háromszöglap határolja, szimmetriaviszonyait az 65.ábra szemlélteti. 65. ábra - Az ikezahedron képe élközéppontos, lapközéppontos és tengelyszimmetrikus vetületben A korábban említett szerkezeti egységek e vírusok kapszidjában az ikozaéder felületének megfelelően rendeződve alakítják ki a kapszidot, a nukleinsav mag (core) ennek belsejében található. A fehérje szerkezeti egységek vírusonként jellegzetes kapszomerekbe rendeződése, csoportosulása határozza meg a víruskapszid jellegzetes képét (66.ábra). A picornavirusok fehérjeegységei pl. 60 trimert képeznek, a parvovirusok esetében 12 pentamert és 20 hexamert alkotnak, a calicivirusok jellegzetes csésze alakú képletekből álló felszínét dimerekbe rendeződött fehérjeegységek alakítják ki. 66. ábra - Kapszomerek felépítése (trimerek, penta- és hexamerek, dimerek) Burok megfigyelhető bizonyos ikozahedrális szimmetriájú víruscsaládok esetében is (herpesvirusok, retrovirusok, afrikai sertéspestis vírusa stb.). A binális szimmetriájú partikulákban az előző két szimmetria alapelemei keverednek. A farkos bakteriofágok (T-fág) teste helikális, tehát cső alakú, és ezen egy hosszirányban kissé megnyúlt ikozahedrális fej ül (67. ábra). 161

182 Virológia 67. ábra - Binális szimmetriájú virion A komplex virionok egyik eddig ismertetett szimmetriával sem jellemezhetők, kapszomerek, illetve fehérje alegységek sem figyelhetők meg a szerkezet tanulmányozása során. A hagyományos értelemben vett fehérjekapszid szerepét itt egy bonyolult felépítésű, fehérjéből, glükoproteinekből és lipid természetű anyagokból álló komplex tok tölti be. Ez a forma jellemző a poxvirusokra (68.ábra). 68. ábra - Komplex szimmetriájú virion 162

183 Virológia A pleomorf vírusoknak szintén nincs hagyományos értelemben vett kapszidjuk, a genetikai információt hordozó nukleinsavat itt kapszid nem, csupán a korábban említett, egyes helikális és ikozahedrális vírusok esetében is megfigyelhető, lipid eredetű burok veszi körül. Ilyen pl. az ún. pleomorf fágok és az arenavirusok felépítése A vírusok kémiai összetétele és vizsgáló módszerei A virion esszenciális alkotórésze a nukleinsav és a fehérje. A burkos és a komplex szerkezetű vírusok ezenkívül lipideket és szénhidrátokat (glükoproteineket) is tartalmaznak Nukleinsavak A vírusok genetikai információja az élővilágban egyedülálló módon nemcsak DNS, hanem RNS formájában is tárolódhat, de minden vírus csak egyféle nukleinsavat tartalmaz. A vírusok genomja általában haploid, kivétel a retrovirusok csoportja, ennek tagjai diploid genommal rendelkeznek. A vírus-dns vagy -RNS víruscsaládtól függően lehet egyszálú vagy kétszálú, illetve alakja szerint lineáris vagy gyűrűszerűen záródó (cirkuláris). A vírusnukleinsavak molekulatömege a DNS-vírusok esetében 1 és 200 millió, az RNS-vírusok esetében 2 és 16 millió dalton szélső értékek között lehet. A nukleotidok száma meghatározza, hogy adott nukleinsav mennyi információt képes tárolni. Az egy meghatározott fehérje kódolására képes nukleinsavszakaszt a vírusok esetében is génnek nevezzük, és a gén itt is az egy-egy aminosav beépülését kódoló bázishármasokból (tripletekből) épül fel. A nukleotidsorrend szintén meghatározó a vírusok esetében. Egyes egyszálú RNS-vírusok nukleotidsorrendje olyan, hogy a fertőzött sejt riboszómája közvetlenül le tudja olvasni. Ha óvatos kezelésekkel megtisztítjuk az egyéb vírusalkotóktól, akkor ezeknek az mrns-hez hasonlóan 5 3 irányban leolvasható ún. pozitív szálú RNS-vírusoknak (pl. picornavirusok, coronavirusok) a nukleinsava fertőzőképes, vagyis sejtbe juttatva önmagában is megindítja a vírusszaporodás folyamatát. Ezzel szemben a 3 5 irányban értelmezhető, ún. negatív szálú RNS-vírusok (pl. orthomyxovirusok, rhabdovirusok) tisztított, fehérjementes nukleinsava nem fertőző, az általa hordozott információ a sejt számára nem hozzáférhető, mivel ilyen nukleinsavak a sejtben nem fordulnak elő, így annak enzimkészlete nem képes a genetikai kód lefordítására. Ehhez szükség van az ilyen vírusok fehérjekészletében megtalálható enzim természetű fehérjékre (RNS dependens RNS polimerázokra) is. A vírusgenomot a DNS-vírusok és több RNS-víruscsalád esetében egyetlen nukleinsavszál alkotja, de bizonyos RNS-vírusok genomja szegmentált, több (2 12) különálló szálból áll (reo-, birna-, orthomyxovirusok stb.). A vírusokban esetenként nem vírusspecifikus nukleinsav is kimutatható: a papovavirusokba gyakran a gazdasejt nukleinsavdarabjai is bekerülnek, az arenavirusokba riboszómák (RNS) épülnek be, a retrovirusok onc és src génjeinek egy része is gazdasejt eredetű (lásd később). Ugyanakkor az is gyakori, hogy a vírus-összeépülés során a virionból a nukleinsav részben vagy egészben kimarad (inkomplett vagy defektív partikulák), az ilyen virion fogékony sejtbe jutva természetesen képtelen a szaporodásra A vírusnukleinsavak vizsgálata A vírusgenetikai vizsgálatok kiindulási anyaga a korábbi fejezetben leírtak szerint előállított, tisztított és koncentrált vírusszuszpenzió. A további vizsgálatok során a vírusszuszpenziót proteázokkal, detergensekkel és fenollal (vagy ezek különböző kombinációjával) kezelve a nukleinsavról eltávolítják a fehérjéket. A kiszabadított, tisztított nukleinsav elektronmikroszkópos vizsgálatával megállapítható, hogy az lineáris vagy cirkuláris szerkezetű. Enzimemésztési próbákkal meghatározható a nukleinsav fajtája: a DN-áz, illetve RN-áz enzimek csak a megfelelő nukleinsavat emésztik. A DNS-vírusok genetikai vizsgálata során legelőször általában a vírusgenom fizikális térképezését végzik el. Ekkor a tisztított nukleinsavat restrikciós endonukleázokkal kezelik. Ezek olyan bakteriális eredetű enzimek, melyek a nukleinsavszálon egy adott, 4 7 bázispárból álló szakaszt felismernek, és a DNS-t ezen a ponton hasítják. A vírusgenom így meghatározott számú fragmensre esik szét attól függően, hogy ez a specifikus bázissorrend hány alkalommal fordul elő a DNS-szálon. A nukleinsavfragmenseket ezután agarózgélben elektroforetikusan futtatják. Megfelelő időpontban az elektroforézist leállítják és az agarózlemezt etídiumbromid-oldattal kezelik, így a nukleinsavfragmensek helyeződése láthatóvá válik. A fragmensek kiindulóponttól mért távolsága és azok molekulatömege között fordított az arány, a fragmensek tömege ezért megfelelő molekulatömeg-markerek (ismert tömegű fragmensek) egyidejű futtatásával meghatározható. Részleges 163

184 Virológia enzimemésztéssel (az enzimhatás korai felfüggesztésével) azt is meg lehet állapítani, hogy mely fragmensek helyeződnek egymás mellett (ilyenkor ugyanis nem minden hasítási pontnál vágódik a genom). Így végül minden fragmens nukleinsavszálon elfoglalt helyét meg lehet határozni. Ez a folyamat a genom fizikális térképezése. Mivel jelenleg már több mint 150 restrikciós endonukleáz ismert, a megfelelő enzim kiválasztásával valamely vírus DNS-szála szinte tetszés szerinti helyen hasítható. A vírusok közötti genetikai különbség így kimutatható, mert megfelelő enzim alkalmazása után még közel rokon vírusok esetében is különböző fragmensek képződnek, és ez eltérő DNS-elektroforetogram (DNS-térkép) kialakulásával jár. A vírusok azonosításában és osztályozásában, a járványtani nyomozásban egyre nagyobb szerepet kap a nukleinsav-térképezés (69. ábra). 69. ábra - Vírusnukleinsav-térképezés (dr. Benkő Mária felvétele). Az egyes sávokban restrikciós enzimmel kezelt vírusnukleinsav-fragmensek elektroforetikus képe látható. Az elektroforetogram azonossága a vizsgált vírusminták azonosságát valószínűsíti (pl. az 1. és 3., valamint a 7. és 9. minta A vírusgenomból adott nukleinsavszakaszok ún. ragadós végű fragmenseket (70. ábra) produkáló restrikciós enzimekkel kivághatók. 70. ábra - Ragadós végű fragmensek A ragadós végű fragmensek baktérium plazmidjába (élesztőgombába, eukaryota sejtbe) ültethetők úgy, hogy a plazmidot ugyanannak az endonukleáznak a segítségével felnyitjuk és a vírusnukleinsav-szakaszt ezen a hasítási helyen a plazmidba illesztjük. Ez a folyamat a nukleinsav-klónozás (71. ábra). 71. ábra - Nukleinsav-klónozás 164

185 Virológia A plazmidot a baktériumsejtbe visszajuttatva az ily módon átalakított baktérium szaporodása során az adott vírus-dns szakaszt is nagy mennyiségben termeli, és így a hagyományos eljárásnál (szövettenyésztés, vírusszaporítás, vírusnukleinsav-tisztítás) gyorsabban és kevesebb költséggel termelhető vírus-dns. Ez a DNS vagy a belőle készített fragmensek többek között az analitikai és a diagnosztikai célból végzett nukleinsavhibridizációs próbákban használhatók fel. A nukleinsav-hibridizációs eljárás alapja az, hogy a DNS-szálon egymással szemben helyezkedő, komplementer nukleinsavszálak mesterséges szétválasztásukat követően megtalálják egymást, és újra kialakítják a dupla láncot. A vírusazonosítás, illetve a különböző vírusgenomok összehasonlító vizsgálata során az egyik vírus DNS-t vagy annak baktériumokkal termeltetett, klónozott szakaszát 32 P izotóppal megjelöljük (próba), majd a 165

186 Virológia másik vírus DNS-ét nitrocellulóz filterhez kötve hőkezeléssel hosszában szétválasztjuk, és az így denaturált nukleinsavhoz hozzáadjuk az izotóppal jelölt mintát. Lehűlés közben ismét kialakul a kettős nukleinsavszál. Amennyiben a vizsgálandó vírus-dns és a próba-dns komplementer, akkor a kialakuló kétszálú DNS egy részébe az izotóppal jelölt próba-dns épül be. Ismételt mosással a nem kötődött próba-dns eltávolítható. A visszamaradó radioaktivitás (amit ma a legtöbb helyen autoradiográfiás eljárással mutatnak ki) a két vírus közötti azonosságot, illetve rokonságot jelzi (72. ábra). 72. ábra - Nukleinsav hibridizációs eljárás Próbaként nemcsak DNS, hanem mrns is alkalmazható, hiszen egy adott génszakaszról készült mrns-kópia is komplementere a megfelelő DNS-szálnak. Az izotóp használatával járó nehézségek és veszélyek kiküszöbölése érdekében újabban különböző enzimekkel jelölt próba-nukleinsavakat is használnak hibridizáció során. A kötődést ebben az esetben nem radioaktivitás, hanem színreakció jelzi. A diagnosztikai célból végzett nukleinsav-hibridizációs eljárásokról később lesz szó. A fentiekben ismertetett hibridizációs technika alapfeltétele a DNS szálakat szétválasztó hőkezelés. Az ilyen vizsgálatokat tehát a 100 C-os hőkezelést elviselő közegben, nitrocellulóz- vagy nylonfiltereken kell végezni, ezért hívják az eljárást gyakran filterhibridizációs eljárásnak. Az agarózgél közegből, amelyet a vírusanalitikai vizsgálatoknál a nukleinsavfragmensek szétválasztására legtöbbször alkalmaznak, a hibridizáció előtt diffúzió segítségével vihetők át az elkülönített fragmensek a nitrocellulóz vagy nylonfilterre (Southern-blot technika). Az ún. heteroduplex technika is a hibridizáció során ismertetett jelenséget, a kettős DNS hőkezelésre bekövetkező reverzibilis denaturációját, felnyílását használja ki. A két különböző vírus hosszában felnyitott, majd lehűlve egyesülő DNS-éből kialakult, kevert kettős DNS-szálat (heteroduplexet) itt elektronmikroszkóppal vizsgálják. Ahol a két szál komplementer, ott az elektronmikroszkópos képen egységes szálként jelenik meg, a nem komplementer szakaszok viszont egymástól elválnak, hurkot képeznek (ún. D-loopot). Ezzel a két vírus genomján elektronmikroszkópos felvételeken a homológ és heterológ szakaszok hossza és helyeződése is megállapítható (73. ábra). 73. ábra - Heteroduplex technika 166

187 Virológia Ez a módszer génlokalizációra is alkalmas, ha a DNS szál és a róla másolódott mrns szál elegyét hőkezeljük. A felnyíló DNS szálhoz a lehűtés során hozzátapad a mrns molekula, ahhoz a génszakaszhoz, amely a transzkripció során az adott mrns templátjául szolgált. A DNS komplementerszála ilyenkor már nem tud visszatapadni, mert a szabad nukleotidokat az adott szakaszon az mrns foglalja el. A hurokképződés (R-loop) ebben az esetben is elektronmikroszkóppal figyelhető meg. A vírus-dns-nukleotidsorrend meghatározása során a kettős DNS-szálat hosszában hőkezeléssel szétválasztják, a szimpla szálú DNS-t jelölik (pl. izotóppal vagy fluoreszkáló festékkel), majd a nukleinsavoldathoz szabad nukleotidokat (adenin, guanin, citozin, timin), szintetikus oligonukleotid primer szálat, polimeráz enzimet és az egyik nukleotid didezoxi-változatát adják (pl. didezoxi-adenint, dda). Az oldat lehűlésekor az oligonukleotid primer szál hozzátapad a komplementer vírus-dns-hez, a polimeráz enzim pedig a primerről kiindulva elkezdi felépíteni a szabad nukleotidokból a szimpla szálú DNS komplementerszálát. Random módon vagy dezoxiadenint vagy didezoxi-adenint épít be a komplementer szálba a templátként szolgáló szál timidin nukleotidjaival szemben. A dezoxi-adenin beépítése esetén a láncépítés folytatódhat, a didezoxi-adenin után azonban megszakad a szál, mert erről a molekuláról hiányzik a következő nukleotid kapcsolódásához szükséges -OH csoport. Vagyis aszerint, hogy hányszor és hol fordul elő timidin a templátként szolgáló szálon, különböző hosszúságú komplementer szállal kiegészült DNS-molekulapopulációk képződnek, melyek mind didezoxiadenin-molekulával végződnek. Egyidejűleg ugyanezt a reakciót három másik reakcióelegyben is elvégzik, de ezek a három másik nukleotid egyikének didezoxi variánsát tartalmazzák. A négy minta párhuzamos elektroforézisével négy egymással párhuzamos sávban a különböző hosszúságú fragmensek elkülöníthetők és a nukleotidsorrend leolvasható (74. ábra és 75 ábra). 74. ábra - A vírus-dns-nukleotidsorrend meghatározásának sematikus rajza 167

188 Virológia 75. ábra - Nukleotidsorrend meghatározáshoz használt poliakrilamid gél fényképe (dr. Benkő Mária felvétele) 168

189 Virológia Az RNS-vírusok esetében az ún. RNS-ujjlenyomat technika segítségével történik a nukleinsav vizsgálata. Ekkor a megfelelő RNS-t hasító enzim (pl. T l ribonukleáz, ribonukleáz-a) a nukleinsavszálat egy-egy meghatározott nukleotid (pl. minden uracil) mellett elvágja. Mivel ezek az enzimek nem nukleotidcsoportokat, hanem egyes nukleotidokat ismernek fel, a nukleinsavszálat több helyen hasítják, és kevesebb nukleotidból álló fragmenseket képeznek (oligonukleotidok), mint a restrikciós endonukleázok a DNS-vírusok esetében. Az oligonukleotidokat kétdimenziós poliakrilamidgél-elektroforézissel szétválasztják. A legyezőszerűen szétterülő pontokból kialakuló oligonukleotid-kép ugyanúgy jellemző egy adott RNS-vírusra, mint a DNS-vírusokra a fragmenstérkép. Az RNS-vírusok genomjának vizsgálatához igen gyakran alkalmazzák a reverz transzkriptázos konverziót, ilyenkor a genomként szolgáló RNS-ről reverz transzkriptáz enzimmel DNS-szálat másolnak. Ezt a DNSmásolatot (ún. cdns-t) használják a hibridizációs vizsgálatokhoz, a nukleotidsorrend meghatározásához, klónozáshoz, restrikciós endonukleázos analízishez, mert ezek az eljárások csak dupla szálú DNS vizsgálatához használhatók A vírusfehérjék szerepe és felosztása A virion szerkezetének a nukleinsavak mellett a fehérjék is alapvető komponensei. Szerepük többféle lehet, így többek között meghatározzák a virion alakját, enzimként szerepelnek a vírusszaporodás folyamataiban stb. A virion fehérje-összetétele jellemző az adott vírusra. A vírusfehérjék alapvetően két csoportra oszthatók. A struktúrproteinek a virion felépítésében vesznek részt, a nem strukturális fehérjék (pl. az ún. korai fehérjék, egyes enzimek és különböző prekurzor fehérjék) pedig csak 169

190 Virológia a vírusszaporodás bizonyos fázisaiban termelődnek, tehát csak a vegetatív vírusban (a fertőzött sejtben) vannak jelen, a virionba nem épülnek be. Ez utóbbiaknak csak genetikai kódja található meg a virion nukleinsavában. A virion struktúrproteinjeit tovább oszthatjuk külső fehérjékre és core-proteinekre. A külső fehérjéknek alapvető szerepe van a fogékony sejtekhez való adszorpcióban, a vírus antigén természetének és a kapszid szimmetriaviszonyainak meghatározásában, továbbá védik a vírusgenomot a környezet inaktiváló hatása ellen. A virion belsejében levő fehérjék (core-proteinek) általában a nukleinsavhoz kapcsolódnak és annak védelmében játszanak szerepet. A virion enzim természetű struktúrproteinjeinek többsége is a core-ban található, ezek többnyire a vírusszaporodás folyamán játszanak szerepet (lásd később) Fehérjevizsgáló módszerek A vírusfehérjék vizsgálatára leggyakrabban a poliakrilamid gélben végrehajtott elektroforézist alkalmazzák. A korábban leírtak szerint tisztított és koncentrált preparátumot nátrium-lauril-szulfáttal (SDS, sodium dodecyl sulphate) és merkaptoetanollal kezelik, ezáltal a diszulfidhidak és a hidrogénkötések felszakadnak, a vírusalkotó fehérjék lineáris polipeptid láncokra esnek szét. Az ily módon feltárt fehérjék megfelelő ph-viszonyok mellett elektroforetikus térben egységesen a pozitív sarok felé vándorolnak, a molekulatömegük által megszabott sebességgel. Megfelelő idejű futtatás után az elektroforézist leállítva és a fehérjéket megfelelő eljárásokkal (pl. ezüst-nitrátos festéssel) láthatóvá téve az azonos molekulatömegű fehérjék a kiindulóponttól azonos távolságra találhatók. A megtett út és a molekula tömege itt is fordított arányban van. Egy adott vírusra éppúgy jellemző az így kapott polipeptidkép, mint az endonukleázos emésztés után a DNS-fragmensek elektroforetogramja. A vírusok antigénszerkezetének, fehérje-összetevőinek vizsgálatára használják a monoklonális ellenanyagokat is. Ezeket mesterségesen előállított hibridomasejtekkel termeltetik. Az eljárás során a vizsgálni kívánt vírussal, illetve annak meghatározott fehérjéjével egereket immunizálnak, majd a megfelelő szintű immunitás kialakulása után ezek lépét eltávolítják. A lépből az ellenanyag-termelésért felelős B-lymphocytákat kiszabadítják és a sejtszuszpenzióhoz lymphoid tumorból származó myelomasejteket kevernek. Polietilénglikol hatására a sejtek cytoplasmamembránja összeolvad, sejtfúzió jön létre. A kialakuló tetraploid hibridsejtek mindkét szülősejttől örökölnek tulajdonságokat: a lépsejttől az ellenanyag-termelő képességet, a myelomasejttől pedig a korlátlan szaporodóképességet (76. és 77. ábra). A hibridsejtek (a B-lymhocytákhoz hasonlóan) rendelkeznek továbbá egy enzimmel (hypoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz, HPRT), melynek segítségével át tudják alakítani a hipoxantint, amely az ilyen enzimmel nem rendelkező myelomasejtek számára toxikus. 76. ábra - Hibridomasejt-előállítás folyamata 170

191 Virológia 77. ábra - Hibridomasejt mikroszkópos képe (A: egy B-lymphocytából és egy myelomasejtből, B: két lymphocytából és két myelomasejtből összeolvadt hibridomasejt) 171

192 Virológia A hibridsejtek klónozásával olyan, egy-egy hibridomából származó sejtvonalak (klónok) különíthetők el, melyeknek sejtjei egyetlen epitop ellen termelnek ellenanyagokat (monoklonális ellenanyagok). A megfelelő ellenanyagok kiválasztásával egyrészt a korábbiaknál specifikusabb és gyorsabb diagnosztikai próbák dolgozhatók ki, másrészt a vírusok fehérjeszerkezetének, a vírusneutralizáció mechanizmusának, a vírusok rokonsági viszonyainak stb. vizsgálatára nyílik lehetőség Lipidek A burkos vírusok tömegének 30 35%-át kitevő lipidtartalmú külső burok sejt eredetű, a kiszabaduló víruspartikula a szaporodási ciklus végén a gazdasejt különböző membránrendszerein áthatolva és azokból egy darabot kiszakítva jut a burokhoz. Ezért a burok lipidösszetétele mindig a gazdasejtéhez hasonló (foszfolipid és koleszterol). A lipidmembránba azonban mindig beépülnek vírusspecifikus proteinek és glükoproteinek is, ezeket a membránhoz mirisztil-csoportok (kovalensen kötött zsírsavak) rögzítik. A komplex szerkezetű poxvirusok kapszidjában vírusspecifikus lipidek vannak, melyek összetétele a gazdasejt membránkomponenseitől eltér. Az afrikai sertéspestis vírusának ikozahedrális kapszidjában is találhatók vírusspecifikus lipidkomponensek, de a külső burok e vírusok esetében is sejteredetű Szénhidrátok A virionban a nukleinsavban található ribózon vagy dezoxiribózon kívül szénhidrátok elsősorban a burkos vírusok peplomerjeiben (felszíni membránfehérjéiben) fordulnak elő, glükoproteinek formájában. Hidrofób részük a lipidmembránba ágyazódik, glükozilált hidrofil részük pedig kifelé irányul. A komplex szerkezetű poxvirusok magjában is kimutatható glükoprotein A vírusok szaporodása (multiplikációja) A már eddig megismert és az újonnan jelentkező vírusos betegségek elleni küzdelemben kulcsfontosságú a vírusok szaporodási stratégiájának minél részletesebb megismerése. A vírusok parazita életmódjukat kizárólag a gazdasejtben történő szaporodásuk (multiplikációjuk) során valósítják meg, amelynek központi lépésére utalva, a folyamatot gyakran replikációnak is nevezik. Minden vírus szaporodási stratégiája lényegében három lépésből áll 172

193 Virológia behatolás a sejtbe (lehetőség a parazitizmusra), a multiplikáció módja (a genetikai parazita életmód megvalósítása), a sejtből való kijutás lehetősége (alkalom a terjedésre, az újabb parazitizmusra). Ezeket a feladatokat a vírusok hat különböző lépésben valósítják meg (78. ábra). Ennek során a vírusnak először meg kell találni azokat a sejtfelszíni struktúrákat, ahol kapcsolódni tud a sejthez (adszorpció), majd ahol behatolhat a cytoplasmába (penetráció). A cytoplasmába jutott vírusnak alkalmassá kell tenni genetikai információját a replikációra, ezért legelőször meg kell szabadulnia a vírusgenomot körülvevő fehérjéktől (lemeztelenedés). Az utódvirionok létrehozásához különböző replikációs, transzkripciós és transzlációs stratégiákat kell alkalmazni, attól függően, hogy milyen típusú nukleinsav tárolta a vírus genetikai információját és hogy a replikáció a sejtmagban vagy a cytoplasmában jön-e létre (makromolekulák szintézise). Az utódvirionoknak az összeépülés után meg kell találni a módot a sejt elhagyására (kiszabadulás), ami különösen nehéz feladat a baktériumokat és a növényi sejteket megtámadó vírusok számára. A sikeresen végrehajtott szaporodási stratégia eredménye a fertőzés. 78. ábra - Vírusok szaporodásának lépései (magyarázat a szövegben) A szaporodási stratégia legfontosabb lépéseit magába foglaló eklipszis (napfogyatkozás) elnevezést eredetileg a pathomorphológusok alkalmazták arra a szaporodási szakaszra, amikor elektronmikroszkópos vizsgálattal nem látták a sejtben a vírus struktúráját. Virológiai értelemben az eklipszis, az első mrns szintézisétől az első 173

194 Virológia utódvirion megjelenéséig tart. A vírusok szaporodási ciklusában az eklipszis a leghosszabb szakasz, melynek időtartalma DNS-vírusoknál átlag 5 15 óra, RNS-vírusoknál pedig 3 10 óra (79. ábra). 79. ábra - Vírusok szaporodási ciklusa Adszorpció Az adszorpció egy specifikus kapcsolat a sejtmembrán bizonyos fehérjéi (receptor) és a virion egyes felszíni, adszorpciós fehérjéi (antireceptor) között. Annak ellenére, hogy a vírus a sejtmembrán teljes felszínén képes landolni, a sejtbe történő behatolás csak azokon a membránrészeken keresztül valósulhat meg, ahol lehetőség nyílik erőteljes, stabil receptor antireceptor kapcsolatra (80. ábra). 80. ábra - Az adszorpciós fehérjék speciális elhelyeződése 174

195 Virológia Az adszorpció rendszerint a sejtek és a virionok véletlenszerű ütközésével indul meg, amit a két lépésben zajló fizikokémiai folyamat követ. Az első lépés során reverzíbilis kapcsolat alakul ki a véletlenszerűen találkozó receptor- és antireceptormolekulák között. Ez a kapcsolat csak akkor jöhet létre, ha a környezetben elegendő kation van jelen ahhoz, hogy semlegesítse az azonos negatív töltéssel rendelkező receptor- és antireceptormolekulák között jelen levő elektrosztatikus erőt. A második lépésben a folyamat irreverzíbilissé válik, a fehérjemolekulák közötti kémiai kötéseknek köszönhetően. A evolúciós események során kialakult receptormolekulák szinte kivétel nélkül a sejt felszínén helyezkednek el és többnyire glükoproteinek. Csak azok a vírusok képesek megfertőzni a sejtet, amelyek az adszorpciós fehérjéjüknek megfelelő receptormolekulát megtalálják a sejtmembránon. Ezért a fertőző vírus sejt, illetve fajspecificitását valójában a receptormolekulák jelenléte határozza meg. Az egy vírus egy receptor kapcsolat mellett különösen az egy családba tartozó vírusok között megvalósulhat az egy receptor több vírus modell is. Adott receptor- molekulából általában példány található a sejt felszínén. A receptorfehérjék genetikai kódját több vírus esetében azonosították (pl. a 19. emberi kromoszóma kódolja a poliovírus, a 3. pedig a herpesz szimplex vírus receptor fehérjéit). A receptormolekulák genetikai kódja a legtöbb esetben már a magzati életben kifejeződik, és ez teszi lehetővé adott vírusok magzatkárosító hatását. Ugyanakkor ismertek olyan eseteket is, amikor a receptorfehérjék csak bizonyos körülmények között jelentek meg annak ellenére, 175

196 Virológia hogy genetikai kódjuk jelen volt a kromoszómában. (pl. az ember vesesejtjei nem tartalmaznak receptort a fertőző gyermekbénulást okozó poliovirussal szemben, ugyanakkor a humán veséből készült egyrétegű sejtkultúrák felszínén kifejeződnek). A genetikailag kódolt specifikus vírusreceptorok mellett a sejtmembránon található komplement és hormonreceptorok is több vírus számára biztosítanak adszorpciós lehetőséget (pl. HIV CD 4-receptor, veszettség vírus acetilkolin-receptor, vaccinia vírus epidermalis növekedési faktor, EGF-receptor). Az antireceptormolekulák általában a vírus kapszidjában vagy a burkában helyezkednek el, ugyanakkor egyes vírusoknál speciális nyúlványokon találhatók (80. ábra.) Amíg a sejtreceptorok kémiai szerkezete és térbeli helyzete viszonylag stabil, addig egyes vírusok éppen az adszorpciós fehérjéik (antireceptor) változtatásával biztosítják túlélésüket a természetben (pl. orthomyxovirusok, HIV). Több vírus esetében a jelentős evolúciós előnyt jelentő gazdafajváltás is az adszorpciós fehérjék sikeres megváltoztatására vezethető vissza (pl. a macska pánleukopénia vírusa így adaptálódott a kutyához és a nyérchez vagy a kutya szopornyica vírusa a fókákhoz és a delfinekhez). Az adszorpciós fehérjékhez kötődő ellenanyagok lehetetlenné teszik az adszorpciót, így megakadályozzák a sejt fertőződését. Ezért az adszorpciós fehérjék doménjeinek változtatása az immunrendszerrel szemben is előnyhöz juttathatja a vírust. A legtöbb vírus esetében az adszorpció a sejttel való találkozás után egy órán belül irreverzíbilissé válik. Ha ezt a kapcsolatot kémiai vagy fizikai módszerekkel megszakítjuk, az antireceptormolekulák sérülése miatt a vírus elvesztheti adszorpciós és fertőzőképességét. Az orthomyxovirusok ugyanakkor rendelkeznek egy speciális enzimatikus hatású felszíni fehérjével is (neuraminidáz), ami úgy oldja fel az adszorpciós kapcsolatot, hogy az antireceptormolekulák (hemagglutinin) épségben maradnak (80. ábra). Ezért a vírusnak ismételt lehetősége adódik az adszorpcióra és a fertőzésre. Az adszorpció kialakulása után azonnal kezdetét veszi a penetráció Penetráció A penetráció energiaigényes, kizárólag élő sejtben végbemenő, gyors folyamat. A ragadós száj- és körömfájás vírusa a 3 percen belül lezajlódó penetrációhoz, 37 C-on kj/mol aktivációs energiát igényel. (Az adszorpció kialakulásához elegendő kj/mol energia még 2 4 C-on is, de ezen a hőmérsékleten nem történik penetráció) az energiatermelő folyamatok lelassulása miatt. A penetráció módját meghatározza a virion struktúrája és a sejt típusa, valamint a koncentrációs tényezők alakulása. A penetráció eddig megismert általános és alternatív formáit elektronmikroszkópos és membránkémiai módszerekkel derítették fel A penetráció általános formái Transzlokáció. Az adszorbeálódott virion előtt megnyílik, majd áthatolás után újra összezárul a sejtmembrán. A csapóajtó mechanizmus -ként is emlegetett transzlokációt elsősorban a nem burkos, ikozahedrális szimmetriájú virusok veszik igénybe. A picornavirusok kapszidja a transzlokáció során elveszti ikozahedrális szerkezetét, és egy amorf, RNS-fehérjekomplexként hatol át a sejtmembránon (81. ábra). 81. ábra - A penetráció általános formái (magyarázat a szövegben) 176

197 Virológia Endocytosis (viropexis). A sejtek táplálkozásuk során adott makromolekulákat, a receptorhoz kötött endocytosissal kebelezik be. A viropexis során az adszorbeálódott vírus, ezt a lehetőséget használja ki, mivel mérete még a bekebelezhető tartományba esik. Az adszorbeálódott vírus mögött a sejtmembrán lefűződik és a vírus, sejtmembránnal körülvett vesiculumként (endosoma), a cytoplasmába jut. Ezzel a vírustartalmú vesiculummal a sejt lysosomája hamarosan fuzionál. Az így kialakult phagolysosomában kezdetét veszi a dekapszidáció. A nem burkos vírusok döntő többsége viropexissel jut a sejtbe. A burkos vírusok viropexise abban különbözik a nem burkos vírusokétől, hogy itt a vírusburok is lefűződik, miközben fuzionál az endosoma sejt eredetű membránjával (81. ábra). A burkos vírusok közül elsősorban a herpesz- és poxvirusok használják az endocytosist a penetrációhoz. 177

198 Virológia Membánfúzió. A membránfúziót kizárólag burkos vírusok vehetik igénybe. A folyamat során a vírus burka egyesül a sejt membránjával, és ezért kizárólag a nukleokapszid lép be a cytoplasmába. A membránfúziót a vírus indukálja, a burokban helyeződő fúziós proteinjei (F) révén. A fúziós fehérjék működésének mechanizmusát még nem tisztázták. A paramyxovirusok és egyes herpesvirusok membránfúzióval jutnak be a sejtbe (81. ábra). A penetráció alternatív formáit elsősorban a baktériumok és növények vírusai alakították ki, mivel a sejtfalon összehasonlíthatatlanul nehezebb az áthatolás, mint az állati sejtek membránján A penetráció alternatív formái A T-bakteriofágok nyaki részében összehúzódásra képes fehérjemolekulák találhatók. A fág adszorpciója után a farki végben levő lizozim enzimek lyukat vágnak a baktériumsejt falába, majd a fág nyaki részében található fehérjék hirtelen összehúzódnak, és szinte belövik a fág nukleinsavát a baktérium cytoplasmájába. Néhány ribofág szellemes módon, a baktérium sejtfal nélküli részén, a sex-fimbrián keresztül hatol be a baktériumba. A ribofág csak a sexfimbriával rendelkező baktériumokat képes megfertőzni, ezért ezt a fertőződési formát a baktériumok nemi betegségének is nevezik. A növényi vírusok a sejtfal sérülésein (pl. rovarszúrás, -harapás, metszés) keresztül, közvetlenül hatolnak a sejtbe Dekapszidáció (uncoating) A cytoplasmába jutott vírus számára létkérdés, hogy genomját vagy legalábbis a korai fehérjéket kódoló génszakaszokat minél gyorsabban alkalmassá tegye a transzkripcióra. Ennek érdekében a vírusnak meg kell szabadulnia a nukleinsavat körülvevő és védelmet nyújtó nukleokapszid fehérjéktől. A dekapszidáció során ezt a feladatot a cytoplasmában található proteolitikus enzimek közül feltételezhetően a lysosomális enzimek végzik el. A vírusburok vagy endosomamembrán emésztésében feltételezhetően az intracelluláris proteázoknak jut kulcsszerep. A dekapszidáció ugyanakkor komoly veszélyt is jelenthet a vírusnak, ha a védőfehérjéktől megszabadított genomja megsérül vagy áldozatul esik a nukleáz enzimek emésztő hatásának. Ennek elkerülésére a vírus számos stratégiát alkalmaz. Több ikozahedrális vírus esetében bizonyították, hogy a dekapszidáció soha sem teljes, és a transzkripció már akkor megindul, amikor a vírus még csak néhány kapszidproteinjét vesztette el. A sejtmagban szaporodó DNSvírusok csak így biztosíthatják nukleinsavuk számára, hogy épségben jussanak be a sejtmagba, ahol transzkripciójuk és replikációjuk zajlik. A cytoplasmában szaporodó poxvirusok egy ún. vetkőztető (uncoating) enzimet kódolnak, amely kíméletesen fejezi be a sejtenzimek által megkezdett, meglehetősen agresszív dekapszidációt. A picornavirusok már az adszorpciót követő struktúraváltozás során elvesztik két kapszidproteinjüket (V 2, VP 4), és maradék fehérjéik ezúton válnak különösen fogékonnyá a proteolytikus enzimekkel szemben. Ennek eredményeképpen a vírus-rns már néhány perc alatt szabaddá válik nemcsak a transzkripcióra, de a nukleáz enzimek számára is. Ez a versenyhelyzet kényszeríti a picornavirusokat a rendkívül gyors szaporodásra. A T-bakteriofágok teljes dekapszidációja már a penetráció során megtörténik, mivel a fág csak a nukleinsavát juttatja be (lövi be) a cytoplasmába Makromolekulák szintézise A vírusok többsége az élővilágban egyedülálló formákban tárolja a genetikai információt (DNS/1, RNS/1, RNS/2), ezért speciális replikációs és transzkripciós stratégiákat kellett kifejlesztenie ahhoz, hogy a makromolekuláit szintetizálni tudja a prokaryota és eukaryota sejtekben (82. ábra). 82. ábra - Dupla szálú DNS-vírusok (DNS/2) makromolekuláinak szintézise (Lomniczi (1978) után módosítva). Magyarázat a szövegben 178

199 Virológia Ezt a feladatot a nukleinsav-szintézist végző replikáció, valamint a fehérjeszintézist irányító transzkripció és transzláció során hajtja végre. Habár ezek az események közel azonos időben zajlanak, mégis funkcionálisan három, jól elkülöníthető szakaszra bonthatók: korai transzkripció (mrns-szintézis) és transzláció (fehérjeszintézis), genomreplikáció (nukleinsav-szintézis), késői transzkripció (mrns-szintézis) és transzláció (fehérjeszintézis). A korai transzkripció és transzláció már az eklipszis fázisban elindul, és ennek során a vírus előállíttatja a sejttel azokat a korai fehérjéket, amelyekre még a vírusgenom replikációja előtt szüksége van. Keletkezésük időbeli eltérése alapján megkülönböztetünk azonnali korai (immediate early) és késleltetett korai (delayed early) fehérjéket. Ezek a korai fehérjék olyan vírus által kódolt enzimek, amelyek egyrészt gátolják a sejt saját fehérjeés nukleinsav-szintézisét (represszorfehérjék), másrészt segítik a vírusgenom replikációját (pl. a vírus által kódolt nukleinsav polimerázok is ekkor szintetizálódnak). Több vírus esetében bizonyították a korai fehérjék primer szerepét is. A korai fehérjék nem épülnek be az utódvirionokba. Feladatuk a vírusgenom replikációjához szükséges körülmények megteremtésével véget ért. A vírusgenom replikációja során a szülő nukleinsavról mint templátról szintetizálódnak az utódvirionok genomjai. A szintézist a HDV, a papovavirusok és a parvovirusok kivételével a vírus által kódolt polimeráz (replikáz) enzimek végzik. (A parvovirusok pl. a sejt illetve más vírus replikáz enzimét használják fel.) A vírusreplikáz enzimek specificitása teszi lehetővé, hogy a cytoplasmában szaporodó vírusok (poxvirusok, afrikai sertéspestis vírusa, RNS-vírusok) is szintetizálni tudják nukleinsavukat. Az eukaryota sejtekben a replikációs mechanizmus ugyanis kizárólag a magban található. A vírus által kódolt replikáz enzimek közös tulajdonsága, hogy nagyságrenddel gyorsabbak, agresszívabbak a sejt replikáz enzimeinél. A vírusok ezáltal jutnak, többnyire behozhatatlan előnyhöz a sejttel szemben a makromolekulák szintéziséért vívott harcban. A késői transzkripció és transzláció során szintetizálódnak az utódvirionok struktúrfehérjéi és azok az enzimek (pl. transzkriptázok) amelyeket adott vírusoknak készen, a nukleokapszidba csomagoltan kell szállítani a fogékony sejtekhez, ahol szaporodási feltételeiket majd megtalálják. Eukaryota sejtekben a transzkripciós események kizárólag a sejtmagban zajlanak, amelynek során a sejt által kódolt transzkriptáz (DNS/2-mRNS-polimeráz) enzim mrns-t szintetizál a mintát adó kromoszomális DNS pozitív száláról. A vírusok közül kizárólag a sejtmagban szaporodó vírusok (herpesz-, adeno-, papova-, hepadna-parvovirusok) használhatják ezt a stratégiát. A sejt cytoplasmájában szaporodó vírusok a saját 179

200 Virológia genomtípusuknak megfelelő transzkripciós enzimkészletet fejlesztettek ki, melyet a (+)RNS-vírusok kivételével nemcsak kódolva, de készen is kénytelenek magukkal vinni. A cytoplasmában ugyanis nincs lehetőség a transzkripcióra. A (+)RNS vírusok genomját a sejt riboszómája mrns-nek fogadja el, ezért a vírusgenomról közvetlenül szintetizálódhatnak a fehérjék. Szimpla szálú RNS-vírusoknál nehéz élesen szétválasztani a replikációt és a transzkripciót, mivel mindkét folyamatnál RNS-dependens RNS-polimeráz végzi a szintézist. Minden vírus, a gazdasejt ribosomáit, trns-eit és transzlációs-poszttranszlációs mechanizmusát használja fel fehérjéinek szintéziséhez (transzláció). Bizonyos vírusfehérjék transzláció utáni glükolizációja és foszforilációja (poszttranszláció) a gazdasejt fehérjéinél alkalmazott módszerekkel történik, többnyire a sejtenzimek irányításával. A herpesvirusok fehérjéinek foszforilációját a vírus által kódolt protein kináz enzim végzi el. A vírusfehérjék glükolizációja a sejtmembránokon zajlik. A magas mannóztartalmú glükoproteinek, a maghártya és a Golgi-rendszer membránjában szintetizálódnak. A vírusok által alkalmazott különböző replikációs, transzkripciós és transzlációs stratégiák jellegzetességeit a Baltimore-féle genetikai rendszer csoportosítása alapján tárgyaljuk (12. táblázat). 12. táblázat - Baltimore-féle genetikai rendszer A Baltimore-féle genetikai rendszerek és az azokat képviselő víruscsaládok A rendszer osztályai I. II. III. IV. V. VI. kettős szálú DNS-vírusok egyszálú DNS-vírusok dupla szálú RNSvírusok pozitív, szimplaszál ú RNSvírusok negatív, szimplaszál ú RNSvírusok DNS közvetítőt használó RNS-vírusok papova- * Parvo- Reo- Astro- Orthomyxo- Retro- adeno- ** Cirko- (Birna-) Picorna- Paramyxo- herpes- *** Hepadna- Calici- Rhabdo- irido- Toga- + Arena- pox- Corona- + Bunya- Toro- Filo- Flavi- * lineáris DNS + Ambiszenc RNS **cirkuláris DNS ***részlegesen duplaszálú DNS Dupla szálú DNS-vírusok (DNS/2) A legtöbb dupla szálú DNS-vírus (herpes-, adeno-, papovavirus) replikációja és transzkripciója a sejtmagban, míg néhányuké (pox-, afrikai sertéspestis vírusa) a cytoplasmában zajlik. A sejtmagban szaporodó DNS/2 vírusok kódolva szállítják és használják virális replikáz (DNS/2-DNS/2 polimeráz) és transzkriptáz (DNS/2-180

201 Virológia mrns polimeráz) enzimeiket annak ellenére, hogy a sejt által kódolt enzimeket is felhasználhatják. A szülő vírus korai transzkripcióját, éppen a sejt által kódolt transzkriptáz enzimek végzik el. Transzláció előtt a policisztronos mrns-t a vírus enzimei monocisztronos részekre vágják (82. ábra). A cytoplasmában szaporodó DNS/2-vírusok ugyancsak kódolják a replikáz és transzkriptáz enzimet. A korai transzkripciót a vírus által készen szállított transzkriptáz enzim végzi el, mivel a sejt cytoplasmájában ez az enzim nem fordul elő. A poxvirus genomjáról monocisztronos mrns-ek szintetizálódnak Szimpla szálú DNS-vírusok (DNS/1) A szimpla szálú DNS-vírusok replikációja és transzkripciója a sejtmagban történik. A replikáció alapfeltétele, hogy a vírus dupla szálú DNS-sé (a replikációhoz szükséges templáttá) alakítsa át genomját. A Parvoviridae család vírusai ezt a feladatot kétféle módon oldják meg. Egyrészt a sejtmagba bejutott + és - irányítottságú szimpla nukleinsavszálak, ha elég közel kerülnek egymáshoz, spontán összeépüléssel létrehozzák a DNS/2-genomot (dependovirus, densovirus). Másrészt a negatív irányítottságú DNS- szálaknak (parvovirus) lehetőségük adódik a komplementációra az ún. kifoltozódásra. Erre az önmagába visszaforduló szimpla szál struktúrája ad lehetőséget. (A genom két vége visszahajlik, így valójában csak egy viszonylag kis szakasz marad egyszálú formában.) A kifoltozódás során erre az egyszálú szakaszra egy komplementer pozitív szál szintetizálódik, és kialakul a replikáció templátját adó dupla szálú vírusgenom. Ezt a folyamatot a sejt enzimei (DNS-DNS polimeráz) végzik el, mivel a parvovirusok, nem kódolnak virális replikáz és transzkriptáz enzimet. Ez az oka annak, hogy replikációjukhoz különösen igénylik az osztódó sejteket, melyek S fázisában nagymértékben felszaporodnak a replikációt és a transzkripciót irányító enzimek (83. ábra). 83. ábra - Szimpla szálú DNS-vírusok (DNS/1) makromolekuláinak szintézise (parvovirus) A parvovirusok egy csoportja (dependovirusok) a herpesz- és adenovirusok polimeráz enzimeit használja fel. Ezek a vírusok hiába alakították ki spontán összeépüléssel a kettős DNS-szálat, szaporodni csak akkor képesek, ha a sejtben egyidejűleg herpes- vagy adenovirus is jelen van. 181

202 Virológia A hepadnavirusok cirkuláris genomjának kb. 50%-a egyszálú DNS. A hepadnavirusok genomjának kifoltozását és cirkuláris formába történő alakítását, a vírus által kódolt és készen szállított DNS-polimeráz enzim végzi (Hepatitis-B vírus) a sejt magjában. A replikációt és a transzkripciót is virális enzimek irányítják. A cirkuláris formába átalakított hepadnavirus genom pozitív száláról egy genom hosszúságú ún. hosszú transzkript (+RNS) és több un. rövid transzkript szintetizálódik. A rövid transzkriptek egy részéről korai fehérjék (enzimek), más részéről késői fehérjék (struktúrproteinek) szintetizálódnak. A hosszú transzkript becsomagolódik az időközben elkészült struktúrproteinekből összeépülő még éretlen (immature) nukleokapszidba és elhagyja a sejtmagot. Amikor a +RNS-t tartalmazó nukleokapszid a cytoplasmába ér, a vírus által előállított reverz transzkriptáz enzimek erre a genom hosszúságú transzkriptre (+RNS-re), egy DNS-szálat szintetizálnak, majd ezután a DNS szál egy részére komplementer +DNS szálat építenek, így kialakul a csak részlegesen dupla szálú vírusgenom. Ezt követően befejeződik a nukleokapszid összeépülése is. A szimpla szálú DNS-vírusok transzkripciós és transzlációs mechanizmusa megegyezik a sejtmagban replikálódó DNS/2-vírusoknál leírtakkal Pozitív szimpla szálú RNS-vírusok (+RNS). A pozitív RNS-vírusok genomját a sejt riboszómája mrns-nek fogadja el, ezért a genomról a dekapszidáció után megindulhat a korai fehérjék transzlációja, melynek eredményeként virális replikáz és transzkriptáz enzimek termelődnek. A replikáció két lépésben zajlik. Először a pozitív RNS-szálra a replikáz enzim (+)RNS/( )RNS polimeráz szintetizál egy komplementer negatív RNS-szálat és kialakul a replikációhoz szükséges kettős szálú intermedier templát (+)RNS/( )RNS). Ennek negatív száláról ugyanez a replikáz enzim, mint ( )RNS/(+)RNS polimeráz most már pozitív RNS szálakat szintetizál (84. ábra). A picornavirusok és flavivirusok esetében ezeknek a pozitív nukleinsav- szálaknak az egyik része az utódvirionok genomját alkotja, másik része policisztronos mrns-ként a riboszómákhoz vándorol. A transzláció során keletkező policisztronos fehérjét a proteolytikus enzimek kész struktúrfehérjékre vágják. 84. ábra - Pozitív szálú RNS-vírusok (+/RNS) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben) Számos növényi és egyes állati vírusok pl. a toga- és coronavirusok, struktúrfehérjéik szintéziséhez, szakaszos transzkripcióval állítanak elő mrns-eket Negatív szimpla szálú RNS-vírusok ( RNS). A negatív irányítottságú vírus-rns-genomot, a riboszóma nem fogadja el, így a vírusnak első lépésben mrnsre kell szert tenni, hogy mind a transzkripcióra, mind a replikációra nyitott legyen. A negatív szálú RNS-vírusok ezért nemcsak kódolva, de a nukleokapszidba becsomagolva, készen is magukkal viszik a virális transzkriptáz enzimüket, amelyik a negatív szálú genomról mrns-t másol. 182

203 Virológia A paramyxovirusok, és a rhabdovirusok genomjáról a transzkriptáz enzim két különböző úton, replikációs módban és transzkripciós módban másol mrns-eket és replikációs RNS-t is. A két folyamat egy időben zajlik (85. ábra). 85. ábra - Negatív szálú RNS-vírusok (-RNS) makromolekuláinak szintézise(magyarázat a szövegben) Replikációs módban, a szülő genom teljes hosszára egy pozitív szál másolódik ( )RNS/(+)RNS polimeráz és kialakul egy kettős szálú intermedier, amelynek pozitív száláról másolódnak az utódvirionok negatív RNSgenomjai, a (+)RNS/( )RNS polimeráz enzim segítségével. Transzkripciós módban a ( )RNS/(+)RNS polimeráz lemásolja a strukturfehérjéket és a kész transzkriptáz enzimet kódoló monocisztronos mrns szakaszokat. Dupla szálú RNS-vírusok (RNS/2) A Reoviridae és Birnaviridae családok vírusai az egyetlenek a ma ismert élővilágban, amelyek genetikai információjukat dupla szálú RNS-ben tárolják. A dupla szálú RNS-vírusok genomja szegmentált, és mivel minden szegment egy-egy fehérjét kódol, a transzkripció során monocisztronos mrns-ek szintetizálódnak. A makromolekulák szintézise az egyes genomszakaszok transzkripciójával indul, amit vírus által készen szállított transzkriptáz enzimek végeznek. A transzkripció során keletkező korai mrns-ek már akkor elhagyják a szülő viriont, amikor annak nukleokapszidját még csak részlegesen emésztették meg a sejt proteolytikus enzimei. (A részlegesen emésztett nukleokapszidot elhagyó mrns-ek elektronmikroszkópos felvételeken százlábú pók -hoz hasonló struktúrát kölcsönöznek a virionnak.) A szülői pozitív nukleinsav szál templátként szolgál azoknak a negatív szálaknak a szintéziséhez, amelyek az utódvirionok kettős genomját alkotják. Az utódvirionok kapszidjába beépülő genomszegmenteket a vírus által szintetizált fehérjék láncba kapcsolják, és ezt követően a korai transzkripcióhoz szükséges transzkriptáz enzimmel együtt becsomagolódnak a kapszidba (86. ábra). 86. ábra - Dupla szálú RNS-vírusok (RNS/2) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben) 183

204 Virológia Pozitív szálú RNS-t DNS-re átíró vírusok (+RNS/DNS2) A Retroviridae családba tartozó vírusok a makromolekulák szintézisét megindító korai transzkripció előtt egy speciális, ún. reverz transzkripciót hajtanak végre, amelynek révén (+)RNS-genomjukat DNS/2-genommá alakítják. A reverz transzkripciót a virionba készen becsomagolt reverz transzkriptáz (visszafelé író transzkriptáz) enzim végzi el, három lépésben. Az első lépésben az RNS-dependens DNS-polimerázként működő reverz transzkriptáz enzim szimpla szálú komplementer DNS-szálat szintetizál a vírus RNS-re. A szintézis megindításához trns-t használ primerként. A második lépésben a vírus által készen szállított ribonukleáz-h enzim leemészti az RNS-t a cdns-ről és ( repair ) javítóenzim-ként működve kijavítja az új DNS szál hibáit. A harmadik lépésben a DNS-dependens DNS-polimerázként funkcionáló reverz transzkriptáz enzim erre a DNS-szálra komplementer DNS-t szintetizál. Ily módon kialakul egy dupla szálú, lineáris vírus -genom, ennek mindkét végére egy-egy ún. hosszú terminális ismétlődő szakasz (long terminal repeat, LTR) kerül. A DNS/2- vírus genom ezután bejut a gazdasejt magjába, ahol cirkuláris formát vesz fel, és lehetősége adódik a sejt kromoszómájába történő integrációra. Az integrálódott vírusgenomot provírusnak nevezzük. A provírus komplett és önálló transzkripciós egység, mivel az LTR régió tartalmaz egy promoter szakaszt (ami a transzkripció közvetlen megindításához szükséges) és egy szabályozó (enchancer) szakaszt (ami a transzkripció megerősítéséhez nélkülözhetetlen). Az integrálódott vírusgenom provírusként, most már a sejt kromoszómájának szerves részévé válik, és róla a sejt transzkripciós enzimjei (DNS-dependens RNS- polimeráz) fognak vírus-mrns-t szintetizálni úgy, mintha saját mrns-t állítanának elő. Az így szintetizálódott vírus-mrns-k akár 1%-át is kitehetik a sejt mrns készletének. Mivel a retrovirusok nem kódolnak RNS-dependens RNS-polimeráz enzimet, a transzkripciót és a replikációt a gazdasejt RNS/RNS- polimeráz enzime végzi el, egyazon lépésben. A transzkripció során genom hosszúságú és annál rövidebb transzkriptek képződnek. A genom hosszúságú transzkriptek vírusnukleinsavként funkcionálnak, ezért kizárólag ezek csomagolódnak be a készülő nukleokapszidba. A rövidebb transzkriptek egy poliproteint szintetizálnak a riboszómákon, és ezek vágásával alakulnak majd ki a struktúrproteinek és a reverz transzkiptázvalamint a ribonukleáz-h enzimek. Ezeket az enzimeket az újonnan szintetizálódó vírusok a vírusgenomhoz kapcsoltan magukkal viszik. A retrovirusok két példányban csomagolják be nukleinsavukat (diploidok) (87. ábra). 87. ábra - Pozitív szálú RNS-t DNS-re átíró vírusok (+/RNS/DNS/2) makromolekuláinak szintézise (magyarázat a szövegben) 184

205 Virológia A transzláció során szintetizálódnak azok a fehérjék is, amelyek a v-onc. génnel rendelkező retrovirusok esetében kialakítják a sejt daganatos transzformációját (lásd. onkogenitás fejezet). A retrovirusok multiplikációs stratégiáját látva érthetővé válik, hogy ezek a vírusok miért nem használják ki a +RNS genom adta lehetőséget (mrns-ként működik). A reverz transzkriptáz enzim ugyanis lehetővé teszi számukra a gazdasejt kromoszómájába történő integrálódást. Az integráció mint a latens fertőzés egyik formája, egyrészt rendkívül gazdaságos (hosszan tartó) túlélési lehetőséget biztosít a vírusnak, másrészt ily módon elkerülheti a cytoplasmában zajló replikáció és transzkripció veszélyeit. A molekuláris biológiát forradalmasító és a centrális dogmán rést ütő reverz transzkriptáz enzim 1970-ben történő felfedezéséért H. Temin és D. Baltimore 1975-ben kapott orvosi Nobel díjat Virionok összeépülése A nukleokapszid összeépülése (a retrovirusok) a genom-replikáció helyén történik. A DNS-vírusok nukleokapszidja a sejtmagban, az összes RNS-vírus és a két cytoplasmában szaporodó DNS-vírus (pox, afrikai sertéspestis vírusa) nukleokapszidja a cytoplasmában épül össze. A replikáció és az összeépülés helyének közelsége révén a vírus így próbálja minél gyorsabban védelem alá helyezni az utódvirionok nukleinsavát. A nukleokapszid és a virusgenom egymásra találását a vírus által kódolt ún. nukleinsavszignál teszi lehetővé. Ez a jelző rendszer még akkor is kitűnően működik, ha a replikáció és a nukleokapszid-előállítás helye meglehetősen távol van egymástól (pl. több DNS-vírus nukleokapszidja a cytoplasmából jut be a sejtmagba, ahol a virusgenom replikációja zajlik (herpesz-, adeno-, parvo-, papillomavirusok). A nukleokapszid összeépülése stratégiai fontosságú a vírus számára. A komplett (fertőzőképes) és az inkomplett (nem fertőzőképes) utódvirionok aránya ugyanis attól függ, hogy az összeépülés ideje alatt mennyi kész nukleinsav és nukleokapszid állt rendelkezésre. Ha kevés a nukleinsav, az elkészült nukleokapszidokba nem kerül vírusgenom, ezért inkomplett virionként hagyják el a sejtet. Ha kevés a nukleokapszid, az elkészült utódvírus-genomok nem találnak menedéket a nukleáz enzimek elől, és ezért megemésztődnek. Mindkét esemény zsákutca a vírus számára, amit a transzkripciós, transzlációs és replikációs folyamatok időbeli és koncentrációfüggő koordinálásával igyekszik elkerülni. Ennek a szabályozásnak a nehézségét jelzi, hogy egy átlagos vírusszaporodás során az inkomplett utódvirionok aránya megközelíti a 60 70%-ot. A nukleokapszid-összeépülés megtörténhet úgy, hogy a kapszomerekből összeépülő üres nukleokapszidba (prokapszid) becsúszik a vírusgenom (A), illetve úgy, hogy a nukleokapszid fehérje egységei körbeépítik a vírusgenomot (B). Mindkét folyamatot a specifikus felépítő (scaffolding) fehérjék irányítják (88. ábra). 88. ábra - Vírusok nukleokapszidjainak összeépülése (magyarázat a szövegben) 185

206 Virológia Egyes vírusok a replikációs stratégiájukhoz nemcsak genetikailag kódolt, de működőképes kész enzimeket (transzkriptázokat) is kénytelenek biztosítani. Ezek az enzimek is az összeépülés során kerülnek be az utódvirionokba. Burkos vírusok utódvirionjainak a nukleokapszidjai a sejtmembránokon történő áthaladás során tesznek szert burokra. A vírusburok és a nukleokapszid összeépülése azokon a sejtmembránrészeken zajlik, amelyekbe már előzetesen a transzlációt követően beépültek a víruseredetű burokfehérjék (glükoproteinek) és amelyek belső felszínén már koncentrálódtak a mátrixproteinek is. A mátrixproteinek megerősítik a kapcsolatot a nukleokapszid és a burok között. A herpesvirusok még egy ún. belső burkot is felvesznek a maghártyán való áthaladás során; nagy mannóztartalma elengedhetetlen a membránfehérjék glükolizációjához. Ez a belső burok egyben egyedülálló védelmet is nyújt a nukleokapszidnak a cytoplasma proteolytikus enzimeivel szemben, a vírus kiszabadulásáig. A coronavirusok és a bunyavirusok burkaikat az endoplasmatikus retikulumhálózat és a Golgi-apparátus membránjaiból nyerik Virionok kiszabadulása a sejtből Bizonyos esetekben az utódvirionok nem hagyják el a sejtet, hanem a sejttel együtt élnek, és csak a sejt halálakor vagy membránjának drasztikus sérülése esetén jutnak az extracelluláris térbe. Ezeket a vírusokat sejthez kötött, (cell-assosiated) vírusoknak nevezzük (pl. Gammaherpesvirinae). Az utódvirionok a sejtet vagy aktív folyamattal, exocytosissal, bimbózással(budding), vagy a sejt lízisét követően passzív úton hagyják el. A legtöbb nem burkos vírus aggregálódik az összeépülés helyén a cytoplasmában vagy a sejtmagban, és rendszerint egyszerre hagyják el a sejtet, amikor a sikeres vírusszaporodás következményeként kialakul a sejt lízise (pl. picornavirus) vagy a lassú degenerálódást követően a sejt halála (pl. parvovirus), illetve az apoptózisnak nevezett, programozott sejthalál (pl. adenovirus). A burkos vírusok többsége bimbózással (budding) hagyja el a sejtet, az összeépülést követően. A bimbózás a sejtmembránnak mindig azokon a helyein következik be, amelyekbe már beépültek a vírus felszíni glükoproteinjei. Ezért a bimbózás már az összeépüléssel kezdetét veszi. Ez azért is fontos, mivel a fertőzött sejt 186

207 Virológia membránja most már kitűnő célpont a szervezet immunsejtjei számára, a membránba integrálódott vírusfehérjéknek (antigéneknek) köszönhetően (89. ábra). 89. ábra - Vírusok kiszabadulása az eukaryota sejtből bimbózással (budding) A bimbózás során az utódvirionok folyamatosan hagyják el a sejtet, és az ebből eredő membránkárosító hatás lényegesen eltér az egyes víruscsoportok között. Amíg a tógavirusok, paramyxovirusok és rhabdovirusok bimbózása gyors, fatális cytolysist eredményez, addig az arenavirusok és a retrovirusok kiszabadulása csak csekély mértékű, gyakran észrevehetetlen membránkárosodással jár. Az alphaherpesvirusok és a paramyxovirusok membránkárosító hatásának eredményeként a szomszédos sejtekben membránfúzió, syncytium is kialakul. A syncytium membránalagútjaiban a vírus biztonságos lehetőséget kap a szomszédos sejtek közötti extracelluláris terjedésre anélkül, hogy az ellenanyagokkal találkozna a szervezetben. A herpesvirusok esetében bizonyították, hogy különböző vírusfehérjék felelősek az intercelluláris, illetve az extracelluláris kiszabadulásért A kiszabadulás alternatív formái Herpesvirusok szaporodása során előállhat olyan eset, amikor az utódvirionok phagocytosisa során a fertőzött sejt lizoszómái szétrobbantják magukat. Ezeknek az öngyilkos lizoszómáknak az emésztő enzimei most már a sejt lízisét is meggyorsítják. A T-bakteriofágok egyik késői gén terméke, a lizozim enzim. Amikor az első fágok összeépülése megkezdődik, ezek a lizozim enzimek elkezdik emészteni a baktérium sejtfalát és a fágok nagy része az így kialakult sejtfalhiányokon keresztül hagyja el a baktériumot, mielőtt a lízis bekövetkezne. Mivel in situ körülmények között, a növényi sejtben nem alakul ki lízis a vírusfertőzés hatására, a növényi vírusok az intercelluláris sejtfalkapcsolatokon keresztül terjednek sejtről sejtre. Ezzel magyarázható több növényi vírus mozaikszerű levélkárosítása, pl. a dohány-mozaikvirus által okozott elváltozás is A vírus és környezetének kölcsönhatásai A vegetatív vírus számára a környezet az a sejt, amelyben szaporodik. A sejtet elhagyó virion környezetén azt a miliőt értjük, amely közvetlen hatással van a vírus létfeltételeire (a vírussal kapcsolatba kerülő másik vírus is környezeti tényezőnek tekinthető). Éppen ezért egy adott vírus életfeltételeit vizsgáló in vitro kísérletek eredményeit legtöbbször csak tájékozódó jellegűnek lehet tekinteni az in vivo-in situ körülményekre vonatkoztatva. 187

208 Virológia A vírust más élőlényekhez hasonlóan a környezet részéről állandó evolúciós kényszerhatás éri, ezért folyamatosan küzdenie kell a fennmaradásáért. Ez a küzdelem egyaránt zajlik térben és időben is. A térben zajló küzdelem célja a multiplikáció lehetőségének megteremtése egy vagy több faj sejtjeiben. Az időben zajló küzdelem célja a már megszerzett optimális életfeltételek megtartása, lehetőleg minél több ideig. A sikeres küzdelem valójában alkalmazkodást jelent a változó környezetei feltételekhez. Ennek a sikernek többnyire az a záloga, hogy változás áll be a vírus genotípusában és/vagy fenotípusában. Az alkalmazkodás tehát változás. Ebben a helyzetben függőségi viszonyok alakulnak ki a vírus és környezete között (13. és 14. táblázat). 13. táblázat - A vírus és környezetének függőségi viszonyai Függőségi viszonyok A VÍRUS a nukleinsav replikáció biokémiai következményei B VÍRUS VÍRUS más vírussal kerül kapcsolatba C VÍRUS SEJT a sejttel kerül kapcsolatba D VÍRUS SZERVEZET a szervezettel és az immunrendszerrel kialakuló kölcsönhatás Függőségi viszonyok típusai A ) mutáció B) rekombináció komplementáció fenotípusos keveredés interferencia exaltáció C) interferon latens fertőzés perzisztens fertőzés onkogenitás CPE (lyzis) D) akut fertőzés perszisztens fertőzés 14. táblázat - A vírusok geno- és fenotípusában bekövetkező változások GENOM öröklődő (ismétlődő esemény) FENOTÍPUS nem öröklődő (egyszeri esemény) mutáció 1 genom rekombináció 2 genom komplementáci ó (enzim) fenotípusos keveredés (fehérje) vírus/virus (génátrendeződés) (szegmentátrendeződés ) vírus/sejt (integráció) interferencia (enzim/fehérje) Ezeknek a változásoknak az eredménye lehet előnyös, hátrányos vagy semleges mind a vírusra, mind a környezetre nézve. A vírusnak, mint parazitának, evolúciós szempontból az a leghasznosabb, ha a változás 188

209 Virológia számára előnyt, a környezet számára pedig legalább semleges hatást biztosít. Ez az ideális állapot azonban rendkívül ritkán következik be (pl. latens fertőződés alatt). A természetben a vírus és környezetének kölcsönhatását a folyamatos küzdelem jellemzi (ugyanis a környezetet ért hátrányos hatás újabb változtatásra kényszeríti a környezetet, ami ismételt kihívást jelent a vírusnak.) Mutáció A vírus genetikai anyagában bekövetkező nukleotid változást mutációnak nevezzük. A természetben a mutáció állandóan zajló folyamat, melynek létrejöttét vagy a fenotípus változásain, vagy a genom analízise során észlelhetjük. A víruspopulációkban az egyedeket érő mutációk sokasága biztosítja azt a variabilitást, ami kulcsfontosságú a populáció fennmaradásához. A mutáció lehetőséget teremt a vírusnak, hogy genotípusát és/vagy fenotípusát alkalmassá tegye új, előnyös környezeti kapcsolatokra, mint pl. a rekombináció, komplementáció, interferencia, de ugyanakkor nagy veszélyt is jelenthet, mivel elveszítheti az addig megszerzett evolúciós előnyét, ami pl. a letális vagy feltételesen letális mutációk során bekövetkezik. A multiplikáció során egy szülő vírus több millió utódviriont hoz létre, többnyire rövidebb idő alatt, mint ami alatt a szaporodását biztosító sejt egyszer osztódna. A sejtgenomhoz viszonyítva ebben a nagy egyedszámú utódpopulációban a mutációk előfordulásának aránya nagyságrendekkel magasabb lesz, mivel a rendkívüli intenzitásra kényszerített víruspolimeráz enzim tévedési aránya is megnő. Pontmutációk. A tévedés (átírási hiba) valójában hibás nukleotid beépítését jelenti, ami a pontmutációk leggyakoribb kialakulási módját okozza (15. táblázat). 15. táblázat - A vírusokban bekövetkező mutációk típusai és eredményei Mutáció típusa Folyamat a genomban Eredmény a fenotípusban Pontmutáció 1 nukleotidváltozás változó Sorozatos pontmutáció több nukleotidváltozás többnyire inaktív fehérje (L) Szakasz kiesése (deléció) nukleotidok esnek ki fehérje nem alakul ki (L) Szakasz betoldása (inzerció) Visszamutáció Frameshift mutáció Szupresszor-mutáció nukleotid épülhet be 1 mutáns nukleotidot újabb mutáció éri eltolódás a transzláció leolvasó fázisában génszabályozás felbomlik fehérje nem alakul ki (L) nem észlelhető fehérje inaktív (L) új variáns keletkezik (pl. RSV) változó (L) Misszensz-mutáció kódon változik változó (más aminosav keletkezik) Nonszensz-mutáció kódon értelmetlen fehérje nem alakul ki, inaktív Néma mutáció 1 nukleotidváltozás nem észlelhető Feltételesen letális kódon megváltozik a fehérje csak bizonyos környezeti 189

210 Virológia mutáció feltételek között aktív Letális mutáció kodon megváltozik a fehérje vagy nem alakul ki. L= letális hatás vagy inaktív (L) A sejt DNS-ének másolását végző polimeráz enzimek tévedéseire visszavezethető mutációk nagy részét a sejtmagban található ún. javítóenzimek (pl. ligáz) korrigálják, a megfelelő nukleotidok kicserélésével. Ezt a javítómechanizmust (proofreading) azok a vírusok is igénybe veszik, amelyek a sejtmagban végzik replikációjukat (DNS/2-, DNS/1-vírusok, a pox- és az afrikai sertéspestis vírusa kivételével). A replikáció hiánya miatt a cytoplasmában nincs javítómechanizmus, ezért az itt szaporodó vírusok nem tudják korrigáltatni a nukleinsav- polimerizáció során kialakult átírási hibákat (pontmutációkat). Ezzel magyarázható, hogy a mutációk előfordulásának gyakoriságát kifejező mutációs ráta (átírási hiba/beépült nukleotid) a sejtben a legalacsonyabb ( ), ennél magasabb a magban szaporodó DNS-vírusokban (10-5 ) és legmagasabb a cytoplasmában szaporodó RNS-vírusokban ( ). Az RNS-vírusok esetében ez azt jelenti, hogy minden ezredik nukleotidbeépítésnél hiba történt (ami pl. a 11 kb. genommal rendelkező vesiculovirusok esetében azt eredményezi, hogy az utódvirionok között nem lesz két egyforma!). A javító (proofreading) mechanizmuson kívül az ún. visszamutáció (back mutation) is segít az átírási hibák korrigálásában. Visszamutáció akkor fordul elő, ha az átírási hibát egy újabb mutáció éri, és szerencsés esetben ez az eredeti aminosav sorrend helyreállítását jelentheti. Indukált mutációk. A környezeti hatásokra kialakuló mutációt indukált mutációnak nevezzük. Indukált mutáció létrehozható kémiai mutagénekkel, sugárzással, hőmérséklet-, ph-, ozmolaritásváltoztatással. Az indukált mutációk esetében a mutációs ráta elérheti a értéket is (vagyis minden századik nukleotid beépítés hibás). Deléciók és inzerciók. A vírus genomjában bekövetkezett mutáció érinthet egy nukleotidot (pontmutáció) vagy több nukleotidot is (sorozatos pontmutáció), valamint kiterjedhet kisebb-nagyobb összefüggő szakaszra is. A szakaszkieséssel járó mutációt deléciónak, a szakaszbetoldással járót inzerciónak nevezzük. Ha a deléció a virulenciagéneket érinti, ún. deléciós vakcinatörzsekhez juthatunk, és éppen a delécióból adódóan nyílik lehetőség olyan diagnosztikai módszer kifejlesztésére, amelyik különbséget tud tenni a vakcinatörzs és a vad vírusok között. Ma már több vírus okozta betegség elleni mentesítési programban használnak ilyen deléciós vakcinákat (Aujeszky-betegség, IBR, klasszikus sertéspestis). A deléciók és az inzerciók a vírusgenomban eltolják a transzláció normális leolvasó fázisát, és ez gyakran működésképtelen fehérjék keletkezését eredményezi (frameshift mutációk). A replikációs enzimeket érintő deléció vagy inzerció többnyire letális mutációhoz vezet. A delécióval elvesztett tulajdonság a mutáció javítómechanizmusaival nem állítható vissza (erre legfeljebb a rekombináció adhat lehetőséget). Az inzerció mindig valamilyen génszakasznak a kárára történhet, ami legtöbb esetben vagy a replikációs, vagy az adszorpciós képesség megszűnéséhez vezet (pl. sarcomát okozó vírusokban az onc gén a polimeráz enzim helyére épült be, ezért ezek a vírusok legtöbbször önállóan nem képesek szaporodni). A mutáció élettani hatása (eredménye a fenotípusra) alapvetően attól függ, hogy a genom melyik génszakaszára lokalizálódott, de kifejeződését egyes esetekben meghatározhatja a genom többi génjének aktivitása is (szuppresszor mutáció). A fenotípusban a mutáció vagy észlelhető élettani változást okoz, vagy eredményének nem lesz kimutatható élettani hatása (néma mutáció). Az észlelhető elváltozás típusa alapján megkülönböztetünk misszensz (eltévesztett) és nonszensz (értelmetlen) mutációt. A missszensz mutáció egy bizonyos aminosavat meghatározó kodont egy másik aminosavnak megfelelő kodonra változtat át. Nonszensz mutáció során egy kodon úgy alakul át, hogy többé egyetlen aminosavat sem kódol. Az esetek többségében ez azt jelenti, hogy az aminosavkodon stop kodonra változik. Ha ez a stop kodon létfontosságú fehérje kialakulását hiúsítja meg, a mutáció letálissá válik. 190

211 Virológia Az észlelhető mutáció eredményét vagy a vírus élettani tulajdonságainak változásain keresztül és/vagy a vírusfehérjék analízise (pl. elektroforézis) során figyelhetjük meg. Néma mutáció akkor fordulhat elő, ha a megváltozott triplet a genetikai kód degeneráltsága miatt nem hoz létre más aminosavat, vagy ha a mutáció nem lényeges aminosav kodonját érintette. A néma mutációk szekvenciaanalízissel felismerhetők és azonosíthatók. A vírus legfontosabb élettani tulajdonsága a multiplikáció. Ha a multiplikációért felelős génekben kialakuló mutáció miatt a vírus szaporodása csak bizonyos környezeti feltételek között valósulhat meg, feltételesen letális mutációról beszélünk. Ezek közül legrészletesebben a hőérzékeny mutációkattanulmányozták. Hőérzékeny mutáns (Ts, temperature sensitive) vírustörzsek esetében, a replikáció csak egy meghatározott hőmérsékleten mehet végbe, mivel a mutáció következtében más hőmérsékleten a polimeráz enzim működése gátolt. Hideg mutánsok esetében (pl. Vnukovo 32 veszettség elleni vakcinatörzs) a vírus-polimeráz enzim a testhőmérsékletnél alacsonyabb hőfokon (32 C) aktív, ezért a szervezetben szaporodása gátolt. Letális mutáció során a vírus szaporodása teljes mértékben blokkolt, ezérta letális mutánsok izolálása nehézségbe ütközik. A replikációs enzimek és/vagy az adszorpciós fehérjék inaktiválását okozó mutációk mindig letálisak. A mutáció következtében kialakuló további észlelhető fenotípus- (tulajdonság-)változások közül a legfontosabbak: Plakkmutánsok (pl. az Aujeszky-betegség vírusának virulens törzsei nagy plakkot, a K 61 vakcinatörzs ugyanakkor kicsi plakkot képez). Gazdafajmutánsok (pl. macska parvovirusa mutáció révén adaptálódott a kutyához és a nyérchez), Attenuált mutánsok (a virulens törzsekkel ellentétben, a szervezetben elszaporodva nem okoznak jelentős klinikai tünetekben megnyilvánuló megbetegedést). A szervezetben szaporodó vírust és utódait az immunrendszer és a szöveti struktúra részéről olyan szelekciós nyomás éri, hogy még az életképes virionok sem jutnak el minden esetben a szaporodásukhoz nélkülözhetetlen célsejtekhez. Mivel laboratóriumi körülmények között ezek a szelektív hatások a kémcsőben nem érvényesülnek, a sejtkultúrákban szaporított vírusok közül a kevésbé életképes mutánsoknak is van esélyük a túlélésre. A sorozatos passzálások során ezért csökkenhet a vad vírustörzsek virulenciája vagy a szaporodóképessége. Ez a hatás tovább fokozható, ha a vírust idegen sejtben próbálják szaporítani (pl. lapinizálás, avinizálás). Ezeket a jelenségeket használják fel attenuált vakcinatörzsek előállítására is Vírus vírus kapcsolatok A továbbiakban részletezésre kerülő vírus vírus kapcsolatok közös jellemzője, hogy kialakulásukhoz mindig szükség van egy sejtre is, ugyanis ezek a kapcsolatok kizárólag a vírusszaporodás valamelyik fázisában jönnek létre. Még abban a ritka esetben is, amikor csak egy vírus fertőz egy sejtet, a számos utódvirion óhatatlanul kapcsolatba kerül egymással. Ezért a vírus vírus kapcsolatok döntően a rokonvírusok között fordulnak elő, bár elvétve nem rokon vírusok között is kialakulhat kapcsolat (pl. adenovirus és dependovirus között). A vírus vírus kapcsolat a genom (rekombináció) és a fehérjék szintjén (komplementáció, fenotípusos keveredés, exaltáció, interferencia) jöhet létre (14. táblázat) Vírus vírus kapcsolat a genom szintjén Rekombináció Amikor két vírus szimultán fertőz egy sejtet, a szintetizálódó utódvirionok nukleinsav szálai között, különböző genetikai rekombinációra nyílik lehetőség, úgymint: génátrendeződés, újrarendeződés, reaktiváció. A vírusnukleinsav és a sejtgenom közötti rekombinációk eredménye az integráció és a pseudovirus. A rekombináció létrejöttének alapvető feltételei: egy sejtben legalább két vírusgenom (vagy 1 vírus- és 1 sejtgenom) legyen jelen egymáshoz közel, 191

212 Virológia legalább nukleotidhomológia legyen a nukleinsavakban, szegmentált genommal rendelkező vírusoknál a cserélődő nukleinsav-szegmentek azonosak legyenek. Génátrendeződés (intramolekuláris rekombináció). Elsősorban rokon vírusok között létrejövő genetikai kapcsolat, melynek során a genomok akár 50 60%-a is kicserélődhet (herpesvirus). A génátrendeződés oka, hogy az egymáshoz közel kerülő két vírusgenom replikációja során a vírusreplikáz enzimek szálat tévesztenek, és átugranak a szomszédos nukleinsavszálra, ahol mit sem sejtve tovább folytatják az átírást. A folyamat eredményeként olyan utódvirionok jönnek létre, amelyek genetikai anyaga vegyesen tartalmazza a két szülői genom információját. Az esetek döntő többségében ez nem vezet új tulajdonságok megjelenéséhez, mivel a rekombinációban részt vevő genomok között is nagy volt az azonosság (ez tette lehetővé a száltévesztést) (90. ábra). 90. ábra - A rekombináció típusai (magyarázat a szövegben) A génátrendeződés elsősorban DNS-vírusok között fordul elő, de kivételesen megfigyelték egyes RNSvírusoknál is (ragadós száj- és körömfájás vírusa, poliovírusok). Nem rokon vírusok között a nukleotidhomológia hiánya miatt nincs lehetőség a génátrendeződésre. Ez alól kivételt képez, az adeno- és papovavirusok (SV-40) között megfigyelt génátrendeződés. Újrarendeződés (szegmentátrendeződés, reassortment). Az újrarendeződés nagy gyakorisággal fordul elő olyan rokon RNS-vírusok között, amelyek genomja szegmentált. Szegmentált genommal a következő szimpla és dupla szálú RNS-vírusok rendelkeznek: birna-, arenavirusok (2 szegment), bunyavirusok (3 szegment), orthomyxovirusok (8 szegment), reovirusok (10 12 szegment). A rekombinációhoz szükséges nukleinsavhomológia biztosítása érdekében csak azonos szegmentek cserélődhetnek ki. Mivel egy szegment többnyire egy gént kódol, ez a rekombináció igen jelentős változást okozhat a szegmentált vírusoknál, különösen az influenzás megbetegedésekért felelős orthomyxovirusoknál (90. ábra). Az orthomyxovírusok virulenciájáért és fertőzőképességéért a vírus burkában található neuraminidáz (NE) és hemagglutinin (HA) fehérjék a felelősek, ezért minden olyan változás, ami az őket kódoló génszakaszokat érinti, rendkívül jelentős a vírus életében. Ezeket, a fenotípusban (HA, NE epitópok) is megjelenő változásokat két csoportra osztjuk. Antigénsodródás (drift) és antigéncsuszamlás (shift) (91. ábra). 91. ábra - Orthomyxovírusok rekombinációja (antigén csuszamlás) 192

213 Virológia Antigénsodródásról akkor beszélünk, ha az egymást követő vírusgenerációk HA és NE fehérjéket kódoló génszakaszában folyamatosan csak minimális változások keletkeznek, többnyire pontmutációk hatására. Ezzel a generációrólgenerációra bekövetkező, de kismértékű változással a vírustörzs (populáció) pillanatnyi előnyökhöz jut a környezettel (pl. az immunrendszerrel) szemben és ez biztosítja a törzs túlélését a természetben (szervezetben), nemegyszer az új törzs születéséig (az antigénsodródás pl. a lovak fertőző arteriitésének vírusainál olyan hatékony, hogy az egy sejtben keletkező utódvírusok minden egyes generációja más-más antigénszerkezettel rendelkezik, ezért az immunrendszernek nem jut elég idő semlegesítésükre). Antigéncsuszamlás akkor következik be, ha hirtelen, egy generációváltáson belül, olyan mértékű változás érte a genomot, ami teljesen új HA és/vagy NE kialakulásához vezet. Az antigéncsuszamlás legtöbbször szegmentújrarendeződés hatására alakul ki és olyan új törzsek (szubtípusok) születését is okozza, amelyek a kontinensekre kiterjedő humán influenzafertőzésekért (pándemiákért) felelősek (ilyen jelentős mértékű szegment-újrarendeződés átlag 10 évenként következik be). Feltételezhetően a szegment-átrendeződés okolható a háziállatok (lovak, sertések, madarak) között időnként fellépő pándémiás influenzamegbetegedésekért is (91. ábra). Az orthomyxovirusoknála szegment újrarendeződés, az emberi és állati vírustörzsek, valamint a különböző állatok (vadkacsa, sirály, fóka) vírustörzsei között is létrejöhet (ezért időnként a humán törzs lemegy egy állatba pl. sertésbe, kacsába, és annak az állatfajnak a saját orthomyxovirusával rekombinálódva új HA és NE antigénkészlettel visszatér) Reaktiváció (kifoltozódás) A reaktiváció az a rekombinációs folyamat, ami lehetőséget biztosít a vírusnak, hogy a korábbi mutációk vagy rekombinációk által sérült vagy evolúciós szempontból hátrányos genomszakaszát kifoltozza és az esetleges inaktív genomot újra (re!)aktiválja (90. ábra). A reaktivációnak két formája ismert: a keresztreaktiváció (marker rescue) és a többszörös reaktiváció. Keresztreaktivációról akkor beszélünk, ha a két rokon vírus között lezajló reaktiváció olyan, többnyire letális vagy feltételesen letális mutációt javít ki, amelyik az egyik vírus meghatározott genetikai szakaszában (pl. restrikciósenzim- fragmentumban) fordult elő. Mivel vírustörzsek azonosításában a restrikciós fragmensek többnyire marker értékű szakaszok, a folyamatot markerkifoltozódásnak (marker rescue) is nevezik. A keresztreaktivációt nem rokon vírusok között is megfigyelték. A keresztreaktiváció révén, az eredetileg sérült genomú szülői vírus is örökítheti genetikai információját. Ez a jelenség gyakran fordul elő a pox- és orthomyxovirus-fertőzések során (90. ábra). Többszörös keresztreaktiváció akkor fordul elő, ha két rokon vírustöbb, de nem azonos helyen sérült genomszakaszai kölcsönösen kicserélődnek (kifoltozódnak), és ennek eredményeként most már mindegyikük fertőző utódvírusokat hoz létre. Ez a vírus számára előnyös evolúciós lehetőség, ugyanakkor komoly veszélyt is rejt magában. Ha egy állatot rövid időn belül két különböző attenuált vakcinával oltunk, előfordulhat, hogy a más-más genetikai szakaszokon sérült (attenuálódott) vakcinatörzsek a keresztreaktiváció révén kifoltozódnak és virulens utódvirionokat hoznak létre, amelyek már súlyos, esetenként halálos kimenetelű megbetegedést 193

214 Virológia okozhatnak (ennek elkerülésére a rövid időn belüli ismételt oltásnál lehetőleg ugyanazt a vakcinatörzset használjuk) Vírus és sejt közötti rekombinációk A multiplikáció során a sejtmagba bejutó vírusnukleinsavnak lehetősége adódik, hogy rekombinációs kapcsolatba lépjen a sejt genomjával. Integrációnak nevezzük azt a folyamatot, amelynek eredményeként a vírus nukleinsava épül be a sejt genomjába. Az integrálódott vírust provírusnak nevezzük. A provírus nem azonos a szintén a sejt genomjában helyeződő endogén vírussal (az endogén vírusról nem képződnek virionok, míg a provírusról igen). Az integrációnak komoly szerepe van a latens fertőzések kialakításában (lásd. később). Pseudovírus keletkezik akkor, ha sejtgenomszakasz épül be a vírus nukleinsavába. Ez többnyire letális a vírusra nézve Vírus vírus kapcsolat a fehérje szintjén A következő vírus vírus kapcsolatok közös jellemzője, hogy a kapcsolat nem a gének, hanem a géntermékek (fehérjék) között jön létre, ezért a mutációval és a rekombinációval ellentétben ezek nem öröklődő, egyszeri események. A kapcsolatok egy része támogató jellegű, amikor a defektes vírus lehetőséget kap az életben maradásra (komplementáció, fenotípusos keveredés, pszeudotípus), más esetben viszont erőteljesen gátolt a kapcsolatban részt vevő valamelyik (többnyire a komplett) vírus szaporodása (interferencia) (14. ábra) Komplementáció A komplementáció során a kapcsolatban részt vevő defektív vírus a komplett vírus enzimeit használja fel szaporodásához. A komplementáció a defektív virionok túlélésének és fennmaradásának leggyakoribb eszköze. Komplementáció rokon vírusok között. A Ts-mutáns (hidegmutáns) vírustörzsek polimeráz enzimje a feltételesen letális mutáció következtében testhőmérsékleten nem tud aktiválódni, csak pl. 32 C-on. Ezért a Tsmutánsok testhőmérsékleten nem szaporodnak. Ha ez a Ts-mutáns a sejtben kapcsolatba kerül egy replikálódó komplett rokon vírussal, akkor annak polimeráz enzimét felhasználhatja saját replikációjához. Ily módon a komplementáció biztosítja a hőmutánsnak azt a lehetőséget, hogy testhőmérsékleten is létrehozza utódait. Komplementációval két rokon vírushőmutáns is létrehozhat komplett utódvirionokat, ha kölcsönösen használják egymás polimeráz enzimét. Erre azonban csak akkor van lehetőség, ha a két hőmutáns enzimei más-más helyen sérültek. Inaktivált virulens és élő avirulens rokon vírusok között is létrejöhet a komplementáció, ha egy időben vannak jelen a sejtben. Ennek feltétele, hogy az inaktiváció ne érintse a vírus adszorpciós fehérjéit, csak a multiplikációért felelős enzimeit (különben az inaktivált vírus nem tudna bejutni a sejtbe). Ebben az esetben a replikálódó élő avirulens vírus polimeráz enzimei, a genetikai rokonságnak köszönhetően, akadály nélkül szintetizálják az inaktivált vírus virulenciáért felelős fehérjéit is, aminek eredményeként a sejtben élő, virulens utódvirionok jönnek létre. Ezt a jelenséget a himlővirusok (poxvirusok) között figyelték meg, és ennek a felismerésnek köszönhető az a nemzetközileg elfogadott határozat, hogy virulens vírustörzsből nem szabad vakcinát készíteni. Komplementáció nem rokon vírusok között. A Parvoviridae családba tartozó dependovirusok az adeno- és herpesvirusok polimeráz enzimeit használják fel saját replikációjukhoz, mivel genomjuk olyan rövid, hogy nem jutott hely a saját replikáz enzim kódolásához. Ennek a komplementációs lehetőségnek viszont az az ára, hogy a dependovirusok kizárólag az adeno- és/vagy herpesvirusok jelenlétében képesek életben maradni. A dependovirusokat támogató herpesz- és adenovirusokat korábban helper (segítő) vírusoknak nevezték, és a dependo (függő) elnevezés is a komplementáció jelenségére utal Fenotípusos keveredés A fenotípusos keveredésről akkor beszélünk, ha az egy időben, egymás mellett replikálódó rokon vírusok olyan utódokat hoznak létre, amelyekben keverednek a szülők struktúrproteinjei, ugyanakkor genomjukban különkülön, tisztán megőrizték az egyes szülők genetikai információját (92. ábra). 92. ábra - Fenotípusos keveredés, transzkapszidáció (magyarázat a szövegben) 194

215 Virológia A fenotípusos keveredés abban különbözik a komplementációtól, hogy itt nem enzimet, hanem strukturális fehérjét vesz át az egyik vírus a másiktól. A fenotípusos keveredés különleges jelentőségét az adja, hogy nem rokon vírusok között is gyakran előfordul (habár ezekben az esetekben az evolúciós kapcsolat kimutatható). Az orthomyxovírussal és paramyxovirussal egy időben fertőződött sejtben olyan utódvirionok is keletkeznek, amelyek burkában keverten jelennek meg a két vírus burokfehérjéi. A Rous-szarkóma-vírus (RSV) multiplikációja során mindig egy madárleukózis-vírus (ALV) teljes burkát ölti magára, mivel saját burokfehérjéit nem tudja szintetizálni (a sarcoma kialakulását elősegítő sarc. gén ugyanis a burokfehérjéket kódoló génszakaszba épült be). A fenotípusos keveredésnek köszönhetően az RSV leukózisvirusként lép be a sejtbe, és sarcomavirusként hajtja végre annak malignus transzformációját. A fenotípusos keveredés olyan egyedi felszíni struktúrát is érinthet, mint az adenovirusok fiberjei vagy kapszidjai. Két különböző típusú adenovirussal történő fertőzéskor az utódvirionok egy részében kevert típusú fiberek vagy kapszidok alakulnak ki. A fenotípusos keveredés különleges formája a transzkapszidáció, amikor az utódvirion az egyik szülő vírus kapszidját és a másik szülő vírus genetikai állományát örökli. (Pl. poliovírus és coxsackievirus közös fertőzésekor kialakultak olyan utódvirionok, amelyek coxsackievirus kapszidot és poliovirus-genomot tartalmaztak. Hasonló jelenséget figyeltek meg humán adenovirus-fertőzés során is, amikor az egyes utódvirionok az adenovirus 2 szülői kapszidját és az adenovirus 7 szülői genetikai anyagát örökölték, 92. ábra) Pszeudotípus Pszeudotípus akkor alakul ki, ha kizárólag a burokfehérjék keverednek össze a burokban (pl. VSV+retrovirus) Interferencia Interferenciának azt a folyamatot nevezzük, amikor egy vírus adszorpcióját vagy replikációját egy másik vírus gátolja. Az interferencia három típusát ismerjük: adszorpciós interferencia,autointerferencia és heterológ interferencia. Az adszorpciós- és autointerferencia kizárólag a rokonvírusok, a heterológ interferencia a nem rokon vírusok közt jön létre Adszorpciós interferencia Adszorpciós interferencia akkor alakul ki, ha a sejtfelszínre először érkező vírus a receptormolekulák lekötésével megakadályozza a következő vírus (vírusok) adszorpcióját. Az először érkező vírust ezért interferáló vírusnak nevezzük. A jelenség kizárólag szoros rokonságban álló vírusok között fordul elő, mivel az antireceptormolekulák legkisebb különbsége esetén a másodszorra érkező vírusnak már lehetősége nyílna az adszorpcióra olyan receptormolekulákon, amit az első vírus nem tudott lefoglalni. A jelenséget leggyakrabban ugyanazon vírus defektív és komplett partikulái között figyelték meg, amikor a sejtfelszínhez először érkező defektív (vagy inaktivált) vírusok megakadályozták a sejt felülfertőződését a komplett (pathogen) virionokkal. Az adszorpciós interferencia ép, érintetlen adszorpciós fehérjéket igényel. Ezért egy inaktivált vírus kizárólag akkor képes interferenciára, ha az inaktiválás nem érintette az adszorpciós fehérjéket, csak a genomot (ezért 195

216 Virológia tudja az UV fénnyel inaktivált baromfipestis-vírus megakadályozni az élő baromfipestis-vírussal történő felülfertőzést). Az adszorpciós interferencia evolúciós szempontból mindenképpen hátrányos a vírusnak, mivel a defektív (inaktivált) partikulák nem tudnak multiplikálódni, ezért a fajfenntartás szempontjából zsákutcát jelentenek. A Rous-sarcoma-vírus (RSV) és a baromfileukózis-vírus (ALV) együttes fertőzésekor, ha az ALV előbb érkezik a sejtreceptorokhoz, az ALV-vel azonos burkot (antireceptor fehérjét) viselő RSV-nek nem lesz lehetősége az adszorpcióra, ami a pusztulását jelenti (itt kell drámai árat fizetnie az ALV-től komplementációval megszerzett burokfehérjékért). A fertőző betegségek elleni védekezésben az adszorpciós interferenciát a javunkra fordíthatjuk. Ha pl. attenuált vakcinával oltjuk az állatot, az attenuált vakcinavírus és utódvirionjai lefoglalják a szervezet fogékony sejtjein levő receptorokat, ezért a vakcinázás után érkező utcai vírus nem tudja létrehozni a fertőzést. Ez az interferencia még tovább fokozható, ha az attenuált vakcinavírust, a fertőzés bemeneti kapujában levő sejtekre juttatjuk. Egyes herpesz- és coronavirusok elleni intranasalis vakcinázással a vakcina hatékonysága számottevően megemelhető az intramuscularis oltáshoz viszonyítva (pl. Aujeszky-betegség, macskák fertőző peritonitise). Az interferencia addig érvényesül, ameddig az interferáló vakcinavírusok szaporodnak (adszorbeálódnak), és hatékonyságát az attenuált és utcai vírusok mindenkori mennyiségi viszonya szabja meg (a második vírusnak az adszorpcióhoz elméletileg elegendő egy szabad hely a sejtfelszínen található több tízezer receptorból) Autointerferencia Autointerferenciáról akkor beszélünk, ha vírus saját utódvirion társaival interferál. Ez a jelenség mindig sejten belül, a multiplikáció közben alakul ki a defektív és komplett utódvirionok között. A vírus multiplikációja során keletkező utódvirionok döntő többsége (nemegyszer 60 70%-a) inkomplett, defektív partikula lesz. Ezek az inkomplett virionok képtelenek a további multiplikációra, mivel esetükben a defektivitás a genomjuk sérülését vagy hiányát jelenti. A defektív virionok több módon gátolják a komplett viriontársak megszületését. A komplett vírussal szembeni mennyiségi előnyt kihasználva, saját maguk számára lefoglalják azokat a sejtorganellumokat, ahol a makromolekulák szintézise folyik. Ebben a folyamatban minden inkomplett virion részt vehet. Az interferencia további lehetőségével csak azok az inkomplett virionok élhetnek, amelyeknél a defektivitás a genom deléciójára vezethető vissza (vagyis rövidebb a nukleinsavuk). Ezeket az interferenciára képes inkomplett vírusokat defektív interferáló (DI) partikuláknak nevezzük. Az elmondottakból következik, hogy nem minden defektív vírus képes interferálni, de minden interferáló vírus defektív. A DI partikulák egy része úgy valósítja meg az interferenciát, hogy elhalássza a közvetlen környezetében replikálódó komplett vírus polimeráz enzimjét, amivel saját inkomplett utódait szintetizáltatja. (Ennek eredményeként a fertőzött sejtben tovább növekszik az inkomplett utódvirionok száma.) Erre feltételezhetően azért van lehetősége, mert a rövidebb nukleinsavszál (és annak lánczáró kodonja) nagyobb affinitást biztosít a polimeráz enzimhez, mint a komplett vírus hosszabb genomja. Ezért részesíti előnybe a replikáz enzim a DI partikulákat. Más DI vírusok az ép struktúrfehérjéket rabolják el a komplett vírusok elől (poliovírusok). Az autointerferencia révén egyre nagyobb számban termelődő inkomplett vírusok a fertőzött sejt elhagyása után az adszorpciós interferencia lehetőségét is kihasználhatják, amivel tovább rontják a komplett virionok életben maradási esélyeit. Többek között ezért válhat a szervezet szintjén önkorlátozóvá egy vírusos betegség Heterológ interferencia Heterol&oa