Labor jegyzőkönyv vol.01

Átírás

1 Labor jegyzőkönyv vol.01 Egysejtűek fénymikroszkópos vizsgálata ELTE TTK Biológia, 2. szemeszter Tárgy: állatszervezettan Csoportvezetők: Pálfia Zsolt, Kovács Attila Február 21. Absztrakt Laboratóriumi csoportmunka során eukarióta egysejtűket vizsgálunk fénymikroszkóp segítségével. Paramecium és Blepharisma egyedekből készített preparátumokhoz neutrális és vitális festékeket, indikátor anyagokat és toxinokat adunk hozzá. Megfigyeléseinket jegyzőkönyvben összegezzük az alábbi szöveg közös munka eredménye.

2 A vizsgálat eszközei, célja A fénymikroszkóp felépítéséről, fentről lefelé haladva: okulár, prizmaház, statív, forgatható revolverfoglalat, objektívek, kondenzor, mezőrekesz, talp, benne a fényforrással. Ezekhez tartoznak még a különböző csavarok: a tárgyasztal magasságát beállító (makro- és mikro-) csavar, a kondenzor magasságát beállító csavar és a tárgy helyzetét beállító csavarok. A vizsgálathoz előre elkészített tenyészetből vettük az egysejtűket. Néhány cseppet tettünk a tárgylemezre a preparátumból, majd vattaszálakat helyeztünk a tetejére, és csak ezután fedtük le a fedőlemezzel. A vattára azért volt szükség, hogy korlátozzuk a csillósok mozgását, és így nagyobb nagyítással is megfigyelhessük őket. Ezután alkalmaztuk valamelyik kezelést, hogy egy-egy szervecskét tüzetesebben megvizsgálhassunk: etetéssel az endoszómákat tettük láthatóvá, indikátorral az emésztőűröcske kémhatásváltozását követhettük figyelemmel, speciális, egy-egy anyaghoz kötődő vitális festékkel pedig az adott anyag sejtben való előfordulását vizsgálhattuk, stb. Rövid leírás a megfigyelt fajokról Mindkét faj a Chromalveolata főcsoporton belül az Alveolata csoportba, azon belül is a Csillós egysejtűk (Ciliophora vagy Ciliata) közé tartozik. Heterotrófok, baktériumokkal táplálkoznak. Vizes élőhelyeken élnek (az általunk tanulmányozott fajok édesvízben, így meg tudtuk figyelni a lüktetőűröcske működését). Paramecium: határozott, állandó testalakkal rendelkezik. Áttetsző. Mérete mikrométer között változik. Egy ovális macronucleusa, és fajonként változó számú micronucleusa van. Két, alternálva működő lüktetőűröcske található benne a sejt két ellentétes végén. Blepharisma: alakja változó, színe pirosas a benne található blepharismin nevű anyagtól (ez egy fotoreceptor pigment, de valószínűleg riasztó vegyületként is működik). Mérete nagyobb a Parameciumnál, körülbelül mikrométer közötti. Macronucleusa hosszúkás, az egész sejt hosszában elnyúló. Hullámzóhártyával rendelkezik. Egy lüktetőűröcskéje van, a sejt végében. 2

3 Kísérletek Natív vizsgálat A vizsgálat során szubsztrátok hozzáadása nélkül figyeltük meg az egysejtűket, összehasonlítási alapot teremtve a kezelt mintákhoz. Ha viszonylag kevés vattát tettünk a mintára, akkor kis nagyításnál megfigyelhettük a csillósok mozgását, és azt, hogy akadálynak ütközve hogyan tolatnak vissza, majd változtatnak irányt, avagy hogyan próbálják magukat a legkisebb résbe is betuszkolni. Több vatta használatakor sikerült egy-egy egyedet becsapdázni láthattuk eredeti állapotukban azokat a sejtszervécskéket, amelyeket a kezelésekkel majd részletesen vizsgálni szeretnénk. Tus-etetés Az elkészített minta (tenyészetből vett cseppekre vattát teszünk, majd erre ráhelyezzük a fedőlemezt) mellé pár csepp tust cseppentünk, majd átszívatjuk (a tussal átellenes oldalon szűrőpapírt érintünk a folyadékhoz, aminek hatására az beleivódik a papírba, és magával szívja a tust is). Így a mintán koncentrációkülönbség keletkezik: a cseppentés helyén a legnagyobb, majd ettől távolodva egyre kisebb. Erre azért van szükség, mert nagy töménységben a tusban lévő adalékanyagoktól az egysejtűk elpusztulnak. Ha a színezékrészecskék eljutnak a sejtgarat végéig, akkor az egysejtű fagocitózissal felveszi azokat. A tus-szemcsék sötét színük miatt jól láthatóak a fénymikroszkóp alatt, így megfigyelhetjük útjukat a sejt emésztőűröcskéjében. A sejt általában meg akar szabadulni a festéktől, ezért gyorsan, akár 2-3 percen belül leadja a cytoprocton keresztül. Szerencsés esetben, ha egy csillóst sikerül beszorítanunk a vattaszálakkal, akkor a tus-szuszpenzióban a csillók által keltett örvények is vizsgálhatóak. 3

4 Metilzöld-pironin A Paramecium-tenyészetből először egy natív mintát készítettünk a Bevezetően ismertetett módon és azt vizsgáltuk binokuláris sztereomikroszkópban. A legkisebb nagyításnál a vattafonalak között csapdába esett papucsállatkákat vehettük szemügyre. A papucsállatkák mellett egy amőbát is észlelni véltem, bár valószínűleg inkább csak a vattában található szennyeződés lehetett. Nagyobb nagyításnál egy lomhán mozgó ostoros is megjelent. Az egyik kevésbé aktív papucsállatka (feltehetőn baktériumban gazdag környezetben helyezkedett el és emiatt nem kellett sokat fáradoznia a táplálék megszerzéséért) esetében jól meg lehetett figyelni az alternáló lüktetőűröcske-komplexeket, a kortikális zónában elhelyezkedő tricho-cystákat. A natív vizsgálatot követőn metilzöld-pironin festési eljárásnak vetettük alá a mintát. Ez úgy történt, hogy a tárgylemez szélére cseppentettem az oldatból, majd szűrőpapír segítségével átitattam a mintát. Ezt követőn fénymikroszkópban vizsgálva a papucsállatkák citoplazmája vörösesnek, a sejtmagok (elsősorban a macronucleus) pedig smaragdzöld színben tűntek fel. A jelenség magyarázata, hogy a két bázikus festék (metilzöld, pironin) szelektíven kötőik a nukleinsavakhoz, azok eltérő polimerizáltsági fokától függőn. A metilzöld a magasabb polimerizáltságú DNS-hez (kb. 8*10 6 dalton) kapcsolódik, míg a pironin az alacsonyabb polimerizáltsági fokú RNS-hez asszociálódik. Minthogy a Paramecium eukarióta egysejtű élőlény, a DNS-állomány a sejtmagban helyezkedik el a maghártyával izoláltan, míg az RNSek főként a citoplazmában lokalizálódnak és ott irányítják a fehérjeszintézis folyamatát [1]. Kármin-szuszpenzió A kármin-oldatban található piros színezékszemcsék segítségével jól megfigyelhető a csillózat mozgása, illetve az egysejtű táplálkozási organellumai. Egy csepp Paramecium tenyészet mellé kevés kármin-oldatot cseppentettünk, majd egy gombostű segítségével összekevertük a két folyadékcseppet. A már hamarabb leírt módszer segítségével (vatta stb...) elkészült mintát sztereomikroszkópban vizsgáltuk. Rövid keresgélés után láthatóvá vált két Paramecium eukarióta, ahogy a vattafonalak közt mozognak. Nagyobb nagyítást használva kivehetőé vált az egysejtűk különböző organellumai ( szájmező, lüktető űröcske ). Piros foltok látszódtak a folyadékban és kis idő elteltével megjelentek a piros színűvé vált fagoszómák az egysejtű testében Különböző mélységélességet használva más-más helyen látszódtak a piros szemcsék, és nagyjából követni lehetett a fagoszómák útvonalát. A piros anyag végül a cytopygén keresztül távozott. Hosszú idő keresztül látni lehetett a piros fagoszómákat (10-20 perc). A csillózat mozgását, az általa keltett vízáramot is remekül meg lehetett figyelni. 4

5 Nikkel-szulfát A mozgékony csillós és ostoros egysejtűk vizsgálata nem könnyű egyszerűn kiúsznak a látómezőnkből mielőtt pillantást vethetnénk rájuk. Ezt elkerülendő, a kutatók különféle fizikai akadályokkal, nagy viszkozitású közeg alkalmazásával és toxinokkal próbálják lassítani a megfigyelt lényeket. Bevált módszer például a nikkel-szulfát alkalmazása, amelyet mi is kipróbáltunk egy Blepharisma példányokat tartalmazó preparátumon. A szubsztrátot meglehetően sűrű, közel 1%-os oldat formájában az egysejtűket tartalmazó vizes közeg mellé cseppentettem a tárgylemezen, majd a két csepp összenyitásával koncentrációgrádienst képeztem. A folyadéktérben pásztázva valóban lelassult példányokat figyeltem meg, a natív készítmény esetén tapasztalt cikázó mozgást ezúttal bizonytalan imbolygás váltotta fel. A toxin hatása a csillók és lüktetőűröcskék lelassult mozgásán volt leginkább megfigyelhető [2]. Sikerült egy, a toxin túladagolásától teljesen mozdulatlanná vált egyedet is megfigyelni, amely 2 perc egyre lassuló lüktetés után végül kipukkant. A sejt csúcsi régiójában látványosan, szinte egy pillanat alatt felszakadt a sejthártya, és kisebb becslésem szerint mikron nagyságú gömbölyded képletek áramlottak ki az eddig elhatárolt rendszerből. A ciánosan zöld színű NiSo 4 kristályvizes formája vizes oldatában szulfát ionra és [Ni(H2O) 6 ] 2+ komplexre disszociál [3]. Ez utóbbi, a sejt kis méretű, poláros anyagok számára átjárható csatornáin keresztül jut az intracelluláris térbe. Itt kálcium-csatornákat blokkol és közvetve akadályozza a mitokondriális ATP szintézist, amely sejten belüli energiahiányhoz vezet [4]. Az ATP készletek kimerülését először a motorikus funkciók megszűnése jelzi, amelyet idővel a vitális funkciók is követnek: az ozmoregulációban szerepet játszó ATP-áz pumpák és lüktetőűröcskék leállása után a sejt percek alatt felfúvódik, majd kipukkan a hipoozmotikus közegből beáramló víz hatására. Bárium-klorid A natív mintában megfigyeljük a Paramecium tipikus mozgási irányát a sejt anterior és posterior végeihez viszonyítunk. Ezek után híg bárium-klorid (BaCl 2 ) oldatot cseppentünk a minta mellé. Megfigyelhetjük a csillóreverzió jelenségét: a bárium-klorid a kálcium-ion szintet növeli meg az egysejtűben, így a csillók mozgása megváltozik. Ahogy helyreáll a kálcium-ion szint a csillók mozgása visszatér az eredeti kerékvágásba (a szokásos irányváltásnál látható imbolygás után). Ha túl nagy koncentrációban adunk a mintához bárium-kloridot, akkor az 5

6 egysejtűek elpusztulnak és kilövik trichocystájukat. Az egysejtűek nem pukkadtak ki azonnal, így meg lehetett figyelni, ahogyan lassan vízzel telítődtek bizonyos pontokon, közvetlenül a plazmamembrán alatt. Miközben a sejthártya elért egy bizonyos feszítettségi állapotot a felgyülemlett víz miatt jelentős alakváltozáson ment keresztül (gömbölydeddé vált), majd átszakadt. Kongóvörös A kongóvörös indikátor segítségével tanulmányozni lehet a papucsállatkák fagocitotikus anyagfelvételét és a táplálék sorsát a felvételtől egészen a cytoprocton keresztül történő kiürítésig. Mivel ph-indikátorként viselkedik, ezért nyomon lehet követni a digestív vakuólumok kémhatását (ph 3,0 alatt kék míg ph 5,2 felett piros színt mutat). Felhasznált források: 1. Microtechnikai alapismeretek 2. A Bit of Basic Microtechnique 3. Nickel-sulfate article 4. P2Y Receptor-Mediated Stimulation of Müller Glial DNA Synthesis 6