Pályázat címe: Struktur und Funktion des antifungalen proteins PAF aus Penicillium chrysogenum. Beszámoló/Eredmények

Átírás

1 Projektszám: 79öu1 Pályázó neve: Dr. Florentine Marx HUF ,00.- EUR 7.061,00.- Intézménye: Med. Univ. Innsbruck Projektpartner neve: Prof. Dr. Gyula Batta Intézménye: University of Debrecen Pályázat címe: Struktur und Funktion des antifungalen proteins PAF aus Penicillium chrysogenum Beszámoló/Eredmények A projekt jellege: (kérjük bejelölni) Workshop, konferencia Publikáció, tananyag Kutatási együttm ködés Oktatási program A projektben tervezett kísérleteket sikeresen megvalósítottuk. Pichia pastoris expressziós rendszerrel a következ rekombináns PAF mutánsokat (cisztein - szerin cserével) állítottuk el : PAF C7S, PAF C14S und PAF C54S. A mutáns fehérjéket és a kontroll natív PAF fehérjét in-vivo körülmények közt stabil 15N és 13C izotópokkal jelöltük további NMR vizsgálatok céljából. Elkészült a duplán jelölt PAF teljes NMR jelhozzárendelése. Az eredmények alapján több tudományos közlemény van el készületben. Az a két fiatal MSc. hallgató (Nyitrai Mónika és Fzil Ádám) akik a projekt keretében hosszabb id t tölthetettek Innsbruck-ban, PhD ösztöndíjat nyertek Batta prof. témavezetésével. Munkájuk során hasznosíthatják a tanult új mikrobiológiai és molekuláris biológiai ismereteiket. H mérsékleti egyensúlyban sok fehérje vizes oldata a feltekeredett ( natív ) és a kitekeredett formákat egyidej leg tartalmazza. Amíg a natív forma NMR technikával megfigyelhet és jellemezhet, a kitekeredett konformerek rejtett cserepartnerként léteznek és nehezen detektálhatók. A m ködési mód megértéséhez fontos lenne megtudni, hogy a PAF esetében melyik forma az aktív. Ezért a natív formában három diszulfid híddal stabilizált PAF és a mutánsok szerkezeti-dinamikai sajátságait vizsgáltuk. Az egyszeres cisztein mutánsok nem voltak feltekeredve, mégis maradt némi biológiai aktivitásuk (pl. C54S). A korábban elkészült lizin mutánsok közül noha fel volt tekeredve, a K35,K38A mutáns teljesen elvesztette az aktivitását. Az eddigi NMR relaxációs méréseink alapján (+31 o C h mérsékleten) a spontán diszulfid híd átrendez dést kizártuk. A h mérséklet által indukált reverzibilis ki-és feltekeredést 15 N- 1 H HSQC NMR segítségével követtük a o C h mérséklet tartományban. A mérésekb l két és háromállapotú modellekkel, aminosavanként meghatároztuk a kitekeredési folyamat termodinamikai paramétereit (entalpia, h kapacitás, alacsony és magas h mérséklet olvadáspontok). Az derült ki, hogy a hideg denaturálódás szinkronban történik, míg a forró denaturálódás jobban érinti a fehérje nem-konzervált hurok régióit. Az irreverzibilisen denaturált fehérje inaktív oligomer szerkezeteket adott. A PAF kémiai szintézisére tett kísérletek (Prof. Tóth Gábor, Szeged) a nem várt diszulfid híd átrendez dések miatt csak részben voltak sikeresek. Azonban az eddigi szintetikus és tömegspektrometriai eredmények kombinációja alátámasztja, hogy a korábban általunk javasolt abcabc diszulfid híd mintázat helyes. A PAF-ra érzékeny A. Nidulans membrán frakciója NMR_STD kísérletben a PAF aromás régióinál mutatott interakciót. Az NMR és ITC el kísérletek szerint a PAF gyengén köt Ca2+ ionokat és foszfatidil-inozitolokat, ami további támpontot adhat a hatásmechanizmushoz.

2 Publikációs jegyzék: Batta G; Fizil Á; Kurtán T; Gáspári Z; Barna T.M; Kövér E.K; Leiter É; Pócsi I; Marx F. "Thermal unfolding of a highly stable antifungal protein at extreme temperatures" The 5 th Central European Conference Chemistry towards Biology, Primošten, Croatia, September 8 11, 2010, SL-5 Batta G; Fizil Á; Gáspári Z; Barna T.M; Kövér E.K; Nyitrai M; Tomori V; Leiter É; Pócsi I; Marx F. Cold and hot unfolding of a higly stable antifungal protein, Bio-NMR and EAST-NMR Annual User Meeting, January 24-27, 2011Brno, Czech Republic, P-4 G. Batta, Á. Fizil, Z. Gáspári, T. Barna, K. E. Kövér, M. Nyitrai, V. Tomori, É. Leiter, I. Pócsi, F. Marx Cold and hot unfolding of a higly stable antifungal protein Gordon Research Conferences, Computational Aspects of Biomolecular NMR Location / Il Ciocco Hotel and Resort /Lucca (Barga), Italy, May , P-8 G. Batta, T. Barna, Á. Fizil, Z. Gáspári, K. E. Kövér, M. Nyitrai, V. Tomori, É. Leiter, I. Pócsi, F. Marx Cold-hot unfolding and dynamics of a higly stable antifungal protein EUROMAR 2011, aug 21-25, Frankfurt am Main, Germany, P-Rd536 G. Batta: To see or not to see? Cold and hot unfolding of a highly stable antifungal protein. EAST-NMR and 13 th Central European NMR Symposium, Budapest, August 30, 2011, L G. Batta: Disulfide bond topology: Synthetic and mass spectroscopy hurdles, 4th European Conference on Chemistry for Life Sciences, Budapest, August 31-September 3, L G. Batta: Structure, dynamics and unfolding of a highly stable antifungal protein. 2nd Regional EAST NMR meeting, Bratislava, September 8-9, 2011, L Heged s N, Leiter E, Kovács B, Tomori V, Kwon NJ, Emri T, Marx F, Batta G, Csernoch L, Haas H, Yu JH, Pócsi I. The small molecular mass antifungal protein of Penicillium chrysogenum - a mechanism of action oriented review. J Basic Microbiol Jul 21. doi: /jobm

3 Projektnummer: 79öu1 Antragsteller: Dr. Florentine Marx HUF ,00.- EUR 7.061,00.- Institut: Med. Univ. Innsbruck Projektpartner: Prof. Dr. Gyula Batta Institut: Univ. Debrecen Titel: Struktur und Funktion des antifungalen proteins PAF aus Penicillium chrysogenum Bericht Art der Förderung: Workshop, Konferenz Publikation, Lehrmaterial Forschungsprojekt Unterrichtsprojekt Die für dieses Projekt geplanten Experimente konnten durchgeführt und erfolgreich abgeschlossen werden. Unter Zuhilfenahme des Pichia pastoris Expressionssystems wurden folgende PAF Proteinvarianten rekombinant hergestellt: PAF C7S, PAF C14S und PAF C54S. In allen diesen Proteinvarianten wurde ein Cystein an der entsprechenden Stelle durch ein Serin ersetzt. Diese Proteinvarianten sowie natives PAF als Kontrolle wurden in vivo mit 13 C- / 15 N-Isotopen markiert, bevor die Proteine gereinigt und deren Struktur mittels NMR- Analyse untersucht wurde. Die Struktur des doppelt-markierten nativen PAF Proteins konnte vollständig aufgeklärt werden. Beide ungarische Diplom-Studenten (Mónika Nyitrai und Ádam Fizil), die an diesem Projekt beteiligt waren und einige Monate in meinem Labor für "Angewandte Mykologie" in der Sektion Molekularbiologie (Medizinischen Universität Innsbruck) verbracht haben, sind nun Doktoranden in der Arbeitsgruppe von Prof. Batta (Universität Debrecen) und verwenden das mikrobiologische und molekularbiologische Know-how, welches sie in Innsbruck erlernt haben. Zahlreiche wasserlösliche Proteine liegen bei thermischen Gleichgewicht als eine Mischung aus gefalteten und ungefalteten Molekülen vor. Während die grossteils gefalteten Proteine problemlos mittels NMR identifiziert werden können, koexistieren die in geringen Mengen vorhandenen ungefalteten Proteine als "versteckte Austauschpartner". Um jene Proteinformen zu identifizieren, die für den biologischen Effekt von PAF verantwortlich sind, haben wir das dynamische Verhalten des antifungalen Proteins untersucht, welches über drei Disulfidbrückenbindungen stabilisert wird. Die Aminosäureaustäusche der Cysteinreste führten in den PAF Proteinvarianten zu ungefalteten Strukturen, wiesen aber trotzdem noch eine antifungale Restaktivität auf (z.b. PAF C54S). Aminosäureaustäusche von kritischen Lysinresten hingegen führten zu dem Verlust der Proteinaktivität trotz korrekter Faltung (z.b. PAF K35,38A). Diese Proteinvarianten standen uns bereits aus vorangegangenen Studien zur Verfügung. Die Möglichkeit einer Neuorganisation der Disulfidbrückenbindungen bei 31 C konnte ausgeschlossen werden. Eine Temperatur-induzierte reversible Entfaltung/Faltung von PAF wurde in einem Bereich zwischen -10 C bis +80 C mittels 15 N- 1 H HSQC NMR untersucht. Die Enthalpie, die Hitze-Kapazität und die Schmelzpunkte der Proteinentfaltung bei tiefen und hohen Temperaturen wurden für jede Aminosäure einzeln anhand verschiedener Modelle untersucht ("two-state model", three-state model", "intermediate-state model"). Wir konnten nachweisen, dass die Denaturierung bei tiefen Temperaturen geregelt abläuft, während bei Hitzeschock nicht, und dass sogenannte "hot-spots" in den nicht-konservierten Loop-Regionen des Proteins auftreten. Weiters konnten wir zeigen, dass Hitze-inaktiviertes PAF als Oligomer vorliegt und inaktiv ist. Die chemische Synthese von PAF (Prof. Gábor Tóth, Szeged) war nur teilweise erfolgreich, da es zur Ausbildung von unerwarteten Disulfidbrückenbindungen im synthetischen PAF kam. Trotzdem konnten wir mittels dieser synthetischen Daten und weiterer MS Analysen jene Disulfidbrückenbindungen bestätigen, die wir in vorangegangenen Arbeiten bereits postuliert haben. ja

4 NMR-STD Expreimente zeigten, dass aromatische Regionen von PAF an Plasmamembranfraktionen des sensitiven Schimmelpilzes Aspergillus nidulans binden. Darüberhinaus lassen vorläufige NMR und ITC Expreimente darauf schliessen, dass PAF Ca2+ Ionen und Phosphatidyl-Inositole (Bestandteile der Plasmamembran) binden. Diese Ergebnisse geben weiter Einblick in die Wirkungsweise dieses antifungalen Proteins. Publikationsliste: Publikationsverzeichnis: Batta G; Fizil Á; Kurtán T; Gáspári Z; Barna T.M; Kövér E.K; Leiter É; Pócsi I; Marx F. "Thermal unfolding of a highly stable antifungal protein at extreme temperatures" The 5 th Central European Conference Chemistry towards Biology, Primošten, Croatia, September 8 11, 2010, SL-5 Batta G; Fizil Á; Gáspári Z; Barna T.M; Kövér E.K; Nyitrai M; Tomori V; Leiter É; Pócsi I; Marx F. Cold and hot unfolding of a higly stable antifungal protein, Bio-NMR and EAST-NMR Annual User Meeting, January 24-27, 2011Brno, Czech Republic, P-4 G. Batta, Á. Fizil, Z. Gáspári, T. Barna, K. E. Kövér, M. Nyitrai, V. Tomori, É. Leiter, I. Pócsi, F. Marx Cold and hot unfolding of a higly stable antifungal protein Gordon Research Conferences, Computational Aspects of Biomolecular NMR Location / Il Ciocco Hotel and Resort /Lucca (Barga), Italy, May , P-8 G. Batta, T. Barna, Á. Fizil, Z. Gáspári, K. E. Kövér, M. Nyitrai, V. Tomori, É. Leiter, I. Pócsi, F. Marx Cold-hot unfolding and dynamics of a higly stable antifungal protein EUROMAR 2011, aug 21-25, Frankfurt am Main, Germany, P-Rd536 G. Batta: To see or not to see? Cold and hot unfolding of a highly stable antifungal protein. EAST-NMR and 13 th Central European NMR Symposium, Budapest, August 30, 2011, L G. Batta: Disulfide bond topology: Synthetic and mass spectroscopy hurdles, 4th European Conference on Chemistry for Life Sciences, Budapest, August 31-September 3, L G. Batta: Structure, dynamics and unfolding of a highly stable antifungal protein. 2nd Regional EAST NMR meeting, Bratislava, September 8-9, 2011, L Hegedüs N, Leiter E, Kovács B, Tomori V, Kwon NJ, Emri T, Marx F, Batta G, Csernoch L, Haas H, Yu JH, Pócsi I. The small molecular mass antifungal protein of Penicillium chrysogenum - a mechanism of action oriented review. J Basic Microbiol Jul 21. doi: /jobm

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